Przygotowanie in vitro do wywoływania i rejestrowania programów motorycznych żerowania z ruchami fizjologicznymi u Aplysia californica

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rejestracja aktywności elektrycznej nerwów, mięśni i neuronów oraz odpowiadających im ruchów aparatu gębowego podczas programów motorycznych karmienia. Jest to realizowane poprzez najpierw usunięcie masy gębowej z znieczulonego ślimaka i przymocowanie elektrod hakowych do kluczowych nerwów i mięśni. Drugim krokiem jest umieszczenie masy gębowej w naczyniu pomiarowym i przygotowanie zwojów do rejestracji zewnątrzkomórkowej.

Następnie, za pomocą elektrod zewnątrzkomórkowych, lokalizuje się neurony docelowe. Ostatnim krokiem jest indukowanie i rejestrowanie programów motorycznych żerowania, takich jak gryzienie, połykanie i odrzucanie pokarmu. Ostatecznie preparat zawieszonej masy przełykowej służy do wykazania aktywności nerwów, mięśni i pojedynczych neuronów podczas różnych ruchów masy przełykowej przypominających żerowanie.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak badania izolowanych zwojów, jest możliwość bezpośredniego powiązania zapisów z nerwów, mięśni i pojedynczych neuronów z ruchami aparatu gębowego. W zademonstrowaniu procedury pomoże huu, doktorant z naszego laboratorium. Aby rozpocząć procedurę, znieczul zdrową plegię o masie od 200 do 300 g w kuwecie sekcyjnej, wstrzykując izotoniczny chlorek magnezu w ilości stanowiącej około 50% masy ciała. Po pierwszym wstrzyknięciu w okolicy ogona zwierzęcia, delikatnie masuj jego powierzchnię, aby rozprowadzić chlorek magnezu.

W razie potrzeby wykonaj dodatkowe iniekcje w pobliżu głowy zwierzęcia. Gdy zwierzę przestanie reagować na delikatne bodźce dotykowe, przytwierdź je szpilkami do tacki stroną grzbietową do góry. Umieść jedną szpilkę w ogonie i po jednej szpilce w każdym przednim macku.

Następnie za pomocą pęsety uciśnij i unieś skórę zwierzęcia w środkowej części głowy. Za naroślami nosowymi wykonaj cięcie koronarne w poprzek głowy zwierzęcia, tuż za punktem, który jest podtrzymywany. Po tym wykonaj cięcie pośrodkowo strzałkowe pomiędzy naroślami nosowymi w kierunku pyska, aby odsłonić masę policzkową.

Następnie odsunąć płat skóry od masy policzkowej i przeciąć nerwy oraz tkankę łączną przytwierdzoną do ściany ciała. Aby całkowicie oddzielić ten płat skóry od masy policzkowej, należy uważać, by nie przeciąć żadnych nerwów ani tkanek wewnątrzmasy policzkowej. Następnie chwycić i przytrzymać przełyk.

Przetnij przełyk za punktem, który jest trzymany. Wyciągnij przełyk do góry i unieś masę jamową znad niej. Zwoje mózgowe, płucne i stopowe tworzą pierścień, w którym zwój mózgowy jest połączony ze zwojami jamowymi za pomocą łączników mózgowo-jamowych.

Pozostaw te zwoje pierścieniowate przytwierdzone do masy gębowej i przetnij wszystkie nerwy biegnące z tych zwojów do innych części ciała. Następnie przetnij tkankę łączną wokół masy gębowej i kontynuuj podnoszenie masy gębowej w miarę jak będzie ona mniej związana z ciałem. Gdy masa gębowa pozostanie przytwierdzona jedynie do otworu gębowego, przytrzymaj przełyk oraz masę gębową.

Wykonaj cięcie prostopadłe. Wykonaj końcowe cięcie tuż przed szczękami, aby oddzielić masę policzkową od ciała. Umieść masę policzkową w roztworze składającym się z 50% izotonicznego chlorku magnezu i 50% soli fizjologicznej SIA, aby utrzymać częściowe znieczulenie podczas mocowania elektrod.

