Aktywacja i ekspansja komórek Natural Killer T (NKT) za pośrednictwem sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC)

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie sztucznych komórek prezentujących antygen (A APC) opartych na CD 1D w celu ekspansji komórek NK T. Jest to realizowane poprzez uprzednie dodanie białek w celu funkcjonalizacji kulek magnetycznych. W drugim kroku przeprowadzono wzbogacenie początkowej populacji komórek NK T z krwi obwodowej.

Następnie wzbogacone limfocyty T poddaje się kokulturze z A A PC. W ostatnim kroku oceniany jest fenotyp i funkcja populacji komórek A A PC. Ostatecznie czystość namnożonych subpopulacji limfocytów T można określić za pomocą analizy cytometrycznej. Główną zaletą APC w porównaniu z obecnymi metodami wykorzystującymi komórki dendrytyczne jest fakt, że w przypadku komórek dendrytycznych może występować wysoka zmienność między donorami.

Sztuczne komórki prezentujące antygen (APCs) zapewniają powtarzalną, gotową do użycia i zestandaryzowaną metodę ekspansji komórek NK T. Pomysł na tę metodę pojawił się podczas mojej współpracy z dr. Schneckiem i zespołem na Johns Hopkins. Byli oni pionierami w wykorzystaniu sztucznych kompleksów prezentujących antygeny do ekspansji klasycznych subpopulacji limfocytów T CD8.

Procedurę zademonstrują dr James East, stażysta podoktorski, oraz syn dr Wendy, pracownik naukowy z mojego laboratorium. Należy rozpocząć od przeniesienia 1 ml kulek dyna bead M four 50 epoxy do 5 ml przezroczystej zakręcanej fiolki borokrzemowej. Następnie należy wypłukać kulki 3 ml sterylnego buforu bore eight w osobnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.

Do 1 ml PBS pozbawionego wapnia i magnezu dodać 100 µg ludzkiego dimeru CD 1D IG oraz 20 µg wybranych cząsteczek kostymulujących. Następnie umieścić szklaną fiolkę zawierającą kuleczki na magnesie i odessać bufor boranowy. Po tym dodać mieszaninę białek do fiolki i ponownie zakręcić korek.

Natychmiast wymieszaj roztwór, odwracając fiolkę, a następnie zabezpiecz zakrętkę parafilmem i pozostaw ją na rotatorze przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia ponownie umieść szklaną fiolkę na magnesie i ostrożnie usuń mieszaninę białek, unikając zassania kulek. Przemyj kulki trzykrotnie, dodając trzy mililitry buforu do płukania kulek i inkubując je na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.

Aby potwierdzić, że białka zostały stabilnie uniesione na kuleczki, zabarw alikwot kuleczek przeciwciałami i przeanalizuj je za pomocą analizy cytometrycznej. Następnie przenieś 5×10⁷ kuleczek do małej szklanej fiolki o pojemności 1,5 ml i wypłucz kuleczki 1 ml sterylnego PBS. Następnie przechowuj od 48 do 72 godzin przed użyciem.

Podczas nasycania kulek antygenem, należy załadować wypłukane kuleczki z antygenem w jednym mililitrze sterylnego PBS. PBMC należy zebrać, najpierw rozcieńczając heparynowaną krew dawcy równą objętością PBS w temperaturze pokojowej. Następnie do stożkowych probówek o pojemności 50 mililitrów należy dodać 15 mililitrów PHI w temperaturze pokojowej, a na wierzch PHI powoli nalać 25 mililitrów rozcieńczonej mieszaniny krwi.

Następnie odwiruj próbki przez 30 minut przy 700 ×g w temperaturze pokojowej z wyłączonym hamulcem. Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie przenieś frakcję limfocytów do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Następnie przemyj limfocyty w 50 ml PBS, odrzuć nadsącz i połącz probówki pochodzące od jednego dawcy w jednej probówce.

Po ponownym przemyciu PBMC 20 mililitrami PBS, należy policzyć komórki, a następnie ponownie zawiesić je w buforze max w stężeniu 5 × 10⁷ komórek na mililitr. Aby wyizolować frakcję limfocytów T, inkubuj 100 mikrolitrów roztworu do wzbogacania limfocytów T PAN z zestawu EP do wzbogacania ludzkich limfocytów T z dwoma mililitrami PBMC przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj roztwór z 100 mikrolitrami kulek magnetycznych w temperaturze pokojowej przez kolejne 10 minut.

Dopełnić objętość rozpuszczalnika do 2,5 mililitrów, a następnie umieścić probówkę w magnesie. Po pięciu minutach szybko zlać frakcję CD3-dodatnią do 15-mililitrowej probówki stożkowej. Następnie przemyć komórki w 5 mililitrach zimnego buforu MAC i policzyć żywe komórki.

Pobrać alikwot do barwienia w celu uprzedniej selekcji komórek CD 1 61 pozytywnych. Resuspendować wzbogacone limfocyty T w 980 µl lodowatego buforu max, a następnie inkubować komórki z 10 µg przeciwciała monoklonalnego anty-CD 1 61 przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po przemyciu komórek resuspendować osad w 800 µl buforu max oraz 200 µl mikrokulek anty-US IgG one.

