Name: Aktywacja i ekspansja limfocytów T NK za pośrednictwem sztucznej komórki prezentującej antygen (aAPC) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Poznaj metodę aktywacji i ekspansji limfocytów T NK za pomocą sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC) opartych na CD1d. Ta technika umożliwia uzyskanie dużych liczb czynnych komórek NKT z krwi obwodowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Priyanka Subrahmanyam za pomocne dyskusje. Autorzy nie wykazują żadnych konkurencyjnych interesów finansowych. Praca ta była wspierana przez granty z American Cancer Society, NIH/NCI K01 CA131487, R21 CA162273, R21 CA162277 oraz program P30 Tumor Immunology and Immunotherapy dla T.J. Webba. Treść opracowania leży wyłącznie po stronie autorów i nie musi odzwierciedlać oficjalnych opinii National Cancer Institute lub National Institutes of Health.

1. Generowanie aAPC
<ol>
	<li>Przed dodaniem białek do kulek, należy przygotować wszystkie odczynniki i bufory: 0,1 M bufor boratowy; 1X D-PBS (bez Ca2+ i Mg2+); bufor do płukania kulek (1X PBS + 5% ludzkiej surowicy grupy AB + 0,02% azotku sodu); pożywka kompletna (pożywka RPMI + 100 mM pirogronianu sodu, 10 mM roztwór witamin nieessentialnych, 100 mM roztwór witamin MEM, 1% 2-merkaptoetanolu, 10 μM cyprofloksacyny, 5% ludzkiej surowicy grupy AB); bufor MACS (1 L PBS wolnego od Ca2+ i Mg2+, 5 g BSA i 2 mmol EDTA).</li>
	<li>Wypłukać 1 ml kulek Dynabeads M-450 Epoxy przy użyciu 3 ml sterylnego 0,1 M buforu boratowego (kwas borowy i woda, pH 7,0-7,4) w 5 ml przezroczystej fiolce z borokrzemianowego szkła z gwintem.</li>
	<li>W oddzielnej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml dodać 100 μg dimeru hCD1d-Ig oraz 20 μg cząsteczek kostymulujących (np. przeciwciało anty-CD28 mAb) do 1 ml PBS bez Ca2+ lub Mg2+.</li>
	<li>Umieścić szklaną fiolkę z kulkami na magnesie i odessać bufor boratowy z kulek. Dodać mieszaninę białek z kroku 1.2 do fiolki i zamknąć ją nakrętką. Natychmiast wymieszać poprzez odwrócenie fiolki, zabezpieczyć nakrętkę parafilmem, umieścić na rotatorze i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia umieścić szklaną fiolkę na magnesie i usunąć mieszaninę białek, uważając, aby nie usunąć kulek. Wypłukać kulki, dodając 3 ml buforu do płukania kulek (PBS z 5% surowicy AB + 0,02% azotku sodu) i inkubując przez 5 min w temperaturze 4 °C na rotatorze. Powtórzyć czynność dwukrotnie.</li>
	<li>Kulki można przechowywać w tej mieszaninie do płukania. Aby przygotować funkcjonalne aAPC, pobrać niewielką alikwot i policzyć kulki za pomocą hematocytometru. Sprawdzić stabilność obciążenia białek na kulkach poprzez barwienie przeciwciałami (np. przeciwciałem anty-mouse IgG1 sprzężonym z PE) i przeprowadzenie analizy cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Aby obciążyć kulki antygenem, pobrać 5 x 107 kulek, przenieść do małej szklanej fiolki o pojemności 1,5 ml i wypłukać kulki 1 ml sterylnego PBS. Resuspendować wypłukane kulki w 1 ml sterylnego PBS i dodać antygen; na przykład: obciążyć α-GalCer/KRN7000 (5 mg/ml). * Uwaga: Chociaż nie stwierdzono żadnych problemów z rozpuszczalnością lipidów lub tworzeniem się miceli, lipidy należy obchodzić zgodnie z zaleceniami producenta. W szczególności w tych badaniach KRN7000 został rozpuszczony w DMSO (1 mg/ml). KRN7000 i inne antygeny glikolipidowe można również rozpuścić w 0,2 mg/ml PBS zawierającym 0,5% Tween-20 (sonikować przez 2 h w 37 °C). WAŻNE – aAPC muszą być obciążone przez co najmniej 48-72 h przed użyciem.</li>
</ol>
2. Izolacja komórek CD161+CD3+
<ol>
	<li>Szeperuj monocyty i limfocyty krwi obwodowej (PBMC). W przypadku oddzielania limfocytów od warstwy leukocytowej (buffy coat) lub koncentratu z leukaferezy za pomocą wirowania w gradiencie gęstości Ficoll, najpierw rozcieńcz krew z heparyną równą objętością 1X PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Do stożkowych probówek o pojemności 50 ml dodaj 15 ml Ficollu (podgrzanego do temperatury pokojowej). Powoli nanieś 25 ml rozcieńczonej mieszaniny krwi na wierzch warstwy Ficollu. Wiruj przy 2 000 rpm przez 30 min w temperaturze pokojowej z wyłączonym hamulcem.</li>
	<li>Ostrożnie pobierz interfejs limfocytowy (biały pierścień między mediami a Ficollu) za pomocą pipety Pasteura i przenieś do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Przemyj komórki, dopełniając probówkę do 50 ml za pomocą PBS i wirując przy 1 500 rpm przez 5 min. Odlej supernatant, połącz zawartość probówek pochodzących od jednego osobnika do jednej probówki i ponownie przemyj monocyty i limfocyty krwi obwodowej (PBMC) za pomocą 20 ml PBS. Następnie policz PBMC i resuspenduj do stężenia 5 x 107 komórek/ml w buforze MACS (1 L PBS bez Ca2+ i Mg2+, 5 g BSA oraz 2 mmol EDTA).</li>
	<li>Aby wyizolować frakcję limfocytów T, zacznij od 2 ml PBMC (108 komórek) i dodaj 100 μl roztworu do wzbogacania Pan T z zestawu EasySep Human T Cell Enrichment Kit. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
	<li>Do roztworu dodaj 100 μl cząsteczek magnetycznych i inkubuj w temperaturze pokojowej przez kolejne 10 min. Doprowadź końcową objętość rozpuszczalnika do 2,5 ml i umieść probówkę w fioletowym magnesie na 5 min. Szybko przelej frakcję CD3+ do probówki stożkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Przemyj komórki, dodając 5 ml zimnego buforu MACS, policz liczbę żywych komórek i pobierz alikwot do barwienia FACS.</li>
	<li>Aby wyselekcjonować komórki CD161+, najpierw resuspenduj wzbogacone limfocyty T w 980 μl lodowatego buforu MACS, dodaj 10 μg przeciwciał mAb anty-CD161 i inkubuj w lodówce przez 10 min.</li>
	<li>Wiruj komórki przy 1 500 rpm w temperaturze 4 °C przez 5 min. Następnie resuspenduj osad komórkowy w 800 μl buforu MACS. Dodaj 200 μl mikro kulek anty-mouse IgG1 i inkubuj roztwór przez 10 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Podczas tego etapu inkubacji przygotuj kolumnę LS, dodając 3 ml buforu MACS.</li>
	<li>Następnie przemyj komórki, wirując przy 1 500 rpm w temperaturze 4 °C przez 5 min. Resuspenduj komórki w 3 ml buforu MACS. Następnie przenieś komórki pipetą do kolumny separacyjnej LS MACS. Pamiętaj, aby pipetować powoli, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza. Przepłucz kolumnę, dodając 3 ml buforu MACS. Powtórz dwukrotnie.</li>
	<li>Dodaj 3 ml świeżego buforu MACS i wyjmij kolumnę z magnesu. Umieść kolumnę w probówce stożkowej o pojemności 15 ml. Włóż tłok i wypchnij zawartość, aby uzyskać oczyszczone komórki CD161+CD3+. Policz frakcję wzbogaconą w komórki NKT. Powinieneś otrzymać od 2 do 4 milionów komórek.</li>
</ol>
3. Ekspansja komórek NKT za pośrednictwem aAPC
<ol>
	<li>Przygotować kokulturę, dodając 106 wzbogaconych limfocytów T CD161+CD3+ oraz 106 aAPC do 16 ml pożywki kompletnej (pożywka kompletna + IL-2, 100 U/ml). Wysiać tę mieszaninę, dodając objętość końcową 160 μl/dołek do 96-dołkowej płytki polistyrenowej z dnem w kształcie litery U, traktowanej do hodowli tkanek, z pokrywką ograniczającą parowanie. Wymieniać pożywkę co 7my dzień, dodając 80 μl świeżej pożywki.</li>
	<li>Zebrać komórki, policzyć je i przeprowadzić barwienie FACS w 12-14 dniu.</li>
	<li>Ekspandowane komórki NKT można wysiać ponownie zgodnie z opisem w kroku 3.1; w szczególności resuspendować 106 ekspandowanych limfocytów T i 106 aAPC w 16 ml pożywki kompletnej. Wysiać tę mieszaninę, dodając 160 μl/dołek do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U. Kontynuować odświeżanie pożywki kokultury co 7my dzień, dodając 80 μl świeżej pożywki.</li>
	<li>Zaleca się zamrozić nadmiar komórek NKT po drugiej rundzie ekspansji (1 x106/krioprobetka w 1 ml 5% DMSO/ 95% FBS).</li>
</ol>
4. Test funkcjonalny: stymulacja komórek NKT za pośrednictwem aAPC
<ol>
	<li>Przygotować 5x104 komórek NKT/do studzienki z 5x105 aAPC w końcowej objętości 200 μl (pożywka kompletna) w płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U.</li>
	<li>zebrać nadsącz z hodowli komórkowej do analizy ELISA po 24–48 h.</li>
</ol>

