Name: Apetytywne asocjacyjne uczenie węchowe u larw Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Poznaj metodę apetytywnego uczenia węchowego u larw Drosophila w neurobiologii. Protokół z fruktozą jako nagrodą pozwala badać mechanizmy asocjacyjnego uczenia się i pamięci w prostym modelu organizmu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Szczególne podziękowania kierujemy do członków laboratorium Gerbera za instrukcje techniczne dotyczące ich układu eksperymentalnego oraz uwagi do manuskryptu. Dziękujemy również Lyubov Pankevych za opiekę nad muchami i utrzymanie szczepu typu dzikiego CantonS. Praca ta została sfinansowana z grantu DFG TH1584/1-1, grantu SNF 31003A_132812/1 oraz przez Zukunftskolleg Uniwersytetu w Konstancji (wszystkie dla AST).

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Larwy dzikiego typu Drosophila są hodowane w temperaturze 25 °C i wilgotności 60%-80% w cyklu światło/ciemność 14/10. Aby kontrolować dokładny wiek larw, do jednej fiolki (wysokość 6 cm i średnica 2,5 cm) zawierającej około 6 ml standardowej pożywki dla muszek umieszcza się zawsze 20 samic i 10 samców. Muszki mogą składać jaja przez 12 hr, po czym w drugim dniu są przenoszone do nowej fiolki. 5-6 dni po złożeniu jaj larwy osiągają stadium żerującego 3rd stadium larwalnego, jeśli są hodowane w 25 °C, i mogą zostać wykorzystane w eksperymencie behawioralnym. Należy jednak upewnić się, że pobiera się tylko larwy, które wciąż znajdują się w pożywce, a nie te ze ścianek fiolki. Larwy te osiągnęły już „wędrujące 3rd stadium larwalne” – krótko przed przepoczwarczeniem – a ich użycie komplikuje interpretację wyników.</li>
	<li>Przygotowanie szalek Petri z 2,5% agarozą (inne laboratoria stosują w całym eksperymencie stężenia agaru 1%, jednak niższe stężenia mogą pozwolić żerującym larwom w 3rd stadium larwalnym na wgryzanie się w podłoże): Rozpuścić 2,5 g agarozy w 100 ml ddH2O. Podgrzewać roztwór w kuchence mikrofalowej do momentu wrzenia. Ostrożnie wymieszać roztwór i ponownie wstawić go do kuchenki mikrofalowej, aż cała agaroza się rozpuści. Nalać gorący roztwór agarozy do szalek Petri tak, aby dno szalek było całkowicie zakryte, a roztwór agarozy tworzył gładką powierzchnię. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej i zamknąć pokrywki. Nie należy zamykać pokrywek natychmiast, aby zapobiec kondensacji wody na pokrywkach.</li>
	<li>Przygotowanie szalek Petri z 2M fruktozą: Rozpuścić 2,5 g agarozy w 100 ml ddH2O (ponownie, możliwe jest zastosowanie 1% stężenia agaru, jednak może to pozwolić żerującym larwom w 3rd stadium larwalnym na wgryzanie się w podłoże). Podgrzewać roztwór w kuchence mikrofalowej do momentu wrzenia. Ostrożnie wymieszać roztwór i ponownie wstawić go do kuchenki mikrofalowej, aż cała agaroza się rozpuści. Do gorącego roztworu ostrożnie dodać 35 g fruktozy; powoli mieszać mieszaninę aż do rozpuszczenia cukru, aby uniknąć gwałtownego wrzenia. Nalać gorący roztwór fruktozy i agarozy do szalek Petri tak, aby dno było całkowicie zakryte, a roztwór fruktozy i agarozy tworzył gładką powierzchnię. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej i zamknąć pokrywki. Nie należy zamykać pokrywek natychmiast, aby zapobiec kondensacji wody na pokrywkach.</li>
	<li>Przygotowanie pojemników z zapachem 1-oktanolu (OCT): Wlać 10 μl czystego OCT do specjalnie wykonanego teflonowego pojemnika na zapach i zamknąć go pokrywką z kilkoma małymi otworami, aby umożliwić odparowywanie zapachu. Szczegółowy opis pojemników znajduje się w pracy Gerber and Stocker 2007. Przygotować trzy pojemniki na zapach OCT. Pojemniki na zapach umożliwiają odparowywanie wprowadzonych substancji chemicznych, zapobiegając jednocześnie bezpośredniemu kontaktowi larw z tymi substancjami. W ten sposób opisane tutaj eksperymenty odnoszą się konkretnie do uczenia się olfaktorycznego u larw, bez zakłóceń związanych z efektami gustatorycznymi.</li>
	<li>Przygotowanie pojemników z zapachem octanu amylu (AM): Rozcieńczyć AM 1:50 w oleju parafinowym. Wlać 10 μl rozcieńczenia do specjalnie wykonanego teflonowego pojemnika na zapach i zamknąć go pokrywką z kilkoma małymi otworami, aby umożliwić odparowywanie zapachu. Przygotować trzy pojemniki na zapach AM. Rozcieńczenie jest ważne z powodów praktycznych, a mianowicie aby uniknąć silnej preferencji jednego zapachu nad drugim, co mogłoby zamaskować zależną od uczenia się zmianę w relatywnej preferencji między dwoma zapachami. Równą atrakcyjność obu zapachów należy być może potwierdzić w laboratorium przed eksperymentem, stosując opisany później test (2.5) z naiwnymi zwierzętami. Wartości zaprezentowane tutaj opierają się na kilku publikacjach laboratorium Gerbera, które zostały niedawno powtórzone w naszym laboratorium9,15,16.</li>
	<li>Oznakowanie szalek Petri: Przed eksperymentami behawioralnymi wszystkie szalki Petri muszą zostać zakodowane. Oznacza to, że szalki Petri zawierające fruktozę muszą być oznakowane na przykład symbolem „X” lub „A”, a szalki zawierające tylko agarozą symbolem „Y” lub „B”. Kod ten powinien zostać ujawniony eksperymentatorowi dopiero po zarejestrowaniu wszystkich danych. Dzięki przeprowadzeniu eksperymentów metodą „ślepej próby” wyklucza się możliwość wpływu oczekiwań eksperymentatora na wyniki larw. Dla ułatwienia zrozumienia przez szerokie grono czytelników, w dalszej części będziemy mówić o zapachach jako o bodźcach warunkowych (CS1 lub CS2), które są albo nagradzane, gdy są prezentowane na szalce Petri z fruktozą (+), albo nienagradzane, gdy są prezentowane na szalce Petri z samą agarozą (-).</li>
</ol>
2. Trening i test nagrody cukrowej
<ol>
