Izolacja pierwotnych komórek nabłonkowych pęcherzyków płucnych typu II myszy metodą cytometrii przepływowej do badań funkcjonalnych i molekularnych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja czystych i żywotnych pierwotnych komórek nabłonka pęcherzykowego typu II dla późniejszych analiz funkcjonalnych i molekularnych. Najpierw do płuc i tchawicy uśmierconej myszy wprowadza się roztwór DYS, a następnie agarozę. Po tym, jak dyspaza przetrawi tkankę płucną, płuca zostają usunięte.

Tkankę rozdrabnia się ręcznie. Otrzymaną zawiesinę filtruje się przez szereg sit o malejącej wielkości oczek. Następnie, za pomocą cytometrii przepływowej i selekcji negatywnej, izoluje się komórki nabłonka pęcherzykowego typu II oraz komórki barwnikowe.

Ostatecznie wyizolowane komórki nabłonka pęcherzykowego typu dwa mogą zostać wykorzystane do przeprowadzenia analiz funkcjonalnych i molekularnych w celu zbadania ich roli w infekcjach dróg oddechowych oraz w przebiegu chorób autoimmunologicznych. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii płuc, szczególnie w kontekście chorób płuc o podłożu autoimmunologicznym oraz infekcji wirusowych. Wizualna prezentacja tej metody jest niezbędna, ponieważ przygotowanie organu oraz zawiesiny komórkowej są trudne do opanowania.

Ogólny sukces tego protokołu zależy od kilku istotnych szczegółów podczas tych etapów. Dla każdej myszy biorącej udział w eksperymencie należy wstępnie ogrzać probówkę o pojemności 15 ml zawierającą 4 ml buforu DYS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Małe aliquoty 1% niskomeltowej agarozy w wodzie należy umieścić w bloku grzejnym o temperaturze 95 °C aż do upłynnienia. Następnie należy je schłodzić do 45 °C i utrzymywać w tej temperaturze do momentu użycia w kolejnym kroku.

Aby przygotować płuco myszy, należy uśmiercić mysz poprzez uduszenie CO2. Następnie należy wykonać długie cięcie wzdłuż brzusznej linii środkowej ciała.

Następnie odciągnij skórę z brzusznej strony, a następnie ostrożnie przetnij i usuń otrzewną. Po upuszczeniu krwi z myszy ostrożnie przebij i usuń przeponę, a następnie odetnij żebra. Aby odsłonić serce i płuco, należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić płuca, używając kaniuli 26G oraz strzykawki 10 ml wypełnionej zimnym roztworem.

Nakłuć prawą komorę serca i przepłukać płuca PBS, aż do całkowitego usunięcia krwi. Odciąć i usunąć gruczoły ślinowe, aby odsłonić tchawicę. Następnie ostrożnie odciąć mięśnie otaczające tchawicę.

Następnie wprowadź do tchawicy kaniulę do zewnątrzwszechwłasową o rozmiarze 22 G. Wyjmij igłę i przesuń plastikowy cewnik w kierunku płuca. Przymocuj cewnik, zawiązując wokół tchawicy i cewnika mały kawałek sznurka.

W razie potrzeby należy przygotować próbkę płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, przepłukując płuca za pomocą cewnika wprowadzonego do tchawicy przy użyciu PBS lub pożywki. Płyn z płukania należy przechowywać w lodzie do czasu dalszej analizy. Najtrudniejszym elementem tej procedury jest trawienie i dezintegracja tkanki.

Aby zapewnić powodzenie tego protokołu, należy dopilnować, aby płuco w wszystkich płatach zostało całkowicie wypełnione roztworem dispa, również po trawieniu tkanki. Należy rozbić tkankę, używając ostrożnie strzykawki o pojemności 2 mL, wstrzykując maksymalną objętość 2 mL wcześniej przygotowanego roztworu dispa do płuca przez cewnik, tak aby wszystkie płaty były w pełni rozprężone. Następnie należy wymienić strzykawkę na strzykawkę o pojemności 1 mL zawierającą 0,5 mL upłynnionego aros i wprowadzić jej zawartość do płuca.

Pozostaw strzykawkę na cewniku, aby zapobiec cofaniu się aerogelu, a następnie natychmiast przykryj płuco chusteczką laboratoryjną i lodem. Pozostaw aerogel na kilka minut. Usuń chusteczkę, lód, strzykawkę oraz cewnik.