Inkubować ten roztwór w temperaturze 4 °C przez kolejne 10 minut. Podczas inkubacji komórek z mikrokuleczkami, dodać 3 mL buforu MAX w celu równoważenia kolumny LS. Po przemyciu tej frakcji komórek, powoli pipetować komórki w 3 mL buforu MAX do kolumny.

Następnie przemyj kolumnę trzykrotnie, używając za każdym razem 3 ml świeżego buforu max. Do kolumny dodaj kolejne 3 ml świeżego buforu max, a następnie przenieś kolumnę do 15 ml probówki stożkowej. Wydobądź oczyszczone komórki CD161+ CD3+ i oblicz liczbę komórek w frakcji wzbogaconej o komórki NKT.

Krok ten należy rozpocząć od kokultury 10⁶ wzbogaconych limfocytów T CD161+ CD3+ oraz 10⁶ komórek AAPC w 16 ml pełnej pożywki. Do 96-dołkowej płytki z polistyrenu traktowanego do hodowli tkankowych z dołkami typu U oraz pokrywką ograniczającą parowanie należy przenieść po 160 µL kokultury na każdy dołek. W 12. lub 14. dniu należy zebrać i policzyć komórki. Populacje należy przeanalizować za pomocą analizy cytometrycznej, a następnie ponownie wprowadzić je do kokultury.

W przypadku rozszerzonych komórek NKT, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, nadmiar komórek NKT po drugiej rundzie ekspansji należy zamrozić. Aby przetestować funkcjonalność komórek A A PC, najpierw przeprowadź ko-kulturę 5×10⁴ komórek NKT na studnię z 5×10⁵ komórek A A PC w końcowej objętości 200 µL pełnej pożywki w 96-dołkowej płytce z wypukłym dnem. Po 24–48 godzinach pobierz nadsącz z hodowli komórkowej do analizy metodą ELISA. Pierwsza rycina demonstruje, że białka CD 1D IG są stabilnie unieruchomione na powierzchni kulek magnetycznych, co przedstawiono tutaj.

Przeciwciała CD 1D IG oraz anty-CD 28 są wyrażone na powierzchni kulek magnetycznych, co przedstawiono na tym wykresie. Hybrydoma komórek NK T myszy DN 30 2D trzy, wykazująca pozytywność dla V alpha 14, była współhodowana z APC A A nieobciążonym rozpuszczalnym antygenem alpha-galera lub APC A A obciążonym alpha-gal. Następnie pobrano nadsącz z hodowli i zmierzono produkcję IL two za pomocą testu Eliza, co zapewnia prostą metodę testowania każdej partii komórek prezentujących antygen. W tym doświadczeniu limfocyty T krwi obwodowej człowieka, pozytywne dla CD 1 61 i CD trzy, zostały wzbogacone metodą separacji na kulkach magnetycznych.

Komórki stymulowano następnie raz w tygodniu przez 14 dni za pomocą A A PC obciążonego alpha galera, a następnie analizowano ekspresję V alpha 24 oraz V beta 11. Co istotne, stwierdzono, że nawet przy stosunkowo niskiej początkowej populacji komórek NKT wynoszącej 0,03%, komórki te można było namnożyć do populacji z około 67% odsetkiem komórek dodatnich dla V alpha 24 i V beta 11. W tym przypadku komórki C one R CD 1D inkubowano z komórkami NKT w wskazanych proporcjach, w obecności lub przy braku antygenu Alpha Gal SER, w 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery U przez 20 do 24 godzin.

Lizę komórek linii chłoniaka komórek B zapośredniczoną przez komórki NKT oceniono następnie za pomocą testu uwalniania chromu. Komórki NKT po ekspansji w obecności PC były zdolne do lizy tej linii komórek chłoniaka. W obecności lub przy braku alfa-galerany, komórki NKT zostały wyhodowane z PBMC zarówno zdrowych ochotników, jak i pacjentów z nowotworami, a następnie obciążone alfa-galeraną.

Zarówno PC, jak i A byli w stanie zwiększyć populacje komórek NKT z obu grup. Przy zastosowaniu populacji wyjściowej składającej się z 2 milionów komórek T CD161+ CD3+, po dwóch rundach ekspansji można uzyskać ponad 10⁷ komórek. Ekspandowane komórki NKT mogą być wykorzystane do badań funkcjonalnych, co zostało tutaj zademonstrowane.

Komórki NKT rozszerzone ex vivo pozostają responsywne na stymulację Alpha GAL i są naszymi silnymi producentami IL 17 A, TNF alpha oraz interferonu gamma. Należy zauważyć, że jeśli początkowa populacja po wzbogaceniu w limfocyty T jest niska i nie można przeprowadzić drugiego etapu wzbogacenia o CD 1 61, ekspansja pośredniczona przez A A PC może nie przynieść oczekiwanych rezultatów. Jednakże, jeśli odsetek krążących komórek NKT jest wyższy niż 0,1%, nadal powinno być możliwe uzyskanie znaczącej ekspansji niezmiennych komórek NKT.

Kolektywnie dane te wykazują, że CD 1D bazujący A A PC może być wykorzystywany do skutecznej ekspansji i stymulacji pierwotnych ludzkich komórek NK T po przeprowadzeniu tej procedury. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak kinetyka aktywacji komórek NK T po ich rozwoju, można przeprowadzić inne metody, np. QPCR. Technika ta toruje drogę badaczom z dziedziny hepatologii do zgłębiania roli komórek NKT w stłuszczeniowej chorobie wątroby.