Name: Nanocząstki wirusowe do obrazowania nowotworów in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Poznaj metodę nanocząstek wirusowych do obrazowania nowotworów in vivo. Technika obejmuje propagację, modyfikację fluorescencyjną i ocenę biodystrybucji w modelu mysim.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty NIH/NIBIB R00 EB009105 (dla NFS) i P30 EB011317 (dla NFS), grant szkoleniowy NIH/NIBIB T32 EB007509 (dla AMW), grant inwestycyjny Interdisciplinary Alliance Investment Grant Uniwersytetu Case Western Reserve (dla NFS) oraz grant Case Comprehensive Cancer Center P30 CA043703 (dla NFS). Dziękujemy studentom badaczom z laboratorium Steinmetza za ich bezpośrednie wsparcie: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D'Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian So oraz Paul Chariou.

1. Namnażanie VNP (CPMV, BMV, PVX i TMV)
<ol>
	<li>Ustaw sterowniki komory dla roślin doniczkowych na 15 h dnia (100% światła, 25 °C, 65% wilgotności) i 9 h nocy (0% światła, 22 °C, 60% wilgotności).</li>
	<li>Zaszczep rośliny zgodnie z harmonogramem przedstawionym w Tabeli 1.</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CPMV</td>
			<td>PVX, TMV i BMV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dzień 0: Posadzić 3 nasiona viguły w każdej doniczce.</td>
			<td>Dzień 0: Zasadź około 30 nasion N. benthamiana w doniczce. Nawoź raz w tygodniu, stosując 1 łyżkę nawozu na 5 l wody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dzień 14: Przesadź rośliny N. benthamiana w stosunku 1 rośliny na doniczkę.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dzień 10: Zainfekuj liście pierwotne wirusem CPMV (5 μg/50 μl/liść) poprzez inokulację mechaniczną z zastosowaniem niewielkiej ilości karborundum.</td>
			<td>Dzień 28: Zainfekuj od trzech do pięciu liści wirusem PVX, TMV lub BMV (5 μg/50 μl na liść) poprzez inokulację mechaniczną przy użyciu niewielkiej ilości karborundu.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dzień 20: Zebrać liście i przechowywać w temperaturze -80 °C.</td>
			<td>Dzień 42: Zebrać liście i przechowywać w temperaturze -80 °C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Harmonogram hodowli, infekcji i zbioru liści.
Uwaga: jako przykład zaprezentowano jedynie propagację CPMV.
2. Oczyszczanie VNP (CPMV, BMV, PVX i TMV)
Uwaga: Wszystkie etapy przeprowadza się na lodzie lub w temperaturze 4 °C.
<ol>
	<li>Zhomogenizować 100 g zamrożonych liści w standardowym blenderze, używając 2 objętości zimnego buforu (patrz Tabela 2). Przefiltrować przez 2-3 warstwy gazy.</li>
	<li>W przypadku PVX skorygować pH do 6,5 za pomocą 1 M HCl. Dodać 0,2% (w/v) kwasu askorbinowego i 0,2% (w/v) siarczynu sodu.</li>
	<li>Odwirować surowy homogenat roślinny przy 5 500 x g przez 20 min. Zebrać nadfiltr.</li>
	<li>W przypadku BMV nanieść 25 ml nadfiltru na 5 ml 10% (w/v) roztworu sacharozy. Odwirować przy 9 000 x g przez 3 h, a następnie resuspender osad w 38,5% (w/v) roztworze CsCl. Mieszać poprzez wstrząsanie przez 5 h, a następnie kontynuować od kroku 2.12.</li>
	<li>Wyekstrahować materiał roślinny, dodając 0,7 objętości mieszaniny chloroform:1-butanol w stosunku 1:1 (v/v). Mieszać mieszaninę przez 30-60 min.</li>
	<li>Odwirować roztwór przy 5 500 x g przez 20 min. Zebrać górną fazę wodną.</li>
	<li>Dodać NaCl do stężenia 0,2 M oraz 8% (w/v) PEG (MW 8 000). W przypadku TMV dodać również 1% (v/v) Triton X-100. Mieszać przez co najmniej 1 h, a następnie odstawić na co najmniej 1 h.</li>
	<li>Odwirować roztwór przy 15 000 x g przez 15 min. Resuspender osad w 10 ml buforu. W przypadku PVX dodać 0,1% β-merkaptoetanolu i mocznik do stężenia 0,5 M.</li>
	<li>Odwirować przy 8 000 x g przez 30 min i zebrać nadfiltr.</li>
	<li>Poddać nadfiltr ultrawirowaniu przy 160 000 x g przez 3 h. Resuspender osad w 5 ml buforu przez noc.</li>
	<li>Przygotować gradient sacharozy 10-40%, używając równych objętości 10%, 20%, 30% i 40% sacharozy w buforze (zaczynając od najwyższego stężenia). Pozostawić gradient do ustabilizowania przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Poddać resuspenderowany osad ultrawirowaniu w gradiencie sacharozy przy 100 000 x g przez 2 h (24 h dla BMV).</li>
	<li>Zebrać pasmo rozpraszania światła i poddać dializie przeciwko buforowi.</li>
	<li>Przeprowadzić charakterystykę VNPs (poniżej) i przechowywać w 4 °C. Do długotrwałego przechowywania użyć temperatury -80 °C.</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >CPMV i TMV</td>
			<td >0.1 M bufor fosforanowy potasu (pH 7.0) 
			38.5 mM KH2PO4 
			61.5 mM K2HPO4</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >PVX</td>
			<td >0.5 M bufor boranowy (pH 7.8) 
			0.5 M kwas borowy 
			Dostosować pH za pomocą NaOH</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >BMV</td>
			<td >bufor SAMA (pH 4.5) 
			250 mM octan sodu 
			10 mM MgCl2 
			2 mM β-merkaptoetanol ( dodać na świeżo)</td>
		</tr >
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Bufory i ich skład dla każdego VNP.