<ol><li>Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+population+of+T-cell+receptor+%CE%B1%CE%B2-bearing+thymocytes+which+predominantly+expresses+a+single+V%CE%B2+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel population of T-cell receptor αβ-bearing thymocytes which predominantly expresses a single Vβ gene family.</a> Nature. 329, 251-254 (1987).</li>
<li>Prigozy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolipid+antigen+presentation+by+CD1d+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glycolipid antigen presentation by CD1d molecules.</a> Science. 291, 664-667 (2001).</li>
<li>Davodeau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+phenotypic+and+functional+similarities+between+human+and+murine+%CE%B1%CE%B2+T+cells+expressing+invariant+TCR+%CE%B1-chains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Close phenotypic and functional similarities between human and murine αβ T cells expressing invariant TCR α-chains.</a> J. Immunol. 158, 5603-5611 (1997).</li>
<li>Exley, M., Garcia, J., Balk, S. P., Porcelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+CD1d+recognition+by+human+invariant+V%CE%B124%2B+CD4-CD8-+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Requirements for CD1d recognition by human invariant Vα24+ CD4-CD8- T cells.</a> J. Exp. Med. 186, 109-120 (1997).</li>
<li>Koseki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+expression+of+a+distinctive+V14%2B+T-cell+antigen+receptor+%CE%B1+chain+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dominant expression of a distinctive V14+ T-cell antigen receptor α chain in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 7518-7522 (1991).</li>
<li>Dellabona, P., Padovan, E., Casorati, G., Brockhaus, M., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+invariant+V%CE%B124-J%CE%B1Q%2FV%CE%B211+T+cell+receptor+is+expressed+in+all+individuals+by+clonally+expanded+CD4-8-+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">An invariant Vα24-JαQ/Vβ11 T cell receptor is expressed in all individuals by clonally expanded CD4-8- T cells.</a> J. Exp. Med. 180, 1171-1176 (1994).</li>
<li>Porcelli, S. A., Modlin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD1+System%3A+Antigen-presenting+molecules+for+T+cell+recognition+of+lipids+and+glycolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The CD1 System: Antigen-presenting molecules for T cell recognition of lipids and glycolipids.</a> Annu. Rev. Immunol. 17, 297-329 (1999).</li>
<li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+alpha-galactosylceramide-stimulated+Valpha24%2B+NKT+cells+cultured+in+the+absence+of+animal+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Expansion of alpha-galactosylceramide-stimulated Valpha24+ NKT cells cultured in the absence of animal materials.</a> J. Immunother. 28, 314-321 (2005).</li>
<li>Bella, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+maturation+of+peripheral+blood+dendritic+cells+in+patients+with+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Altered maturation of peripheral blood dendritic cells in patients with breast cancer.</a> Br. J. Cancer. 89, 1463-1472 (2003).</li>
<li>Onishi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+and+Short-Lived+Subsets+in+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+from+Patients+with+Advanced+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional and Short-Lived Subsets in Monocyte-Derived Dendritic Cells from Patients with Advanced Cancer.</a> Clinical Immunology. 105, 286-295 (2002).</li>
<li>Shimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+function+of+human+invariant+NKT+cells+from+cancer+patients+using+alpha-galactosylceramide-loaded+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the function of human invariant NKT cells from cancer patients using alpha-galactosylceramide-loaded murine dendritic cells.</a> J. Immunol. 177, 3484-3492 (2006).</li>
<li>Shiratsuchi, T., Schneck, J., Kawamura, A., Tsuji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD1+dimeric+proteins+as+indispensable+tools+for+research+on+CD1-binding+lipids+and+CD1-restricted+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Human CD1 dimeric proteins as indispensable tools for research on CD1-binding lipids and CD1-restricted T cells.</a> Journal of immunological. 345, 49-59 (2009).</li>
<li>Webb, T. J., Bieler, J. G., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+natural+killer+T+cells+by+CD1d1-Ig+coated+artificial+antigen+presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of natural killer T cells by CD1d1-Ig coated artificial antigen presenting cells.</a> J. Immunol. Methods. 346, 38-44 (2009).</li>
<li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+antigen-specific+T+cells+by+artificial+cell+constructs+having+immobilized+multimeric+peptide-class+I+complexes+and+recombinant+B7-Fc+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins.</a> J. Immunol. Methods. 249, 111-119 (2001).</li>
<li>Goldberg, J., Shrikant, P., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+augmentation+of+tumor-specific+CTL+responses+by+class+I%2Fpeptide+antigen+complexes+on+microspheres+%28large+multivalent+immunogen%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo augmentation of tumor-specific CTL responses by class I/peptide antigen complexes on microspheres (large multivalent immunogen).</a> J. Immunol. 170, 228-235 (2003).</li>
<li>Dal Porto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+soluble+divalent+class+I+major+histocompatibility+complex+molecule+inhibits+alloreactive+T+cells+at+nanomolar+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A soluble divalent class I major histocompatibility complex molecule inhibits alloreactive T cells at nanomolar concentrations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6671-6675 (1993).</li>
<li>Greten, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+antigen-specific+T+cells%3A+HTLV-1+Tax11-19-specific+CD8%2B+T+cells+are+activated+in+peripheral+blood+and+accumulate+in+cerebrospinal+fluid+from+HAM%2FTSP+patients%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of antigen-specific T cells: HTLV-1 Tax11-19-specific CD8+ T cells are activated in peripheral blood and accumulate in cerebrospinal fluid from HAM/TSP patients.</a> PNAS. 95, 7568-7573 (1998).</li>
<li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat. Med. 9, 619-625 (2003).</li>
<li>Huang, M. M. S., Borszcz, P., Sidobre, S., Kronenberg, M., Kane, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1d1+Displayed+on+Cell+Size+Beads+Identifies+and+Enriches+an+NK+Cell+Population+Negatively+Regulated+by+CD1d1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD1d1 Displayed on Cell Size Beads Identifies and Enriches an NK Cell Population Negatively Regulated by CD1d1.</a> J. Immunol. 172, 5304-5312 (2004).</li>
<li>Bourgeois, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pro-Th2+cytokine+IL-33+directly+interacts+with+invariant+NKT+and+NK+cells+to+induce+IFN-gamma+production%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The pro-Th2 cytokine IL-33 directly interacts with invariant NKT and NK cells to induce IFN-gamma production.</a> Eur. J. Immunol. 39, 1046-1055 (2009).</li>
<li>Ugel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+administration+of+artificial+antigen-presenting+cells+activates+low-avidity+T+cells+for+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo administration of artificial antigen-presenting cells activates low-avidity T cells for treatment of cancer.</a> Cancer Res. 69, 9376-9384 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

