Name: Izolacja cytometryczna przepływowa pierwotnych mysich komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu II do badań funkcjonalnych i molekularnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Poznaj metodę izolacji pierwotnych mysich komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu II za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta zapewnia wysoką czystość i żywotność komórek do badań funkcjonalnych i molekularnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować M. Höxter za pomoc techniczną przy sortowaniu pierwotnych mysich AECII z próbek poziomu biosafety 2.
Praca ta była wspierana przez granty z Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) dla DB (SFB587, TP B12 oraz BR2221/1-1) oraz stypendium z Hannover Biomedical Research School (DFG GSC 108) dla AA. DB jest wspierany przez President´s Initiative and Networking Fund Stowarzyszenia Helmholtzowskich Ośrodków Badawczych (HGF) na podstawie umowy numer W2/W3-029.

Szczegółowe informacje dotyczące wymaganych odczynników i materiałów znajdują się w tabeli na końcu poniższego protokołu. Przed rozpoczęciem pracy przygotować probówki 15 ml (jedna na mysz) zawierające 4 ml dispazy i podgrzać je do 37 °C w kąpieli wodnej. W bloku grzejnym krótko podgrzać niewielkie alikwoty 1 % niskotopliwego agarozy (w wodzie) do 95 °C aż do upłynnienia, a następnie schłodzić do 45 °C do momentu użycia.
1. Przygotowanie płuc myszy
<ol>
	<li>Uśmierć mysz poprzez uduszenie CO2. Uwaga: Nie wykonuj zwichnięcia szyi, ponieważ spowoduje to uszkodzenie tchawki, co uniemożliwi poprawne wykonanie kolejnych kroków protokołu, takich jak wypełnienie płuc cieczą. Upewnij się, że odruchy nocyceptywne zanikły.</li>
	<li>Spryskaj mysz etanolem i wykonaj długie cięcie wzdłuż brzusznej linii środkowej ciała. Odciągnij skórę i futro z brzucha, a następnie ostrożnie przetnij i usuń otrzewną.</li>
	<li>Odkrwaw mysz poprzez przecięcie lewej i prawej żyły szyjnej (Vena jugularis) oraz tętnicy nerkowej (Arteria renalis). Usuń wypływającą krew za pomocą chusteczek.</li>
	<li>Ostrożnie przebij, a następnie usuń przeponę, aby odsłonić serce i płuca, odcinając żebra. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić płuc.</li>
	<li>Za pomocą kaniuli 26G i strzykawki 10 ml wypełnionej zimnym roztworem soli fosforanowej (PBS), przebij prawą komorę serca i przepłucz płuca PBS, aż do całkowitego usunięcia krwi.</li>
	<li>Wycinając i usuwając gruczoły ślinowe, odsłoń tchawicę. Ostrożnie przetnij również mięśnie otaczające tchawicę.</li>
	<li>Wprowadź kaniulę dożylną 22G do tchawicy, wyjmij igłę i przesuń plastikowy cewnik w stronę płuc. Zabezpiecz cewnik, zawiązując wokół tchawicy i cewnika mały kawałek nici.</li>
</ol>
2. Trawienie enzymatyczne tkanki płucnej
W razie potrzeby można przygotować próbkę płynu z płukania przedsionkowo-pęcherzykowego, przepłukując płuca przez cewnik wprowadzony do tchawicy za pomocą PBS lub pożywki przed przejściem do następnego kroku.
<ol>
	<li>Za pomocą strzykawki 2 ml ostrożnie wstrzyknij do płuc przez cewnik maksymalną objętość 2 ml dyspazy (z pobranej porcji 4 ml), tak aby wszystkie płaty były w pełni rozprężone. Zamień strzykawkę na strzykawkę 1 ml zawierającą 0,5 ml upłynnionego agarozy i również wstrzyknij ją do płuc.</li>
	<li>Pozostaw strzykawkę na cewniku, aby zapobiec cofaniu się agarozy, a następnie natychmiast przykryj płuca papierem laboratoryjnym i lodem. Pozostaw agarozę do zżelowania na kilka minut.</li>
	<li>Usuń papier, lód, strzykawkę oraz cewnik, przetnij tchawicę i wypreparuj z klatki piersiowej płuca, serce i grasicę. Następnie wypłucz płuca w naczyniu z PBS i usuń serce, grasicę oraz pozostałą część tchawicy.</li>
	<li>Umieść płuca w pozostałych 2 ml dyspazy i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 45 min.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zawiesiny komórek płuc
<ol>
