Name: Rozwarstwienie i immunohistochemia siatkówki larw, poczwarek i dorosłych osobników Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Poznaj techniki rozwarstwienia i immunohistochemii siatkówki Drosophila na trzech etapach rozwojowych. Ta metoda umożliwia wizualizację białek i różnicowania fotoreceptorów na poziomie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca była wspierana przez stypendium Ehrman dla H-Y. H., stypendium podoktorskie Jane Coffin Childs Memorial Fund for Medical Research dla R.J.J., grant NIH F32EY016309 dla D.V., stypendium doktorskie New York University Dean's Dissertation Fellowship dla D.J., grant NIH R01 EY13010 dla C.D. oraz stypendium DFG dla J.R. (RI 2208/1-1). Dziękujemy Ninie Vogt i Pamelei Boodram za uwagi do rękopisu.

1. Wstęp
W tym filmie opisujemy metody preparowania siatkówki oraz immunohistochemii w trzech określonych okresach rozwojowych: w stadium trzeciego poczwargowego larwy, stadium połowy przepoczwarowania oraz w stadium dorosłym. Choć nasz protokół sprawdza się również w innych stadiach poczwarki (szczegóły dotyczące wcześniejszych etapów znajdują się w 16), wybraliśmy stadium połowy przepoczwarowania, ponieważ jest ono optymalne do obrazowania wszystkich PR w jednej płaszczyźnie ogniskowania, a ich jądra są łatwo identyfikowalne, co ułatwia wizualizację wzorców ekspresji czynników transkrypcyjnych. Preparowanie siatkówki w późnych stadiach poczwarki jest bardzo podobne do preparowania siatkówki u osobników dorosłych.
W pierwszej kolejności pokazujemy, jak zbierać larwy i poczwarki na wybranych etapach rozwoju. Następnie wyjaśniamy, jak uzyskać optymalne preparaty anatomiczne siatkówek larwalnych w stadiach 17-18, siatkówek w połowie rozwoju poczwarki oraz siatkówek dorosłych osobników. Po drugie, demonstrujemy, jak wizualizować rozwój fotoreceptorów (PR) na tych etapach, wykorzystując immunohistochemię i mikroskopię konfokalną.
2. Pozycjonowanie i przygotowanie preparatu
Okres rozwojowy owadów jest zależny od temperatury. Aby umożliwić powtarzalne wyznaczanie stadiów rozwojowych larw i poczek, zaleca się hodowlę wszystkich linii much w temperaturze 25 °C w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność.
Larwy trzeciego stadium: Około 96 h po zniesieniu jaj (w temperaturze 25 °C) larwy w późnej fazie trzeciego stadium przestają żerować i przemieszczają się po ściankach fiolki z pożywką, gdzie ostatecznie przechodzą w stadium poczwarki. Używając miękkiego pędzla lub pęsety, należy delikatnie usunąć wędrującą larwę trzeciego stadium ze ścianki fiolki z pożywką.
50% poczwarek ('midpupae') obserwuje się około 48 hr po przepoczwarczeniu. Aby dokładnie określić czas, można zaznaczyć markerem na fiolce z pożywką nowo powstałe białe poczwarki. Alternatywnie, można przenieść wszystkie białe poczwarki do nowej fiolki, aby uzyskać grupę o jednolitym stopniu rozwoju (w sprawie określania stadium poczwarek na podstawie kryteriów morfologicznych patrz 19). Po 48 hr ostrożnie usuń poczwarki ze stadium midpupae z fiolki za pomocą pęsety.
Dorosłe muchy: Znieczulić młode dorosłe muchy (2-5 dni po wyjściu z poczwarki) na podkładce z CO2. Odciąć głowy za pomocą pęsety i umieścić je w szklanym naczyniu z zimnym 1x PBS.
3. Procedura sekcji (ok. 1-2 h na jeden eksperyment)
Po pobraniu preparatów, należy umieścić je w kropli zimnego PBS na szalce do sekcji Sylgard. Wypreparować około 10-15 siatkówek na genotyp.
Prosimy o zapoznanie się z Kartami Charakterystyki Substancji Chemicznych oraz konsultację z biurem BHP i ochrony środowiska w Państwa instytucji w celu zapewnienia właściwego obchodzenia się z odczynnikami i sprzętem (patrz tabele na końcu niniejszego protokołu).