Uwaga: jako przykład zaprezentowano jedynie propagację CPMV.
3. Charakterystyka VNP (CPMV, BMV, PVX i TMV)
<ol>
	<li>Przeprowadź spektroskopię UV/vis w celu oznaczenia stężenia VNPs.
	<ol>
		<li>Zmieierz absorbancję 2 μl próbki za pomocą spektrofotometru NanoDrop.</li>
		<li>Wyznacz stężenie cząsteczek i barwników, korzystając z prawa Beer-Lamberta (A=εcl, gdzie A to absorbancja, ε to współczynnik ekstynkcji, c to stężenie, a l to długość drogi optycznej). Dla NanoDrop długość drogi optycznej wynosi 0,1 cm. 
		Współczynniki ekstynkcji specyficzne dla VNPs wynoszą: 
		CPMV: 8,1 cm-1mg-1ml (przy 260 nm) 
		PVX: 2,97 cm-1mg-1ml (przy 260 nm) 
		TMV: 3,0 cm-1mg-1ml (przy 260 nm) 
		BMV: 5,15 cm-1mg-1ml (przy 260 nm)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj cząsteczki za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) z wykluczaniem żelowym.
	<ol>
		<li>Używając kolumny do wykluczania żelowego Superose 6 oraz systemu ÄKTA Explorer, nanieś 50-100 μg VNPs w 200 μl 0,1 M buforu fosforanowego potasu (pH 7,0).</li>
		<li>Ustaw detektory na 260 nm (kwasy nukleinowe), 280 nm (białka) oraz na długość fali wzbudzenia zastosowanych barwników.</li>
		<li>Przeprowadź analizę przy szybkości przepływu 0,5 ml/min przez 72 min.</li>
		<li>Profil elucji oraz stosunek A260:A280 nm wskazują, czy preparat VNP jest czysty oraz czy cząsteczki są nienaruszone i prawidłowo złożone. 
		Następujące stosunki A260:280 wskazują na czysty preparat VNP: 
		CPMV: 1,8±0,1 
		PVX: 1,2±0,1 
		TMV: 1,1±0,1 
		BMV: 1,7±0,1</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź denaturującą elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z gradientem 4-12% Bis-Tris (gotowe żele NuPAGE), aby przeanalizować czystość preparatu i stopień konjugacji z poszczególnymi białkami otoczki.
	<ol>
		<li>Dodaj 3 ml 4x buforu do próbek LDS do 10 μg cząsteczek w 9 μl buforu fosforanowego potasu. W przypadku BMV dodaj dodatkowo 1 μl 4x buforu do próbek LDS oraz 3 μl β-merkaptoetanolu, aby zredukować dużą liczbę mostków disiarczkowych.</li>
		<li>Inkubuj w bloku grzejnym przez 5 min w temperaturze 100 °C.</li>
		<li>Nanieś próbki na żel SDS.</li>
		<li>Przeprowadź elektroforezę przy napięciu 200 V przez 1 h w 1x buforze do elektroforezy MOPS.</li>
		<li>Zdokumentuj żel w świetle UV, aby zwizualizować fluorescencyjne białka otoczki.</li>
		<li>W przypadku białek niewykazujących fluorescencji, barwi żel błękitem Coomassie (0,25% (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250, 30% (v/v) metanol, 10% (v/v) kwas octowy) przez 1 h.</li>
		<li>Odbarwiaj żel w 30% metanolu i 10% kwasie octowym przez noc. W razie potrzeby wymień roztwór.</li>
		<li>Zdokumentuj żel w świetle białym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj integralność cząsteczek za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).