	<li>Wyjąć płuco z roztworu dyspazy i przenieść je do naczynia zawierającego 7 ml przeciwciała anty-CD16/32 (stężenie końcowe 1 μg/ml) w medium DMEM oraz 100 μl DNazy.</li>
	<li>Za pomocą pincety całkowicie rozdrobić tkankę płucną poprzez rozrywanie i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc na wytrząsarce ustawionej na 200 rpm. W razie potrzeby zawiesinę komórkową można następnie przechowywać w temperaturze 4 °C do następnego etapu.</li>
	<li>Przefiltrować zawiesinę komórkową przez nylonowe sitka, najpierw o oczkach 100 μm, a następnie o oczkach 70 μm, 48 μm i 30 μm. Należy pamiętać o dokładnym płukaniu każdego sitka, a także probówek i naczyń medium DMEM, aby zminimalizować utratę komórek i zmaksymalizować wydajność. W przypadku łączenia próbek można to osiągnąć poprzez sekwencyjne przepuszczanie zawiesin komórkowych z myszy z jednej grupy przez to samo sitko. W przypadku zapchania należy wymienić sitko.</li>
	<li>W zależności od objętości przenieść filtrat do jednej lub kilku probówek 50 ml i wirować przez 15 min przy 160 x g w temperaturze 4 °C. Odmienić supernatant.</li>
	<li>Resuspendować osad komórkowy w 2 ml buforu do lizy erytrocytów (0,15 M NH4Cl, 0,01 M KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2) i szybko przerwać lizę poprzez dodanie 13 ml medium DMEM. Przenieść roztwór do probówki 15 ml i wirować przez 12 min przy 160 x g w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Barwienie przeciwciałami do sortowania komórek metodą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Resuspenduj komórki w 3 ml koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych, przygotowanego w medium DMEM w rozcieńczeniach odpowiednich dla cytometrii przepływowej. (Przeciwciała zostały wcześniej mianowane w celu ustalenia optymalnych rozcieńczeń roboczych poprzez barwienie 1 x 106 splenocytów w objętości 100 μl. Użyj 3 ml koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych zawierającego optymalne stężenia dla każdego z użytych przeciwciał dla komórek połączonych z maksymalnie pięciu myszy. Jeśli do jednej próbki zostanie połączono komórki z większej liczby myszy, dostosuj objętość).</li>
	<li>W celu barwienia inkubuj komórki przez 10 min w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyj komórki, dopełniając probówkę 15 ml medium DMEM i wirując przez 12 min przy 160 x g i 4 °C.</li>
	<li>W przypadku użycia przeciwciał nie sprzęgniętych lub biotynylowanych w punkcie 4.1: Usuń nadsącz i resuspenduj komórki w 2 – 3 ml koktajlu przeciwciał wtórnych. Barw przez 10 min w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Przemyj komórki, dopełniając probówkę medium DMEM i wirując przez 12 min przy 160 x g i 4 °C.</li>
	<li>Resuspenduj komórki w 1 ml DMEM i przefiltruj wstępnie przez filtr 50 μm do probówki do sortowania komórek. Opcjonalnie: Policz komórki, aby uzyskać całkowitą liczbę komórek w zawiesinie komórek płuc.</li>
</ol>
5. Sortowanie komórek
<ol>
	<li>Przed sortowaniem wymieszać komórki za pomocą wortexa. Do sortowania komórek AECII należy użyć dyszy 100 μm. Ciśnienie płynu osłonowego, a także długości fal emisji i detekcji laserowej zależą od instrumentu wykorzystywanego do cytometrycznego sortowania komórek oraz od fluorochromów użytych w procedurze barwienia przeciwciałami.</li>
	<li>Zastosować bramkowanie na komórkach SSChigh, które są negatywne dla fluorochromów użytych do barwienia, i posortować je do probówki zawierającej DMEM. Wykorzystać okna rozproszenia przedniego wysokość (FSC-H) względem powierzchni (FSC-A) oraz rozproszenia bocznego wysokość (SSC-H) względem powierzchni (SSC-A), aby wykluczyć dublety lub agregaty komórkowe (szczegóły strategii bramkowania przedstawiono na Ryc. 1a).</li>
	<li>W celu zebrania posortowanych komórek wirować przez 20 min przy 280 x g i 4 °C.</li>
	<li>Resuspendować komórki w pożywce hodowlanej lub buforze, zgodnie z wymaganiami dla kolejnych analiz.</li>
</ol>