	<li>Pobrać 30 żerujących larw 3rd stadium z fiolki z pożywką. Przenieść je do pierwszej szalki Petriego zawierającej kilka kropli wody z kranu i ostrożnie przesuwać je pędzlem w przód i w tył. Następnie przenieść je do drugiej szalki Petriego, również zawierającej kilka kropli wody z kranu, aby upewnić się, że na ścianach ciała larw nie pozostała pasta pokarmowa; w przeciwnym razie larwy mogłyby odczuwać zapach pożywki podczas eksperymentu. Mogłoby to prawdopodobnie zamaskować proces uczenia się oraz ich wyniki w sytuacji testowej.</li>
	<li>Trening: Aby nauczyć larwy kojarzenia zapachów z apetycznym sygnałem cukrowym, stosuje się następujący schemat. Umieścić pojemnik z zapachem OCT po lewej i prawej stronie szalki Petriego oznaczonej znakiem „X” – czyli szalki zawierającej nagrodę w postaci fruktozy (+), (eksperyment „ślepy”, szczegóły w punkcie 1.6). Umieścić grupę 30 żerujących larw 3rd stadium na środku szalki Petriego, zamknąć pokrywkę i odczekać 5 min, podczas gdy zwierzęta są narażone na działanie OCT. Należy upewnić się, że larwy nie utknęły w kropli wody i są w stanie pokonać jej napięcie powierzchniowe. Dzięki temu larwy mogą swobodnie poruszać się po szalce Petriego i doświadczać bodźców węchowych i/lub smakowych.</li>
	<li>Trening: Usunąć larwy z szalki Petriego za pomocą zwilżonego pędzla i przenieść je na drugą szalkę Petriego oznaczoną literą „Y” – czyli szalkę zawierającą wyłącznie agar (-) – z pojemnikiem z zapachem AM umieszczonym po jej lewej i prawej stronie. Zamknąć pokrywkę i odczekać 5 min, podczas gdy zwierzęta są narażone na działanie AM.</li>
	<li>Trening: Powtórzyć punkty 2.2) i 2.3) dwukrotnie, tak aby wszystkie 30 larw przeszło trzy cykle treningowe: CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-). W tym eksperymencie CS1 reprezentuje OCT, a CS2 reprezentuje AM.</li>
	<li>Test: Umieścić jeden pojemnik z zapachem AM i jeden z zapachem OCT po przeciwnych stronach szalki Petriego zawierającej wyłącznie agar. Przenieść wytrenowane zwierzęta na środek testowej szalki Petriego. Zamknąć pokrywkę i odczekać 5 min. Następnie policzyć liczbę larw po lewej stronie, w środku oraz po prawej stronie testowej szalki Petriego.</li>
	<li>Powtórzyć kroki od 2.1) do 2.5) z drugą grupą 30 żerujących larw 3rd stadium, ale zamienić eksperymentalne role AM i OCT w taki sposób, aby zwierzęta otrzymały następujący trening: CS2 / (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-). W tym eksperymencie CS1 reprezentuje OCT, a CS2 reprezentuje AM.</li>
	<li>Możliwe układy treningu. Powyżej przedstawiono trening składający się z trzech prób treningowych OCT / (+) - AM / (-) lub w grupie odwrotnej z trzech prób treningowych AM / (+) - OCT / (-). Jednak aby uniknąć efektów zależnych od sekwencji podczas treningu, ważne jest zróżnicowanie kolejności bodźców w następnych powtórzeniach całego eksperymentu. Poprzez zmianę kolejności CS1 lub CS2, a także prezentacji nagrody na pierwszej lub drugiej przedstawionej szalce, możliwe są cztery różne sekwencje prób treningowych:</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody >
		<tr>
			<td>Pierwsza grupa</td>
			<td>CS1 / (+) - CS2 / (-)</td>
			<td>Grupa odwrotna</td>
			<td>CS2 / (+) - CS1 / (-)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>CS1 / (-) - CS2 / (+)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>CS2 / (-) - CS1 / (+)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>CS2 / (+) - CS2 / (-)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>CS1 / (+) - CS2 / (-)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>CS2 / (-) - CS1 / (+)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>CS1 / (-) - CS2 / (+)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Aby zapobiec systematycznym efektom bodźców w otaczającym środowisku eksperymentalnym, w połowie przypadków test należy przeprowadzić w taki sposób, aby OCT znajdowało się po lewej stronie, a AM po prawej. W pozostałej połowie przypadków AM powinno być prezentowane po lewej stronie, a OCT po prawej.
3. Testy sprawności sensoryczno-motorycznych istotnych dla wykonywanego zadania
Projekt powyższych eksperymentów pozwala na samodzielną analizę uczenia się związku zapach-cukier u larw dzikiego typu w 3rd stadium rozwojowym podczas żerowania. Jednak w codziennej praktyce laboratoryjnej badacze zazwyczaj wykorzystują dwie lub więcej różnych grup eksperymentalnych larw, aby sprawdzić, czy uczenie się olfaktoryczne zależy od konkretnego genu, specyficznego zestawu neuronów, linii mutantów, specjalnej diety pokarmowej, różnych warunków hodowli, toksycznych substancji chemicznych dodanych podczas rozwoju itp. Zatem w każdym przypadku, gdy testowane są dwie lub więcej grup eksperymentalnych larw, należy przeprowadzić zestaw obowiązkowych eksperymentów kontrolnych, aby sprawdzić, czy różne grupy larw wykazują prawidłową sprawność sensoryczno-motoryczną. Jest to niezbędne, ponieważ potencjalne fenotypy niekoniecznie wynikają ze zmniejszonej lub zniesionej zdolności do kojarzenia zapachów z cukrem. Zamiast tego, potencjalne deficyty uczenia się mogą wynikać z zaburzeń na dowolnym etapie obwodów sensoryczno-motorycznych w przetwarzaniu zapachów i/lub cukru. Innymi słowy, jeśli larwa mutant nie jest w stanie wyczuć cukru, nie może utworzyć pamięci cukrowej. Nie pozwala to jednak na wyciągnięcie wniosku, że larwa nie potrafi się uczyć. W szczegółach, aby przetestować prawidłowe przetwarzanie OCT, AM i fruktozy u larw transgenicznych, należy przeprowadzić następujące eksperymenty kontrolne.
1. Test preferencji naiwnych OCT
Pobierz 30 żerujących larw 3rd stadium z fiolki z pożywką. Umyj je dokładnie w wodzie z kranu, zgodnie z opisem w punkcie 2.1. Umieść pojedynczy pojemnik z zapachem OCT po jednej stronie szalki Petriego z agarozą, przenieś larwy na środek szalki, zamknij pokrywkę i odczekaj 5 min, aby larwy mogły przemieszczać się po szalce i zorientować się w stronę źródła zapachu OCT. Następnie policz liczbę larw znajdujących się po lewej stronie, w środku oraz po prawej stronie testowej szalki Petriego.