1. Larwalne tarczki imaginalne oka
<ol>
	<li>Zlokalizuj przedni koniec larwy, w którym znajdują się haczyki gębowe. Za pomocą pęsety delikatnie dociśnij środkową część larwy do podstawy szalki z Sylgardu. Drugą pęsetą uchwyć haczyki gębowe i powoli oraz delikatnie odciągnij je od ciała. Usuń główną część ciała, wykorzystując aparat gębowy do przytrzymania części przedniej, aby usunąć zbędne tkanki z tarczek imaginalnych, które pozostają przytwierdzone do mózgu.</li>
	<li>Przenieś mózg z tarczkami imaginalnymi do 1x PBS w szklanej szalkach trzechdołkowej, chwytając haczyki gębowe pęsetą. Przeprowadź etap fiksacji (krok 4.1.).</li>
	<li>Po fiksacji usuń gruczoły ślinowe oraz tkankę tłuszczową i oddziel mózg od tarczki imaginalnej oka i anteny. Aby zwiększyć dostępność „trudnych” przeciwciał, można usunąć błonę perypodialną znajdującą się na powierzchni nabłonka, przytrzymując część antenalną tarczki i odrywając błonę za pomocą igły sekcyjnej. Następnie przeprowadź immunohistochemię (krok 5.1.).</li>
</ol>
2. Siatkówki w 50% pupacji/środkowej fazie poczwarki
<ol>
	<li>Przytrzymaj tylny koniec poczwarki pęsetą. Ostrożnie usuń przednią powierzchnię poczwarki, chwytając kutykulę drugą pęsetą i powoli odciągając ją od puparium. Oderwij resztki kutykuli, aby odsłonić głowę.</li>
	<li>Używając końcówek pęsety, przebij leżący poniżej miękki worek w grzbietowo-przednim regionie. Umożliwi to dostęp do głowy. Ostrożnie oddziel głowę od tułowia, powoli odsysając ją pipetą P20. Wypuść głowę z końcówki pipety do świeżego, zimnego 1x PBS i usuń nadmiar tkanki; chwyć kutykulę głowy i usuń trąbkę. Przejdź do etapu utrwalania (krok 4.1.).</li>
	<li>Przebij płat wzrokowy jedną szpilką sekcyjną, aby unieruchomić tkankę. Wsuń drugą szpilkę sekcyjną między laminę a siatkówkę, aby oddzielić siatkówkę od laminy/płata wzrokowego. Przeprowadź immunohistochemię (krok 5.1.).</li>
</ol>
3. Oczy dorosłych osobników
<ol>
	<li>Uchwyć pęsetą środek tylnej części torebki głowowej i usuń części gębowe (trąbek), tkankę tłuszczową oraz tchawki.</li>
	<li>Uchwyć jedną pęsetą grzbietową kutykulę głowy, a drugą oddziel oczy od tkanki mózgowej, delikatnie pociągając na bok. W większości przypadków lamina, cienka i przezroczysta osłonka neuropilu mózgowego, pozostanie przytwierdzona do siatkówki. Łatwiej jest usunąć laminę po utrwaleniu.</li>
	<li>Usuń kutykulę na brzegu oka, pozostawiając niewielki fragment, aby ułatwić przenoszenie siatkówek pomiędzy różnymi roztworami. Przeprowadź utrwalenie (krok 4.1.).</li>
	<li>Usuń laminę, chwytając ją z jednej strony pęsetą i delikatnie pociągając na bok drugą pęsetą, tak aby nie uszkodzić siatkówki. Usuń pozostałości kutykuli, ponieważ mogłyby one złożyć się na siatkówce podczas montowania preparatu. Te dwa kroki są kluczowe dla wizualizacji fotoreceptorów, które w przeciwnym razie byłyby przesłonięte przez laminę i pozostałości kutykuli podczas procesu obrazowania. Przejdź do immunohistochemii (krok 5.1.).</li>
</ol>
4. Fixacja i płukanie (około 1 h)
<ol>
	<li>Przechowywać wypreparowane siatkówki w 1x PBS w szklanej płytce z trzema dołkami umieszczonej na lodzie podczas przygotowywania świeżego utrwalacza (rozcieńczyć 40 µl 37% roztworu formaldehydu w 360 μl 1x PBS, wymieszać w wortexie i przechowywać na lodzie). Zaleca się niezwłoczne przystąpienie do protokołu utrwalania i unikanie długiego przechowywania na lodzie (&gt;15 min).</li>