aAPC mogą być wykorzystywane do badania podstawowych wymagań niezbędnych do aktywacji komórek NKT i posiadają potencjalną wartość kliniczną w zakresie ekspansji komórek NK T ex vivo na potrzeby immunoterapii adopcyjnej. Mescher et al. opisali jeden z pierwszych systemów opartych na kuleczkach, w którym biotynilowane mysie konstrukty jednołańcuchowe MHC klasy I-peptydu połączono z biotynilowanymi cząsteczkami kostymulującymi B7.1 i B7.2 za pomocą streptawidyny na powierzchni mikrosfer lateksowych 14, 15. Podejście to z powodzeniem zastosowano do stymulacji antygenowo specyficznych limfocytów T pochodzących z myszy transgenicznych. Ponadto, ponieważ metoda ta wykorzystuje jednołańcuchowy kompleks MHC-peptyd w celu zapewnienia homogennego obciążenia cząsteczek MHC, każdy docelowy antygen peptydowy wymagałby nowej transfekcji w celu ekspresji pożądanego jednołańcuchowego kompleksu MHC-peptyd, co ogranicza uniwersalność tej metody. Co istotne, grupa dr. Schnecka zapoczątkowała stosowanie aAPC opartych na kuleczkach, opracowując inny niekomórkowy system aAPC, stworzony poprzez sprzęganie HLA-Ig (sygnał 1) oraz anty-CD28 (sygnał 2) z kuleczkami magnetycznymi. Przez jego grupę opracowano HLA-Ig, unikalną multimeryczną formę HLA połączoną z molekularnym rusztowaniem immunoglobulinowym 16, 17. Następnie opracowano aAPC oparte na MHC-Ig, które wykazały skuteczność w ekspansji CTL specyficznych dla CMV oraz MART-1 18. W niniejszej pracy wykazaliśmy, że aAPC oparte na CD1d-Ig mogą być wykorzystywane do ekspansji funkcjonalnych komórek NKT. W jednej z badań wykorzystano podobny system do analizy fizycznej interakcji komórek NK z CD1d 19.
Warto zauważyć, że zaprojektowaliśmy sztuczną komórkę prezentującą antygen, która jest dostosowana do wszelkich wymagań niezbędnych dla optymalnej proliferacji komórek NKT. Metoda ekspansji z użyciem aAPC stanowi prosty i niezawodny sposób namnażania i wzbogacania ludzkich komórek NKT. Nasze aAPC mogą być modyfikowane w celu systematycznej oceny roli panelu potencjalnych cząsteczek kostymulujących oraz analizy ich wpływu na proliferację i funkcję komórek NKT. Tym samym aAPC stanowią solidną i wszechstronną technologię przydatną do indukcji i ekspansji komórek NKT. Generowanie aAPC trwa mniej niż tydzień i nadaje się do produkcji dużych ilości kulecek. Jednak krytycznym krokiem podczas tworzenia aAPC jest potwierdzenie, że CD1d-Ig jest stabilnie unieruchomiony na powierzchni kulecek oraz ocena ich funkcjonalności w celu zapewnienia spójności między partiami. Potencjalnym ograniczeniem systemu jest brak mechanizmu wyłączającego stymulację, poza mechanicznym usunięciem kulecek. W szczególności, zaangażowanie receptora limfocytów T (TCR) z kompleksem antygenu: CD1d/MHC zazwyczaj prowadzi do powstania synapsy immunologicznej we współpracy z cząsteczkami akcesoryjnymi/adhezyjnymi, co może skutkować indukcją czynników hamujących lub supresyjnych zarówno w limfocycie T, jak i w komórce prezentującej antygen. W systemie aAPC czynniki te mogą być upregulowane przez limfocyt T, jednak kulecka nie będzie wykazywać ekspresji kognatywnych ligandów dla tych receptorów.
Ponadto wykazano, że komórki NKT CD4+ hamują odpowiedzi przeciwnowotworowe u myszy i ludzi, zatem możliwe jest, że nieselektywna aktywacja wszystkich komórek NKT (t.j. globalna stymulacja za pomocą α-GalCer) lub aktywacja niewłaściwego podzbioru może doprowadzić do niepożądanych skutków immunologicznych. W związku z tym należy przeprowadzić charakterystykę fenotypową i funkcjonalną populacji komórek NKT expandowanych za pomocą aAPC. Jak pokazano na Rysunku 4, stwierdziliśmy, że stymulacja za pomocą naładowanych α-GalCer aAPC wykazujących ekspresję anty-CD28 może prowadzić do produkcji cytokin typu Th1, Th2 i Th17 przez komórki NKT. W badaniach na myszach zgłoszono, że podanie IL-33, niedawno zidentyfikowanej cytokiny, spowodowało wzrost poziomu krążących cytokin zapalnych, takich jak IL-5 i IL-13. Leczenie komórek NKT za pomocą IL-33 zwiększyło ich produkcję cytokin 20. IL-33 jest specyficznym ligandem dla ST2 i wykazano, że rozpuszczalne ST2 może blokować sygnalizację IL-33. Zatem jako przykład przyszłego zastosowania można by wygenerować aAPC wykazujące ekspresję ST2 i wykorzystać je do sprawdzenia, czy można selektywnie hamować produkcję cytokin Th2 przy jednoczesnym indukowaniu sekrecji cytokin Th1 przez komórki NKT. Poinformowano również, że dożylne wstrzyknięcie aAPC wykazujących ekspresję Kb myszom C57BL/6 skutkowało zmniejszeniem przerzutów nowotworu do płuc 21. Co ważne, dane te demonstrują, że aAPC migrują do płuc i są w stanie aktywować podzbiory efektorowych limfocytów T. Zatem można by wygenerować wiele typów aAPC i zbadać interakcje między antygenowo specyficznymi podzbiorami limfocytów T. Podsumowując, badania te wykazują, że aAPC oparte na CD1d-Ig mogą być stosowane jako zamiennik normalnych komórkowych APC i mają potencjał do usprawnienia obecnych podejść klinicznych w zakresie adoptywnej immunoterapii opartej na komórkach NKT.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-1440</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wzbogacania ludzkich limfocytów T EasySep</td><td>StemCell Technologies</td><td>19051</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu CD161 znakowane allofikocyjaniną</td><td>Pharmingen</td><td>550968</td><td></td></tr><tr><td>Magnes EasySep</td><td>StemCell Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokulki anty-IgG1 mysie</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-047-101</td><td></td></tr><tr><td>Dimer XI Rekombinowane Rozpuszczalne Dymeryczne Białko Fuzyjne CD1d:IG mysie</td><td>BD Biosciences</td><td>557599</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne anty-CD28</td><td>Biolegend</td><td>302914</td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki epoksydowe M-450</td><td>Life Technologies</td><td>150-11</td><td></td></tr><tr><td>Alfa-galaktozyloceramid (KRN7000)</td><td>Axxora, LLC</td><td>BML-SL232-0100</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka RPMI 1640</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R 0883</td><td></td></tr><tr><td>pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy nieessentialne</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór witamin</td><td>Gibco</td><td>11120-052</td><td></td></tr><tr><td>2-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyprofloksacyna</td><td>Alexis Biochemicals</td><td>380-288-G025</td><td></td></tr><tr><td>PE-V&amp;alpha;24J&amp;alpha;18 </td><td>Biolegend</td><td>342904</td><td></td></tr><tr><td>PE-V&amp;alpha;24 (Klon C15) </td><td>Beckman Coulter</td><td>A66907</td><td></td></tr><tr><td>FITC-V&amp;#946;11 (Klon C21) </td><td>Beckman Coulter</td><td>A66905</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD1d</td><td>Biolegend</td><td>123510</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie IgG1 znakowane PE</td><td>BD Biosciences</td><td>556650</td><td></td></tr><tr><td>FITC przeciwciało anty-mysie IgG2a</td><td>Biolegend</td><td>407105</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Albumin surowicy bydlęcej</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00440-00100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 (Proleukin)</td><td>BD Biosciences</td><td>354043</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie serum AB</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S40110</td><td></td></tr><tr><td>Rotator do probówek Labquake</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-687-10Q</td><td></td></tr><tr><td>probówki polistyrenowe z okrągłym dnem BD Falcon 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-1A</td><td></td></tr><tr><td>Szklane fiolki na próbki Wheaton z nakrętką</td><td>Fisher Scientific</td><td>Mały (03-343-6A) Duży (03-343-6E)</td><td></td></tr></tbody></table>