2. Test preferencji naiwnych AM
Pobrać 30 żerujących larw 3rd stadium z fiolki z pożywką. Umyć je dokładnie w wodzie z kranu, zgodnie z opisem w punkcie 2.1. Umieścić pojedynczy pojemnik z zapachem AM po jednej stronie szalki Petriego z agaroza, przenieść larwy na środek szalki, zamknąć pokrywkę i odczekać 5 min, aby larwy mogły przemieścić się po szalce i zorientować w kierunku źródła zapachu AM. Następnie policzyć liczbę larw znajdujących się po lewej stronie, w środku oraz po prawej stronie testowej szalki Petriego.
3. Test preferencji w stosunku do cukrów u osobników naiwnych
Pobierz 30 żerujących larw 3rd stadium z fiolki z pożywką. Umyj je dokładnie w wodzie z kranu, zgodnie z opisem w sekcji 2.1. Przygotuj szalki Petriego, w których jedna połowa zawiera 2,5% agarozy, a druga połowa mieszaninę 2M fruktozy i agarozy. Umieść larwy na szalce Petriego, zamknij pokrywkę i odczekaj 5 min, aby larwy mogły przemieścić się po szalce i zorientować w stronę strony zawierającej fruktozę. Następnie policz liczbę larw po lewej stronie, w środku oraz po prawej stronie testowej szalki Petriego.
Przygotowanie szalek Petri z podziałem pół na pół: Przygotuj standardowe płytki agarowe zgodnie z opisem w sekcji 1.2. Po ostygnięciu szalek Petri wypełnionych agarozą, ostrożnie przetnij agar wzdłuż osi pionowej za pomocą skalpela. Usuń jedną połowę agarozy z szalki Petri. Do pustej połowy szalki Petri dodaj gorący roztwór fruktozo-agarozy (sposób przygotowania opisano w sekcji 1.3). Należy dopilnować, aby obie połowy stykały się ze sobą i nie tworzyły wyraźnej krawędzi – wpływa to na behawioralny wybór larw i znacząco utrudnia analizę zachowania4.
Trening pozorowany
Pomimo przeprowadzenia testów sprawdzających, czy transgeniczne larwy 3rd stadium są w stanie odróżnić na poziomie typu dzikiego OCT od powietrza (3.1), AM od powietrza (3.2) oraz cukier od czystej agarozy (3.3), niedawno wprowadzono dodatkowy zestaw eksperymentów testowych (dyskusję na ten temat zobacz w Gerber and Stocker, 2007). Uzasadnienie tych eksperymentów jest następujące. Podczas treningu larwy są poddawane intensywnym manipulacjom oraz sukcesywnej stymulacji zapachowej i cukrowej. W związku z tym jest wysoce prawdopodobne, że obserwowany fenotyp uczenia się jest mylący (mimo że testy percepcji zapachu i cukru u osobników naiwnych znajdują się na poziomie typu dzikiego!). Rzeczywiście możliwe jest, że zwierzęta transgeniczne różnią się od larw typu dzikiego pod względem odporności na stres, motywacji, zmęczenia, adaptacji sensorycznej, uczenia się kontekstowego oraz zmian w poczuciu sytości. Dlatego Michels et al. (2005) wprowadzili kontrole sprawdzające, czy dany mutant jest w stanie: (1) wykryć AM w porównaniu z pustym pojemnikiem na zapach, jeśli traktuje się larwy dokładnie tak samo jak podczas treningu, z wyjątkiem pominięcia nagrody i jedynie wystawienia na oba zapachy; (2) wykryć OCT po zastosowaniu tego samego schematu; (3) wykryć AM w porównaniu z pustym pojemnikiem na zapach, jeśli traktuje się larwy w sposób zbliżony do treningu, z wyjątkiem pominięcia zapachów i jedynie wystawienia na nagrodę; oraz (4) wykryć OCT po zastosowaniu tego samego schematu. Kompletną dyskusję i dalsze szczegóły dotyczące metod można znaleźć w Michels et al (2005) oraz Gerber and Stocker (2007).
4. Analiza danych dla uczenia się nagrody cukrowej
<ol>
	<li>Aby ocenić dane z protokołu uczenia się nagrody cukrowej, należy obliczyć indeks preferencji OCT (PREF OCT) dla każdej z dwóch grup trenowanych wzajemnie: 
	Dla pierwszej grupy, która przeszła trening OCT/(+) - AM/ (-): 
	PREF OCT (OCT+/AM-) = (# larw po stronie OCT - # larw po stronie AM) / # wszystkich larw w strefach lewej, prawej i środkowej 
	Dla drugiej grupy, która przeszła trening AM/ (+) - OCT/(-): 
	PREF AM (AM+/OCT-) = (# larw po stronie AM - # larw po stronie OCT) / # wszystkich larw w strefach lewej, prawej i środkowej</li>
</ol>
<ol start="2">
	<li>Oblicz indeks wydajności (PI) dla dwóch wartości PREF uzyskanych w punkcie 4.1). PI reprezentuje uczenie się asocjacyjne poprzez zniesienie zakłócających efektów ekspozycji na zapach i karę, upływu czasu oraz manipulacji: 
	PI = (PREF OCT (OCT+/AM) + PREF AM (AM+/OCT)) / 2 
	W związku z tym wartości PI mogą mieścić się w zakresie od -1 do 1. Istotnie ujemne wartości reprezentują uczenie się awersyjne, natomiast istotnie dodatnie wartości opisują uczenie się apetytywne. Pełny eksperyment obejmuje zazwyczaj 10 lub więcej wartości PI. Dane są wizualizowane za pomocą wykresów pudełkowych zawierających wszystkie wartości danej grupy eksperymentalnej. 50% wartości znajduje się wewnątrz pudełka; mediana indeksu wydajności jest zaznaczona pogrubioną linią wewnątrz wykresu pudełkowego.</li>
</ol>
5. Analiza danych dla zdolności sensoryczno-motorycznych istotnych dla zadania
<ol>
	<li>Aby ocenić dane podczas badania prawidłowego przetwarzania zapachu OCT, należy obliczyć indeks preferencji zapachu OCT w następujący sposób: 
	Odor PREF OCT = (# larw po stronie OCT - # larw po drugiej stronie) / # wszystkich larw w strefach lewej, prawej i środkowej</li>
	<li>Aby ocenić dane podczas badania prawidłowej percepcji zapachu AM, należy obliczyć indeks preferencji zapachu AM w następujący sposób: 
	Odor PREF AM = (# larw po stronie AM - # larw po drugiej stronie) / # wszystkich larw w strefach lewej, prawej i środkowej</li>
	<li>Aby ocenić dane podczas badania prawidłowej percepcji fruktozy, należy obliczyć indeks preferencji fruktozy w następujący sposób: 
	PREF fructose = (# larw po stronie fruktozy - # larw po drugiej stronie) / # wszystkich larw w strefach lewej, prawej i środkowej</li>
	<li>Szczegółowe informacje dotyczące treningu pozorowanego (sham training) podano w pracy Michels et al. 2005.</li>
</ol>

