Apetytystyczne warunkowanie węchowe u larw Drosophila

Celem niniejszej procedury jest analiza wyższych funkcji mózgu. W prostym modelu wykorzystuje się larwy DFA, badając ich apetyt oraz asocjacyjne uczenie się węchowe. W tym celu w pierwszej kolejności należy zebrać 30 żerujących larw trzeciego stadium z fiolki z pożywką.

Następnie larwy są trenowane przez pięć minut na szalce Petriego z fruktozą w roli nagrody oraz pojemnikami z zapachami po obu stronach, z których jeden zawiera octan oktenylu jako bodziec olfaktoryczny. Następnie przeprowadzana jest druga faza treningu trwająca pięć minut na szalce bez nagrody w postaci fruktozy i z pojemnikami z zapachami po obu stronach, zawierającymi octan amilowy. Po trzech powtórzeniach obu faz treningowych larwy są poddawane pięciominutowemu testowi bez nagrody, podczas którego są eksponowane na pojemniki z zapachami znajdujące się po przeciwległych stronach.

Ostatecznie względna preferencja zapachowa jednego octanu względem octanu amalu wskazuje, że larwy drosofil potrafią tworzyć skojarzenia między bodźcami węchowymi a nagrodą w postaci cukru, co może być wykorzystane do badania uczenia się asocjacyjnego w systemie plastycznym genetycznie. Metoda ta w połączeniu z genetyczną interferencją funkcji neuronalnych może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie uczenia się i pamięci, takie jak: które neurony sygnalizują nagrodę lub które neurony są niezbędne lub wystarczające do nabycia lub przywołania powtarzalnego wspomnienia? Przedstawienie tej procedury będzie miało charakter postoperacyjny.

Doktorant z mojego laboratorium najpierw przygotował szalki Petriego z 2,5% agarosem bez fruktozy. Aby przygotować szalki z fruktozą, należy dodać fruktozę do rozpuszczonego agarosu, a następnie wylać go na płytkę. Następnie każdą z tych szalek należy oznaczyć innym symbolem, co pozwoli na zaślepienie eksperymentatora.

Naczynie zawierające fruktozę stanowi nagrodę warunkową, a naczynie puste jest brakiem nagrody. Jako bodźce warunkowe należy przygotować łącznie trzy spersonalizowane teflonowe pojemniki zapachowe z 10 µl czystego oktanu-1. Pokrywki posiadają niewielkie otwory, które umożliwiają odparowywanie zapachu.

Po drugie, przygotuj kolejne trzy pojemniki zapachowe z 10 µL octanu amylu rozcieńczonego w stosunku 1:50 w oleju parafinowym. To rozcieńczenie jest tak samo atrakcyjne jak 10 µL czystego octanu amylu; zacznij od zebrania 30 osobników, które żerują, a nie wędrują. Po trzecie, przełóż je z fiolki z pożywką.

Protokół ten można przeprowadzać o dowolnej porze dnia. Jest on niezależny od rytmów okołodobowych. Przenieś larwy do szalki Petriego zawierającej kilka kropel wody z kranu i ostrożnie przesuwaj je pędzlem do przodu i do tyłu.

Następnie przenieś larwy do drugiej szalki Petriego, w której znajduje się kilka kropel wody z kranu. Sprawdź, czy na ścianach ciała larw znajduje się pasta pokarmowa. Teraz umieść szalkę Petriego w układzie doświadczalnym, aby wytrenować larwy w kojarzeniu zapachów z konkretnym sygnałem cukrowym.

Umieść pojemnik z zapachem po lewej i prawej stronie jednego z dwóch rodzajów szalek wykorzystywanych jako bodźce. Tutaj zastosowano jedną octalną, jednak wybór jest dowolny, ponieważ eksperymentator nie zna rodzaju nagrody. Następnie umieść grupę larw w środku szalki.

Zamknij pokrywkę i odczekaj pięć minut, podczas gdy zwierzęta są poddawane działaniu bodźców. Upewnij się, że larwy są w stanie pokonać napięcie powierzchniowe kropli wody, aby nie zostały w niej uwięzione i mogły swobodnie eksplorować otoczenie. Umieść nowy pojemnik z octanem amalu na świeżym szalce Petriego.

Po pięciu minutach, przy użyciu wilgotnego pędzelka, przenieś larwy do naczynia przeciwnego typu, w którym po lewej i prawej stronie znajdują się przeciwstawne bodźce. W tym przypadku zapach to octan amylu. Po przeniesieniu larw zamknij pokrywkę i pozwól zwierzętom na eksplorację przez pięć minut.