	<li>Zastąpić 1x PBS 200 μl 3,7% roztworu formaldehydu. Należy upewnić się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w utrwalaczu. Jest to kluczowe, w przeciwnym razie utrwalenie może być nieprawidłowe. W razie potrzeby usunąć pęcherzyki powietrza i tchawki za pomocą pęsety.</li>
	<li>Inkubować na wytrząsarce przez 15 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zastąpić utrwalacz 1x PBS i przepłukać dwukrotnie 1x PBS. Kontynuować płukanie w PBS przez 30 min (na wytrząsarce, w temperaturze pokojowej).</li>
	<li>Zastąpić PBS roztworem PBST. Przepłukać dwukrotnie PBST.</li>
	<li>Przystąpić do usuwania błony peripodialnej z tarczek ocznych larw (3.1.3.) oraz blaszek z siatkówek w stadium połowy poczwarki/dorosłych (3.2.3., 3.3.4.).</li>
</ol>
5. Immunohistochemia
<ol>
	<li>Blokowanie: zastąpić PBS 200 μl 5% surowicy normalnej w PBST i inkubować siatkówki przez 20 min na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zastąpić roztwór blokujący roztworem przeciwciał pierwszorzędowych. Uszczelnić płytkę trzystudzienkową parafilmem i inkubować przez noc na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zastąpić roztwór PBST i przepłukać 3 razy. Kontynuować płukanie w PBST przez minimum 1 hr na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść do roztworu przeciwciał wtórnych i inkubować w uszczelnionej parafilmem szklanej płytce studzienkowej na wytrząsarce przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zastąpić roztwór przeciwciał PBST i przepłukać trzy razy. Kontynuować płukanie w PBST przez minimum jedną hr na wytrząsarce w temperaturze pokojowej. Próbki można przechowywać w PBST przez kilka dni, jednak kluczowe jest dodawanie świeżego PBST przynajmniej raz dziennie, aby zapobiec ich wyschnięciu.</li>
</ol>
6. Montowanie preparatu
<ol>
	<li>W celu montowania siatkówek larwalnych i średnio-pupaalnych, za pomocą pipety P20 przenieść siatkówki na środek czystego szkiełka przedmiotowego. Usunąć nadmiar PBST. Użyć pęsety do wyrównania siatkówek, aby ułatwić obrazowanie.</li>
	<li>Nanieść 10 μl medium montującego na wierzch siatkówek. Delikatnie przykryć je szkiełkiem zakrywczym 24x40-1 i zabezpieczyć bezbarwnym lakierem do paznokci.</li>
	<li>W celu montowania siatkówek dorosłych, przygotować „mostki” 20: nanieść dwie krople po 5 μl 50% glicerolu na obu końcach szkiełka przedmiotowego i przykryć je szkiełkami zakrywczymi 22x22-1 (o grubości od 0,13 do 0,17 mm).</li>
	<li>Usunąć PBST za pomocą pipety P20, dbając o to, aby siatkówki nie wyschły. Dodać 20 μl medium montującego do zagłębienia. Użyć medium montującego do przeniesienia siatkówek pipetą P20 na szkiełko przedmiotowe z „mostkiem”.</li>
	<li>Użyć pęsety do zorientowania (soczewki powinny być skierowane w stronę szkiełka przedmiotowego) i wyrównania siatkówek, aby ułatwić obrazowanie. W razie potrzeby usunąć pęcherzyki powietrza za pomocą pipety P20.</li>
	<li>Powoli nałożyć od jednej strony szkiełko zakrywcze 24x40-1 (o grubości od 0,13 do 0,17 mm) i zabezpieczyć krawędzie bezbarwnym lakierem do paznokci lub taśmą klejącą. Próbki przechowywać w temperaturze 4 °C w kasecie do szkiełek mikroskopowych (w ciemności).</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Jako przykład zastosowania niniejszego protokołu, w filmie przedstawiamy reprezentatywne wyniki wizualizacji różnicowania fotoreceptorów na trzech etapach rozwojowych. Tarczkę oka i czułka larwy oraz siatkówkę w średniej fazie przepoczwarzenia zabarwiono przeciwciałami znakującymi różne typy fotoreceptorów podczas ich rozwoju (Rycina 1A, B), natomiast siatkówkę osobnika dorosłego zabarwiono dwoma przeciwciałami przeciwko rodopsynie, aby zwizualizować dwa podtypy fotoreceptorów (Rycina 1C).