<ol><li>Pawlow, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Researches+on+Conditioned+Reflexes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New Researches on Conditioned Reflexes.</a> Science. 58, 359-361 (1923).</li>
<li>Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mushroom+body+memoir%3A+from+maps+to+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mushroom body memoir: from maps to models.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 266-275 (2003).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+insights+into+behavior+and+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Harvey+Lect%22%5BJournal%5D)">Cellular insights into behavior and learning.</a> Harvey Lect. 73, 19-92 (1979).</li>
<li>Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engram+found%3F+Evaluating+the+evidence+from+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 14, 737-744 (2004).</li>
<li>Milner, B., Squire, L. R., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+neuroscience+and+the+study+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cognitive neuroscience and the study of memory.</a> Neuron. 20, 445-468 (1998).</li>
<li>Keene, A. C., Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+olfactory+memory%3A+single+genes+to+complex+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drosophila olfactory memory: single genes to complex neural circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8, (2007).</li>
<li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+Drosophila%3A+a+fly+geneticist%27s+Swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li>
<li>Gerber, B., Stocker, R. F., Tanimura, T., Thum, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smelling%2C+tasting%2C+learning%3A+Drosophila+as+a+study+case%5BTitle%5D)+AND+%22Results+Probl.+Cell.+Differ%22%5BJournal%5D)">Smelling, tasting, learning: Drosophila as a study case.</a> Results Probl. Cell. Differ. 47, 139-185 (2009).</li>
<li>Gerber, B., Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+larva+as+a+model+for+studying+chemosensation+and+chemosensory+learning%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">The Drosophila larva as a model for studying chemosensation and chemosensory learning: a review.</a> Chem. Senses. 32, 65-89 (2007).</li>
<li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72, 202-230 (2011).</li>
<li>Gerber, B., Hendel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+expectations+drive+learned+behaviour+in+larval+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Outcome expectations drive learned behaviour in larval Drosophila.</a> Proc. Biol. Sci. 273, 2965-2968 (2006).</li>
<li>Schleyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+behavior-based+circuit+model+of+how+outcome+expectations+organize+learned+behavior+in+larval+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila.</a> Learn Mem. 18, 639-653 (2011).</li>
<li>Pauls, D., Selcho, M., Gendre, N., Stocker, R. F., Thum, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larvae+establish+appetitive+olfactory+memories+via+mushroom+body+neurons+of+embryonic+origin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drosophila larvae establish appetitive olfactory memories via mushroom body neurons of embryonic origin.</a> J. Neurosci. 30, 10655-10666 (2010).</li>
<li>Selcho, M., Pauls, D., Han, K. A., Stocker, R. F., Thum, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dopamine+in+Drosophila+larval+classical+olfactory+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The role of dopamine in Drosophila larval classical olfactory conditioning.</a> PLoS One. 4, e5897(2009).</li>
<li>Neuser, K., Husse, J., Stock, P., Gerber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appetitive+olfactory+learning+in+Drosophila+larvae%3Aeffects+of+repetition%2C+reward+strength%2C+age%2C+gender%2C+assay+type+and+memory+span%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Appetitive olfactory learning in Drosophila larvae:effects of repetition, reward strength, age, gender, assay type and memory span.</a> Animal Behaviour. 69, 891-898 (2005).</li>
<li>Scherer, S., Stocker, R. F., Gerber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+learning+in+individually+assayed+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Olfactory learning in individually assayed Drosophila larvae.</a> Learn Mem. 10, 217-225 (2003).</li>
<li>Aceves-Pina, E. O., Quinn, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Learning in normal and mutant Drosophila larvae.</a> Science. 206, 93-96 (1979).</li>
<li>Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+mushroom+body+mutants+are+deficient+in+olfactory+learning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning.</a> J. Neurogenet. 2, 1-30 (1985).</li>
<li>Khurana, S., Abu Baker, M. B., Siddiqi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odour+avoidance+learning+in+the+larva+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Odour avoidance learning in the larva of Drosophila melanogaster.</a> J. Biosci. 34, 621-631 (2009).</li>
<li>Pauls, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+shock-induced+associative+olfactory+learning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Electric shock-induced associative olfactory learning in Drosophila larvae.</a> Chem. Senses. 35, 335-346 (2010).</li>
<li>Eschbach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+learning+between+odorants+and+mechanosensory+punishment+in+larval+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Associative learning between odorants and mechanosensory punishment in larval Drosophila.</a> J. Exp. Biol. 214, 3897-3905 (2011).</li>
<li>von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+visual+classical+conditioning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae.</a> Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).</li>
<li>Gerber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+learning+in+individually+assayed+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Visual learning in individually assayed Drosophila larvae.</a> J. Exp. Biol. 207, 179-188 (2004).</li>
