Name: Przygotowanie in vitro do wywoływania i rejestrowania programów motorycznych karmienia z ruchami fizjologicznymi u Aplysia californica (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Poznaj metodę ekstracelularnego rejestrowania aktywności nerwów, mięśni i neuronów u Aplysia californica. Technika ta pozwala obserwować ruchy aparatu karmienia podczas programów motorycznych gryzienia, połykania i odrzucania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były wspierane przez grant NIH NS047073 oraz grant NSF DMS1010434.

<ol><li>Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinematics+of+multifunctionality%3A+comparisons+of+biting+and+swallowing+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica.</a> J. Exp. Biol. 210, 238-260 (2007).</li>
<li>Morton, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+buccal+nerve+activity+that+distinguishes+ingestion+from+rejection+can+be+used+to+predict+behavioral+transitions+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia.</a> J. Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).</li>
<li>Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+patterns+of+the+B31%2FB32+pattern+initiators+innervating+the+I2+muscle+of+the+buccal+mass+during+normal+feeding+movements+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica.</a> J. Neurophys. 75, 1309-1326 (1996).</li>
<li>Cullins, M. J., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrode+fabrication+and+implantation+in+Aplysia+californica+for+multi-channel+neural+and+muscular+recordings+in+intact%2C+freely+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals.</a> J. Vis. Exp. (40), e1791(2010).</li>
<li>Warman, E. N., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+chronic+single+extracellular+recording+in+freely+behaving+animals+using+pipette+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes.</a> J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).</li>
<li>Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+extracellular+stimulation+of+individual+neurons+in+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia.</a> J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).</li>
<li>Church, P. J., Lloyd, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+diverse+neuropeptide+cotransmitters+by+identified+motor+neurons+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia.</a> J. Neurosci. 11, 618-625 (1991).</li>
<li>Church, P. J., Lloyd, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+multiple+identified+motor+neurons+recorded+intracellularly+during+evoked+feedinglike+motor+programs+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia.</a> J. Neurophys. 72, 1794-1809 (1994).</li>
<li>Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contingent-dependent+enhancement+of+rhythmic+motor+patterns%3A+an+in+vitro+analog+of+operant+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning.</a> J. Neurosci. 17, 8093-8105 (1997).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Behavioral+biology+of+Aplysia%22">Behavioral biology of Aplysia</a>. , Freeman. San Francisco. (1979).</li>
<li>Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+organization+of+the+buccal+system+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica.</a> J. Comp. Neurol. 312, 207-222 (1991).</li>
<li>Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+buccal+motor+programs+elicited+by+a+cholinergic+agonist+applied+to+the+cerebral+ganglion+of+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica.</a> J. Comp. Physiol. A. 179, 509-524 (1996).</li>
<li>Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+behavior+in+Aplysia%3A+A+simple+system+for+the+study+of+motivation%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Biol%22%5BJournal%5D)">Feeding behavior in Aplysia: A simple system for the study of motivation.</a> Behav. Biol. 10, 1-26 (1974).</li>
<li>Morton, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+timing+of+activity+in+motor+neurons+that+produce+radula+movements+distinguishes+ingestion+from+rejection+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia.</a> J. Comp. Physiol. A. 173, 519-536 (1993).</li>
<li>Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+an+identified+histaminergic+neuron%2C+and+its+possible+role+in+arousal+of+feeding+behavior+in+semi-intact+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia.</a> J. Neurosci. 6, 2403-2415 (1986).</li>
<li>Jing, J., Weiss, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+variants+of+a+motor+act+in+a+modular+and+hierarchical+motor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network.</a> Curr. Biol. 15, 1712-1721 (2005).</li>
<li>Jing, J., Weiss, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+mechanisms+of+motor+program+switching+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural mechanisms of motor program switching in Aplysia.</a> J. Neurosci. 21, 7349-7362 (2001).</li>
<li>Morgan, P. T., Jing, J., Vilim, F. S., Weiss, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuronal+and+peptidergic+control+of+motor+pattern+switching+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Interneuronal and peptidergic control of motor pattern switching in Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 87, 49-61 (2002).</li>
<li>Jing, J., Cropper, E. C., Hurwitz, I., Weiss, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+construction+of+movement+with+behavior-specific+and+behavior-independent+modules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The construction of movement with behavior-specific and behavior-independent modules.</a> J. Neurosci. 24, 6315-6325 (2004).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Wcześniejsze prace scharakteryzowały programy motoryczne Aplysia u nienaruszonego zwierzęcia oraz w preparatach zredukowanych, takich jak izolowane zwoje. U nienaruszonego zwierzęcia, mimo że uzyskano zapisy z pojedynczych neuronów5, tego typu eksperymenty są bardzo trudne, a elektrody nie mogą być przenoszone z neuronu na neuron podczas karmienia. W izolowanych zwojach nie można obserwować ruchów karmienia indukowanych przez aktywność neuronalną. Preparat zawieszonej masy gwałkowej wypełnia lukę międ...