	<ol>
		<li>Rozcieńcz próbki do stężenia 0,1-1 mg/ml w 20 μl wody DI.</li>
		<li>Nanieś 20 μl krople próbek na Parafilm.</li>
		<li>Przykryj krople siatką do TEM i pozostaw na 2 min. Nadmiar roztworu z siatki usuń za pomocą papieru filtracyjnego.</li>
		<li>Przepłucz siatkę, kładąc ją na kropli wody DI, a następnie osusz papierem.</li>
		<li>Zbarw siatkę, kładąc ją na 20 μl kropli 2% (w/v) octanu uranylu przez 2 min. Nadmiar barwnika usuń papierem filtracyjnym.</li>
		<li>Przepłucz siatkę ponownie w wodzie.</li>
		<li>Obserwuj siatkę pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Konjugacja chemiczna VNPs z PEG i fluoroforami, oczyszczanie oraz charakterystyka
<ol>
	<li>W obliczeniach dla poniższych reakcji przyjęto następujące masy molowe VNP: 
	CPMV: 5,6 x 106 g/mol 
	PVX: 35 x 106 g/mol 
	TMV: 41 x 106 g/mol 
	BMV: 4,6 x 106 g/mol</li>
	<li>Sprzęgnij barwniki i PEG z lysynami powierzchniowymi CPMV oraz PVX, wykorzystując jednowypadkową reakcję sprzęgania z N-hydroksysukcynimidem: dodaj 2 500 równoważników molowych (wszystkie nadmiary molowe odnoszą się do nadmiaru molowego na jeden VNP) estru sukcynimidylowego Alexa Fluor 647 oraz 4 500 równoważników NHS-PEG (M.W. 5 000) rozpuszczonych w DMSO do CPMV w 0,1 M buforze fosforanowym potasu. W przypadku pracy z PVX dodaj 10 000-krotny nadmiar molowy NHS-barwnika i NHS-PEG. Dostosuj objętości buforu i DMSO w taki sposób, aby końcowe stężenie CPMV i PVX wynosiło 2 mg/ml, a zawartość DMSO stanowiła 10% całkowitej objętości reakcji. Inkubuj mieszaninę reakcyjną przez noc w temperaturze pokojowej, chroniąc ją przed światłem. CPMV i PVX posiadają odpowiednio 300 i 1 270 dostępnych do modyfikacji lysyn. (W celu pogłębienia wiedzy na temat modyfikacji chemicznej CPMV i PVX zaleca się zapoznanie z następującymi referencjami: 13-15).</li>
	<li>Sprzęgnij barwniki i PEG z tyrozynami TMV poprzez sprzęganie diazoniowe, a następnie miedziową(I)-katalizowaną cykloaddycję azydowo-alkinową.
	<ol>
		<li>Przygotuj sól diazoniową (alkin), mieszając 400 μl 0,3 M monohydratu kwasu p-toluenosulfonowego, 25 μl 3,0 M azotyku sodu i 75 μl 0,68 M destylowanej 3-etynylaniliny rozpuszczonej w acetonitrylu w temperaturze 4 °C przez 1 h.</li>
		<li>Dodaj 3,3 ml buforu boratowego o pH 8,8 zawierającego 100 mM NaCl do 1,25 ml TMV (roztwór zapasowy 20 mg/ml).</li>
		<li>Reaguj TMV z 450 μl roztworu soli diazoniowej (alkinu) w kąpieli lodowej przez 3 h, aby wprowadzić grupę alkinową jako uchwyt do ligacji w TMV poprzez sprzęganie diazoniowe. Roztwór przybierze jasnobrązowy kolor. TMV posiada 2 140 tyrozyn dostępnych do sprzęgania.</li>
		<li>Oczyść produkt końcowy, wykorzystując poduszkę sacharozową zgodnie z opisem w punkcie 4.4.</li>
		<li>Przyłącz funkcjonalizowany azydowo Alexa Fluor 647 oraz PEG-azyd (M.W. 5 000) za pomocą miedziowej(I)-katalizowanej cykloaddycji azydowo-alkinowej (CuAAC). Dodaj 2 równoważniki azyd-barwnika i azyd-PEG na białko otoczki i inkubuj z 1 mM CuSO4, 2 mM AMG oraz 2 mM askorbinianem sodu w temperaturze pokojowej przez 15 min. Dostosuj objętość buforu tak, aby końcowe stężenie reakcyjne TMV wynosiło 2 mg/ml. (W celu pogłębienia wiedzy na temat modyfikacji chemicznej TMV zaleca się zapoznanie z następującymi referencjami: 16,17).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprzęgnij barwniki z lysynami, a PEG z cysteinami mutantu cysteinowego BMV (cBMV):
	<ol>
		<li>Dodaj 2 000 równoważników molowych estru sukcynimidylowego Oregon Green 488 rozpuszczonego w DMSO do cBMV w 0,1 M buforze TNKM (50 mM Tris, 50 mM NaCl, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, pH 7,4). Dostosuj objętości buforu i DMSO tak, aby końcowe stężenie BMV wynosiło 1 mg/ml, a zawartość DMSO stanowiła 10% całkowitej objętości reakcji. Inkubuj mieszaninę reakcyjną przez noc w temperaturze 4 °C, chroniąc ją przed światłem.</li>
		<li>Oczyść cząsteczki, używając filtrów odwirku zgodnie z opisem w punkcie 4.4.</li>
		<li>Dodaj 2 000-krotny nadmiar molowy PEG-maleimidu (M.W. 2 000), stosując te same warunki reakcji co wcześniej, i inkubuj mieszaninę reakcyjną przez 2 h w temperaturze 4 °C. cBMV posiada 180 reaktywnych lysyn i cystein. (W celu pogłębienia wiedzy na temat modyfikacji chemicznej BMV zaleca się zapoznanie z następującą referencją:18).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie: Przepuść roztwór przez 40% (w/v) poduszkę sacharozową przy 160 000 x g przez 2,5 h. Ponownie rozpuść osad w buforze. Alternatywnie przeprowadź dializę przeciwko odpowiedniemu buforowi, używając filtrów wirowych z odcięciem 10 kDa.</li>
	<li>Charakteryzacja: PEGylizowane i znakowane fluorescencyjnie VNP analizuje się za pomocą opisanych powyżej metod: spektroskopii UV/Vis, elektroforezy w żelu SDS, FPLC oraz TEM (nie pokazano, jednak należy odnieść się do Rysunków 6 i 7).</li>
