Name: Tworzenie się neowysp trzustkowych w wątrobie myszy z cukrzycą przez zależny od pomocnika transfer genów za pośrednictwem wektora adenowirusowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 59 s
Description: Poznaj metodę tworzenia neowysp trzustkowych w wątrobie myszy z cukrzycą przy użyciu wektorów adenowirusowych zależnych od pomocnika. Technika ta umożliwia odwrócenie hiperglikemii poprzez indukcję komórek beta produkujących insulinę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty z NIH: R03 DK089061-01 (VKY); NIH: K08 DK068391 (VKY); Centrum Badań nad Cukrzycą i Endokrynologią (DERC - P30DK079638) w Baylor College of Medicine, grant pilotażowy i wykonalności z DERC (VKY); Juvenile Diabetes Research Foundation: JDRF Award # 5-2006-134 (VKY).

<ol><li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helper-dependent+adenovirus+vector+system%3A+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li>
<li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li>
<li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li>
<li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li>
<li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li>
<li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+Cre%2FloxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li>
<li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li>
<li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Wektory HDAd zostały opracowane, aby wyeliminować wady wczesnych generacji Ad i wykorzystać je w zastosowaniach terapii genowej. Pozostają jednak wyzwania techniczne. Na przykład HDAd wymaga HV do pakowania, a amplifikacja wektora nie jest tak wydajna jak w przypadku wczesnych generacji Ad. HV jest wirusem Ad pierwszej generacji i jakiekolwiek zanieczyszczenie HV obniża skuteczność HDAd. Dlatego kluczowe są wysoce wydajna transfekcja oraz optymalne warunki dla każdego kolejnego pasażu. Innym krytycznym parametrem w produkcji wektora jest wybór pasażu (P1-P4), który powinien zostać użyty do następnego pasażu 5, wykorzystywanego bezpośrednio jako inokulum dla komórek w zawiesinie. Z naszego doświadczenia wynika, że najlepsze rezultaty uzyskuje się, stosując pasaż, w którym proporcja wektora HDAd gwałtownie wzrasta w kolejnym pasażu (P3 na Rysunku 2). Wydajność wektorów HDAd zależy od kaset transgenów. Podczas produkcji wektora oba transgeny są ekspresjonowane, ponieważ oba geny znajdują się pod promotorem powszechnym. Ngn3 jest czynnikiem transkrypcyjnym, a Btc czynnikiem wzrostu, co sugeruje, że wektor HDAd ekspresjonujący czynnik transkrypcyjny, który może wpływać na linię komórkową, hamuje amplifikację wektora, podczas gdy wektor ekspresjonujący hormon wzrostu wspomaga replikację i pakowanie wektora.
W obliczu epidemii cukrzycy niezbędne jest opracowanie nowych metod przywracania masy komórek $\beta$. W niniejszym raporcie opisujemy metody wykorzystania zalet wektorów HDAd w celu transferu genu czynnika transkrypcyjnego definiującego linię wyspkową, Ngn3, wraz z czynnikiem wzrostu wyspkowych komórek $\beta$, betacelluliną, aby indukować neogenezę wysepek w obszarach okołoportalnych wątroby. Aby ocenić skuteczność tego procesu, ważne jest wybranie myszy ze stabilną hiperglikemią oraz zapewnienie stałego uwzględnienia odpowiednich grup kontrolnych. W eksperymentach z transferem genów należy zawsze wykorzystywać myszy z cukrzycą traktowane pustym wektorem. Ponadto zastosowanie myszy z cukrzycą traktowanych oddzielnie HDAd-Ngn3 i HDAd-Btc pozwala przetestować indywidualny wkład tych dwóch genów w neogenezę wysepek. Nasze dane wykazują, że sam Ngn3 jest wystarczający do indukcji neogenezy wysepek, jednak dodatek czynnika wzrostu Btc potęguje odpowiedź, prowadząc do silnej indukcji neogenezy wysepek. Ważne jest również potwierdzenie, że ekspresja wektora została rzeczywiście osiągnięta w tkance docelowej, czyli w wątrobie, a także wykazanie, że insulina oznaczona w osoczu traktowanych myszy nie pochodzi z resztkowych wysepek w trzustce, poprzez udowodnienie braku wysepek trzustkowych u myszy z cukrzycą.
Podsumowując, zaleta systemu wektorów HDAd w transferze genów polega na wysokiej pojemności klonowania, wydajnej transdukcji i długotrwałej ekspresji genów w wątrobie przy minimalnej toksyczności przewlekłej, a także na braku integracji genomu wektora z chromosomem gospodarza. Głównymi ograniczeniami są złożone etapy jego generowania, a zastosowania in vivo ograniczają się przede wszystkim do wątroby przy użyciu najpopularniejszego serotypu Ad 5. Neogeneza wysepek, prowadząca do pełnego przywrócenia poziomu insuliny w osoczu i tolerancji glukozy u myszy z cukrzycą, może zostać wywołana w wątrobie poprzez transfer genów czynnika transkrypcyjnego definiującego linię wysepek, Ngn3, wraz z czynnikiem wzrostu wysepek, betacelluliną. W niniejszym raporcie przedstawiamy optymalny protokół generowania wysokiej jakości HDAd-Ngn3 oraz HDAd-Btc i prezentujemy techniki indukcji oraz oceny neogenezy wysepek w wątrobach myszy z cukrzycą w celu odwrócenia hiperglikemii.
Przypis: Wektory wirusowe oraz linie komórkowe opisane w niniejszym materiale są dostępne w Vector Production Core Laboratory, Diabetes Research Center, Baylor College of Medicine (<a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a>). Dostępne są również niektóre komercyjne zestawy do generowania wirusów HDAd (np. Microbix biosystems Inc.).