aktywacja i ekspansja komórek natural killer t (nkt) za pośrednictwem sztucznych komórek prezentujących antygen (aapc)

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Komórki natural killer T (NKT) stanowią unikalną subpopulację limfocytów T, które wykazują markery charakterystyczne zarówno dla komórek natural killer (NK), jak i limfocytów T1. W przeciwieństwie do klasycznych limfocytów T, komórki NKT rozpoznają antygeny lipidowe w kontekście cząsteczek CD12. Komórki NKT wykazują niezmienną rearanżację łańcucha TCRα: Vα14Jα18 u myszy oraz Vα24Jα18 u ludzi, co wiąże się z łańcuchami Vβ o ograniczonej różnorodności3-6; są one określane jako kanoniczne lub niezmienne komórki NKT (iNKT). Podobnie jak konwencjonalne limfocyty T, komórki NKT rozwijają się z CD4-CD8- prekursorowych limfocytów T w grasicy po odpowiednim sygnale przekazanym przez CD1d 7. Potencjał wykorzystania komórek NKT w celach terapeutycznych znacznie wzrósł dzięki możliwości stymulacji i ekspansji ludzkich komórek NKT za pomocą α-galaktozyloceramidu (α-GalCer) i różnych cytokin8. Co istotne, komórki te zachowały swój pierwotny fenotyp, wydzielały cytokiny i wykazywały funkcję cytotoksyczną przeciwko liniom komórek nowotworowych. Zatem komórki NKT rozszerzone ex vivo pozostają funkcjonalne i mogą być stosowane w adoptywnej immunoterapii. Jednak immunoterapia oparta na komórkach NKT jest ograniczona przez konieczność stosowania autologicznych komórek prezentujących antygen, a ilość i jakość tych komórek stymulujących mogą się znacznie różnić. Wykazano, że pochodne z monocytów komórki DC u pacjentów z nowotworami wykazują obniżony poziom cząsteczek kostymulujących i produkują mniej cytokin prozapalnych9,10. W rzeczywistości do testowania funkcji komórek NKT u pacjentów z CML stosowano mysie komórki DC zamiast autologicznych APC11. System ten może być jednak wykorzystywany wyłącznie do testów in vitro, ponieważ komórki NKT nie mogą być rozszerzane przez mysie DC, a następnie wykorzystywane do adoptywnej immunoterapii. W związku z tym standaryzowany system oparty na sztucznych komórkach prezentujących antygen (aAPC) mógłby wywoływać efekty stymulujące typowe dla DC, eliminując wady związane z komórkami allogenycznymi lub ksenogenicznymi12, 13. W niniejszej pracy opisujemy metodę generowania aAPC opartych na CD1d. Ponieważ zaangażowanie receptora limfocytów T (TCR) przez kompleksy antygen-CD1d jest podstawowym wymogiem aktywacji komórek NKT, kompleksy antygen: CD1d-Ig stanowią niezawodną metodę izolacji, aktywacji i ekspansji populacji efektorowych komórek NKT.