<li>Rohwedder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Value-Dependent+and+Nutritional+Value-Independent+Effects+on+Drosophila+melanogaster+Larval+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Nutritional Value-Dependent and Nutritional Value-Independent Effects on Drosophila melanogaster Larval Behavior.</a> Chem. Senses. , (2012).</li>
<li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies%3A+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126, 4065-4076 (1999).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+extrinsic+neurons+and+their+implications+in+the+functional+roles+of+the+mushroom+bodies+in+Drosophila+melanogaster+Meigen%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">The organization of extrinsic neurons and their implications in the functional roles of the mushroom bodies in Drosophila melanogaster Meigen.</a> Learn Mem. 5, 52-77 (1998).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane%2Fjuxtamembrane+domain-dependent+Dscam+distribution+and+function+during+mushroom+body+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transmembrane/juxtamembrane domain-dependent Dscam distribution and function during mushroom body neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 43, 663-672 (2004).</li>
<li>Robertson, K., Mergliano, J., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Drosophila+embryonic+brain+development+using+photoactivated+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissecting Drosophila embryonic brain development using photoactivated gene expression.</a> Dev. Biol. 260, 124-137 (2003).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+functions+of+the+reaper+and+head+involution+defective+genes+in+the+programmed+cell+death+of+Drosophila+central+nervous+system+midline+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cooperative functions of the reaper and head involution defective genes in the programmed cell death of Drosophila central nervous system midline cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 5131-5136 (1997).</li>
<li>Kitamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+modification+of+behavior+in+Drosophila+by+targeted+expression+of+a+temperature-sensitive+shibire+allele+in+defined+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons.</a> J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).</li>
<li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li>
<li>Rosenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+ortholog+of+vertebrate+TRPA1+regulates+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis.</a> Genes Dev. 19, 419-424 (2005).</li>
<li>Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+electrical+properties+in+Drosophila+neurons+developing+without+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission.</a> J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).</li>
<li>Chen, Y. C., Mishra, D., Schmitt, L., Schmuker, M., Gerber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+behavioral+odor+similarity+%22space%22+in+larval+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">A behavioral odor similarity "space" in larval Drosophila.</a> Chem. Senses. 36, 237-249 (2011).</li>
<li>Saumweber, T., Husse, J., Gerber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+attractiveness+and+associative+learnability+of+odors+can+be+dissociated+in+larval+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Innate attractiveness and associative learnability of odors can be dissociated in larval Drosophila.</a> Chem. Senses. 36, 223-235 (2011).</li>
<li>von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+visual+classical+conditioning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae.</a> Behav. Neurosci. , (2011).</li>
<li>Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cAMP+response+element-binding+protein-dependent+medium-term+memory+by+appetitive+gustatory+reinforcement+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induction of cAMP response element-binding protein-dependent medium-term memory by appetitive gustatory reinforcement in Drosophila larvae.</a> J. Neurosci. 25, 7905-7913 (2005).</li>
<li>Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+neuronal+networks+and+biochemical+pathways+for+appetitive+and+aversive+memory+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinctive neuronal networks and biochemical pathways for appetitive and aversive memory in Drosophila larvae.</a> J. Neurosci. 29, 852-862 (2009).</li>
<li>Khurana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Conditioning+in+the+Third+Instar+Larvae+of+Drosophila+melanogaster+Using+Heat+Shock+Reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Genet%22%5BJournal%5D)">Olfactory Conditioning in the Third Instar Larvae of Drosophila melanogaster Using Heat Shock Reinforcement.</a> Behav. Genet. 42, 151-161 (2012).</li>
<li>Tully, T., Cambiazo, V., Kruse, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+through+metamorphosis+in+normal+and+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Memory through metamorphosis in normal and mutant.</a> 14, 68-74 (1994).</li>
<li>Michels, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+site+and+molecular+mode+of+synapsin+action+in+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Cellular site and molecular mode of synapsin action in associative learning.</a> Learn Mem. 18, 332-344 (2011).</li>
<li>Saumweber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+synaptic+plasticity+are+impaired+upon+lack+of+the+synaptic+protein+SAP47%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Behavioral and synaptic plasticity are impaired upon lack of the synaptic protein SAP47.</a> J. Neurosci. 31, 3508-3518 (2011).</li>
<li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+tools+for+targeted+gene+expression+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila.</a> Genetics. 186, 735-755 (2010).</li>
<li>Rosenzweig, M., Kang, K., Garrity, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+TRP+channels+are+required+for+warm+and+cool+avoidance+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Distinct TRP channels are required for warm and cool avoidance in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 14668-14673 (2008).</li>
</ol>