<table><tbody><tr><td>zestaw do transfekcji komórek ssaków ProFectionR</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp;zestaw do izolacji tkanek (50)</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR Green SuperMix, ROX</td><td>Quanta Biosciences</td><td>95055-500</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma</td><td>D6750-25G</td><td></td></tr><tr><td>proszek MEM</td><td>Invitrogen</td><td>61100087</td><td></td></tr><tr><td>penicylina streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>Sigma</td><td>H0654-1G</td><td></td></tr><tr><td>MEM EAGLE JOKLIK</td><td>Sigma</td><td>M0518-10L</td><td></td></tr><tr><td>RNaza</td><td>Roche</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I, stopień II</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Streptozotocyna</td><td>Sigma</td><td>s0130</td><td></td></tr><tr><td>Szklane kolby z mieszadłem</td><td>Corning</td><td>4500-3L</td><td></td></tr><tr><td>Szklane kolby z mieszadłem (spinner flasks)</td><td>Corning</td><td>4500-250</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta Slide A-lyzer</td><td>PIERCE CH</td><td>PI66380</td><td></td></tr><tr><td>Probówka Optiseal polyallomer, 11,2 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>362181</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek cezu 1 kg</td><td>JT4042-2</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LE-80K</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optymalna ultrawirówka LE-80K</td><td></td></tr><tr><td>Filtruj</td><td>VWR</td><td>28143-338</td><td></td></tr><tr><td>probówka wirówkowa 500 ml</td><td>Corning</td><td>431123</td><td></td></tr><tr><td>stabilizator do iniekcji dożylnych w ogon</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>tv-150</td><td></td></tr><tr><td>ELISA insuliny, mysz</td><td>Mercodia</td><td>10-1247-01</td><td></td></tr><tr><td>microvette CB300</td><td>Sarstedt</td><td>16.443.100</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ELISA do oznaczania C-peptydu mysiego</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>#631-07231</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało przeciwinsulinowe świnki morskiej</td><td>Abcam</td><td>ab7842</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało kozie przeciwko Pdx1</td><td>prezent od dr. Christophera Wrighta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało mysie przeciwko Ngn3</td><td>Konsorcjum Biologii Komórek Beta,&lt;br/&gt; Uniwersytet Pensylwanii</td><td>AB2013</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało mysie przeciwko Nkx6.1</td><td>Beta Cell Biology Consortium,&lt;br/&gt; Uniwersytet Pensylwanii</td><td>F64A6B4</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało przeciwko betacellulinie</td><td>Nauki o komórkach</td><td>PAAQ1</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników kolorystycznych ALT (SGPT).</td><td>Teco Diagnostics</td><td>A526 - 120</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników do oznaczeń końcowych kolorymetrycznych AST/(SGOT)</td><td>Teco Diagnostics</td><td>A561-120</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 2. &lt;/strong&gt; Specyficzne odczynniki i sprzęt.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