</ol>
5. Celowanie w nowotwór i obrazowanie z wykorzystaniem modelu ksenoprzeszczepu mysiego
<ol>
	<li>Hodować ludzkie komórki raka jelita grubego HT-29 w podłożu RPMI uzupełnionym o 5% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny i 1% L-glutaminy w temperaturze 37 °C w 5% CO2, używając kolb do hodowli komórkowej o powierzchni 175 cm2.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie sterylnym PBS i zebrać poprzez inkubację z 5 ml trypsyny-EDTA w 37 °C przez 5 min. Inaktywować trypsynę za pomocą 5 ml podłoża RPMI. Zebrać komórki przez wirowanie przy 500 x g przez 5 min. w 4 °C i resuspendować w świeżym RPMI w zagęszczeniu 5x106 komórek/50 μl podłoża (liczbę całkowitą komórek oznaczyć przy użyciu błękitu trypanu i hemocytometru). Przed wstrzyknięciem zmieszać z równą objętością matrigelu (wszystkie roztwory i odczynniki muszą pozostać sterylne).</li>
	<li>Pozyskać sześciotygodniowe myszy NCR nu/nu i utrzymywać je na diecie bez lucerny przez 2 tygodnie. [Uwaga: wszystkie procedury dotyczące zwierząt muszą zostać zatwierdzone przez IACUC]. Indukować ksenoprzeszczepy guzów poprzez podskórne wstrzyknięcie 5x106 komórek/100 μl/guz w boki (2 guzy/mysz), używając sterylnej igły o średnicy 18 1/2 G. Regularnie monitorować zwierzęta. Pomieścić wielkość guzów za pomocą suwmiarki i pozwolić guzom urosnąć do średniej objętości 20 mm3 (w ciągu następnych 12 dni). Przyporządkować myszy losowo do dwóch różnych grup: PBS i VNP (n = 3 zwierzęta/grupa/punkt czasowy). Używając strzykawki insulinowej 1 ml o średnicy 28 G, podać dożylnie przez żyłę ogonową 100 μl sterylnego PBS lub formulację VNP w dawce 10 mg/kg.</li>
</ol>
Uwaga: Eksperymenty z hodowlami tkankowymi oraz badania na żywych zwierzętach nie zostaną zaprezentowane. Demonstracja praktyczna ograniczy się do przetwarzania tkanek i akwizycji danych. W celu uzyskania informacji na temat modelu ksenograftu guza HT-29 należy odwołać się do pozycji 19
Do oceny homingu VNPs do guza wykorzystuje się trzy techniki:
<ol start="4">
	<li>Obrazowanie fluorescencyjne z wykorzystaniem systemu obrazowania Maestro: Uśmierć myszy w różnych punktach czasowych (2, 24 i 72 h) przy użyciu CO2 gaz. Przeprowadź sekcję zwierząt i wyciśnij wszystkie główne organy (mózg, serce, płuca, śledzionę, nerki i wątrobę) wraz z guzami na bokach ciała. Umieść tkanki na parafilmie i przeanalizuj za pomocą urządzenia do obrazowania fluorescencyjnego, stosując żółte filtry wzbudzenia i emisji (czas ekspozycji 800 ms), aby wykryć obecność sygnałów fluorescencyjnych w tkankach (pochodzących z etykiety A647 sprzężonej z VNPs). Zapisz obrazy i przeanalizuj intensywność fluorescencji przy użyciu oprogramowania ImageJ 1.44o (<a href="http://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij</a>). Porównać w czasie wzorzec wychwytu VNPs w guzach i innych głównych tkankach.</li>
	<li>Po obrazowaniu każdą tkankę należy przeciąć na pół, a jedną połowę zatopić w związku OCT w celu wykonania kriosnittów i analizy konfokalnej. Drugą połowę należy umieścić w wcześniej zważonych probówkach kriogenicznych i natychmiast zamrozić w ciekłym azocie.2Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania.</li>
	<li>Ilościowe oznaczanie fluorescencji: Zapisz masę tkanek. Rozmroź zamrożone tkanki w temperaturze pokojowej i umieść je w osobnych probówkach Falcon o pojemności 50 ml zawierających 1 ml PBS. Za pomocą ręcznego homogenizatora do tkanek homogenizuj tkanki w PBS przez 2–3 min, a następnie przenieś homogenizat do probówek do mikrowirówki. Wirowarkuj homogenizaty przez 10 min przy 13 000 x g w celu usunięcia niezhomogenizowanej tkanki.</li>
	<li>Przenieś 100 μl supernatantu z tkanek z każdej grupy (PBS i preparaty VNP/punkty czasowe) do czarnej płytki UV z 384 dołkami. Oceń intensywność fluorescencji (długości fal Ex/Em 600/665) za pomocą czytnika płytek. Znormalizuj otrzymane wartości fluorescencji względem masy tkanek.</li>
	<li>Immunohistochemia: Przygotować skrawki na mikrotomie kriostatycznej (10 μm) i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przeprowadzić barwienie skrawków tkanek w celu wykazania jąder komórkowych (DAPI) oraz markera komórek śródbłonka (przeciwciało anty-mysie CD31 znakowane FITC). Wykonać analizę z użyciem mikroskopii konfokalnej w celu zmapowania lokalizacji znakowanych fluorescencyjnie VNP w naczyniach oraz w obrębie guza.</li>
</ol>
Uwaga: Procedura ta nie zostanie zaprezentowana, reprezentatywne dane przedstawiono na Rysunku 8. W celu uzyskania informacji na temat immunohistochemii oraz opisanych metod barwienia, czytelnik może zapoznać się z ref. 19

<ol><li>Description of Plant Viruses [Internet]. , Association of Biologists. Warwick, UK. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://dpvweb.net/ ">http://dpvweb.net/ </a> (2012).</li>