Po upływie tego czasu pierwsza runda treningu zostaje zakończona. Przeprowadź dwie kolejne rundy treningu w ten sam sposób, co pierwszą. Przenosi się zwierzęta za pomocą wilgotnego pędzla, eksponując je na każdą kombinację bodźca i nagrody łącznie trzy razy.

W celu przeprowadzenia testu eksperymentalnego należy umieścić świeże pojemniki z zapachami, po jednym dla każdego bodźca, po przeciwnych stronach niepowlekanej szalki Petriego wypełnionej agarem. Przenieść wytrenowane zwierzęta na środek szalki. Zamknąć pokrywę i odczekać pięć minut.

Po pięciu minutach, używając pod szalką szablonu wyraźnie wyznaczającego trzy strefy szalki – lewą, prawą i środkową – należy policzyć liczbę larw w każdej z nich. Strefa środkowa stanowi wynik braku preferencji, co czyni analizę bardziej rygorystyczną i mniej podatną na błędy systematyczne. Na koniec, aby zakończyć eksperyment, należy wybrać 30 nowych larw trzeciego stadium i powtórzyć proces uczenia oraz testowania z przeciwną kombinacją nagrody i bodźców.

Nadal należy używać tych samych pojemników z zapachami. Wymagane jest przeprowadzenie kilku testów kontrolnych w celu ustalenia, czy zwierzęta transgeniczne wykazują prawidłowe przetwarzanie zapachów w odniesieniu do bodźców nagradzających. Test preferencji zapachowej u osobników naiwnych rozpoczyna się od zebrania i przemycia 30 larw, w taki sam sposób, jak zrobiono to podczas treningu i testowania.

Następnie umieść larwy na szalce Petri z agarem różowym, zawierającej tylko jedną fiolkę ze bodźcem po jednej stronie. Zamknij pokrywkę i odczekaj pięć minut. Następnie, korzystając z szablonu, policz liczbę larw znajdujących się po stronie bliskiej, w środkowej części oraz po stronie przeciwnej względem bodźca.

Przeprowadź ten test dla każdego bodźca użytego w eksperymencie w celu zbadania pierwotnych preferencji cukrowych. Przygotuj szalki Petriego z dwoma rodzajami agaru, wycinając połowę agaru w szalce i wypełniając wolną przestrzeń stopionym agarem drugiego rodzaju. Należy zadbać o to, aby obie połowy miały taką samą objętość i nie tworzyły wyraźnej krawędzi.

Może to wymagać ćwiczeń z wykorzystaniem przygotowanej szalki typu half-half w temperaturze pokojowej, umieszczonej 30 naiwnych, oczyszczonych z pokarmu osobników. Umieść larwy w stadium trzecim w centrum szalki. Zamknij pokrywę i odczekaj pięć minut.

Następnie, korzystając z szablonu, należy policzyć liczbę larw po obu stronach oraz te znajdujące się w środku. Opisana procedura została wykorzystana do przeszkolenia i przetestowania larw trenchgenic. Przy użyciu przykładowych bodźców, dane zestawiono jako liczbę larw w różnych obszarach szalek Petriego.

Po pięciu minutach poza tą preferencją danych obliczono indeksy, a wskaźniki wydajności wyprowadzono z grup trenowanych wzajemnie. Ponieważ testowane larwy były transgeniczne, zaoferowano im wybór między wypełnionym pojemnikiem z zapachem a powietrzem, a także wybór między czystymi aromatami a aromatami z dodatkiem cukru. Analiza obliczonych wskaźników na wykresie pudełkowym wykazała, że zwierzęta były w stanie nauczyć się rozróżniać jeden octan z ML, wykorzystując aromaty fruktozy jako wzmocnienie apetytowe.

Zwierzęta zidentyfikowały oba bodźce jako atraktanty i wykazały pierwotną preferencję dla zapachu fruktozy nad zapachem aero. Ten paradygmat eksperymentalny był z sukcesem stosowany w przypadku szerokiej gamy bodźców węchowych i wzrokowych, a także różnorodnych bodźców nagradzających i karzących. Paradygmat ten, w połączeniu z wieloma potężnymi manipulacjami genetycznymi dostępnymi u drosophila, jest szczególnie użyteczny w analizie sieci neuronalnych; na przykład poprzez genetyczną manipulację specyficznymi zestawami neuronów, zdefiniowanymi przez wzorce ekspresji gal four, można ocenić funkcjonalną rolę tych neuronów w uczeniu się apetytu.

Niniejszą procedurę, wraz z genetyczną interferencją funkcji neuronalnych, można wykorzystać do analizy sieci neuronowych mózgu larwy zaangażowanych w uczenie się i pamięć. Ze względu na prostotę mózgu larwy, jest to możliwe do osiągnięcia nawet na poziomie pojedynczej komórki.