tworzenie neo-wysepek w wątrobie myszy z cukrzycą za pomocą transferu genów za pośrednictwem adenowirusowego wektora zależnego od pomocnika

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Cukrzyca typu 1 jest spowodowana autoimmunologicznym zniszczeniem komórek produkujących insulinę w trzustce, zapośredniczonym przez limfocyty T. Do chwili obecnej podstawową terapią pozostaje zastępcza podaż insuliny, ponieważ transplantacja wysepek była ograniczona dostępnością dawców oraz koniecznością długotrwałej immunosupresji. Indukowana neogeneza wysepek poprzez transfer genów Neurogeniny 3 (Ngn3), specyficznego czynnika transkrypcyjnego definiującego linię wysepek, oraz Betacelluliny (Btc), czynnika wzrostu wysepek, ma potencjał do wyleczenia cukrzycy typu 1.
Wektory adenowirusowe (Ads) są wysoce wydajnymi wektorami do transferu genów; jednak wczesne generacje Ads wykazują szereg wad w zastosowaniach in vivo. Wektory HDAds (helper-dependent Ads) to najbardziej zaawansowane wektory Ad, opracowane w celu poprawy profilu bezpieczeństwa wczesnych generacji Ads oraz przedłużenia ekspresji transgenu1. Charakteryzują się one brakiem toksyczności przewlekłej, ponieważ nie zawierają wirusowych sekwencji kodujących2-5, a zachowują jedynie elementy cis Ad niezbędne do replikacji i pakowania wektora. Pozwala to na klonowanie genów o wielkości do 36 kb.
W niniejszym protokole opisujemy metodę generowania HDAd-Ngn3 i HDAd-Btc oraz wprowadzania tych wektorów do myszy z cukrzycą indukowaną STZ. Nasze wyniki pokazują, że jednoczesna iniekcja HDAd-Ngn3 i HDAd-Btc indukuje powstawanie „neo-wysepek” w wątrobie i odwraca hiperglikemię u myszy z cukrzycą.

Opisujemy tworzenie wątrobowych neo-wysepek u myszy z cukrzycą indukowaną STZ (streptozotocyną) poprzez transfer genów Neurogenin3 (Ngn3) i Betacellulin (Btc) z wykorzystaniem zależnego od helpera wektora adenowirusowego (HDAd) oraz odwrócenie hiperglikemii. Nasza metoda wykorzystuje zależne od helpera wektory adenowirusowe, które charakteryzują się wysoką wydajnością transdukcji in vivo oraz długotrwałą ekspresją genów.

Tworzenie neo-wysepek w wątrobie myszy z cukrzycą za pomocą transferu genów za pośrednictwem adenowirusowego wektora zależnego od pomocnika