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671</td><td>Biologiczny, certyfikowany</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td>Certyfikowany ACS</td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Acros Organics</td><td>19753</td><td>99% </td></tr><tr><td>Siedmiowodny siarczan magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td>Certyfikowany ACS </td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Fisher Scientifc</td><td>C79</td><td>Certyfikowany ACS </td></tr><tr><td>Glukoza (dekstroza)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>BioXtra</td></tr><tr><td>Bufor MOPS</td><td>Acros Organics</td><td>17263</td><td>99%</td></tr><tr><td>Karbachol</td><td>Acros Organics</td><td>10824</td><td>99%</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255</td><td>Certyfikowany</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA49</td><td>Certyfikowany</td></tr><tr><td>Jednotubowa kapilara szklana</td><td>A-M Systems</td><td>6150</td><td></td></tr><tr><td>Wytwornica mikropipet Flaming-Brown model P-80/PC</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Użyty żarnik: FT345B</td></tr><tr><td>Drut ze stali nierdzewnej w powłoce emaliowej</td><td>California Fine Wire</td><td></td><td>0.001D, powłoka h </td></tr><tr><td>Domowy klej silikonowy Silicone II</td><td>GE</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Superklej Duro Quick-Gel</td><td>Henkel corp.</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Wzmacniacz A-M Systems model 1700</td><td>A-M Systems</td><td></td><td>Ustawienia filtrów: 300-500 Hz nerwy, 10-500 Hz mięsień I2</td></tr><tr><td>Wielokanałowy stymulator Pulsemaster</td><td>World Precision Instruments</td><td>A300</td><td></td></tr><tr><td>Izolator bodźca</td><td>World Precision Instruments</td><td>A360</td><td></td></tr><tr><td>AxoGraph X</td><td>AxoGraph Scientific</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Licznik sumujący Veeder-Root</td><td>Danaher</td><td>C342-0562</td><td></td></tr><tr><td>Złote piny łącznikowe</td><td>Bulgin</td><td>SA3148/1</td><td></td></tr><tr><td>Złote gniazda łącznikowe</td><td>Bulgin</td><td>SA3149/1</td><td></td></tr><tr><td>Elastomer silikonowy Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szalka krystalizacyjna 100 x 50 mm</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Smar wysokopróżniowy</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td> końcówki do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-375D</td><td></td></tr><tr><td>Piny Minutien</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Plastelina modelarska</td><td>Sargent Art</td><td>22-4400</td><td></td></tr><tr><td>Szwy jedwabne</td><td>Ethicon</td><td>K89OH</td><td></td></tr><tr><td>Cicha pompa powietrzna Whisper</td><td>Tetra</td><td>77849</td><td></td></tr><tr><td>Przewód akwariowy</td><td>Eheim</td><td>7783</td><td>12/16 mm</td></tr><tr><td>Kamień napowietrzający Elite Airstone</td><td>Hagen</td><td>A962</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannasa</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjna pęseta Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Wodorosty Yaki Sushi Nori</td><td>Rhee Bros</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ręczniki Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie in vitro do wywoływania i rejestrowania programów motorycznych żerowania z ruchami fizjologicznymi u aplysia californica