W niniejszej pracy opisujemy metodę generowania sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC) opartych na CD1d-Ig, wytwarzanych poprzez kowalencyjne sprzęganie CD1d-Ig i przeciwciała mAb anty-CD28 z kulkami magnetycznymi w celu stymulacji komórek NKT jako zstandaryzowanej metody propagacji komórek NKT (Rysunek 1). Po pierwsze, należy wykazać, że białka fuzyjne CD1d-Ig są stabilnie unieruchomione na powierzchni kulek magnetycznych. Jak pokazano na Rysunku 2A, zarówno CD1d-Ig, jak i przeciwciała anty-CD28 były eksponowane na powierzchni kulek magnetycznych. Aby zbadać zdolność stymulacyjną aAPC, przeprowadzono kokulturę hybrydomów komórek NKT z aAPC przez noc, zebrano nadsącz z kultur i zmierzono produkcję IL-2 za pomocą testu ELISA. Stwierdzono, że aAPC oparte na CD1d-Ig były w stanie stymulować hybrydomy komórek NKT na poziomach równych lub wyższych niż ich komórkowe odpowiedniki (Rysunek 3, dane nie pokazano). Co ciekawe, odkryliśmy, że nasze mysie hybrydomy komórek NKT są stymulowane przez aAPC oparte na ludzkim CD1d (Rysunek 2B), co zapewnia prostą metodę testowania każdej partii aAPC.
Następnie postanowiono zademonstrować potencjał propagacyjny aAPC, w związku z czym z krwi obwodowej wyizolowano ludzkie limfocyty T. Najpierw frakcję limfocytów T CD161+CD3+ wzbogacono za pomocą separacji magnetycznej. Następnie limfocyty T stymulowano dwa razy w tygodniu aAPC obciążonymi $\alpha$-GalCer. Co istotne, stwierdzono, że nawet przy stosunkowo niskiej początkowej populacji komórek NKT (0,03%), udało się zwiększyć liczbę komórek do ~67% V$\alpha$24+V$\beta$11+ (Rycina 3). Przeprowadzono ekspansję komórek NKT z PBMC wielu zdrowych ochotników oraz pacjentów onkologicznych i stwierdzono, że aAPC obciążone $\alpha$-GalCer były w stanie zwiększyć populację komórek NKT w obu grupach. Warto zauważyć, że tempo ekspansji było w dużym stopniu zależne od dawcy. Zgodnie z oczekiwaniami, im wyższa była początkowa populacja komórek V$\alpha$24+, tym większy był procent ekspansji. Dodatkowo, przy zastosowaniu populacji wyjściowej 2 milionów limfocytów T CD161+CD3+, po dwóch rundach ekspansji można uzyskać &gt;107 komórek (Tabela 1). Około 80-90% wyekspandowanych komórek NKT to komórki CD4+, ~5% to CD8+, a pozostałe są prawdopodobnie podwójnie negatywnymi komórkami NKT CD4-CD8-. Te wyekspandowane komórki NKT mogą być wykorzystane do badań funkcjonalnych, jak pokazano na Rycini 4A-C. Stwierdzono, że wyekspandowane ex vivo komórki NKT pozostają responsywne na stymulację $\alpha$-GalCer i są silnymi producentami IL-17A, TNF-$\alpha$ oraz IFN-$\gamma$. Należy zauważyć, że jeśli początkowa populacja wzbogaconych limfocytów T jest niska i nie można przeprowadzić drugiego etapu wzbogacania CD161, ekspansja zapośredniczona przez aAPC może nie przynieść oczekiwanych rezultatów (patrz Rycina 4D, Dawca 1). Jednakże, jeśli odsetek krążących komórek NKT jest wyższy niż 0,1%, nadal powinno być możliwe uzyskanie znaczącej ekspansji komórek iNKT. Wspólnie dane te wykazują, że aAPC oparte na CD1d mogą być skutecznie wykorzystywane do ekspansji i stymulacji pierwotnych ludzkich komórek NKT.
<img alt="Schemat koniugacji kulek magnetycznych z przeciwciałami w celu syntezy aAPC do analizy immunologicznej." src="/files/ftp_upload/4333/4333fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Schemat aAPC opartych na CD1d:Ig Części zewnątrzkomórkowe cząsteczki CD1d są połączone z regionem stałym białka ciężkiego łańcucha immunoglobulin za pomocą krótkiego łącznika aminokwasowego. Cząsteczki te można łatwo obciążyć antygenami lipidowymi, takimi jak α-GalCer, poprzez prostą inkubację z nadmiarem interesującego lipidu. aAPC przygotowano poprzez sprzężenie CD1d-Ig oraz przeciwciał anty-CD z kulkami magnetycznymi. W tym systemie CD1d-Ig służy do dostarczenia swoistego dla antygenu sygnału poprzez TCR, a przeciwciało monoklonalne anty-CD28 zapewnia sygnał kostymulujący.
<img alt="Histogram cytometrii przepływowej; wykres słupkowy produkcji IL-2; test komórek DN32.D3; analiza odpowiedzi immunologicznej." fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Barwienie FACS białek powierzchniowych na aAPC. A) aAPC przebadano pod kątem obecności dimeru CD1d:IgG (poprzez barwienie przeciwciałem anty-mysim IgG1 sprzężonym z PE) oraz przeciwciała anty-CD28 (przy użyciu przeciwciała anty-mysiego IgG2a sprzężonego z FITC). Otwarte histogramy wskazują kontrolę izotypową; wypełnione histogramy reprezentują wskazane przeciwciała. aAPC wykazujące ekspresję CD1d-Ig mogą stymulować produkcję IL-2 przez komórki NKT. B) Hybrydoma komórek NKT myszy Vα14+, DN32.D3, była współhodowana z medium, rozpuszczalnym antygenem (α-GalCer), nieobciążonymi aAPC lub aAPC obciążonymi α-GalCer. Zebrano nadsączniki hodowlane i zastosowano standardowy test ELISA metodą kanapkową w celu pomiaru produkcji IL-2.
<img alt="Wykresy kropkowe rozproszenia z cytometrii przepływowej i wykres liniowy; analiza populacji komórek i odpowiedzi cytotoksycznej." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Ekspansja komórek NKT za pomocą sztucznych komórek prezentujących antygen powlekanych CD1d-Ig. (A) Pierwotne komórki podwójnie dodatnie CD3+CD161+ zostały wyizolowane z PBMC za pomocą separacji magnetycznej. Posortowane komórki stymulowano aAPC powlekanymi CD1d-Ig i obciążonymi α-GalCer przez 14 dni. Po stymulacji aAPC komórki barwiono na Vα24 i Vβ11. (B) Liza linii chłoniaka komórek B zapośredniczona przez pierwotne ludzkie komórki NKT. Komórki C1R-CD1d inkubowano z komórkami NKT w indicated ratios w obecności lub braku antygenu, α-GalCer (100 ng/ml), w płytkach 96-dołkowych z dnem w kształcie litery U przez 20-24 h. Lizę komórek zapośredniczoną przez komórki NKT oceniano za pomocą standardowego testu uwalniania 51Cr.)
<img alt="Wykresy słupkowe i punkty rozrzutu poziomów cytokin oraz aktywacji komórek w analizie odpowiedzi immunologicznej." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. Profile cytokinowe komórek NKT ekspandowanych przy użyciu aAPC. Po dwutygodniowej stymulacji za pomocą aAPC obciążonych α GalCer, ekspandowane komórki NKT (1×105/studzienkę) współhodowano przez 48 hr z rozpuszczalnym α-GalCer, PMA/jonomycyną, mikrogranulkami anti-CD3/28 lub aAPC obciążonymi α-GalCer (2×105/studzienkę). (A) Produkcję IL-17A, (B) TNF-α oraz (C) IFN-γ zmierzono standardową metodą ELISA dla cytokin. Przedstawione dane to netto produkcja cytokin po odjęciu wartości dla kontroli negatywnych (pożywka i puste granulki). (D) Pierwotne komórki T wyizolowano z PBMC przy użyciu separacji magnetycznej. Posortowane komórki stymulowano przez dwa tygodnie wskazanymi aAPC obciążonymi α-GalCer. Komórki barwiono przeciwciałami specyficznymi dla Vα24+ oraz Vβ11+ i analizowano metodą cytometrii przepływowej.