Cukrzyca typu 1 jest spowodowana autoimmunologicznym zniszczeniem komórek produkujących insulinę w trzustce, zapośredniczonym przez limfocyty T. Do chwili obecnej substytucja insuliny pozostaje wciąż...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest indukcja neo-wysepek w wątrobie myszy z cukrzycą za pomocą transferu genów za pośrednictwem pomocniczo-zależnych wektorów adenowirusowych. Jest to realizowane poprzez wytworzenie pomocniczo-zależnych wektorów adenowirusowych niosących gen czynnika transkrypcyjnego wysepek neurogen 3 oraz gen czynnika wzrostu wysepek betalina, aby indukować tworzenie okołowrotnych neo-wysepek w wątrobie; wektory te są wstrzykiwane myszom z cukrzycą. Następnie u leczonych myszy z cukrzycą bada się normalizację poziomu glukozy we krwi, insuliny w osoczu oraz obecność produkujących insulinę komórek beta w wątrobie.Wyniki tych analiz wykazują, że hiperglikemia zostaje cofnięta u myszy traktowanych wektorem w wyniku tworzenia się nowych wysepek w obszarach okołowrotnych wątroby. Zaletą wektora adenowirusowego zależnego od HSV jest szeroki tropizm oraz wysoka pojemność pakowania. Ponadto wektor adenowirusowy zależny od HSV nie zawiera żadnych regionów kodujących adenowirusa.Dlatego też nie wykazuje ona toksyczności przewlekłej. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię cukrzycy, ponieważ indukcja nowych wysepek jest skuteczną alternatywą dla transplantacji wysepek, która jest ograniczona brakiem dawców, odrzuceniem przeszczepu oraz alloimmunnością. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą będą napotykać trudności, gdyż proces transfekcji jest utrudniony ze względu na duży rozmiar klasy wektora.Aby zminimalizować ryzyko kontaminacji wirusem pomocniczym, proces amplifikacji i oczyszczania musi być przeprowadzany z należytą starannością. Produkcja wektora adenowirusowego zależnego od wirusa pomocniczego obejmuje wiele etapów, których należy ściśle przestrzegać w celu uzyskania optymalnych wyników. W ramach przygotowania do transfekcji, wysiej 800 000 komórek 293 do każdej z dwóch szalek o średnicy 6 cm.Inkubować w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2. Po dwóch dniach komórki osiągną 70 do 80% konfluencji, co jest odpowiednie do transfekcji. W dniu transfekcji.Wymień pożywkę wzrostową na 5 mL świeżej pożywki i inkubuj komórki przez 3 godziny. Następnie, używając zestawu do transfekcji ssaczych Pro Perfection Arm firmy Promega Transfect, przeprowadź transfekcję komórek 16 z zastosowaniem 10 µg DNA kodującego gen neuro w trzech, zwanym w dalszej części tekstu three, lub komórek beta, zwanych w dalszej części tekstu BTC. Następnego dnia przemyj komórki dwukrotnie, używając za każdym razem 1 mL pożywki wzrostowej.Dodać wirus pomocniczy w ilości 500 cząsteczek wektora na komórkę w 0,1 mililitra PBS z wapniem i magnezem. Następnie umieścić komórki w inkubatorze i powtarzać tę czynność co 10 minut. Delikatnie kołysać naczyniami, aby równomiernie rozprowadzić wirus pomocniczy.Po 60 minutach należy dodać 1,5 milliliters pożywki podtrzymującej i zwrócić szalki do inkubatora na 24 godziny. Następnego dnia należy dodać kolejny jeden milliliter pożywki podtrzymującej. Następnie, używając standardowego mikroskopu świetlnego, należy zbadać komórki w celu oceny efektów cytopatycznych.Zakażone komórki zaokrąglą się i