Brak declared konfliktów interesów.

Opisany układ badawczy u larw Drosophila umożliwia badanie asocjacyjnego uczenia się węchowego w stosunkowo prostym mózgu. Podejście to jest proste, tanie, łatwe do wdrożenia w laboratorium i nie wymaga zaawansowanego sprzętu9. Przedstawiamy wersję eksperymentu służącą do badania asocjacyjnego uczenia się apetycyjnego, wzmacnianego nagrodą w postaci fruktozy11. Opisany układ opiera się na serii badań parametrycznych, w których kompleksowo przeanalizowano zmienne takie jak liczba prób trenin...

<table><tbody><tr><td>Fruktoza</td><td>Sigma</td><td>47740</td><td>57-48-7</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fluka</td><td>71350</td><td>7647-14-5</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma</td><td>A5093</td><td>9012-36-6</td></tr><tr><td>1-oktanol</td><td>Sigma</td><td>12012</td><td>111-87-5</td></tr><tr><td>Octan amylu</td><td>Sigma</td><td>46022</td><td>628-63-7</td></tr><tr><td>Olej parafinowy</td><td>Sigma</td><td>18512</td><td>8012-95-1</td></tr></tbody></table>

apetytywne warunkowanie węchowe u larw drosophila

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Poniżej opisujemy szczegóły metodologiczne apetytywnego asocjacyjnego uczenia się zapachowego u larw Drosophila. Układ ten, w połączeniu z interferencją genetyczną, umożliwia analizę neuronalnych i molekularnych podstaw konkretnie uczenia się asocjacyjnego w prostym mózgu larwalnym.
Organizmy mogą wykorzystywać przeszłe doświadczenia do modyfikowania obecnego zachowania. Taką aktualizację potencjału behawioralnego można zdefiniować jako uczenie się, a fizyczne podstawy tych potencjałów jako ślady pamięciowe1-4. Neuronaukowcy starają się zrozumieć, w jaki sposób procesy te są zorganizowane pod kątem zmian molekularnych i neuronalnych w mózgu, stosując różnorodne metody na organizmach modelowych, od owadów po kręgowce5,6. W takich badaniach pomocne jest wykorzystanie systemów modelowych, które są proste i dostępne eksperymentalnie. Larwa Drosophila okazała się spełniać te wymogi dzięki dostępności wiarygodnych testów behawioralnych, istnieniu wielu technik transgenicznych oraz prostej organizacji układu nerwowego obejmującego jedynie około 10 000 neuronów (choć z pewnymi zastrzeżeniami: ograniczeniami poznawczymi, niewielką liczbą opcji behawioralnych oraz wątpliwą bogatością doświadczeń)7-10.
Drosophila larvae mogą tworzyć skojarzenia między zapachami a apetycznym wzmocnieniem smakowym, takim jak cukier11-14. W standardowym teście, opracowanym w laboratorium B. Gerbera, zwierzęta przechodzą wzajemne treningi dwuzapachowe: pierwsza grupa larw jest eksponowana na zapach A wraz ze wzmocnieniem smakowym (nagrodą w postaci cukru), a następnie na zapach B bez wzmocnienia9. W tym samym czasie druga grupa larw przechodzi trening odwrotny, doświadczając zapachu A bez wzmocnienia, a następnie zapachu B wraz ze wzmocnieniem (nagrodą w postaci cukru). Następnie w obu grupach testowana jest preferencja między dwoma zapachami. Stosunkowo wyższa preferencja dla zapachu nagradzanego odzwierciedla uczenie się asocjacyjne – prezentowane jako wskaźnik wydajności (performance index, PI). Wniosek dotyczący asocjacyjnego charakteru wskaźnika wydajności jest przekonujący, ponieważ poza współzależnością między zapachami a substancjami smakowymi, inne parametry, takie jak ekspozycja na zapach i nagrodę, upływ czasu oraz sposób obchodzenia się ze zwierzętami, nie różnią się między dwiema grupami9.

Rycina 1A przedstawia ogólny schemat procedur doświadczalnych dla larwalnego zapamiętywania asocjacyjnego opartego na węchu. Poprzez parowanie jednego z dwóch prezentowanych zapachów z nagrodą w postaci cukru, larwy nabywają potencjału behawioralnego do wykazania reakcji atrakcyjnej wobec zapachu nagradzanego w porównaniu z zapachem nienagradzanym. Dwie grupy larw są zawsze trenowane poprzez parowanie wzmocnienia z zapachem OCT lub AM. Wskaźnik efektywności (PI) mierzy funkcję asocjacyjną jako różnicę w ...

Drosophila larwy są w stanie kojarzyć bodźce zapachowe z nagrodą smakową. W niniejszej pracy opisujemy prosty paradygmat behawioralny, który umożliwia analizę apetytywnego uczenia się asocjacyjnego w odpowiedzi na zapachy.

Apetytywne warunkowanie węchowe u larw Drosophila

W dalszej części opisujemy szczegóły metodologiczne apetytywnego uczenia się asocjacyjnego zapachów u larw Drosophila. Układ ten, w połączeniu z...