W niniejszej pracy opisujemy metodę aktywacji i ekspansji ludzkich komórek NKT z populacji zmieszanych limfocytów T przy użyciu sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC). Wykorzystanie aAPC opartych na CD1d zapewnia zestandaryzowaną metodę generowania wysokiej liczby funkcjonalnych komórek NKT.

Aktywacja i ekspansja komórek Natural Killer T (NKT) za pośrednictwem sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC)

Komórki natural killer T (NKT) to wyjątkowa subpopulacja limfocytów T, które wykazują markery charakterystyczne zarówno dla komórek natural killer (NK), jak i limfocytów T1. W przeciwieństwie do...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC) opartych na CD 1D w celu ekspansji komórek NK T. Jest to realizowane poprzez najpierw dodanie białek w celu funkcjonalizacji kulek magnetycznych. W drugim kroku następuje wzbogacenie początkowej populacji komórek NK T z krwi obwodowej.Następnie wzbogacone limfocyty T są hodowane wspólnie z A A PC. W ostatnim kroku ocenia się fenotyp i funkcję populacji komórek A A PC. Ostatecznie czystość namnożonych subpopulacji limfocytów T można określić za pomocą analizy cytometrycznej. Główną zaletą APC w porównaniu z obecnymi metodami wykorzystującymi komórki dendrytyczne jest fakt, że w przypadku komórek dendrytycznych może występować duża zmienność między dawcami.Sztuczne komórki prezentujące antygen (APCs) zapewniają powtarzalną, standaryzowaną i gotową do użycia metodę ekspansji komórek NK T. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy pracowałem z dr Schneckiem i zespołem na Johns Hopkins. Byli oni pionierami w dziedzinie wykorzystania sztucznych kompleksów prezentujących antygen do ekspansji klasycznych podzbiorów limfocytów T CD8.Procedurę zademonstrują dr James East, stażysta postdoctoralny, oraz syn dr Wendy, badacz współpracujący z mojego laboratorium. Należy rozpocząć od przeniesienia 1 mL kulek dyna bead M four 50 epoxy do 5 mL przezroczystej fiolki z gwintem wykonanej z borokrzemianowego szkła. Następnie należy wypłukać kulki 3 mL sterylnego buforu bore eight w oddzielnej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.Dodaj 100 µg ludzkiego dimeru CD 1D IG oraz 20 µg wybranych cząsteczek kostymulujących do 1 mL PBS pozbawionego wapnia i magnezu. Następnie umieść szklaną fiolkę zawierającą koraliki na magnesie i odessaj bufor boranowy. Po tym dodaj mieszaninę białek do fiolki i zakręć ją.Natychmiast wymieszaj roztwór, odwracając fiolkę, następnie zabezpiecz korek parafilmem i pozostaw ją na rotatorze przez noc w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza. Następnego dnia ponownie umieść szklaną fiolkę na magnesie i ostrożnie usuń mieszaninę białek, unikając pobrania kulek. Przemyj kulki trzykrotnie, dodając trzy mililitrów buforu do mycia kulek i inkubując je na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza przez pięć minut.Aby potwierdzić, że białka zostały stabilnie uniesione na kulkach, należy zabarwić alikwot kulek przeciwciałami i poddać je analizie cytometrycznej. Następnie przenieść 5 × 10⁷ kulek do małej szklanej fiolki o pojemności 1,5 ml i wypłukać kulki 1 ml sterylnego PBS. Przechowywać od 48 do 72 godzin przed użyciem.Załaduj przemyte kulki antygenem w jednym mililitrze sterylnego PBS podczas procesu ładowania antygenu na kulki. Pobierz PBMC, najpierw rozcieńczając heparynowaną krew dawcy równą objętością PBS w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 15 mililitrów PHI w temperaturze pokojowej do stożkowych probówek o pojemności 50 mililitrów i powoli nanieś 25 mililitrów rozcieńczonej mieszaniny krwi na wierzch PHI.Następnie odwiruj próbki przez 30 minut przy 700 ×g i temperaturze pokojowej z wyłączonym hamowaniem. Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie przenieś warstwę limfocytów do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Następnie przemyj limfocyty w 50 ml PBS, odrzuć nadsącz i połącz zawartość probówek pochodzących od jednego dawcy w jednej probówce.Po ponownym przemyciu PBMC 20 mililitrami PBS, należy policzyć komórki, a następnie zawiesić je w buforze max w stężeniu 5 × 10⁷ komórek na mililitr. Aby wyizolować frakcję limfocytów T, należy inkubować 100 mikrolitrów roztworu do wzbogacania limfocytów T PAN z zestawu do wzbogacania ludzkich limfocytów T EP z dwoma mililitrami PBMC przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie roztwór należy inkubować z 100 mikrolitrami kulek magnetycznych w temperaturze pokojowej przez kolejne 10 minut.Dopełnij objętość rozpuszczalnika do 2,5 milliliters, a następnie umieść probówkę w magnesie. Po pięciu minutach szybko przelej frakcję dodatnią CD3 do probówki stożkowej o pojemności 15 milliliters. Następnie przemyj komórki w pięciu milliliters zimnego buforu max i dokonaj zliczenia żywych komórek.Pobierz alikwot do barwienia kontrolnego, aby w pierwszej kolejności wyselekcjonować komórki CD 1 61 