<li>Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VIPERdb2%3A+an+enhanced+and+web+API+enabled+relational+database+for+structural+virology%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology.</a> Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).</li>
<li>Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+of+engineering+viral+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">The art of engineering viral nanoparticles.</a> Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+engineering+of+an+icosahedral+virus+for+nanomedicine+and+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).</li>
<li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Nano-Constructs+Composed+of+Genome-Depleted+Brome+Mosaic+Virus+Doped+with+a+Near+Infrared+Chromophore+for+Potential+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications.</a> ACS Nano. , (2011).</li>
<li>Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).</li>
<li>Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+virions%3A+dynamic+tracking+of+the+pathway+of+adenoviral+gene+transfer+vectors+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells.</a> Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).</li>
<li>Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nat. Med. 12, 354-360 (2006).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+human+prostate+cancer+using+viral+nanoparticles+targeted+to+gastrin-releasing+Peptide+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors.</a> Small. 7, 1664-1672 (2011).</li>
<li>Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+probe+using+hybrid+virus-dye+nanoparticles+for+near-infrared+fluorescence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Communications%22%5BJournal%5D)">A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography.</a> Optics Communications. 255, 366-374 (2005).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cowpea+mosaic+virus+nanoparticles+target+surface+vimentin+on+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells.</a> Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).</li>
<li>Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+vascular+permeability+and+the+EPR+effect+in+macromolecular+therapeutics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review.</a> Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).</li>
<li>Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+addresses+on+an+addressable+virus+nanoblock%3A+uniquely+reactive+Lys+residues+on+cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus.</a> Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potato+virus+X+as+a+novel+platform+for+potential+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications.</a> Nano Lett. 10, 305-312 (2010).</li>
<li>Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icosahedral+virus+particles+as+addressable+nanoscale+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).</li>
<li>Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modification+of+tobacco+mosaic+virus+with+%22click%22+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry.</a> Chembiochem. 9, 519-523 (2008).</li>
<li>Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-surface+modification+of+the+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).</li>
<li>Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Brome+mosaic+virus+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications.</a> RSC Advances. , (2012).</li>
<li>Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrazone+ligation+strategy+to+assemble+multifunctional+viral+nanoparticles+for+cell+imaging+and+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting.</a> Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).</li>
<li>Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+tumor+homing+and+tissue+penetration+of+the+filamentous+plant+viral+nanoparticle+Potato+virus+X%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X.</a> Molecular Pharmaceutics. , (2012).</li>
<li>Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+conjugation+of+heterologous+proteins+on+the+surface+of+Cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus.</a> Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Niniejszy protokół przedstawia metodę chemicznej modyfikacji VNPs oraz ich zastosowania w obrazowaniu nowotworów in vivo. Prezentowane tutaj techniki obrazowania fluorescencyjnego zwierząt, kwantyfikacji fluorescencji oraz immunohistochemii są przydatne do badania biodystrybucji i oceny celowania w nowotwór. Techniki te dostarczają cennych informacji na temat dostępu nanocząsteczek do guza poprzez efekt EPR. Dzięki połączeniu wyników z różnych metod analitycznych otrzymujemy skuteczne podejście do oceny lokaliza...