Celem niniejszej procedury jest analiza wyższych funkcji mózgu. W prostym modelu, u larw DFA, za pomocą apetytu oraz asocjacyjnego uczenia się węchowego. Jest to realizowane poprzez uprzednie zebranie 30 żerujących larw trzeciego stadium z probówki z pożywką.Następnie larwy są trenowane przez pięć minut na szalce Petriego, gdzie jako nagroda służy fruktoza, a po obu stronach znajdują się pojemniki z zapachami, z których jeden zawiera octanal jako bodziec węchowy. Następnie przeprowadza się drugą, pięciominutową fazę treningu na szalce bez nagrody w postaci fruktozy, z pojemnikami zapachowymi po obu stronach zawierającymi octan amylu. Po trzech powtórzeniach obu faz treningowych larwy są poddane pięciominutowemu testowi bez nagrody, podczas którego po przeciwnych stronach znajdują się pojemniki z zapachami.Ostatecznie, wzglólna preferencja zapachowa jednego octanu względem octanu amalu wskazuje, że larwy drozo-fili potrafią stworzyć skojarzenie między bodźcami węchowymi a nagrodą w postaci cukru, co może być wykorzystane do badania uczenia się asocjacyjnego w systemie genetycznie plastycznym. Metoda ta, w połączeniu z genetyczną interferencją funkcji neuronalnych, może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie uczenia się i pamięci, takie jak: które neurony sygnalizują nagrodę lub które neurony są niezbędne lub wystarczające do nabycia bądź przywołania powtarzalnego wspomnienia? Zademonstrowanie tej procedury będzie miało charakter anty-postoperacyjny.Doktorant z mojego laboratorium najpierw przygotowuje szalki Petriego z 2,5% agarosem bez fruktozy. Aby przygotować szalki z fruktozą, należy dodać fruktozę do rozpuszczonej agarozy, a następnie wlać ją do szalek. Następnie należy oznaczyć każdą z tych szalek innym symbolem, aby zapewnić zaślepienie osoby przeprowadzającej eksperyment.Naczynie zawierające fruktozę stanowi nagrodę warunkową, a naczynie puste jest kontrolą bez nagrody. Jako bodźce warunkowe należy przygotować łącznie trzy dostosowane pojemniki zapachowe z Teflonu, zawierające 10 µL czystego oktanolu. Pokrywki posiadają małe otwory, aby umożliwić odparowywanie zapachu.Po drugie, przygotuj kolejne trzy pojemniki z zapachem, zawierające 10 µL octanu amylu rozcieńczonego w oleju parafinowym w stosunku 1:50. Rozcieńczenie to jest tak samo atrakcyjne jak 10 µL czystego octanu amylu, co przyciąga 30 osobników, które żerują, a nie błąkają się. Po trzecie, przenieś je z fiolki z pokarmem.Protokół ten można przeprowadzać o dowolnej porze dnia. Jest on niezależny od rytmów okołodobowych. Przenieś larwy do szalki Petriego zawierającej kilka kropel wody z kranu i ostrożnie przesuwaj je pędzlem do przodu i do tyłu.Następnie przenieś larwy do drugiej szalki Petriego, w której znajduje się kilka kropel wody z kranu. Sprawdź, czy na ścianach ciała larw znajduje się pasta pokarmowa. Teraz umieść szalkę Petriego w układzie eksperymentalnym, aby nauczyć larwy kojarzenia zapachów z konkretnym sygnałem cukrowym.Umieść pojemnik z zapachem po lewej i prawej stronie jednej z dwóch użytych w bodźcach płytek. Tutaj zastosowano oktahedralną, lecz wybór jest dowolny, ponieważ eksperymentator nie zna rodzaju nagrody. Następnie umieść grupę larw w środkowej części płytki.Zamknij pokrywkę i odczekaj pięć minut, podczas gdy zwierzęta są poddane działaniu bodźców. Upewnij się, że larwy mogą pokonać napięcie powierzchniowe kropli wody, aby nie zostały uwięzione i mogły swobodnie eksplorować. Umieść nowy pojemnik z octanem Amalu na świeżej płytce Petriego.Po pięciu minutach, używając zwilżonego pędzelka, przenieś larwy do naczynia z przeciwnym typem bodźców umieszczonych po lewej i prawej stronie. W tym przypadku zapachem jest octan amylu. Po przeniesieniu larw zamknij pokrywkę i pozwól zwierzętom na eksplorację przez pięć minut.Po upływie tego czasu pierwsza runda treningu zostaje zakończona. Przeprowadź dwie kolejne rundy treningu w ten sam sposób co pierwszą. Przenoś zwierzęta za pomocą wilgotnego pędzla, eksponując je na każdą kombinację bodźca i nagrody łącznie trzy razy.W miejscu testu doświadczalnego należy umieścić świeże pojemniki z zapachami, po jednym z każdego bodźca, po przeciwnych stronach niepowlekanej szalki Petriego z agarozy. Przenieś wytrenowane zwierzęta na środek szalki. Zamknij pokrywkę i odczekaj pięć minut.Po pięciu minutach, używając szablonu umieszczonego pod szalką, który wyraźnie wyznacza trzy strefy (lewą, prawą i środkową), należy policzyć liczbę larw w każdej z nich. Strefa środkowa jest traktowana jako wynik braku preferencji, co czyni analizę bardziej rygorystyczną i mniej podatną na błędy. Na koniec, aby zakończyć eksperyment, należy wybrać 30 nowych larw trzeciego stadium i powtórzyć proces uczenia i testowania z odwrotną kombinacją nagrody i bodźców.Nadal należy używać tych samych pojemników z zapachami. Wymagane jest przeprowadzenie kilku testów kontrolnych, aby ustalić, czy zwierzęta transgeniczne wykazują prawidłowe przetwarzanie zapachów w odniesieniu do bodźców nagradzających. Test preferencji zapachowej u osobników naiwnych rozpoczyna się od zebrania i przemycia 30 larw w sposób analogiczny do procedury treningu i testowania.Następnie przenieś larwy na szalkę Petriego z agaroza, zawierającą tylko jedną fiolkę z bodźcem po jednej stronie. Zamknij pokrywkę i odczekaj pięć minut. Następnie, korzystając z szablonu, oblicz liczbę larw znajdujących się po stronie bliższej, w środku oraz po stronie dalszej od bodźca.Przeprowadź ten test dla każdego bodźca użytego w eksperymencie w celu zbadania preferencji cukrowej osobników naiwnych. Przygotuj połówkowe szalki Petriego, wycinając połowę agaru z jednej szalki i wypełniając pustą przestrzeń roztopionym agarem drugiego typu. Należy zadbać o to, aby obie połowy miały taką samą objętość i nie tworzyły wyraźnej krawędzi.Może to wymagać ćwiczeń z wykorzystaniem przygotowanej w temperaturze pokojowej płytki typu half-half, umieszczonej 30 naiwnych osobników, oczyszczonych z pokarmu. Umieść larwy w stadium trzecim w centrum płytki. Zamknij pokrywkę i odczekaj pięć minut.Następnie, korzystając z szablonu, należy policzyć liczbę larw po obu stronach oraz te znajdujące się w środku. Opisana procedura została wykorzystana do uczenia i testowania larw trenchgenic. Przy użyciu przykładowych bodźców dane zestawiono jako liczbę larw w różnych obszarach naczyń Petriego.Po pięciu minutach poza tym preferowaniem danych obliczono indeksy, a wskaźniki wydajności wyprowadzono z grup trenowanych wzajemnie. Ponieważ badane larwy były transgeniczne, zaoferowano im wybór między wypełnionym pojemnikiem z zapachem a powietrzem, a także wybór między czystymi aromatami a aromatami z dodatkiem cukru. Analiza obliczonych indeksów na wykresie pudełkowym wykazała, że zwierzęta były w stanie nauczyć się rozróżniać jeden octan octanu od ML, wykorzystując aromaty fruktozy jako wzmocnienie apetytu.Zwierzęta rozpoznały oba bodźce jako atraktanty i wykazały pierwotną preferencję zapachu fruktozy nad zapachem aero. Ten paradygmat eksperymentalny był z powodzeniem stosowany w przypadku szerokiej gamy bodźców węchowych i wizualnych, a także różnorodnych bodźców nagradzających i karzących. Paradygmat ten, w połączeniu z licznymi potężnymi manipulacjami genetycznymi dostępnymi u drosophila, jest szczególnie użyteczny w analizie sieci neuronowych; na przykład poprzez genetyczną manipulację specyficznymi zestawami neuronów, zdefiniowanymi przez wzorce ekspresji gal4, można ocenić funkcjonalną rolę tych neuronów w uczeniu się apetytu.Niniejszą procedurę, wraz z genetyczną interferencją funkcji neuronalnych, można wykorzystać do analizy sieci neuronalnych w mózgu larwy zaangażowanych w procesy uczenia się i pamięci. Dzięki prostocie mózgu larwy możliwe jest osiągnięcie takiej precyzji analizy nawet na poziomie pojedynczej komórki.