odkleją. Kontynuuj inkubację zakażonych komórek do drugiego dnia. W tym punkcie ponad 80% komórek powinno wykazywać efekt cytopatyczny.Zebrać surowy lizat wirusowy poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieść go do probówki o pojemności pięciu mililitrów z surowym lizatem wirusowym. Dodać 10% objętości 40% sacharozy. Oznaczyć tę probówkę jako CVL (surowy lizat wirusowy, pasaż zero) w celu lizy.Aby uwolnić cząstki wirusowe, zamroź i rozmroź probówkę zawierającą surowy lizat wirusowy trzy razy, naprzemiennie umieszczając ją w zamrażarce o temperaturze -80°C oraz w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C. Po trzecim cyklu zamrażania i rozmrażania wykorzystaj medium do dalszej amplifikacji wektora zgodnie z opisem w towarzyszącym tekście. Proces amplifikacji wektora pozwoli na uzyskanie surowego lizatu wirusowego z piątego pasażu (P5) wektora.W celu wielkoskalowej produkcji adenowirusów zależnych od helpera należy rozpocząć od trzykrotnego zamrożenia i rozmrożenia P5 z procedury amplifikacji wektora, postępując analogicznie jak podczas wcześniejszego procesu zamrażania i rozmrażania. Przenieść 1 16 komórek z 3-litrowej kolby do inkubatora z mieszadłem (spinner flask) do 500-mililitrowych butelek stożkowych i odwirować je przy 1000 ×g przez 5 minut. Po wirowaniu usunąć cały nadsącz, pozostawiając jedynie 100 ml.Następnie resuspenduj komórki i przenieś je do kolby z mieszadłem o pojemności 250 ml. Dodaj cały surowy lizat wirusowy P5. Następnie dodaj wirus pomocniczy w ilości 200 cząstek wirusowych na komórkę i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C przy 60 RPM.Po inkubacji przenieś jeden mililitr zawiesiny komórek do dołka płytki 12-dołkowej, a resztę zawiesiny komórek przelej do nowej trylitrowej kolby z mieszadłem i dodaj dwa litry pożywki wzrostowej w zawiesinie. Inkubuj kolbę oraz płytkę przez dwa dni w inkubatorze z dwutlenkiem węgla przy 60 RPM; w ciągu kolejnych dwóch dni monitoruj komórki na płytce pod kątem efektu cytopatycznego.Jeśli komórki na płytce wykazują efekt cytopatyczny, komórki w kolbie z mieszadłem również wykazują efekt cytopatyczny. Po inkubacji zebrać komórki poprzez wirowanie i resuspender w 15 mililitrach 100 milimolarnego TRIS-HCl w probówce o pojemności 50 mililitrów z etykietą P6.Przechowywać tę probówkę w temperaturze -80 °C do czasu oczyszczania. Aby oczyścić wektor, dodać 1 mL 5% sodium deoxy coate do rozmrożonej probówki zawierającej surowy lizat wirusowy P six. Delikatnie wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie należy dodać chlorek magnezu, RNazę A oraz DNazę I i inkubować w temperaturze 37°C przez jedną godzinę. Po inkubacji probówkę wirujemy przy 6 000 ×g przez 10 minut. Po wirowaniu supernatant przenosi się do nowej sterylnej probówki do ultrawirowania NVT 65 o pojemności 50 ml. Należy dodać 2,8 ml roztworu chlorku cezu o niskiej gęstości (1,25 g/ml).Następnie, używając pipety o objętości 2 ml, nanieś 2,8 ml roztworu chlorku CM o wysokiej gęstości (1,41 g/ml) do probówki, dotykając pipetą dna probówki i powoli dozując roztwór. Następnie, używając pipety o objętości 2 ml, nanieś na wierzch od 5 do 6 ml supernatantu. Dotykając ścianki bocznej probówki i powoli dozując roztwór, należy wypełnić probówkę aż do szyjki.W przeciwnym razie może on ulec zapadnięciu podczas wirowania przy wysokich