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Produkcja VNP&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Wewnętrzna komora roślinna</td><td>Percival Scientific</td><td>E-41L2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. unguiculata&lt;/em&gt; nasiona (odmiana California black-eye no. 5)</td><td>Burpee</td><td>51771A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N. benthamiana&lt;/em&gt; nasiona</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Nasiona N. benthamiana zostały otrzymane w darowiźnie z Salk Institute. Nasiona są pozyskiwane poprzez rozmnażanie roślin.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Karborund</td><td>Fisher</td><td>C192-500</td><td></td></tr><tr><td>Ziemia do doniczek Pro-mix BX</td><td>Premier Horticulture</td><td>713400</td><td></td></tr><tr><td>Profesjonalny nawóz Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite</td><td>JR Peters</td><td>77860</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Sprzęt&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>50,2 rotor z tytaun</td><td>Beckman</td><td>337901</td><td></td></tr><tr><td>rotor SW 32 Ti</td><td>Beckman</td><td>369694</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka Optima L-90K</td><td>Beckman</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>rotor SLA-3000</td><td>Thermo Scientific</td><td>07149</td><td></td></tr><tr><td>rotor SS-34</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>wirówka Sorvall RC-6 Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Butelka z polipropylenu</td><td>Beckman</td><td>355607</td><td>Dla rotora SLA-3000</td></tr><tr><td>Butelka poliwęglanowa</td><td>Beckman</td><td>357002</td><td>Dla rotora SS-34</td></tr><tr><td>probówka Ultra-Clear</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>Do gradientu sacharozy i rotora SW 32 Ti</td></tr><tr><td>Butelka poliwęglanowa</td><td>Beckman</td><td>355618</td><td>Do wirowania w celu otrzymania osadu i rotora 50.2 Ti</td></tr><tr><td>spektrofotometr NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop2000c</td><td></td></tr><tr><td>system gotowych żeli PowerEase 500</td><td>Invitrogen</td><td>EI8675EU</td><td></td></tr><tr><td>kolumna do chromatografii żelowej (wykluczania sterycznego) Superose 6 10/300 GL (24 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#196;Chromatograf KTA Explorer 100</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-66</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R</td><td>Beckman</td><td>392302</td><td>Wirówka nakładkowa</td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Maestro 2</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>&lt;em&gt;In vivo&lt;/em&gt; system obrazowania</td></tr><tr><td>Rozrywacz tkanek</td><td>Produkty Biospec</td><td>985370-395</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Tecan</td><td>Infinite-200</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop elektronowy transmisyjny</td><td>ZEISS</td><td>Libra 200FE</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny FluoView</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Odczynniki i substancje chemiczne&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>3-etynyloanilina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>498289-5G</td><td></td></tr><tr><td>czarna płytka 384-dołkowa</td><td>BD Biosciences</td><td>353285</td><td></td></tr><tr><td>żel NuPAGE SDS Bis-Tris 4-12%</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>bufor do próbek 4X LDS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher</td><td>A385-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>271004-1L</td><td></td></tr><tr><td>azydek Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A10277</td><td></td></tr><tr><td>Kwas karboksylowy Alexa Fluor 647, ester succynimidylowy</td><td>Invitrogen</td><td>A20006</td><td></td></tr><tr><td>Filtry wirówkowe Amicon Ultra-0,5 ml</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td>próg odcięcia 10 kDa</td></tr><tr><td>Chlorowodorek aminoguanidyny</td><td>Acros Organics</td><td>36891-0250</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Fisher</td><td>A74-500</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Fisher</td><td>BP101-25</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Acros Organics</td><td>42285-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MP Biomedicals</td><td>157574</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfoksyd</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtracyjny</td><td>Fisher</td><td>09-801K</td><td>stopień P5</td></tr><tr><td>przeciwciało przeciwko CD31 mysiego pochodzenia znakowane FITC</td><td>BioLegend</td><td>102406</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Invitrogen</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Sód L-askorbinian</td><td>Acros