Następnie przetnij tchawicę i wyciśnij płuca, serce oraz grasicę z klatki piersiowej. Przepłucz przygotowane organy w naczyniu za pomocą PBS. Następnie oddziel od płuc serce, grasicę i pozostałą część tchawicy, a następnie je usuń.

Umieść płuco w probówce zawierającej pozostałe 2 mL roztworu blokującego i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Inkubacja ta służy zapewnieniu efektywnego blokowania receptorów FC komórek fagocytujących przed procedurą barwienia. Przenieś płuco z roztworu blokującego do naczynia zawierającego 7 mL przeciwciała anty-CD163 w stężeniu 1 µg/mL oraz 100 µL DNase w DMEM; za pomocą dwóch par pęset całkowicie rozdrabniaj tkankę płucną, rozrywając ją.

Następnie inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce ustawionej na 200 RPM, jeśli jest to wskazane. Zawiesinę komórkową można następnie przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do następnego etapu. Przenieść zawiesinę komórkową pipetą przez serię sit nylonowych.

Najpierw przelać zawiesinę przez filtr o rozmiarze oczek 100 µm umieszczony na probówce o pojemności 50 ml. W przypadku łączenia próbek, zawiesiny komórkowe od myszy z tej samej grupy należy przepuścić przez ten sam filtr. Jeśli filtr się zapcha, należy wymienić go na nowy.

Powtórz ten proces, używając filtra z siatką o oczkach 70 µm. Należy dokładnie wypłukać każdą siatkę, a także probówki i naczynia za pomocą DMEM, aby zminimalizować utratę komórek i zmaksymalizować wydajność. Następnie przeciągnij zawiesinę przez filtr z siatką o oczkach 48 µm rozpiętą na plastikowym lub szklanym pierścieniu, jak pokazano tutaj.

Zbierz frakcję przepływową do szalki Petriego. Następnie powtórz ten proces, używając sita o oczkach 30 µm. W zależności od objętości przenieś filtrat do jednej lub kilku probówek o pojemności 50 ml i wiruj przez 15 minut przy 160 ×g w temperaturze 4 °C.

Po wirowaniu odpiąć nadosad i zawiesić osad komórkowy w 2 ml buforu do lizy erytrocytów. Następnie szybko przerwać lizę poprzez dodanie 13 ml pożywki DMEM. Przenieść roztwór do probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 12 minut przy 160 ×g i 4 °C.

Komórki inkubowano w 3 mL koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych zawierającego przeciwciała przeciwko CD 11 C, CD 11 BF, F4/80, CD 19, CD 163 i CD 45. Komórki inkubowano przez 10 minut w ciemności w temperaturze 4 °C lub na lodzie. Po inkubacji komórki przemyto, dopełniając probówkę medium DMEM, a następnie odwirowano przez 12 minut przy 160 ×g w temperaturze 4 °C.

Resuspenduj komórki w 1 ml DMEM i przefiltruj wstępnie przez filtr 50 µm do probówki przeznaczonej do sortowania komórek. Policz komórki, aby określić całkowitą liczbę komórek w zawiesinie płucnej. Do sortowania EC2 bezpośrednio przed rozpoczęciem procedury użyj dyszy 100 µm.

Wymieszać zawiesinę komórek, stosując wortexowanie. Ciśnienie płynu, długość fali emisji lasera oraz długość fali detekcji zależą od urządzenia użytego do sortowania komórek metodą cytometrii przepływowej, a także od fluorochromów zastosowanych w procedurze barwienia przeciwciałami. W pierwszej kolejności należy utworzyć wykres rozrzutu bocznego (SSC) względem fluorescencji i wyznaczyć bramkę dla wszystkich komórek o wysokim rozproszeniu bocznym, które są negatywne pod kątem fluorochromów użytych do barwienia.

Następnie wygeneruj wykresy powierzchni rozproszenia bocznego (SSC-A) względem powierzchni rozproszenia przedniego (FSC-A), wysokości rozproszenia przedniego (FSC-H) względem powierzchni rozproszenia przedniego (FSC-A) oraz wysokości rozproszenia bocznego (SSC-H) względem powierzchni rozproszenia bocznego (SSC-A), a następnie ustaw bramki w celu wykluczenia dubletów lub agregatów komórkowych, kierując sortowane komórki do probówki zawierającej DMEM. Podczas sortowania zawiesin komórek płuc izolowanych od zdrowych myszy, bramka EC2 zazwyczaj obejmuje około 42 ± 10% wszystkich zdarzeń. Aby zebrać posortowane komórki, wiruj je przez 20 minut przy 280 ×g i 4 °C.