<ol><li>Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+epithelial+type+II+cell%3A+defender+of+the+alveolus+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited.</a> Respir. Res. 2, 33-46 (2001).</li>
<li>Folkerts, G., Nijkamp, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelium%3A+more+than+just+a+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Airway epithelium: more than just a barrier.</a> Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).</li>
<li>Gereke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+alterations+in+type+II+alveolar+epithelial+cells+in+CD4%2B+T+cell+mediated+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation.</a> Respir. Res. 8, 47(2007).</li>
<li>Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+type+II+epithelial+cells+present+antigen+to+CD4%28%2B%29+T+cells+and+induce+Foxp3%28%2B%29+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells.</a> Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).</li>
<li>Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+longer+an+innocent+bystander%3A+epithelial+toll-like+receptor+signaling+in+the+development+of+mucosal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation.</a> Mol. Med. 14, 645-659 (2008).</li>
<li>Herold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+epithelial+cells+direct+monocyte+transepithelial+migration+upon+influenza+virus+infection%3A+impact+of+chemokines+and+adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules.</a> J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).</li>
<li>Knight, D. A., Holgate, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+airway+epithelium%3A+structural+and+functional+properties+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease.</a> Respirology. 8, 432-446 (2003).</li>
<li>Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+distribution+in+lung+parenchyma+early+after+pulmonary+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).</li>
<li>Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal-+and+Strain-Specific+Host+MicroRNA+Molecular+Signatures+Associated+with+Swine-Origin+H1N1+and+Avian-Origin+H7N7+Influenza+A+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection.</a> J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).</li>
<li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae%2C+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).</li>
<li>Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetyl-L-cysteine+%28NAC%29+inhibit+mucin+synthesis+and+pro-inflammatory+mediators+in+alveolar+type+II+epithelial+cells+infected+with+influenza+virus+A+and+B+and+with+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV).</a> Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).</li>
<li>Zarbock, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surfactant+protein+C+mutation+A116D+alters+cellular+processing%2C+stress+tolerance%2C+surfactant+lipid+composition%2C+and+immune+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Pulm.+Med%22%5BJournal%5D)">The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation.</a> BMC. Pulm. Med. 12, 15(2012).</li>
<li>Taubenberger, J. K., Morens, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+influenza+virus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The pathology of influenza virus infections.</a> Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).</li>
<li>Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of alveolar type II cells.</a> Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).</li>
<li>Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+murine+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).</li>
<li>Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization%2C+synthesis%2C+and+processing+of+surfactant+protein+SP-C+in+rat+lung+analyzed+by+epitope-specific+antipeptide+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies.</a> J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).</li>
<li>Phelps, D. S., Floros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+pulmonary+surfactant+proteins+using+immunohistochemistry+and+tissue+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization.</a> Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+human+alveolar+type+II+cells+secrete+antiviral+IL-29+%28IFN-lambda+1%29+in+response+to+influenza+A+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection.</a> J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+response+to+influenza+A+virus+in+differentiated+human+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Nasz protokół izolacji mysich komórek AECII metodą cytometrii przepłyewej oferuje szybki sposób pozyskiwania pierwotnych komórek z płuc myszy do szerokiego zakresu badań funkcjonalnych i molekularnych. Opisana procedura pozwala uzyskać wysoce żywotne i czyste populacje AECII, których liczba jest wystarczająca do bezpośrednich analiz, takich jak izolacja RNA (patrz Rycina 2b) oraz badania transkryptomiczne. W zastosowaniach funkcjonalnych możliwe jest również hodowanie wyizolowanych komórek, co pozwala <e...

<table><tbody><tr><td>kaniula dożylna Introcan 22G</td><td>Braun</td><td>REF 4252098B</td><td></td></tr><tr><td>Dispase, 100 ml(5000 jednostek kazeinolitycznych)</td><td>BD Biosciences</td><td>354235</td><td>podzielić na alikwoty po 4 ml w probówkach 15 ml, przechowywać w -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Agaroza Biozym Plaque</td><td>Biozym</td><td>840101</td><td>1% w/v w H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Deoksynukleaza I z trzustki bydlęcej, 2000 jednostek Kunitza/fiolka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4263</td><td>zawartość 1 fiolki rozpuścić na świeżo w 300 &amp;mu;l DMEM</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>22320-022</td><td>stosować zgodnie z zaleceniami producenta (niska zawartość glukozy, pirogronian, HEPES)</td></tr><tr><td>sitka do komórek (100 &amp;mu;m, 75 &amp;mu;m) </td><td>BD Falcon</td><td>352360, 352350</td><td></td></tr><tr><td>siatka nylonowa (48 &amp;mu;m, 30 &amp;mu;m) </td><td>B&amp;#252;ckmann GmbH</td><td>03-48/26-1020, 03-30/18-108</td><td></td></tr><tr><td>filtr CellTrics 50 &amp;mu;m</td><td>PARTEC</td><td>04-0042-2317</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie CD16/CD32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>klon 93; oczyszczone</td></tr><tr><td>anty-mysie F4/80</td><td>BioLegend</td><td>123116</td><td>klon BM8; sprzężone z APC</td></tr><tr><td>anty-mysie CD11b</td><td>BioLegend</td><td>101208</td><td>klon M1/70; sprzężone z PE</td></tr><tr><td>anty-mysie CD11c</td><td>BioLegend</td><td>117310</td><td>klon N418; sprzężone z APC</td></tr><tr><td>anty-mysie CD45</td><td>BioLegend</td><td>103102</td><td>klon 30-F11; oczyszczone</td></tr><tr><td>anty-mysie CD19</td><td>eBioscience</td><td>12-0193-83</td><td>eBio 1D3; sprzężone z PE</td></tr><tr><td>poliklonalne przeciwciała kozie anty-szczurze IgG</td><td>BD Pharmingen</td><td>550767</td><td>poliklonalne, sprzężone z PE</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content">W zależności od dostępnego cytometru przepływowego i laserów można zastosować przeciwciała sprzężone z alternatywnymi fluorochromami.&lt;/p&gt; </td></tr></tbody></table>