<ol><li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+retina%2C+a+neurocrystalline+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).</li>
<li>Hardie, R. C. Functional organization of the fly retina. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHardie%2C+RC+%22Sensory+Physiology%22">Sensory Physiology</a>. D, O. ttoson 5, Springer-Verlag. 1-79 (1985).</li>
<li>O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+ninaE+gene+encodes+an+opsin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila ninaE gene encodes an opsin.</a> Cell. 40, 839-850 (1985).</li>
<li>Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+structure+of+a+rhodopsin+gene+from+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster.</a> Cell. 40, 851-858 (1985).</li>
<li>Rister, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+mosaics+of+opsin+expression+in+invertebrates+and+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates.</a> Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).</li>
<li>Chou, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+Drosophila+opsin+reveals+specific+patterning+of+the+R7+and+R8+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells.</a> Neuron. 17, 1101-1115 (1996).</li>
<li>Chou, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+the+R7+and+R8+photoreceptor+cells+of+Drosophila%3A+evidence+for+induced+and+default+cell-fate+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification.</a> Development. 126, 607-616 (1999).</li>
<li>Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+rhodopsin+in+R8+photoreceptors+of+Drosophila%3A+evidence+for+coordinate+expression+with+Rh3+in+R7+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells.</a> Development. 124, 1665-1673 (1997).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye%3A+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113, 841-850 (1991).</li>
<li>Roignant, J. Y., Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila eye disc.</a> Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).</li>
<li>Tsachaki, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+developmental+mechanisms+underlying+the+formation+of+the+Drosophila+compound+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye.</a> Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+differentiation+in+Drosophila+ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).</li>
<li>Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+genetic+analysis+of+Drosophila+eye+development%3A+sevenless%2C+bride+of+sevenless+and+rough%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough.</a> Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).</li>
<li>Basler, K., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+cell+fate+in+the+developing+eye+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila.</a> Bioessays. 13, 621-631 (1991).</li>
<li>Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+fly+eye%3A+terminal+differentiation+events+of+the+retina%2C+corneal+lens%2C+and+pigmented+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia.</a> Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).</li>
<li>Walther, R. F., Pichaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining+and+imaging+of+the+pupal+and+adult+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system.</a> Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).</li>
<li>Wolff, T. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolff%2C+T+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W. ea , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).</li>
<li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+techniques+for+pupal+and+larval+Drosophila+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes.</a> CSH Protoc. 2007, pdb prot4715(2007).</li>
<li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).</li>
<li>Morante, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+staining+of+Drosophila+optic+lobes+at+different+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).</li>
<li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936(2010).</li>
<li>Stowers, R. S., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+method+for+generating+Drosophila+eyes+composed+exclusively+of+mitotic+clones+of+a+single+genotype%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype.</a> Genetics. 152, 1631-1639 (1999).</li>
<li>Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Drosophila+photoreceptor+axon+guidance+in+eye-specific+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics.</a> Development. 127, 851-860 (2000).</li>
<li>Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+De-repression+of+Rhodopsins+in+Single+Photoreceptors+of+the+Fly+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002357(2012).</li>
<li>Johnston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlocked+feedforward+loops+control+cell-type-specific+Rhodopsin+expression+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye.</a> Cell. 145, 956-968 (2011).</li>
<li>Jukam, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+regulation+of+Hippo+pathway+by+Merlin%2FNF2%2C+Kibra%2C+Lgl%2C+and+Melted+specifies+and+maintains+postmitotic+neuronal+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate.</a> Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).</li>
<li>Vasiliauskas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+from+rhodopsin+controls+rhodopsin+exclusion+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors.</a> Nature. 479, 108-112 (2011).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