Resuspenduj pęcherzykowe komórki nabłonkowe typu drugiego (AEC2) w pożywce hodowlanej lub buforze, zgodnie z wymogami dla kolejnych analiz. Pierwotne mysie pęcherzykowe komórki nabłonkowe typu drugiego zostały wyizolowane metodą negatywnej selekcji z użyciem cytometrii przepływowej, zgodnie z opisem w tym filmie; analiza posortowanych komórek została przedstawiona tutaj, jak wskazano.

Czystość wyizolowanych komórek wynosi około 92 ± 5%. Komórki A EC2 uzyskane po sortowaniu zostały poddane barwieniu na białko surfaktantu C; po lewej stronie przedstawiono obraz w kontraście fazowym, a po prawej immunofluorescencję. Stwierdzono, że prawie 100% komórek było pozytywnych pod kątem białka surfaktantu C, co potwierdziło pomyślną izolację czystej populacji. Aby ocenić efekty infekcji wirusem grypy A in vivo, komórki A EC2 wyizolowano z myszy C 57 BL six, którym donosowo podano albo roztwór soli fizjologicznej (PBS), albo wirusa grypy A PR eight A 34 jeden, dwa lub trzy dni wcześniej.

Wykresy te przedstawiają zawiesiny komórek płuc pobranych od niezakażonych oraz zakażonych od trzech dni samców myszy C 57 black six, barwionych w celu sortowania ze względu na rekrutację komórek odpornościowych do zakażonego płuca. Udział komórek o ujemnej fluorescencji i wysokim rozproszeniu bocznym (side scatter area) jest znacznie mniejszy w zawiesinie komórkowej przygotowanej od myszy zakażonych od trzech dni w porównaniu do myszy niezakażonych. Ekspresję białka nukleokapsydowego wirusa grypy A w posortowanych komórkach A2 przeanalizowano za pomocą barwienia wewnątrzkomórkowego z użyciem przeciwciała specyficznego dla białka nukleokapsydowego.

Histogram pokazuje, że komórki EC2 wyizolowane z myszy zainfekowanych in vivo dają specyficzny sygnał fluorescencji po barwieniu wewnątrzkomórkowym na białko nukleoproteinowe wirusa grypy A. Tabela przedstawia średnią intensywność fluorescencji barwienia białka nukleoproteinowego; intensywność sygnału generowanego przez wewnątrzkomórkowe barwienie białka nukleoproteinowego w komórkach EC2 wyizolowanych z myszy zainfekowanych wirusem grypy A wzrasta wraz z czasem trwania infekcji wirusowej, aby wykazać żywotność komórek EC2 wyizolowanych z myszy zdrowych oraz przetestować ich podatność na zakażenie wirusem grypy A.

Przeanalizowano również ekspresję wirusowego białka jądrowego grypy w wyizolowanych komórkach zainfekowanych ex vivo, co przedstawiono tutaj. Znaczna część komórek EC2 wykazuje ekspresję wirusowego białka jądrowego sześć godzin po infekcji. Dane te zostały tutaj podsumowane.

Procent komórek EC2 wykazujących pozytywny wynik barwienia wewnątrzkomórkowego białka jądrowego wirusa zależy od dawki wirusa zastosowanej w eksperymencie zakażenia ex vivo. Wyniki te wykazują, że wyizolowane pierwotne neurony, tj. EC2, są żywotne oraz podatne na zakażenie i replikację wirusa, co oceniono na podstawie obserwowanej ekspresji białka wirusowego. Podczas przeprowadzania tej procedury bardzo ważne jest, aby starannie wykonywać wszystkie etapy trawienia i dezintegracji tkanki.

Ponadto bardzo ważne jest, aby rygorystycznie ustawić bramkowanie (gating) dla komórek negatywnych pod względem fluorescencji oraz dla obszaru side scatter o wysokiej liczbie komórek. Po przeprowadzeniu sortowania zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak badania molekularne i funkcjonalne, aby wykluczyć rolę komórek typu drugiego i trzeciego płuc w kontekście infekcji wirusowych oraz autoimmunologicznych chorób płuc.