appetitive-associative-olfactory-learning-in-drosophila-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Uczącość skojarzeniowa węchowa u larw Drosophila

W niniejszym artykule wideo opisujemy nową metodę umożliwiającą tworzenie gradientów substancji zapachowych o stabilnych i kontrolowalnych geometriach. Krótko ilustrujemy, w jaki sposób gradienty te mogą być wykorzystane do wykrywania wad węchu (całkowitej i częściowej anosmii) oraz do badania bardziej subtelnych cech zachowań chemotaktycznych.

Wysokorozdzielczy pomiar zachowań sterowanych węchem u larw Drosophila

Opisano metodę pomiaru pamięci asocjacyjnej dorosłego Drosophila. Test opiera się na zdolności muchy do kojarzenia prezentowanego zapachu z negatywnym wzmacniaczem (porażeniem prądem), a następnie przywoływania tych informacji w późniejszym czasie, co pozwala na pomiar pamięci.

Drosophila Uczenie się szoku węchowego u dorosłych

W tym artykule wideo opisujemy zautomatyzowany test do pomiaru wpływu głodu lub sytości na zależne od węchu zachowanie związane z poszukiwaniem pokarmu u dorosłej muszki owocowej Drosophila melanogaster.

Test pojedynczej muchy na zachowania żerowe u Drosophila

Przedstawiamy test wyboru, który ma na celu ujawnienie wpływu odorantów na zachowanie Drosophila za pomocą testu Y-labirynt.

Testowanie węchu Drosophila za pomocą testu Y-maze

Opisujemy tutaj konfigurację behawioralną i metodę analizy danych do oceny reakcji węchowych do 100 muszek octowych (Drosophila melanogaster). System ten może być stosowany z pojedynczymi lub wieloma bodźcami węchowymi i może być przystosowany do optogenetycznej aktywacji lub wyciszania podzbiorów neuronów.

Zachowania węchowe oceniane za pomocą komputerowego śledzenia Drosophila w czterokwadrantowym olfaktometrze

Smak jest ważnym procesem sensorycznym, który ułatwia przyciąganie do dobroczynnych substancji i unikanie substancji toksycznych.  Protokół ten opisuje prosty test spożycia w celu określenia preferencji smakowej Drosophila dla danego związku chemicznego.

Test preferencji smakowych dla dorosłych Drosophila

Ten protokół opisuje test uczenia się i zapamiętywania u Drosophila zwany warunkowaniem zalotów. Ten klasyczny test opiera się na zmniejszeniu zachowań związanych z zalotami samców po odrzuceniu seksualnym przez niepodatną samicę z premfetem. Ta naturalna forma plastyczności behawioralnej może być wykorzystana do testowania uczenia się, pamięci krótkotrwałej i pamięci długotrwałej.

Drosophila Warunkowanie zalotów jako miara uczenia się i pamięci

Ten protokół analizuje zachowanie nawigacyjne larwy Drosophila w odpowiedzi na jednoczesną optogenetyczną stymulację jej neuronów węchowych. Światło o długości fali 630 nm służy do aktywacji pojedynczych neuronów węchowych wyrażających rodopsynę z przesuniętym ku czerwieni kanałem. Ruch larw jest jednocześnie śledzony, rejestrowany cyfrowo i analizowany za pomocą specjalnie napisanego oprogramowania.

Śledzenie zachowań larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację neuronów węchowych

Tutaj prezentujemy protokół, za pomocą którego można wizualizować wapń pre- i/lub postsynaptyczny w kontekście uczenia się i zapamiętywania Drosophila. Obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia jest połączone z klasycznym paradygmatem warunkowania węchowego, dzięki czemu można określić plastyczność synaptyczną leżącą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego.

Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

Ta praca opisuje prosty paradygmat behawioralny, który pozwala na analizę awersyjnego uczenia się asocjacyjnego u dorosłych muszek owocowych. Metoda opiera się na tłumieniu wrodzonego negatywnego zachowania geotaksji ze względu na związek powstały między określonym kontekstem środowiskowym a porażeniem prądem.

Drosophila Pasywne zachowanie unikające jako nowy paradygmat badania awersyjnego uczenia się awersyjnego

Istotną przeszkodą w badaniu aktywności komórkowej podczas procesów poznawczych, takich jak uczenie się i pamięć, jest stosowanie środków znieczulających do przygotowania obrazowania in vivo. Znieczulenie upośledza pamięć krótkotrwałą i funkcje poznawcze w wielu modelach, w tym u Drosophila. W pracy przedstawiono unikalną metodę przygotowania dorosłej Drosophila do obrazowania in vivo bez znieczulenia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie aktywności neuronalnej u nieznieczulonych dorosłych much Drosophila

Poznaj metodę apetytywnego uczenia węchowego u larw Drosophila w neurobiologii. Protokół z fruktozą jako nagrodą pozwala badać mechanizmy asocjacyjnego uczenia się i pamięci w prostym modelu organizmu.

Apetytywne warunkowanie węchowe u larw Drosophila

Przeglądaj więcej filmów