dodatnie. Resuspenduj wzbogacone limfocyty T w 980 µL lodowatego buforu max, a następnie inkubuj komórki z 10 µg przeciwciała monoklonalnego anty-CD 1 61 przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po przemyciu komórek zresuspenduj osad w 800 µL buforu max i 200 µL mikro kulek anty-US IgG 1.Inkubować ten roztwór w temperaturze 4°C przez kolejne 10 minut. Podczas inkubacji komórek z mikrokuleczkami, dodać 3 mL buforu MAX w celu równoważenia kolumny LS. Po przemyciu tej frakcji komórek, powoli pipetować komórki w 3 mL buforu MAX do kolumny.Następnie wypłucz kolumnę trzykrotnie, używając po 3 ml świeżego buforu max. Następnie dodaj do kolumny kolejne 3 ml świeżego buforu max i przenieś kolumnę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wyciśnij oczyszczone komórki CD161+ CD3+ i oblicz liczbę komórek we frakcji wzbogaconej w komórki NKT.Krok ten należy rozpocząć od kokultury 10⁶ wzbogaconych limfocytów T CD161+ CD3+ oraz 10⁶ allogenicznych komórek prezentujących antygen (aAPC) w 16 ml pożywki kompletnej. Następnie do płytki 96-dołkowej z polistyrenu o dnie w kształcie litery U, traktowanego do hodowli tkankowej i wyposażonej w pokrywkę ograniczającą parowanie, należy nanieść 160 µL kokultury na każdy dołek. W dniu 12–14 należy zebrać i przeliczyć komórki. Populacje należy przeanalizować za pomocą analizy cytometrycznej, a następnie ponownie poddać kokulturze.Po przeprowadzeniu drugiej rundy ekspansji, nadmiarowe komórki NKT, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, należy zamrozić. Aby przetestować funkcjonalność komórek A APC, w pierwszej kolejności należy przeprowadzić kokulturę 5×10⁴ komórek NKT na studzienkę z 5×10⁵ komórek A APC w końcowej objętości 200 µL pożywki kompletnej w 96-dołkowej płytce z zaokrąglonym dnem. Po 24–48 godzinach należy zebrać nadsącz z hodowli komórkowej do analizy metodą ELISA. Pierwsza rycina pokazuje, że białka CD1D IG są stabilnie unieruchomione na powierzchni kulek magnetycznych, co przedstawiono tutaj.Przeciwciała CD 1D IG oraz anty-CD 28 są wykazywane na powierzchni kulek magnetycznych, co przedstawiono na tym wykresie. Hybrynoma komórek NK T myszy DN 30 2D three, pozytywna pod kątem V alpha 14, była współhodowana z rozpuszczalnymi w medium A A PC nieobciążonym antygenem alpha-galactosyl, lub A A PC obciążonym alpha-gal. Następnie pobrano nadsącz z kultur i zmierzono produkcję IL two za pomocą metody ELISA, co stanowi prostą metodę testowania każdej partii komórek prezentujących antygen. W tym doświadczeniu ludzkie komórki T krwi obwodowej, pozytywne pod kątem CD 1 61 i CD three, zostały wzbogacone poprzez separację na kulkach magnetycznych.Komórki stymulowano następnie raz w tygodniu przez 14 dni za pomocą A A PC obciążonego alpha galera, a następnie analizowano ekspresję V alpha 24 i V beta 11. Co istotne, stwierdzono, że nawet przy stosunkowo niskiej początkowej populacji komórek NKT wynoszącej 0,03%, możliwe było ich namnożenie do populacji w około 67% pozytywnej pod kątem V alpha 24 i V beta 11. W tym etapie komórki C one R CD 1D inkubowano z komórkami NKT w określonych proporcjach, w obecności lub nieobecności antygenu Alpha Gal SER, w 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery U przez 20 do 24 godzin.Lize komórek linii chłoniaka z komórek B pośredniczona przez komórki NKT oceniono następnie za pomocą testu uwalniania chromu. Komórki NKT rozszerzone w obecności PC były w stanie lizować tę linię komórek chłoniaka. W obecności lub przy braku alfa-galeractyny, komórki NKT zostały rozszerzone z PBMC zarówno zdrowych ochotników, jak i pacjentów onkologicznych, a następnie obciążone alfa-galeractyną.W obu grupach udało się zwiększyć populacje komórek NKT. Przy zastosowaniu populacji wyjściowej składającej się z 2 milionów komórek T CD161+ CD3+, po dwóch rundach ekspansji można uzyskać ponad 10⁷ komórek. Ekspandowane komórki NKT mogą być wykorzystane do badań funkcjonalnych, co zostało tutaj zademonstrowane.Komórki NKT rozszerzone ex vivo pozostają responsywne na stymulację Alpha GAL i są silnymi producentami IL 17 A, TNF alpha oraz interferonu gamma. Należy zauważyć, że jeśli początkowa populacja wzbogacona w limfocyty T jest niska i nie można przeprowadzić drugiego etapu wzbogacenia CD 1 61, ekspansja zapośredniczona przez A A PC może nie przynieść oczekiwanych rezultatów. Jeśli jednak odsetek krążących komórek NKT jest wyższy niż 0,1%, nadal powinno być możliwe uzyskanie znaczącej ekspansji niezmienniczych komórek NKT.Łącznie dane te wykazują, że PC oparty na CD 1D może być skutecznie wykorzystywany do ekspansji i stymulacji pierwotnych ludzkich komórek NK T. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak QPCR, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące kinetyki aktywacji komórek NK T po ich namnożeniu. Technika ta toruje drogę badaczom z dziedziny hepatologii do zgłębienia roli komórek NKT w stłuszczeniowej chorobie wątroby.