izolacja pierwotnych komórek nabłonkowych pęcherzyków płucnych typu ii myszy metodą cytometrii przepływowej do badań funkcjonalnych i molekularnych

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

W ciągu ostatnich lat coraz bardziej dostrzegany jest wkład pęcherzykowych komórek nabłonkowych typu II (AECII) w różne aspekty regulacji odpornościowej w płucach. Wykazano, że AECII uczestniczą w produkcji cytokin w zapalnych drogach oddechowych, a nawet pełnią funkcję komórek prezentujących antygen zarówno w przebiegu infekcji, jak i autoimmunizacji zależnej od limfocytów T 1-8. Dlatego są one szczególnie interesujące również w kontekstach klinicznych, takich jak nadreaktywność dróg oddechowych na antygeny obce i własne, a także w infekcjach, które bezpośrednio lub pośrednio atakują AECII. Niemniej jednak nasza wiedza na temat szczegółowych funkcji immunologicznych pełnionych przez pęcherzykowe komórki nabłonkowe typu II w zdrowych płucach, a także w stanach zapalnych, pozostaje niepełna. Wiele badań dotyczących funkcji AECII przeprowadzanych jest z wykorzystaniem linii komórkowych nabłonka pęcherzykowego myszy lub ludzi 9-12. Praca z liniami komórkowymi bez wątpienia oferuje szereg korzyści, takich jak dostępność dużej liczby komórek do szeroko zakrojonych analiz. Uważamy jednak, że zastosowanie pierwotnych AECII myszy pozwala na lepsze zrozumienie roli tego typu komórek w złożonych procesach, takich jak infekcja czy zapalne procesy autoimmunizacyjne. Pierwotne AECII myszy mogą być izolowane bezpośrednio od zwierząt cierpiących na takie schorzenia układu oddechowego, co oznacza, że były one poddane wszystkim dodatkowym czynnikom zewnętrznym odgrywającym rolę w analizowanym środowisku. Przykładowo, żywe AECII można wyizolować z myszy zainfekowanych donosowo wirusem grypy A, który w celu replikacji atakuje głównie te komórki 13. Co istotne, dzięki infekcji ex vivo AECII izolowanych od zdrowych myszy, można dodatkowo rozszerzyć badania nad odpowiedziami komórkowymi wywołanymi przez infekcję.
Nasz protokół izolacji pierwotnych mysich AECII opiera się na trawieniu enzymatycznym płuc myszy, a następnie znakowaniu otrzymanej zawiesiny komórkowej przeciwciałami specyficznymi dla CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 oraz CD16/CD32. Ziarniste AECII są następnie identyfikowane jako nieznakowana populacja komórek o wysokim rozproszeniu bocznym (SSChigh) i są oddzielane za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek 3.
W porównaniu z alternatywnymi metodami izolacji pierwotnych komórek nabłonkowych z płuc myszy, nasz protokół izolacji AECII metodą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem selekcji negatywnej pozwala na uzyskanie nienaruszonych, o wysokiej żywotności i czystych AECII w stosunkowo krótkim czasie. Dodatkowo, w przeciwieństwie do konwencjonalnych metod izolacji poprzez panowanie (panning) i usuwanie limfocytów za pomocą wiązania magnetycznych kulek sprzężonych z przeciwciałami 14, 15, sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej umożliwia rozróżnianie komórek na podstawie ich wielkości i ziarnistości. Przy dostępności aparatury do cytometrycznego sortowania komórek opisana procedura może być stosowana przy stosunkowo niskich kosztach. Poza standardowymi przeciwciałami i enzymami do dezintegracji tkanki płucnej nie są wymagane żadne dodatkowe odczynniki, takie jak kulki magnetyczne. Izolowane komórki nadają się do szerokiego zakresu badań funkcjonalnych i molekularnych, obejmujących hodowle in vitro i testy stymulacji limfocytów T, a także analizy transkryptomu, proteomu lub sekretomu 3, 4.