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

Wielofunkcyjność, czyli zdolność jednej struktury peryferyjnej do generowania wielu odrębnych zachowań1, pozwala zwierzętom na szybką adaptację ich zachowań do zmieniającego się środowiska. Morskie mięczak Aplysia californica stanowi przystępny system do badania wielofunkcyjności. Podczas żerowania Aplysia generuje kilka odrębnych typów zachowań, wykorzystując ten sam aparat pokarmowy – masę gębową. Zwoje kontrolujące te zachowania zawierają szereg dużych, zidentyfikowanych neuronów, które są dostępne do badań elektrofizjologicznych. Aktywność tych neuronów opisano w ramach programów ruchowych, które można podzielić na dwa typy: programy ingestywne (wprowadzające pokarm) i egestywne (wydalnicze), w zależności od czasu aktywności neuronalnej zamykającej chwytak pokarmowy w stosunku do aktywności neuronalnej wysuwającej lub cofającej chwytak2. Jednak w izolowanych zwojach ruchy mięśni, które wywołują te zachowania, nie występują, co utrudnia pewność, czy obserwowane programy ruchowe są korelatami rzeczywistych zachowań. In vivo uzyskano zapisy z nerwów i mięśni odpowiadające programom żerowania2,3,4, lecz bezpośrednia rejestracja z pojedynczych neuronów jest bardzo trudna5. Ponadto in vivo programy ingestywne można dalej podzielić na kęsy i połykania1,2, co jest rozróżnieniem trudnym do dokonania w większości wcześniej opisanych preparatów in vitro.
Preparat zawieszonej masy bukkalnej (Rysunek 1) wypełnia lukę pomiędzy izolowanymi zwojami a nienaruszonymi zwierzętami. W tym preparacie można wywołać zachowania pokarmowe – w tym zarówno gryzienie, jak i połykanie – oraz zachowania wydalnicze (odrzucanie), przy jednoczesnej możliwości rejestracji i stymulacji pojedynczych neuronów za pomocą elektrod zewnątrzkomórkowych6. Ruchy żerowania związane z tymi różnymi zachowaniami mogą być rejestrowane, kwantyfikowane i bezpośrednio wiązane z programami motorycznymi. Programy motoryczne w preparacie zawieszonej masy bukkalnej wydają się być bardziej podobne do tych obserwowanych in vivo niż programy motoryczne wywołane w izolowanych zwojach. Zatem programy motoryczne w tym preparacie mogą być bardziej bezpośrednio powiązane z zachowaniem in vivo; jednocześnie pojedyncze neurony są bardziej dostępne do rejestracji i stymulacji niż u nienaruszonych zwierząt. Ponadto, jako etap pośredni między izolowanymi zwojami a nienaruszonymi zwierzętami, wyniki uzyskane z zawieszonej masy bukkalnej mogą pomóc w interpretacji danych otrzymanych zarówno w układach bardziej zredukowanych, jak i bardziej kompletnych. Preparat zawieszonej masy bukkalnej jest użytecznym narzędziem do charakteryzacji neuronalnej kontroli wielofunkcyjności u Aplysia.

Gdy elektrodę zewnątrzkomórkową umieści się nad somą neuronu i wykorzysta ją do jego stymulacji, można zaobserwować jednowartościową odpowiedniość między impulsami w kanale somy a impulsami w nerwie (nerwach), do których neuron ten rzutuje (Rycina 6, panel lewy, stymulacja zidentyfikowanego neuronu B9). Kanał somy (kanał górny) jest ustawiony w trybie stymulacji w momencie przyłożenia prądu (czas 1 na rysunku), a następnie szybko przełączany w tryb rejestracji (czas 2). Dzięki utrzymaniu pozycji elektrod...

Opisujemy technikę pozwalającą na rejestrację i stymulację pozakomórkową nerwów, mięśni oraz pojedynczych, zidentyfikowanych neuronów in vitro przy jednoczesnym wywoływaniu i obserwowaniu różnych rodzajów zachowań żerowania w aparacie gębowym Aplysia.