prędkościach. W razie potrzeby należy dopełnić probówkę 100 mM Tris-HCl. Następnie wirować w temperaturze 10 °C przez 30 minut przy 237 000 ×g w temperaturze 10 °C.Po ultrawirowaniu w gradiencie gęstości, poniżej nieprzezroczystych resztek komórkowych widoczny jest pojedynczy opalizujący prążek wektora. Czasami poniżej wyraźniejszego prążka wektora może być widoczny bardzo słaby prążek pomocniczy. Przetrzyj probówkę w miejscu dolnego opalizującego prążka 70% etanolem.Następnie, używając strzykawki o pojemności 3 ml wyposażonej w igłę 22 G, nakłuj ściankę probówki u podstawy prążka wektora i pobierz dolny, opalizujący prążek. Przenieś pobrany materiał wektora do nowych, wysterylizowanych probówek do ultrawirówki, a następnie nałóż roztwór gęstościowy chlorku cezu o stężeniu 1,35 g/ml, aby wypełnić probówki do szyjki.Wiruj w temperaturze 10 °C przy 237 000 ×g przez noc. Po drugim gradientowym wirowaniu w ultrawirówce zbierz opalescencyjny prążek w ten sam sposób co wcześniej. Przenieś prążek do kasety dializacyjnej i dializuj przeciwko trzem litrom sterylnego buforu T tris, HCL zawierającego chlorek magnezu i sacharozę w temperaturze 4 °C przez noc następnego dnia.Aby usunąć wektor adenowirusowy zależny od pomocnika z kasety dializacyjnej, należy użyć strzykawki o pojemności 3 ml, aby wstrzyknąć 2 ml powietrza do kasety przez górny róg. Obróć kasetę tak, aby strzykawka z igłą znajdowały się w dolnym rogu, a następnie, trzymając kasetę w pozycji pionowej, odessaj roztwór do strzykawki. Przenieś roztwór zawierający oczyszczony wirus do oznakowanych probówek kriogenicznych.Przenieś 20 µL na oznaczenie miana fizycznego oraz 50 µL do charakterystyki DNA do probótek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, a następnie zamroź. Probótki kriogeniczne zawierają oczyszczony wirus w temperaturze -80 °C. Oczyszczony wirus należy następnie poddać ocenie pod kątem czystości miana oraz skuteczności in vitro.Zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie, streptozotocyna jest stosowana w celu indukcji cukrzycy. W niniejszym badaniu, zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie, należy raz w tygodniu monitorować poziom hiperglikemii u myszy kontrolnych oraz leczonych. Gdy poziom glukozy we krwi utrzymuje się w zakresie od 250 do 500 mg/dL przez 48 h, należy umieścić myszy w stabilizatorze do żyły ogonowej w celu wykonania iniekcji dożylnej w ogon.Umieść ogon w probówce o pojemności 50 ml zawierającej ciepłą wodę, aby rozszerzyć żyły ogonowe. Następnie przemyj ogon chusteczką nasączoną 70% etanolem. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 30,5 odpowiednim stężeniem wektora, upewniając się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza.Następnie kciukiem i palcem wskazującym uchwyć ogon poniżej miejsca wstrzyknięcia i wprowadź igłę do żyły ogonowej. Jeśli igła znajduje się w naczyniu, w nasadzie igły może pojawić się kropla krwi. Powoli wstrzyknij wektor.Jeśli igła została umieszczona prawidłowo, podczas wstrzykiwania nie zostanie odczuty opór. Należy usunąć igłę i przycisnąć miejsce wstrzyknięcia gazikiem, aby zatamować krwawienie przed umieszczeniem myszy z powrotem w klatce. Po podaniu wektora należy co tydzień kontrolować poziom glukozy na czczo (po sześciu godzinach) oraz masę ciała, a co dwa tygodnie monitorować poziom insuliny i