1. Rozwiązywanie problemów
W naszym doświadczeniu sekcje wymagają praktyki (nawet przez kilka tygodni) i są ułatwione dzięki osiągnięciu wygodnej pozycji dłoni 21, poprzez oparcie łokci i przedramion o stół oraz kontakt palców z naczyniem sekcyjnym. W ten sposób jedynie kciuki, palce wskazujące i środkowe wykonują precyzyjne ruchy.
Usunięcie warstwy lamina bez uszkodzenia fotoreceptorów jest prawdopodobnie najtrudniejszym etapem. Przed przeprowadzeniem sek...

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Odczynnik&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Krystalicznie czysty roztwór soli fosforanowej (PBS 1x, pH 7,4)</td><td>Sigma</td><td></td><td>Przygotować 10x roztwór zapasu 20. Rozcieńczyć wodą destylowaną do uzyskania 1x PBS i przechowywać w temperaturze pokojowej. Chłodzić w lodzie przed sekcją.</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td>&lt;strong&gt;Uwaga: Substancja drażniąca!&lt;/strong&gt; Stosować rękawiczki. Przygotować 50 ml 1xPBS z 0,3% Triton X-100 (PBST). Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>37% roztwór formaldehydu</td><td>Fisher Scientific</td><td>F75P1GAL</td><td>&lt;strong&gt;Uwaga: Toksyczne, prawdopodobny rakotwórca u ludzi!&lt;/strong&gt; Stosować rękawiczki. Przed etapem fiksacji świeżo przygotować 3,7% roztwór w dygestorze chemicznym poprzez rozcieńczenie w PBS; przechowywać w lodzie.</td></tr><tr><td>5% normalna surowica konia</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>008-000-001</td><td>Przygotować rozcieńczenie 5% v/v w PBST. Przechowywać w temperaturze czterech stopni.</td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwotne i wtórne (&lt;em&gt;np.&lt;/em&gt; Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647)</td><td>Invitrogen Molecular Probes</td><td>A11015&lt;br/&gt;A31572&lt;br/&gt;A31571</td><td>Rozcieńczyć przeciwciała wtórne 1:800 w PBST i przechowywać w temperaturze czterech stopni.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td></td><td>A12379</td><td>Rozcieńczyć 1:100 w roztworze przeciwciał wtórnych.</td></tr><tr><td>Odczynnik przeciwwyblakaniowy Slowfade Gold Antifade</td><td>Invitrogen Molecular Probes</td><td>S36936</td><td>Medium montażowe. Przechowywać w temperaturze -20 stopni.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G31-1</td><td>Do montowania. Przygotować 10 ml rozcieńczenia 50% w wodzie destylowanej, przechowywać w temp. pokojowej.</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>Do znieczulania dorosłych much.</td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Sprzęt&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dwie ostre pęsety (Dumont #55)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw elastomeru silikonowego Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Przygotować naczynie do sekcji Sylgard poprzez wypełnienie plastikowej szalki Petri mieszaniną Sylgard.</td></tr><tr><td>Szklane naczynia do sekcji z trzema wgłębieniami</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-379</td><td></td></tr><tr><td>Dwie mikroigły sekcyjne (średnica 0,1 mm) i dwa uchwyty do igieł (12 cm)</td><td>Fine Science tools</td><td>26002-10</td><td>Włożyć jedną mikroigłę do każdego z dwóch uchwytów i zgiąć jedną z igieł, aby utworzyć haczyk.</td></tr><tr><td>Kryszalki do mikroskopu (22x22-1 i 24x40-1)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Przedmioty szkiełka do mikroskopu (25x75x1,0 mm; wstępnie oczyszczone)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrocentrifugowania 1,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysty lakier do paznokci lub taśma Scotch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wstrząsarka orbitalna</td><td>Bellco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pudełko na szkiełka</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Cienki pędzel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety P20 i P200 oraz końcówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mały kubełek z lodem</td><td></td><td></td><td>Do chłodzenia szklanych płytek z wgłębieniami, wypreparowanych siatkówek i roztworów.</td></tr></tbody></table>

disekcja i immunohistochemia siatkówek larwalnych, poczwarkowych i dorosłych drosophila