Podczas sortowania zawiesin komórek płuc izolowanych od zdrowych myszy, bramka AECII będzie zazwyczaj obejmować około 42 ± 10 % wszystkich zdarzeń. Odsetek ten może być zauważalnie niższy w przypadku użycia myszy z schorzeniami układu oddechowego, takimi jak infekcja wirusowa, ponieważ początkowa zawiesina komórkowa będzie zawierać znacznie wyższą proporcję limfocytów i innych komórek odpornościowych rekrutowanych do dróg oddechowych. W przypadku AECII izolowanych z płuc zainfekowanych IAV w 3. dobie po infekcji zaobserw...

Opisujemy metodę szybkiej izolacji pierwotnych pęcherzykowych komórek nabłonkowych typu II (AECII) myszy za pomocą negatywnej selekcji cytometrycznej. Uzyskane komórki AECII wykazują wysoką żywotność oraz czystość i nadają się do szerokiego zakresu badań funkcjonalnych i molekularnych dotyczących ich roli w schorzeniach układu oddechowego, takich jak choroby autoimmunologiczne lub zakaźne.

Izolacja pierwotnych komórek nabłonkowych pęcherzyków płucnych typu II myszy metodą cytometrii przepływowej do badań funkcjonalnych i molekularnych

W ciągu ostatnich lat wkład pęcherzykowych komórek nabłonkowych typu II (AECII) w różne aspekty regulacji odporności w płucach został...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja czystych i żywotnych pierwotnych komórek nabłonka pęcherzykowego typu II dla późniejszych analiz funkcjonalnych i molekularnych. Najpierw do płuc i tchawicy uśmierconej myszy wprowadza się roztwór DYS, a następnie agarozę. Po tym, jak dyspaza przetrawi tkankę płucną, płuca zostają usunięte.Tkankę rozdrabnia się ręcznie. Otrzymaną zawiesinę filtruje się przez szereg sit o malejącej wielkości oczek. Następnie, za pomocą cytometrii przepływowej i selekcji negatywnej, izoluje się komórki nabłonka pęcherzykowego typu II oraz komórki barwnikowe.Ostatecznie wyizolowane komórki nabłonka pęcherzykowego typu dwa mogą zostać wykorzystane do przeprowadzenia analiz funkcjonalnych i molekularnych w celu zbadania ich roli w infekcjach dróg oddechowych oraz w przebiegu chorób autoimmunologicznych. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii płuc, szczególnie w kontekście chorób płuc o podłożu autoimmunologicznym oraz infekcji wirusowych. Wizualna prezentacja tej metody jest niezbędna, ponieważ przygotowanie organu oraz zawiesiny komórkowej są trudne do opanowania.Ogólny sukces tego protokołu zależy od kilku istotnych szczegółów podczas tych etapów. Dla każdej myszy biorącej udział w eksperymencie należy wstępnie ogrzać probówkę o pojemności 15 ml zawierającą 4 ml buforu DYS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Małe aliquoty 1% niskomeltowej agarozy w wodzie należy umieścić w bloku grzejnym o temperaturze 95 °C aż do upłynnienia. Następnie należy je schłodzić do 45 °C i utrzymywać w tej temperaturze do momentu użycia w kolejnym kroku.Aby przygotować płuco myszy, należy uśmiercić mysz poprzez uduszenie CO2. Następnie należy wykonać długie cięcie wzdłuż brzusznej linii środkowej ciała.Następnie odciągnij skórę z brzusznej strony, a następnie ostrożnie przetnij i usuń otrzewną. Po upuszczeniu krwi z myszy ostrożnie przebij i usuń przeponę, a następnie odetnij żebra. Aby odsłonić serce i płuco, należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić płuca, używając kaniuli 26G oraz strzykawki 10 ml wypełnionej zimnym roztworem.Nakłuć prawą komorę serca i przepłukać płuca PBS, aż do całkowitego usunięcia krwi. Odciąć i usunąć gruczoły ślinowe, aby odsłonić tchawicę. Następnie ostrożnie odciąć mięśnie otaczające tchawicę.Następnie wprowadź do tchawicy kaniulę do zewnątrzwszechwłasową o rozmiarze 22 G. Wyjmij igłę i przesuń plastikowy cewnik w kierunku płuca. Przymocuj cewnik, zawiązując wokół tchawicy i cewnika mały kawałek sznurka.W razie potrzeby należy przygotować próbkę płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, przepłukując płuca za pomocą cewnika wprowadzonego do tchawicy przy użyciu PBS lub pożywki. Płyn z płukania należy przechowywać w lodzie do czasu dalszej analizy. Najtrudniejszym elementem tej procedury jest trawienie i dezintegracja tkanki.Aby