Organics</td><td>35268-0050</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A412P-4</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Przesmyki szkiełka przedmiotowego</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe do mikroskopu</td><td>VWR</td><td>48366-277</td><td></td></tr><tr><td>bufor MOPS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-mal</td><td>Nanokryształy</td><td>PG1-ML-2k</td><td>MW 2000</td></tr><tr><td>mPEG-N3</td><td>Nanokryształy</td><td>PG1-AZ-5k</td><td>masa cząsteczkowa 5000</td></tr><tr><td>mPEG-NHS</td><td>Nanokryształy</td><td>PG1-SC-5k</td><td>MW 5000</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 ester succynimidylowy *izomer 6*</td><td>Invitrogen</td><td>O-6149</td><td></td></tr><tr><td>monohydrat kwasu p-toluenosulfonowego</td><td>Acros Organics</td><td>13902-0050</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Fisher</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednodobazowy</td><td>Fisher</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Fisher</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Azotyn sodu</td><td>Acros Organics</td><td>42435-0050</td><td></td></tr><tr><td>Siarczyn sodu</td><td>Amresco</td><td>0628-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher</td><td>S6-500</td><td></td></tr><tr><td>Siatka do TEM</td><td>Ted Pella</td><td>FCF-400Cu</td><td></td></tr><tr><td>Tris (zasada)</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Chemicals</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Fisher</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Kultura tkanek&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Invitrogen</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Komora countingowa (hemocytometr)</td><td>Fisher</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>komórki HT-29</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-080</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>31800-089</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych</td><td>Corning</td><td>431080</td><td>175 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna, 0,05% (1X) z EDTA 4Na, roztwór</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Badania na zwierzętach&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Dieta dla gryzoni z 18% zawartością białka</td><td>Harlan Teklad</td><td>Teklad Global 2018S</td><td>Dieta bez lucerny</td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa</td><td>BD Biosciences</td><td>329410</td><td>igła 28 G</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Baxter</td><td>AHN3637</td><td></td></tr><tr><td>Macierz Matrigel, błona podstawna</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>myszy NCR nu/nu</td><td></td><td></td><td>Szkoła CWRU&lt;br/&gt; Jednostka ds. Zwierząt Atymicznych i Ksenoprzeszczepów przy Wydziale Medycyny</td></tr><tr><td>Sterylna strzykawka</td><td>BD Biosciences</td><td>305196</td><td>igła 18 1/2 G</td></tr><tr><td>Związek do kriotomii Tissue-Tek CRYO-OCT</td><td>Andwin Scientific</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

nanocząsteczki wirusowe do obrazowania guzów in vivo

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Wykorzystanie nanomateriałów ma potencjał, by zrewolucjonizować inżynierię materiałową i medycynę. Obecnie badana jest szereg różnych nanocząsteczek pod kątem zastosowań w obrazowaniu i terapii. Wirusowe nanocząsteczki (VNPs) pochodzące z roślin można uznać za samoskładające się bionanomateriały o określonych rozmiarach i kształtach. Wirusy roślinne badane w laboratorium Steinmetza obejmują cząsteczki ikosaedryczne tworzone przez Cowpea mosaic virus (CPMV) oraz Brome mosaic virus (BMV), z których oba mają średnicę 30 nm. Opracowujemy również struktury pręcikowe i nitkowate pochodzące z następujących wirusów roślinnych: Tobacco mosaic virus (TMV), który tworzy sztywne pręciki o wymiarach 300 nm na 18 nm, oraz Potato virus X (PVX), który tworzy cząsteczki nitkowate o długości 515 nm i szerokości 13 nm (czytelnika odsyłamy do ref. 1 i 2 w celu uzyskania dalszych informacji na temat VNPs).
Z punktu widzenia inżyniera materiałowego VNPs są atrakcyjnymi modułami budulcowymi z kilku powodów: cząstki te są monodyspersyjne, mogą być z łatwością produkowane na dużą skalę in planta, są wyjątkowo stabilne i biokompatybilne. Ponadto VNPs są jednostkami „programowalnymi”, które można specyficznie modyfikować za pomocą inżynierii genetycznej lub metod biokoniugacji chemicznej 3. Struktura VNPs jest znana z rozdzielczości atomowej, a modyfikacje mogą być przeprowadzane z precyzją przestrzenną na poziomie atomowym4 – jest to poziom kontroli, którego nie można osiągnąć przy użyciu syntetycznych nanomateriałów z zastosowaniem obecnie dostępnych, najnowocześniejszych technologii.