Następnie umieść masę policzkową wraz z roztworem w szalce Petriego z dnem w kształcie cygara, przecinając tętnicę policzkową na powierzchni brzusznej masy policzkowej. Następnie usuń zwoje pleuralne i pedalne, przecinając ich połączenia ze zwojem mózgowym. Pozostaw zwój mózgowy połączony ze zwojami policzkowymi i masą policzkową za pomocą CBC, a pozostałe połączenia między zwojem mózgowym a masą policzkową przetnij.

Przytnij przełyk i gruczoły ślinowe do krótkich odcinków. Na tym etapie przymocuj elektrody hakowe do oka nerwu ulnarnego, dwóch mięśniowych nerwów policzkowych dwa i trzy oraz gałęzi A drugiego nerwu policzkowego. Zastosuj procedurę podobną do tej zaprezentowanej w publikacji JoVE autorstwa Collinsa i Shielda, którą krótko podsumowano w niniejszym tekście.

Przy każdym oddzielaniu elektrody należy umieścić elektrodę w pobliżu nerwu lub mięśnia, umieścić docelowy nerw w haczyku i delikatnie go unieść za pomocą manipulatora. Następnie należy osuszyć odcinek nerwu za pomocą chusteczki Kimwipe. Na zahaczony nerw należy nałożyć kroplę szybko schnącego kleju super glue, upewniając się, że haczyk jest całkowicie pokryty klejem, a końcówka drutu referencyjnego nie została nim pokryta.

Następnie używa się strzykawki z przymocowaną rurką polietylenową, aby nanieść roztwór z naczynia na klej, co spowoduje utwardzenie jego powierzchni. Kolejnym krokiem jest przygotowanie okrągłego naczynia rejestracyjnego Pyrex o wymiarach 100 by 50 milimetrów do wykorzystania jako komora rejestracyjna; za pomocą końcówki pipety nanosi się cienką warstwę smaru próżniowego na wycięcie między komorą mózgową a zakrzywioną, aby zminimalizować wycieki. Następnie przednią komorę wypełnia się solą fizjologiczną plescia.

Ostrożnie przenieś masę policzkową z szalki Petriego do przedniej komory okrągłego naczynia Pyrex, upewniając się, że żadna z elektrod nie jest zbyt mocno naciągnięta, co mogłoby doprowadzić do przerwania nerwów. Zachowaj szczególną ostrożność przy elektrodach hakowych, jeśli naczynie musi zostać przeniesione pod inny stereomikroskop. Do pocieniania osłonki.

Pogrupuj elektrody po każdej stronie masy policzkowej. Ostrożnie trzymaj elektrody, chwytając taśmę laboratoryjną zakrywającą piny złącza, i ponownie upewnij się, że żadna z elektrod nie jest mocno naciągnięta. Gdy szalka zostanie umieszczona pod mikroskopem, elektrody powinny swobodnie opadać na boki szalki i spoczywać na platformie podczas przerw oraz pomiędzy etapami eksperymentu; napowietrzaj sól fizjologiczną w komorze masy policzkowej za pomocą kamienia napowietrzającego do akwarium.

Następnie przypnij zwoje mózgowe w tylnej komorze, prowadząc CBC przez wycięcie. Nałóż więcej smaru próżniowego na CBC. Następnie dodaj więcej soli fizjologicznej SIA do obu części szalki, aby zwoje były całkowicie zanurzone.

Należy upewnić się, że poziom soli fizjologicznej jest niższy niż wysokość smaru próżniowego między komorą mózgową a jamową, aby zapobiec wyciekowi między komorami. Na tym etapie masa jamowa powinna spoczywać na dnie przedniej komory. Następnie należy przypiąć zwoje jamowe do środniej platformy, aby uniknąć uszkodzenia nerwów, które są wciąż przytwierdzone do masy jamowej.

Umieść piny wyłącznie na osłonce pomiędzy dwoma nerwami. Następnie dodaj dwa kolejne piny po bokach CBC, aby je rozciągnąć i zakotwiczyć. Utrzymuj zwoje policzkowe płasko lub obrócone, w zależności od położenia neuronów będących przedmiotem zainteresowania.