zapewnić powodzenie tego protokołu, należy dopilnować, aby płuco w wszystkich płatach zostało całkowicie wypełnione roztworem dispa, również po trawieniu tkanki. Należy rozbić tkankę, używając ostrożnie strzykawki o pojemności 2 mL, wstrzykując maksymalną objętość 2 mL wcześniej przygotowanego roztworu dispa do płuca przez cewnik, tak aby wszystkie płaty były w pełni rozprężone. Następnie należy wymienić strzykawkę na strzykawkę o pojemności 1 mL zawierającą 0,5 mL upłynnionego aros i wprowadzić jej zawartość do płuca.Pozostaw strzykawkę na cewniku, aby zapobiec cofaniu się aerogelu, a następnie natychmiast przykryj płuco chusteczką laboratoryjną i lodem. Pozostaw aerogel na kilka minut. Usuń chusteczkę, lód, strzykawkę oraz cewnik.Następnie przetnij tchawicę i wyciśnij płuca, serce oraz grasicę z klatki piersiowej. Przepłucz przygotowane organy w naczyniu za pomocą PBS. Następnie oddziel od płuc serce, grasicę i pozostałą część tchawicy, a następnie je usuń.Umieść płuco w probówce zawierającej pozostałe 2 mL roztworu blokującego i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Inkubacja ta służy zapewnieniu efektywnego blokowania receptorów FC komórek fagocytujących przed procedurą barwienia. Przenieś płuco z roztworu blokującego do naczynia zawierającego 7 mL przeciwciała anty-CD163 w stężeniu 1 µg/mL oraz 100 µL DNase w DMEM; za pomocą dwóch par pęset całkowicie rozdrabniaj tkankę płucną, rozrywając ją.Następnie inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce ustawionej na 200 RPM, jeśli jest to wskazane. Zawiesinę komórkową można następnie przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do następnego etapu. Przenieść zawiesinę komórkową pipetą przez serię sit nylonowych.Najpierw przelać zawiesinę przez filtr o rozmiarze oczek 100 µm umieszczony na probówce o pojemności 50 ml. W przypadku łączenia próbek, zawiesiny komórkowe od myszy z tej samej grupy należy przepuścić przez ten sam filtr. Jeśli filtr się zapcha, należy wymienić go na nowy.Powtórz ten proces, używając filtra z siatką o oczkach 70 µm. Należy dokładnie wypłukać każdą siatkę, a także probówki i naczynia za pomocą DMEM, aby zminimalizować utratę komórek i zmaksymalizować wydajność. Następnie przeciągnij zawiesinę przez filtr z siatką o oczkach 48 µm rozpiętą na plastikowym lub szklanym pierścieniu, jak pokazano tutaj.Zbierz frakcję przepływową do szalki Petriego. Następnie powtórz ten proces, używając sita o oczkach 30 µm. W zależności od objętości przenieś filtrat do jednej lub kilku probówek o pojemności 50 ml i wiruj przez 15 minut przy 160 ×g w temperaturze 4 °C.Po wirowaniu odpiąć nadosad i zawiesić osad komórkowy w 2 ml buforu do lizy erytrocytów. Następnie szybko przerwać lizę poprzez dodanie 13 ml pożywki DMEM. Przenieść roztwór do probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 12 minut przy 160 ×g i 4 °C.Komórki inkubowano w 3 mL koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych zawierającego przeciwciała przeciwko CD 11 C, CD 11 BF, F4/80, CD 19, CD 163 i CD 45. Komórki inkubowano przez 10 minut w ciemności w temperaturze 4 °C lub na lodzie. Po inkubacji komórki przemyto, dopełniając probówkę medium DMEM, a następnie odwirowano przez 12 minut przy 160 ×g w temperaturze 4 °C.Resuspenduj komórki w 1 ml DMEM i przefiltruj wstępnie przez filtr 50 µm do probówki przeznaczonej do sortowania komórek. Policz komórki, aby określić całkowitą liczbę komórek w zawiesinie płucnej. Do sortowania EC2 bezpośrednio przed rozpoczęciem procedury użyj dyszy 100 µm.Wymieszać zawiesinę komórek, stosując wortexowanie. Ciśnienie płynu, długość fali emisji lasera oraz długość fali detekcji zależą od urządzenia użytego do sortowania komórek metodą cytometrii przepływowej, a także od fluorochromów zastosowanych w procedurze barwienia przeciwciałami. W pierwszej kolejności należy utworzyć wykres rozrzutu bocznego (SSC) względem fluorescencji i wyznaczyć bramkę dla wszystkich komórek o wysokim rozproszeniu bocznym, które są negatywne pod kątem fluorochromów użytych do barwienia.Następnie wygeneruj wykresy powierzchni