Przygotowanie in vitro do wywoływania i rejestrowania programów motorycznych żerowania z ruchami fizjologicznymi u Aplysia californica

Wielofunkcyjność, czyli zdolność jednej struktury obwodowej do generowania wielu odrębnych zachowań1, pozwala zwierzętom na szybką adaptację ich zachowań...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rejestracja aktywności elektrycznej nerwów, mięśni i neuronów oraz odpowiadających im ruchów aparatu gębowego podczas programów motorycznych karmienia. Jest to realizowane poprzez najpierw usunięcie masy gębowej z znieczulonego ślimaka i przymocowanie elektrod hakowych do kluczowych nerwów i mięśni. Drugim krokiem jest umieszczenie masy gębowej w naczyniu pomiarowym i przygotowanie zwojów do rejestracji zewnątrzkomórkowej.Następnie, za pomocą elektrod zewnątrzkomórkowych, lokalizuje się neurony docelowe. Ostatnim krokiem jest indukowanie i rejestrowanie programów motorycznych żerowania, takich jak gryzienie, połykanie i odrzucanie pokarmu. Ostatecznie preparat zawieszonej masy przełykowej służy do wykazania aktywności nerwów, mięśni i pojedynczych neuronów podczas różnych ruchów masy przełykowej przypominających żerowanie.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak badania izolowanych zwojów, jest możliwość bezpośredniego powiązania zapisów z nerwów, mięśni i pojedynczych neuronów z ruchami aparatu gębowego. W zademonstrowaniu procedury pomoże huu, doktorant z naszego laboratorium. Aby rozpocząć procedurę, znieczul zdrową plegię o masie od 200 do 300 g w kuwecie sekcyjnej, wstrzykując izotoniczny chlorek magnezu w ilości stanowiącej około 50% masy ciała. Po pierwszym wstrzyknięciu w okolicy ogona zwierzęcia, delikatnie masuj jego powierzchnię, aby rozprowadzić chlorek magnezu.W razie potrzeby wykonaj dodatkowe iniekcje w pobliżu głowy zwierzęcia. Gdy zwierzę przestanie reagować na delikatne bodźce dotykowe, przytwierdź je szpilkami do tacki stroną grzbietową do góry. Umieść jedną szpilkę w ogonie i po jednej szpilce w każdym przednim macku.Następnie za pomocą pęsety uciśnij i unieś skórę zwierzęcia w środkowej części głowy. Za naroślami nosowymi wykonaj cięcie koronarne w poprzek głowy zwierzęcia, tuż za punktem, który jest podtrzymywany. Po tym wykonaj cięcie pośrodkowo strzałkowe pomiędzy naroślami nosowymi w kierunku pyska, aby odsłonić masę policzkową.Następnie odsunąć płat skóry od masy policzkowej i przeciąć nerwy oraz tkankę łączną przytwierdzoną do ściany ciała. Aby całkowicie oddzielić ten płat skóry od masy policzkowej, należy uważać, by nie przeciąć żadnych nerwów ani tkanek wewnątrzmasy policzkowej. Następnie chwycić i przytrzymać przełyk.Przetnij przełyk za punktem, który jest trzymany. Wyciągnij przełyk do góry i unieś masę jamową znad niej. Zwoje mózgowe, płucne i stopowe tworzą pierścień, w którym zwój mózgowy jest połączony ze zwojami jamowymi za pomocą łączników mózgowo-jamowych.Pozostaw te zwoje pierścieniowate przytwierdzone do masy gębowej i przetnij wszystkie nerwy biegnące z tych zwojów do innych części ciała. Następnie przetnij tkankę łączną wokół masy gębowej i kontynuuj podnoszenie masy gębowej w miarę jak będzie ona mniej związana z ciałem. Gdy masa gębowa pozostanie przytwierdzona jedynie do otworu gębowego, przytrzymaj przełyk oraz masę gębową.Wykonaj cięcie prostopadłe. Wykonaj końcowe cięcie tuż przed szczękami, aby oddzielić masę policzkową od ciała. Umieść masę policzkową w roztworze składającym się z 50% izotonicznego chlorku magnezu i 50% soli fizjologicznej SIA, aby