Aby obrócić zwoje policzkowe, należy za pomocą precyzyjnej pęsety chwycić nadmiar osłonki CBC i przytwierdzić ją szpilką między drugim a trzecim nerwem policzkowym. Dzięki temu widoczna stanie się większość ciał komórkowych znajdujących się w pobliżu tylnej komory, do których nie można było łatwo dotrzeć od strony górnej zwojów policzkowych. Na koniec należy umieścić dwie szpilki w osłonce zwojów policzkowych po stronie masy policzkowej.

Aby zminimalizować przemieszczanie się zwoju jamowego, chwyć osłonkę zwoju jamowego w pobliżu tylnej komory i odetnij nadmiar osłonki za pomocą precyzyjnych nożyczek, nie odsłaniając ciał komórkowych. W celu zminimalizowania uszkodzeń, usuń tylko taką ilość osłonki, jaka jest niezbędna do zobaczenia ciał komórkowych po zakończeniu procesu jej ścieńczenia. Podłącz wszystkie piny elektrod do gniazd w kablach łączących je z wzmacniaczami.

Należy upewnić się, że elektrody nie są zbyt mocno naciągnięte, są prawidłowo podłączone do odpowiednich kabli oraz że polaryzacja jest właściwa, aby wypłukać pozostały chlorek magnezu. Wymień sól fizjologiczną SIA w komorze z masą policzkową na świeżą sól fizjologiczną SIA. Następnie przeciągnij jedwabną nić chirurgiczną przez tkankę miękką w przedniej części masy policzkowej, grzbietowo względem chrząstki żuchwy.

Użyj dwóch kawałków plasteliny, aby przymocować szew do krawędzi szalki, w ten sposób zawieszając masę policzkową z jej przedniego końca. Użyj manipulatora do przytrzymania szklanej elektrody zewnątrzkomórkowej w taki sposób, aby końcówka elektrody znajdowała się w pobliżu zwoju policzkowego. Aby zlokalizować i zidentyfikować neuron, delikatnie opuść końcówkę elektrody zewnątrzkomórkowej na osłonkę.

Nad somą neuronu. Przyłożyć prąd stymulujący, a następnie przełączyć kanał używany do pobudzania somy w tryb rejestracji, aby zarejestrować aktywność na elektrodzie pozakomórkowej oraz odpowiadającą jej aktywność w nerwach w celu wywołania odrzucenia. Podobnie jak w przypadku programów motorycznych, stymulować nerw gębowy dwa A długą serią impulsów o częstotliwości 2 Hz i czasie trwania 1 ms, aby wygenerować wzorce ees.

Wzorce utrzymują się przez cały czas trwania stymulacji i mogą trwać jeszcze przez krótką chwilę po jej zakończeniu. Aby wywołać programy motoryczne przypominające gryzienie, należy umieścić kilka kryształków stałego karakolu bezpośrednio na zwoju mózgowym.

Wzorce repetytywne zazwyczaj rozpoczynają się w ciągu pięciu minut i trwają w przybliżeniu od 10 do 15 minut, zanim zaczną wygasać, aby wywołać połykanie. Podobnie jak w przypadku programów motorycznych, zastosuj stymulację caracol i poczekaj, aż masa gębowa zacznie generować silne ugryzienia. Następnie, podczas ugryzienia, umieść pasek wodorostów w pysku zwierzęcia w taki sposób, aby chwyciło ono wodorosty.

Poniżej przedstawiono stymulację i rejestrację zidentyfikowanego neuronu ruchowego B9 oraz rejestrację z tego samego neuronu, mięśnia I2 i kilku nerwów podczas programów ruchowych karmienia. Przedstawiono również obrazy wideo pochodzące z tej samej serii programów ruchowych. Wzorce połykania wywołano poprzez aplikację karbacholu do zwoju mózgowego i późniejsze umieszczenie paska wodorostów w chwytaczu podczas indukowanego karbacholem gryzienia.

Na tym obrazie ragula jest wysunięta, aby chwycić wodorosty, a na tym obrazie ragula została cofnięta, wciągając wodorosty do otworu gębowego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować zawieszoną masę gębową oraz jak uzyskać zapisy in vitro programów motorycznych żerowania.