enzymów wątrobowych.Przeprowadź test tolerancji glukozy w szóstym tygodniu po leczeniu, aby sprawdzić, czy sekrecja insuliny stymulowana glukozą została przywrócona in vivo w trzecim i szóstym tygodniu po terapii. Pobierz wątrobę i trzustkę od myszy w celu analizy MNA tkanek oraz barwienia immunocytochemicznego, aby ocenić, czy w wątrobie myszy z cukrzycą można indukować neogenezę wysepek za pomocą transferu genów za pośrednictwem wektora adenowirusowego. Wektory adenowirusowe zależne od pomocniczych (helper-dependent adenovirus) H-D-A-D-N-G-N 3 oraz BTC zostały przygotowane i oczyszczone zgodnie z opisem w tym filmie, a następnie podano je myszom z cukrzycą indukowaną streptozotocyną poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej.W roli kontroli negatywnych posłużyły puste wektory oraz same wektory H-D-A-D-B-T-C. Poziom glukozy we krwi monitorowano następnie co dwa dni przez okres od siedmiu do 10 dni po iniekcji. Hiperglikemia ustąpiła u myszy, którym wstrzyknięto zarówno HDAD i GN three, jak i H-D-A-D-B-T-C, natomiast nie zaobserwowano tego efektu u myszy kontrolnych.Wydzielanie insuliny stymulowane glukozą monitorowano również za pomocą testu tolerancji glukozy przeprowadzonego sześć tygodni po leczeniu, co przedstawiono tutaj. Wydzielanie insuliny zostało przywrócone u myszy, którym wstrzyknięto zarówno HDAD i GN three, jak i H-D-A-D-B-T-C, aby ocenić, czy insulina była syntetyzowana w wątrobie. Oznaczono zawartość C-peptydu i insuliny w wątrobie.Stężenia C-peptydu oraz całkowita zawartość insuliny zostały zmierzone przy użyciu komercyjnego zestawu ELISA. Obecność peptydu i insuliny w stosunkach molowych potwierdza, że insulina wykrywana w wątrobie jest rzeczywiście syntetyzowana w wątrobie. Immunohistochemia wykazała obecność komórek pozytywnych w wątrobie myszy traktowanych HDAD, NGN three i H-D-A-D-B-T-C, lecz nie w myszach traktowanych wektorem kontrolnym; barwienie immunologiczne wykazało również brak pozostałości wysepek w trzustkach myszy traktowanych NGN three BTC.Ekspresję czynników transkrypcyjnych specyficznych dla linii powiek oceniono również poprzez barwienie immunocytochemiczne wątroby. Jak pokazano tutaj, NGN three wykazano w wątrobie myszy traktowanych NGN three BTC, ale nie w myszach traktowanych pustym wektorem.Podobnie, BTC wykazano na wyższym poziomie w wątrobie myszy traktowanych NGN three BTC w porównaniu do poziomu obserwowanego przy traktowaniu pustym wektorem, co pokazano tutaj. Barwienie immunohistochemiczne P DX one ujawniło lokalizację jądrową w wątrobach myszy traktowanych NGN three BTC, czego nie zaobserwowano w wątrobach myszy traktowanych pustym wektorem. NK X 6.1 wykryto również wyłącznie w pobranych wątrobach myszy traktowanych NGN three BTC.Wspólnie wyniki te sugerują pomyślną indukcję tworzenia się nowej powieki w wątrobie myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak generować zależne od pomocniczych wektory adenowirusowe w celu transferu genów determinujących linię powieki do wątroby w celu indukowania neogenezy powieki. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu trzech tygodni, jeśli jest prowadzona prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że wirus pomocniczy jest avirem pierwszej generacji, który nam pomaga. W przypadku zastosowań in vivo należy zminimalizować ryzyko kontaminacji.