rozproszenia bocznego (SSC-A) względem powierzchni rozproszenia przedniego (FSC-A), wysokości rozproszenia przedniego (FSC-H) względem powierzchni rozproszenia przedniego (FSC-A) oraz wysokości rozproszenia bocznego (SSC-H) względem powierzchni rozproszenia bocznego (SSC-A), a następnie ustaw bramki w celu wykluczenia dubletów lub agregatów komórkowych, kierując sortowane komórki do probówki zawierającej DMEM. Podczas sortowania zawiesin komórek płuc izolowanych od zdrowych myszy, bramka EC2 zazwyczaj obejmuje około 42 ± 10% wszystkich zdarzeń. Aby zebrać posortowane komórki, wiruj je przez 20 minut przy 280 ×g i 4 °C.Resuspenduj pęcherzykowe komórki nabłonkowe typu drugiego (AEC2) w pożywce hodowlanej lub buforze, zgodnie z wymogami dla kolejnych analiz. Pierwotne mysie pęcherzykowe komórki nabłonkowe typu drugiego zostały wyizolowane metodą negatywnej selekcji z użyciem cytometrii przepływowej, zgodnie z opisem w tym filmie; analiza posortowanych komórek została przedstawiona tutaj, jak wskazano.Czystość wyizolowanych komórek wynosi około 92 ± 5%. Komórki A EC2 uzyskane po sortowaniu zostały poddane barwieniu na białko surfaktantu C; po lewej stronie przedstawiono obraz w kontraście fazowym, a po prawej immunofluorescencję. Stwierdzono, że prawie 100% komórek było pozytywnych pod kątem białka surfaktantu C, co potwierdziło pomyślną izolację czystej populacji. Aby ocenić efekty infekcji wirusem grypy A in vivo, komórki A EC2 wyizolowano z myszy C 57 BL six, którym donosowo podano albo roztwór soli fizjologicznej (PBS), albo wirusa grypy A PR eight A 34 jeden, dwa lub trzy dni wcześniej.Wykresy te przedstawiają zawiesiny komórek płuc pobranych od niezakażonych oraz zakażonych od trzech dni samców myszy C 57 black six, barwionych w celu sortowania ze względu na rekrutację komórek odpornościowych do zakażonego płuca. Udział komórek o ujemnej fluorescencji i wysokim rozproszeniu bocznym (side scatter area) jest znacznie mniejszy w zawiesinie komórkowej przygotowanej od myszy zakażonych od trzech dni w porównaniu do myszy niezakażonych. Ekspresję białka nukleokapsydowego wirusa grypy A w posortowanych komórkach A2 przeanalizowano za pomocą barwienia wewnątrzkomórkowego z użyciem przeciwciała specyficznego dla białka nukleokapsydowego.Histogram pokazuje, że komórki EC2 wyizolowane z myszy zainfekowanych in vivo dają specyficzny sygnał fluorescencji po barwieniu wewnątrzkomórkowym na białko nukleoproteinowe wirusa grypy A. Tabela przedstawia średnią intensywność fluorescencji barwienia białka nukleoproteinowego; intensywność sygnału generowanego przez wewnątrzkomórkowe barwienie białka nukleoproteinowego w komórkach EC2 wyizolowanych z myszy zainfekowanych wirusem grypy A wzrasta wraz z czasem trwania infekcji wirusowej, aby wykazać żywotność komórek EC2 wyizolowanych z myszy zdrowych oraz przetestować ich podatność na zakażenie wirusem grypy A.Przeanalizowano również ekspresję wirusowego białka jądrowego grypy w wyizolowanych komórkach zainfekowanych ex vivo, co przedstawiono tutaj. Znaczna część komórek EC2 wykazuje ekspresję wirusowego białka jądrowego sześć godzin po infekcji. Dane te zostały tutaj podsumowane.Procent komórek EC2 wykazujących pozytywny wynik barwienia wewnątrzkomórkowego białka jądrowego wirusa zależy od dawki wirusa zastosowanej w eksperymencie zakażenia ex vivo. Wyniki te wykazują, że wyizolowane pierwotne neurony, tj. EC2, są żywotne oraz podatne na zakażenie i replikację wirusa, co oceniono na podstawie obserwowanej ekspresji białka wirusowego. Podczas przeprowadzania tej procedury bardzo ważne jest, aby starannie wykonywać wszystkie etapy trawienia i dezintegracji tkanki.Ponadto bardzo ważne jest, aby rygorystycznie ustawić bramkowanie (gating) dla komórek negatywnych pod względem fluorescencji oraz dla obszaru side scatter o wysokiej liczbie komórek. Po przeprowadzeniu sortowania zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak badania molekularne i funkcjonalne, aby wykluczyć rolę komórek typu drugiego i trzeciego płuc w kontekście infekcji wirusowych oraz autoimmunologicznych chorób płuc.