utrzymać częściowe znieczulenie podczas mocowania elektrod.Następnie umieść masę policzkową wraz z roztworem w szalce Petriego z dnem w kształcie cygara, przecinając tętnicę policzkową na powierzchni brzusznej masy policzkowej. Następnie usuń zwoje pleuralne i pedalne, przecinając ich połączenia ze zwojem mózgowym. Pozostaw zwój mózgowy połączony ze zwojami policzkowymi i masą policzkową za pomocą CBC, a pozostałe połączenia między zwojem mózgowym a masą policzkową przetnij.Przytnij przełyk i gruczoły ślinowe do krótkich odcinków. Na tym etapie przymocuj elektrody hakowe do oka nerwu ulnarnego, dwóch mięśniowych nerwów policzkowych dwa i trzy oraz gałęzi A drugiego nerwu policzkowego. Zastosuj procedurę podobną do tej zaprezentowanej w publikacji JoVE autorstwa Collinsa i Shielda, którą krótko podsumowano w niniejszym tekście.Przy każdym oddzielaniu elektrody należy umieścić elektrodę w pobliżu nerwu lub mięśnia, umieścić docelowy nerw w haczyku i delikatnie go unieść za pomocą manipulatora. Następnie należy osuszyć odcinek nerwu za pomocą chusteczki Kimwipe. Na zahaczony nerw należy nałożyć kroplę szybko schnącego kleju super glue, upewniając się, że haczyk jest całkowicie pokryty klejem, a końcówka drutu referencyjnego nie została nim pokryta.Następnie używa się strzykawki z przymocowaną rurką polietylenową, aby nanieść roztwór z naczynia na klej, co spowoduje utwardzenie jego powierzchni. Kolejnym krokiem jest przygotowanie okrągłego naczynia rejestracyjnego Pyrex o wymiarach 100 by 50 milimetrów do wykorzystania jako komora rejestracyjna; za pomocą końcówki pipety nanosi się cienką warstwę smaru próżniowego na wycięcie między komorą mózgową a zakrzywioną, aby zminimalizować wycieki. Następnie przednią komorę wypełnia się solą fizjologiczną plescia.Ostrożnie przenieś masę policzkową z szalki Petriego do przedniej komory okrągłego naczynia Pyrex, upewniając się, że żadna z elektrod nie jest zbyt mocno naciągnięta, co mogłoby doprowadzić do przerwania nerwów. Zachowaj szczególną ostrożność przy elektrodach hakowych, jeśli naczynie musi zostać przeniesione pod inny stereomikroskop. Do pocieniania osłonki.Pogrupuj elektrody po każdej stronie masy policzkowej. Ostrożnie trzymaj elektrody, chwytając taśmę laboratoryjną zakrywającą piny złącza, i ponownie upewnij się, że żadna z elektrod nie jest mocno naciągnięta. Gdy szalka zostanie umieszczona pod mikroskopem, elektrody powinny swobodnie opadać na boki szalki i spoczywać na platformie podczas przerw oraz pomiędzy etapami eksperymentu; napowietrzaj sól fizjologiczną w komorze masy policzkowej za pomocą kamienia napowietrzającego do akwarium.Następnie przypnij zwoje mózgowe w tylnej komorze, prowadząc CBC przez wycięcie. Nałóż więcej smaru próżniowego na CBC. Następnie dodaj więcej soli fizjologicznej SIA do obu części szalki, aby zwoje były całkowicie zanurzone.Należy upewnić się, że poziom soli fizjologicznej jest niższy niż wysokość smaru próżniowego między komorą mózgową a jamową, aby zapobiec wyciekowi między komorami. Na tym etapie masa jamowa powinna spoczywać na dnie przedniej komory. Następnie należy przypiąć zwoje jamowe do środniej platformy, aby uniknąć uszkodzenia nerwów, które są wciąż przytwierdzone do masy jamowej.Umieść piny wyłącznie na osłonce pomiędzy dwoma nerwami. Następnie dodaj dwa kolejne piny po bokach CBC, aby je rozciągnąć i zakotwiczyć. Utrzymuj zwoje policzkowe płasko lub obrócone, w zależności od położenia neuronów będących przedmiotem zainteresowania.Aby obrócić zwoje