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Złożone oko Drosophila melanogaster składa się z około 750 ommatidiów (oczek). Każde ommatidium składa się z około 20 komórek, w tym komórek stożkowych wydzielających soczewkę, komórek pigmentowych, komórki szczecinkowej oraz ośmiu fotoreceptorów (PRs) R1-R8 2. Fotoreceptory posiadają wyspecjalizowane struktury mikrokoskowe, rhabdomery, które zawierają pigmenty światłoczułe, rhodopsyny (Rhs). Rhabdomery sześciu fotoreceptorów (R1-R6) tworzą trapez i zawierają Rh1 3 4. Rhabdomery R7 i R8 są rozmieszczone tandemowo w centrum trapezu i znajdują się na tej samej drodze światła. Fotoreceptory R7 i R8 stochastycznie wykazują ekspresję różnych kombinacji rhodopsyn w dwóch głównych podtypach5: w podtypie „p” Rh3 w pR7s jest powiązany z Rh5 w pR8s, natomiast w podtypie „y” Rh4 w yR7s jest powiązany z Rh6 w yR8s 6 7 8.
Wczesna specyfikacja PR oraz rozwój ommatidiów rozpoczyna się w larwalnym krążku wyobraźnię oczno-antenalnym, który stanowi monowarstwę komórek nabłonkowych. Fala różnicowania przemieszcza się przez krążek9, inicjując organizację nieróżnicujących się komórek w ommatidia10-11. Jako pierwsza specyfikowana jest „komórka założycielska” R8, która rekrutuje komórki R1-6, a następnie R7 12-14. Następnie, podczas rozwoju poczwarki, różnicowanie PR prowadzi do rozległych zmian morfologicznych 15, w tym do formowania się rabdomerów, synaptogenezy i ostatecznie ekspresji rh.
W niniejszym protokole opisujemy metody preparowania siatkówki oraz immunohistochemii w trzech określonych okresach rozwoju siatkówki, które można zastosować w celu odpowiedzi na szereg pytań dotyczących formowania się siatkówki i szlaków rozwojowych. Tutaj wykorzystujemy te metody do wizualizacji etapowej różnicowania się PR na poziomie pojedynczych komórek w całych preparatach siatkówek larwalnych, średnio-poczwarkowych oraz dorosłych (Rysunek 1).

Siatkówka Drosophila stanowi krystaliczną sieć złożoną z niewielkiej liczby typów komórek, które są generowane w sposób stereotypowy 1. Jej podatność na zaawansowane analizy genetyczne umożliwia badanie złożonych programów rozwojowych. Niniejszy protokół opisuje preparowanie oraz immunohistochemię siatkówek na trzech odrębnych etapach rozwoju, ze szczególnym uwzględnieniem różnicowania fotoreceptorów.

Disekcja i immunohistochemia siatkówek larwalnych, poczwarkowych i dorosłych Drosophila

Złożone oko Drosophila melanogaster składa się z około 750 ommatidiów (oczek). Każde ommatidium składa się z około 20 komórek, w tym ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie optymalnych preparatów siatkówki drozylid oraz wizualizacja białek wyrazanych w rozwijającej się siatkówce. W pierwszej kolejności przedstawiono preparatykę siatkówki na trzech etapach rozwojowych: w stadium larwalnym, stadium pupalnym oraz w stadium dorosłym. Kolejne kroki obejmują fiksację oraz immunohistochemię.W ostatnim kroku siatkówki są montowane na szkiełkach przedmiotowych w celu wizualizacji przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Ostatecznie protokół ten obrazuje rozwój i różnicowanie komórek siatkówki na poziomie pojedynczych komórek. Historycznie siatkówka muchy stanowiła idealny system do rozstrzygania szerokiego zakresu pytań w biologii rozwoju oraz badania podstawowych genetycznych mechanizmów regulacyjnych.W niniejszym materiale prezentujemy techniki wizualizacji komórek rozwijającej się siatkówki – od stadium pluripotencjalnego po stan terminalnego zróżnicowania. Przedstawię sposób wycinania siatkówki. Zademonstruję procesy sekcji na siatkówkach w fazie mid-pupil, ponieważ jądra fotoreceptorów znajdują się wówczas niemal w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Stadium to jest idealne do porównania ekspresji białek zlokal

dissection-immunohistochemistry-larval-pupal-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Sekcja i immunohistologia siatkówek larw, poczwarek i dorosłych Drosophila

Niniejszy protokół opisuje trzy preparaty Drosophila: 1) wypreparowanie mózgu dorosłego osobnika, 2) wypreparowanie siatkówki dorosłego osobnika oraz 3) wypreparowanie kompleksów rozwijającego się krążka oka i mózgu. Szczególny nacisk położono na specjalne techniki przygotowania i warunki obrazowania żywych tkanek, choć wszystkie preparaty mogą być wykorzystane do immunohistochemii tkanek utrwalonych.

Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

Czynnikiem ograniczającym wykorzystanie oka dorosłych Drosophila w badaniach nad neurodegeneracją i biologią komórki jest trudność w obrazowaniu procesów wewnątrzkomórkowych. Opisujemy metodę preparowania pojedynczych ommatidiów w celu utworzenia właściwej pierwotnej hodowli komórek neuronalnych, która może być poddawana działaniu leków oraz zaawansowanemu obrazowaniu.

Disekcja i obrazowanie pojedynczego ommatidium Drosophila

W niniejszym materiale przedstawiono standardowe podejście do przygotowania oczu dorosłych osobników Drosophila do wykonywania półcienkich przekrojów oraz analizy pod mikroskopem świetlnym. Protokół ten może być stosowany do ogólnej analizy morfologicznej wad oka lub, po wprowadzeniu wskazanych modyfikacji, do określania wymagań genetycznych genów w konkretnych typach komórek oka (np. analiza klonalna fotoreceptorów) bądź do analizy pod mikroskopem elektronowym.

Przygotowanie oczu dorosłych osobników Drosophila do cienkiego krojenia i analizy mikroskopowej

Barwienie przeciwciałami poczwerek Drosophila może usprawnić analizy genetyczne rozwoju odwłoka osobników dorosłych. Przedstawiamy nasz protokół sekcji, utrwalania i barwienia przeciwciałami odwłoka poczwarek Drosophila w określonych stadiach rozwojowych.

Immunohistochemia odwłoka poczwarki Drosophila

Ten film opisuje, jak przeprowadzić sekcję i wyizolować kompleks oko-mózg od poczwarek Drosophila. Przedstawiony protokół pokazuje, że procedura pozwala uzyskać wysokiej jakości tkankę, kompatybilną na przykład z barwieniem immunologicznym, a także innymi eksperymentami z ekspresją genów.

Rozwarstwienie kompleksu oko-mózg z poczwarek much: metoda izolacji tkanki siatkówki

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Dorosłe struktury Drosophila wywodzą się z workowatych struktur zwanych dyskami imaginalnymi. Analiza tych dysków zapewnia wgląd w wiele procesów rozwojowych, w tym określanie tkanek, ustalanie granic przedziałów, proliferację komórek, specyfikację losu komórki i polaryzację komórek płaskich. Protokół ten służy do przygotowania dysków wyobrażeniowych do mikroskopii świetlnej/fluorescencyjnej.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster

Celem tej techniki jest umożliwienie naukowcom przeprowadzenia sekcji, barwienia immunologicznego i montażu krążków z oczami poczwarek Drosophila melanogaster w każdym wieku.

Wypreparowanie i montaż krążków ocznych poczwarki Drosophila

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Ten artykuł przedstawia chirurgiczną metodę preparowania siatkówki poczwarki Drosophila wraz z protokołami przetwarzania tkanek do immunohistochemii, analizy zachodniej i ekstrakcji RNA.

Rozwarstwienie siatkówki poczwarki Drosophila w celu immunohistochemii, analizy zachodniej i izolacji RNA

Ten protokół opisuje trzy kroki przygotowania płatów wzrokowych larw i dorosłych Drosophila do obrazowania: 1) preparacje mózgu, 2) immunohistochemia i 3) montaż. Nacisk położono na krok 3, ponieważ do wizualizacji określonych struktur płatów optycznych wymagane są różne orientacje montażowe.

Rozwarstwienie, immunohistochemia i montaż mózgów larw i dorosłych osobników Drosophila w celu wizualizacji płata wzrokowego

Poznaj techniki rozwarstwienia i immunohistochemii siatkówki Drosophila na trzech etapach rozwojowych. Ta metoda umożliwia wizualizację białek i różnicowania fotoreceptorów na poziomie pojedynczych komórek.

Disekcja i immunohistochemia siatkówek larwalnych, poczwarkowych i dorosłych Drosophila

Przeglądaj więcej filmów