artificial-antigen-presenting-cell-aapc-mediated-activation-expansion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Aktywacja i ekspansja Natural Killer T Cells za pośrednictwem komórek prezentujących antygen sztuczny (aAPC)

Komórki Natural Killer T (NKT) są kluczowymi czynnikami determinującymi odpowiedź immunologiczną na nowotwory, regulację autoimmunizacji, eliminację infekcji oraz rozwój blaszek miażdżycowych. W tym wywiadzie Mitch Kronenberg omawia wysiłki swojego laboratorium mające na celu zrozumienie mechanizmu, poprzez który komórki NKT są aktywowane przez antygeny glikolipidowe.

Wywiad: Prezentacja antygenów glikolipidowych przez CD1d oraz potencjał terapeutyczny aktywacji komórek NKT

W niniejszej pracy opisujemy metodę wydajnej ekspansji i oczyszczania dużych ilości ludzkich komórek NK oraz oceny ich funkcji.

Ekspansja, oczyszczanie i ocena funkcjonalna ludzkich komórek NK z krwi obwodowej

Opisano nową metodę indukcji i ekspansji antygenowo swoistych limfocytów T, niezależną od komórek dendrytycznych (DC). Sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC) oparte na HLA A2-Ig są ładowane peptydami ograniczonymi przez HLA-A2 w celu efektywnej ekspansji CTL o różnej swoistości antygenowej. Technologia ta wykazuje duży potencjał w zastosowaniu w immunoterapii adoptywnej opartej na CTL.

Sztuczne komórki prezentujące antygen oparte na HLA-Ig dla efektywnej ekspansji ludzkich CTL ex vivo

Ten film opisuje protokół izolacji limfocytów T CD8+ specyficznych dla rzadkiego antygenu za pomocą magnetycznych komórek prezentujących sztuczny antygen oparty na nanocząstkach (aAPC) funkcjonalizowanych antygenowymi peptydami MHC-Igs i przeciwciałami anty-CD28. Interakcja aAPC z limfocytami T CD8 + specyficznie eksprymującymi receptory limfocytów T ukierunkowanych na peptydy antygenowe, a następnie ich ekspansję in vitro, powoduje wzbogacenie i ekspansję tej populacji limfocytów T CD8 +.

Wzbogacanie i ekspansja limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu

wyrażające specyficzny dla CD19 receptor antygenu chimerycznego (CAR) są podawane jako eksperymentalne leczenie nowotworów złośliwych komórek B w naszych pierwszych badaniach klinicznych terapii genowej u ludzi. Opisujemy modyfikację genetyczną limfocytów T przy użyciu systemu Śpiącej Królewny (SB) w celu wprowadzenia specyficznego dla CD19 CAR i selektywnej propagacji na zaprojektowanych sztucznych komórkach prezentujących antygen CD19 +.

Kliniczne zastosowanie śpiącej królewny i sztucznych komórek prezentujących antygen do genetycznej modyfikacji limfocytów T z krwi obwodowej i pępowinowej

Przedstawiono wytyczne dotyczące generowania zabójczych komórek prezentujących sztuczny antygen, KaAPC, skutecznego narzędzia do in vitro wyczerpywania ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu oraz alternatywnego rozwiązania dla immunoterapii komórkowej w leczeniu chorób autoimmunologicznych za pośrednictwem limfocytów T w sposób specyficzny dla antygenu bez narażania pozostałego układu odpornościowego.

Zabójcze sztuczne komórki prezentujące antygen (KaAPC) do skutecznego zubożania in vitro ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego i powtarzalnego generowania biologicznie inspirowanych, biodegradowalnych komórek prezentujących antygen sztuczny (aAPC) o regulowanym rozmiarze, kształcie i prezentacji białka powierzchniowego do ekspansji limfocytów T ex vivo lub in vivo.

Wytwarzanie anizotropowych polimerowych sztucznych komórek prezentujących antygen do aktywacji limfocytów T CD8 +

Limfocyty T specyficzne dla antygenu są trudne do scharakteryzowania lub wykorzystania w terapiach ze względu na ich ekstremalnie niską częstotliwość. W tym miejscu przedstawiamy protokół rozwoju cząsteczki magnetycznej, która może wiązać się z limfocytami T specyficznymi dla antygenu, aby wzbogacić te komórki, a następnie rozszerzyć je kilkaset razy zarówno w celu charakteryzacji, jak i terapii.

Wzbogacanie i rozszerzanie rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu za pomocą nanocząstek magnetycznych

Opisujemy szybki i solidny protokół wzbogacania niezmiennych komórek T natural killer (iNKT) ze śledziony myszy i rozszerzania ich in vitro do odpowiedniej liczby dla badań in vitro i in vivo.

Oczyszczanie i namnażanie mysich niezmiennych limfocytów T NK do badań in vitro i in vivo

Tutaj prezentujemy metodę rozszerzania naturalnego killera krwi obwodowej (PBNK), komórek NK z tkanek wątroby oraz chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-komórek NK pochodzących z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) lub krwi pępowinowej (CB). Protokół ten demonstruje ekspansję komórek NK i CAR-NK przy użyciu ogniw zasilających 221-mIL-21 oprócz zoptymalizowanej czystości ekspandowanych komórek NK.

Metoda ekspansji komórek NK i CAR-NK przy użyciu linii komórkowej B zmodyfikowanej przez błonę IL-21

Tutaj prezentujemy metodę różnicowania i rozszerzania ludzkich komórek NK wyrażających chimeryczny receptor antygenowy (CAR) pochodzących z ludzkiego iPSC z ulepszonym zabijaniem przeciwko różnym nowotworom złośliwym. Protokół ten demonstruje różnicowanie i ekspansję komórek CAR-NK pochodzących z iPSC zoptymalizowanych pod kątem metody NK oraz pomiar aktywności przeciwnowotworowej przeciwko różnym liniom komórek nowotworowych.

Postępy w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach NK wykazujących ekspresję receptora chimerycznego antygenu macierzystego

Poznaj metodę aktywacji i ekspansji limfocytów T NK za pomocą sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC) opartych na CD1d. Ta technika umożliwia uzyskanie dużych liczb czynnych komórek NKT z krwi obwodowej.

Aktywacja i ekspansja komórek Natural Killer T (NKT) za pośrednictwem sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC)

Przeglądaj więcej filmów