policzkowe, należy za pomocą precyzyjnej pęsety chwycić nadmiar osłonki CBC i przytwierdzić ją szpilką między drugim a trzecim nerwem policzkowym. Dzięki temu widoczna stanie się większość ciał komórkowych znajdujących się w pobliżu tylnej komory, do których nie można było łatwo dotrzeć od strony górnej zwojów policzkowych. Na koniec należy umieścić dwie szpilki w osłonce zwojów policzkowych po stronie masy policzkowej.Aby zminimalizować przemieszczanie się zwoju jamowego, chwyć osłonkę zwoju jamowego w pobliżu tylnej komory i odetnij nadmiar osłonki za pomocą precyzyjnych nożyczek, nie odsłaniając ciał komórkowych. W celu zminimalizowania uszkodzeń, usuń tylko taką ilość osłonki, jaka jest niezbędna do zobaczenia ciał komórkowych po zakończeniu procesu jej ścieńczenia. Podłącz wszystkie piny elektrod do gniazd w kablach łączących je z wzmacniaczami.Należy upewnić się, że elektrody nie są zbyt mocno naciągnięte, są prawidłowo podłączone do odpowiednich kabli oraz że polaryzacja jest właściwa, aby wypłukać pozostały chlorek magnezu. Wymień sól fizjologiczną SIA w komorze z masą policzkową na świeżą sól fizjologiczną SIA. Następnie przeciągnij jedwabną nić chirurgiczną przez tkankę miękką w przedniej części masy policzkowej, grzbietowo względem chrząstki żuchwy.Użyj dwóch kawałków plasteliny, aby przymocować szew do krawędzi szalki, w ten sposób zawieszając masę policzkową z jej przedniego końca. Użyj manipulatora do przytrzymania szklanej elektrody zewnątrzkomórkowej w taki sposób, aby końcówka elektrody znajdowała się w pobliżu zwoju policzkowego. Aby zlokalizować i zidentyfikować neuron, delikatnie opuść końcówkę elektrody zewnątrzkomórkowej na osłonkę.Nad somą neuronu. Przyłożyć prąd stymulujący, a następnie przełączyć kanał używany do pobudzania somy w tryb rejestracji, aby zarejestrować aktywność na elektrodzie pozakomórkowej oraz odpowiadającą jej aktywność w nerwach w celu wywołania odrzucenia. Podobnie jak w przypadku programów motorycznych, stymulować nerw gębowy dwa A długą serią impulsów o częstotliwości 2 Hz i czasie trwania 1 ms, aby wygenerować wzorce ees.Wzorce utrzymują się przez cały czas trwania stymulacji i mogą trwać jeszcze przez krótką chwilę po jej zakończeniu. Aby wywołać programy motoryczne przypominające gryzienie, należy umieścić kilka kryształków stałego karakolu bezpośrednio na zwoju mózgowym.Wzorce repetytywne zazwyczaj rozpoczynają się w ciągu pięciu minut i trwają w przybliżeniu od 10 do 15 minut, zanim zaczną wygasać, aby wywołać połykanie. Podobnie jak w przypadku programów motorycznych, zastosuj stymulację caracol i poczekaj, aż masa gębowa zacznie generować silne ugryzienia. Następnie, podczas ugryzienia, umieść pasek wodorostów w pysku zwierzęcia w taki sposób, aby chwyciło ono wodorosty.Poniżej przedstawiono stymulację i rejestrację zidentyfikowanego neuronu ruchowego B9 oraz rejestrację z tego samego neuronu, mięśnia I2 i kilku nerwów podczas programów ruchowych karmienia. Przedstawiono również obrazy wideo pochodzące z tej samej serii programów ruchowych. Wzorce połykania wywołano poprzez aplikację karbacholu do zwoju mózgowego i późniejsze umieszczenie paska wodorostów w chwytaczu podczas indukowanego karbacholem gryzienia.Na tym obrazie ragula jest wysunięta, aby chwycić wodorosty, a na tym obrazie ragula została cofnięta, wciągając wodorosty do otworu gębowego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować zawieszoną masę gębową oraz jak uzyskać zapisy in vitro programów motorycznych żerowania.