flow-cytometric-isolation-primary-murine-type-ii-alveolar-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przepływowa cytometria izolacją pierwotnych mysiech komórek nabłonkowych pęcherzyków płuc typu II do badań funkcjonalnych i molekularnych

Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

Tutaj opisujemy skuteczną metodę izolacji, identyfikacji i oczyszczania mysich komórek nabłonka grasicy (TEC). Protokół może być wykorzystany do badań funkcji grasicy pod kątem prawidłowego rozwoju komórek T, dysfunkcji grasicy i rekonstytucji limfocytów T.

Izolacja, identyfikacja i oczyszczanie mysich komórek nabłonkowych grasicy

Stan zdrowia płuc jest odzwierciedlony przez typ i liczbę komórek odpornościowych, które są obecne w oskrzelikach płuc. Opisujemy technikę płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, która umożliwia izolację i badanie nieprzylegających komórek i rozpuszczalnych czynników z dolnych dróg oddechowych myszy.

Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe płuc myszy w celu analizy nacieku komórek zapalnych

Miliony ludzi cierpią na choroby zwyrodnieniowe siatkówki, które prowadzą do nieodwracalnej ślepoty. Wspólnym elementem wielu z tych chorób jest utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC). Ten szczegółowy protokół opisuje izolację pierwotnych mysich RGC przez selekcję dodatnią i ujemną za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej

Ta praca opisuje protokół oparty na FACS, który pozwala na łatwą i jednoczesną izolację perycytów typu I i II od mięśni szkieletowych.

Izolacja perycytów typu I i typu II z mięśni szkieletowych myszy

Ta komunikacja opisuje metodologie izolacji i hodowli makrofagów pęcherzykowych od ludzi oraz modeli mysich do celów eksperymentalnych.

Izolacja i hodowla in vitro mysich i ludzkich makrofagów pęcherzykowych

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię metod dysocjacji tkanek i frakcjonowania komórkowego, umożliwiając wzbogacenie żywotnych komórek nabłonkowych z bliższych i dalszych obszarów ludzkiego płuca. W tym przypadku podejścia te są stosowane do analizy funkcjonalnej komórek progenitorowych nabłonka płuc poprzez wykorzystanie modeli hodowli organoidów 3D.

Izolacja i wzbogacanie ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc do hodowli organoidów

W tym badaniu prezentujemy skuteczny i powtarzalny protokół izolowania populacji immunologicznych mysiego układu oddechowego. Zapewniamy również metodę identyfikacji wszystkich wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych, które znajdują się w płucach zdrowych myszy, przy użyciu 9-kolorowego panelu cytometrii przepływowej.

Analiza cytometrii przepływowej w celu identyfikacji wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych płuc myszy

W tym artykule, pierwotne komórki śródbłonka płuc zostały wyizolowane i wyhodowane od nowonarodzonych myszy.

Izolacja pierwotnych komórek śródbłonka płuc myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację żywych populacji immunologicznych i nieimmunologicznych z płuc myszy w stanie ustalonym i po zakażeniu grypą. Zapewnia również strategie bramkowania do identyfikacji podzbiorów komórek nabłonkowych i szpikowych.

Izolacja żywych populacji komórek szpikowych i nabłonkowych z płuc myszy

Protokół ten przedstawia metodę opartą na cytometrii przepływowej, która izoluje żywotne komórki nabłonkowe typu II (AECII) z płuc noworodków, młodocień lub dorosłych myszy (zakażonych lub niezakażonych). Takie podejście umożliwia późniejszym badaniam molekularnym i/lub funkcjonalnym AECII identyfikację ich roli podczas zapalenia i infekcji płuc.

Izolacja komórek nabłonkowych typu II pęcherzyka z płuc noworodkowych, młodociowych i dorosłych myszy, przystosowanych do zakaźnych warunków eksperymentalnych

Poznaj metodę izolacji pierwotnych mysich komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu II za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta zapewnia wysoką czystość i żywotność komórek do badań funkcjonalnych i molekularnych.

Izolacja cytometryczna przepływowa pierwotnych mysich komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu II do badań funkcjonalnych i molekularnych (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja pierwotnych komórek nabłonkowych pęcherzyków płucnych typu II myszy metodą cytometrii przepływowej do badań funkcjonalnych i molekularnych

Przeglądaj więcej filmów