neo-islet-formation-liver-diabetic-mice-helper-dependent-adenoviral

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Tworzenie neo-wysepek w wątrobie myszy z cukrzycą przez transfer genu z otoczenia adenowirusowego uzależnionego od pomocnika

Przeszczepianie wyizolowanych wysepek zostało zaproponowane jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu 1. W niniejszym materiale opisujemy metodę izolacji wysepek z trzustek myszy oraz ich transplantacji do przestrzeni podtorebkowej nerki.

Metoda izolacji wysepek mysich i przeszczepiania podtorebkowego do nerki

Niniejszy protokół umożliwia identyfikację czynników modulujących funkcjonalną masę komórek beta w celu znalezienia potencjalnych celów terapeutycznych w leczeniu cukrzycy. Protokół składa się z usprawnionej metody oceny replikacji wysepek oraz funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach szczura po manipulacji ekspresją genów za pomocą adenowirusów.

Ocena replikacji i funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach gryzoni poddanych transdukcji adenowirusowej

Zapewniamy powtarzalną metodę wywoływania cukrzycy typu 1 (T1D) u myszy w ciągu dwóch tygodni poprzez adopcyjny transfer pierwotnych limfocytów T CD4+ specyficznych dla antygenu wysp trzustkowych.

Przyspieszona indukcja cukrzycy typu 1 u myszy przez adoptywny transfer cukrzycowych limfocytów T CD4 +

Prezentujemy tutaj protokół izolacji wysp trzustkowych z mysiego modelu cukrzycy typu 2, Leprdb oraz szczegóły testu żywych komórek do pomiaru wydzielania insuliny z nienaruszonych wysp trzustkowych, który wykorzystuje mikroskopię 2-fotonową.

Mysi model cukrzycy typu 2 Leprdb: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych

Ten protokół demonstruje izolację mysich wysepek i zasiewanie ich na rusztowaniu zdecelularycznym. Wyspy trzustkowe wsparte na rusztowaniach przeszczepiono do poduszeczki tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ). Wyspy trzustkowe przetrwały w miejscu przeszczepu i odwróciły stan hiperglikemii.

Wspomagany rusztowaniem przeszczep wysp trzustkowych w poduszce tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą

Wprowadzono metodę przeszczepiania wysp trzustkowych u myszy. Wyizolowane wysepki miesza się z hydrożelem, a mieszaninę umieszcza się w woreczku omentalnym myszy z cukrzycą. Następnie monitorowany jest poziom glukozy we krwi i wykonywana jest analiza immunohistochemiczna.

Metoda przeszczepu wysp trzustkowych do sieci u myszy

Tutaj prezentujemy protokół modulacji ekspresji transgenu za pomocą przełącznika pojedynczego genu pEUI(+) przez leczenie tebufenozydem.

Przełącznik pojedynczego genu oparty na receptorze ekdyzonu do celowej ekspresji transgenu z solidnością, odwracalnością i znikomą nieszczelnością

Przeszczep wysp trzustkowych jest sposobem na osiągnięcie normoglikemii w cukrzycy typu 1. Ten artykuł koncentruje się na technice przeszczepiania drogą wewnątrzwrotną w celu utrzymania prawidłowego poziomu glukozy u myszy z cukrzycą.

Wewnątrzportalowy przeszczep wysp trzustkowych w modelu mysim

Przedstawiono protokół tworzenia zmodyfikowanych genowo ludzkich pseudowysp trzustkowych z rozproszonych ludzkich komórek wysp trzustkowych, które są transdukowane przez lentiwirusa niosącego krótkie RNA spinki do włosów (shRNA). Protokół ten wykorzystuje łatwo dostępne naczynia enzymatyczne i hodowlane, może być łatwo wykonywany i wytwarza genetycznie zmodyfikowane ludzkie pseudowysepki odpowiednie do badań funkcjonalnych i morfologicznych.

Wyciszanie genów za pośrednictwem lentiwirusa w ludzkiej pseudowysepce przygotowanej na płytkach o niskim przyłączeniu

Ten protokół opisuje prostą i minimalnie inwazyjną metodę przeszczepiania i obrazowania komórek NIT-1 u myszy z nieotyłym cukrzycą (NOD) z ciężkim niedoborem odporności, którym podano splenocyty oczyszczone z myszy NOD z spontaniczną cukrzycą.

Bioluminescencyjne monitorowanie przeżywalności przeszczepu w adoptywnym modelu transferowym cukrzycy autoimmunologicznej u myszy

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Poznaj metodę tworzenia neowysp trzustkowych w wątrobie myszy z cukrzycą przy użyciu wektorów adenowirusowych zależnych od pomocnika. Technika ta umożliwia odwrócenie hiperglikemii poprzez indukcję komórek beta produkujących insulinę.

Tworzenie się neowysp trzustkowych w wątrobie myszy z cukrzycą przez zależny od pomocnika transfer genów za pośrednictwem wektora adenowirusowego (Wideo) | JoVE Journal

Tworzenie neo-wysepek w wątrobie myszy z cukrzycą za pomocą transferu genów za pośrednictwem adenowirusowego wektora zależnego od pomocnika

Przeglądaj więcej filmów