an-vitro-preparation-for-eliciting-recording-feeding-motor-programs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przygotowanie in vitro do wywoływania i rejestrowania programów ruchowych żerowania z fizjologicznymi ruchami w Aplysia californica

Opisano technikę implantacji czterech elektrod in vivo w celu monitorowania neuromięśniowej kontroli zachowania żerowania u Aplysia californica.

Wytwarzanie i implantacja elektrod u Aplysia californica do wielokanałowych rejestracji aktywności neuronalnej i mięśniowej u nienaruszonych zwierząt w swobodnym zachowaniu

Prezentujemy sposób jednoczesnego monitorowania zmian stężenia wewnątrzkomórkowego wolnego wapnia oraz skuteczności synaptycznej w preparacie zwojowym Aplysia. Obrazujemy wapń wewnątrzkomórkowy z wykorzystaniem barwnika fluorescencyjnego Calcium Orange, a transmisję synaptyczną indukujemy i monitorujemy za pomocą elektrod ostrych (wewnątrzkomórkowych).

Monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej u mięczaka Aplysia

U zwierząt z dużymi zidentyfikowanymi neuronami (np.), analiza puli motorycznej odbywa się za pomocą technik wewnątrzkomórkowych1,2,3,4. Niedawno opracowaliśmy technikę zewnątrzkomórkowej stymulacji i zapisu pojedynczych neuronów w Aplysia californica5. Opisujemy teraz protokół wykorzystania tej techniki do unikalnej identyfikacji i scharakteryzowania neuronów ruchowych w puli motorycznej.

Zewnątrzkomórkowa identyfikacja neuronów ruchowych w puli motorycznej mięśni u Aplysia californica

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Opisujemy sekcję układu nerwowego zająca morskiego Aplysia po znieczuleniu, izolację neuronów do krótkotrwałej hodowli tkanek oraz zapisy prądów jonowych pojedynczej komórki za pomocą techniki patch clamp.

Izolacja neuronów czuciowych Aplysia californica w celu nagrań prądów glutaminergicznego za pomocą zacisków krosowych

Ślimak morski Aplysia californica był powszechnie używany jako model neurobiologiczny do badań nad komórkowymi i molekularnymi podstawami zachowania. Opisano metodologię badania układu nerwowego Aplysia do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów zidentyfikowanych obwodów neuronalnych.

Aplizja Przygotowanie zwojów nerwowych do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów

Testy behawioralne dostarczają potężnych narzędzi do zrozumienia funkcji neuronów. W tym miejscu przedstawiamy kilka protokołów ilościowego określania zachowań żywieniowych drapieżników występujących u modelowego nicienia Pristionchus pacificus i jego krewnych. Dodatkowo udostępniamy metody analizy adaptacji żywieniowych drapieżników, w tym budowy jamy ustnej i zębów.

Badanie drapieżnych zachowań żywieniowych u Pristionchus i innych nicieni

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów Ca2+ do rejestrowania zmian w aktywności neuronalnej u zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans.

Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół minimalnie inwazyjnego chirurgicznego uszkadzania mięśni nieodłącznie związanych z aparatem żywieniowym morskiego Aplysia californica, aby zrozumieć rolę tych mięśni podczas zachowania żywieniowego.

Minimalnie inwazyjna technika zmiany mięśni nieodłącznie związana z odontoforem Aplysia californica

Ten protokół przedstawia metodę obrazowania aktywności populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczej komórki u nietransgenicznych gatunków bezkręgowców przy użyciu barwników absorbancyjnych wrażliwych na napięcie i matrycy fotodiodowej. Takie podejście umożliwia szybki przepływ pracy, w którym obrazowanie i analiza mogą być realizowane w ciągu jednego dnia.

Obrazowanie optyczne oparte na fotodiodach do rejestrowania dynamiki sieci z rozdzielczością pojedynczego neuronu u bezkręgowców nietransgenicznych

Protokół ten opisuje ilościowy test defekacji u młodych mutantów RAC1/CED-10 Caenorhabditis elegans, oferując prosty model do badania stadij choroby Parkinsona prodromalnej. Przezwycięża ograniczenia innych modeli zwierzęcych i ułatwia testowanie strategii terapeutycznych skierowanych do wczesnej patologii Parkinsona.

Ocena ruchliwości przewodu pokarmowego u mutantów Caenorhabditis elegans RAC1/CED-10 jako narzędzie do badania wczesnej choroby Parkinsona

Poznaj metodę ekstracelularnego rejestrowania aktywności nerwów, mięśni i neuronów u Aplysia californica. Technika ta pozwala obserwować ruchy aparatu karmienia podczas programów motorycznych gryzienia, połykania i odrzucania.

Przygotowanie in vitro do wywoływania i rejestrowania programów motorycznych karmienia z ruchami fizjologicznymi u Aplysia californica (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie in vitro do wywoływania i rejestrowania programów motorycznych żerowania z ruchami fizjologicznymi u Aplysia californica

Przeglądaj więcej filmów