W niniejszej pracy opisujemy propagację wirusów CPMV, PVX, TMV i BMV w roślinach Vigna ungiuculata oraz Nicotiana benthamiana. Przedstawiono protokoły ekstrakcji i oczyszczania dla każdego VNP. Opisano metody charakteryzacji oczyszczonych i chemicznie znakowanych VNP. W badaniu tym skupiamy się na znakowaniu chemicznym VNP fluoroforami (np. Alexa Fluor 647) oraz glikolem polietylenowym (PEG). Barwniki ułatwiają śledzenie i detekcję VNP 5-10, a PEG zmniejsza immunogenność białkowych nanocząsteczek, jednocześnie poprawiając ich farmakokinetykę 8,11. Wykazaliśmy celowanie do guza PEGylacji VNP z wykorzystaniem modelu mysiego ksenoprzeszczepu nowotworowego. Do badania biodystrybucji wykorzystano kombinację obrazowania fluorescencyjnego tkanek ex vivo przy użyciu systemu Maestro Imaging System, kwantyfikacji fluorescencji w homogenizowanych tkankach oraz mikroskopii konfokalnej. VNP są usuwane przez układ siateczkowo-ściśleczny (RES); celowanie do guza odbywa się biernie poprzez efekt zwiększonej przepuszczalności i retencji (EPR)12. Nanotechnologia VNP jest potężną technologią typu plug-and-play do obrazowania i leczenia ognisk chorobowych in vivo. Dalsze prace nad VNP koncentrujemy na dostarczaniu ładunków leków i klinicznie istotnych grup obrazujących, a także ligandów specyficznych dla tkanek, aby celować w receptory molekularne nadmiernie ekspresowane w nowotworach i chorobach układu sercowo-naczyniowego.

<img alt="Porównawcza analiza wzrostu roślin; układ eksperymentalny, badanie zmienności koloru liści, metoda chlorozy." src="/files/ftp_upload/4352/4352fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Rośliny zainfekowane wirusami roślinnymi. Rośliny Vigna unguiculata zainfekowane CPMV (A). Rośliny Nicotiana benthamiana zainfekowane PVX (B), TMV (C) oraz BMV (D). Zdjęcia wykonano około 10 dni po infekcji poprzez inokul...

Nanocząstki wirusowe pochodzenia roślinnego (VNPs) stanowią obiecujące platformy do zastosowań w biomedycynie. W niniejszym materiale opisujemy procedury propagacji, oczyszczania, charakteryzacji oraz biokoniugacji roślinnych VNP. Na koniec przedstawiamy zastosowanie VNP w celowanym dostarczaniu do guzów oraz obrazowaniu z wykorzystaniem modelu ksenoprzeszczepu u myszy i obrazowania fluorescencyjnego.

Nanocząsteczki wirusowe do obrazowania guzów in vivo

Wykorzystanie nanomateriałów ma potencjał zrewolucjonizować inżynierię materiałową oraz medycynę. Obecnie opracowywanych jest szereg różnych nanocząsteczek...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie wewnątrzorganizacyjnego (in vivo) celowania w nowotwór oraz biodystrybucji wirusowych nanocząsteczek znakowanych fluorescencyjnie. W mysich modelach nowotworowych należy najpierw namnożyć i oczyścić wirusa, a następnie sprzęgnąć barwniki oraz peg z cząsteczkami. Po scharakteryzowaniu funkcjonalizowanych cząsteczek należy przystąpić do ich wstrzyknięcia myszom z ksenoprzeszczepami nowotworowymi.Wyniki obrazowania Maestro, natężenia fluorescencji, pomiarów homogenatów tkanek oraz immunofluorescencji wykazują lokalizację nanocząsteczek wirusowych w guzie oraz w różnych organach w całym organizmie. Nanocząsteczki lub VMP są obiecującymi platformami do zastosowań w biomedycynie. W niniejszej pracy opisujemy procedury dotyczące PLA VMP: namnażania, oczyszczania, charakterystyki oraz koniugacji.Na koniec prezentujemy zastosowanie V mps w ukierunkowaniu na guz oraz w obrazowaniu z wykorzystaniem modelu przeszczepu malino oraz obrazowania fluorescencyjnego. Obecnie bada się szereg różnych nanocząsteczek pod kątem zastosowań w diagnostyce obrazowej i terapii. Główną zaletą stosowania nanocząsteczek biologicznych w porównaniu z materiałami syntetycznymi, takimi jak nanomateriały metaliczne lub polimerowe, jest fakt, że BMP pochodzenia roślinnego są jednorodnie rozproszone, a ich struktury są znane z rozdzielczości atomowej.Wirusy roślinne mogą być produkowane na dużą skalę za pomocą farmingu molekularnego i poddawane zarówno inżynierii genetycznej, jak i chemicznej. W niniejszym pokazie prezentujemy chemiczną modyfikację nanocząsteczek wirusowych za pomocą fluoroforów oraz PEG. Fluorofory zostaną wykorzystane do poprawy obrazowania, natomiast PEG posłuży do usprawnienia farmakokinetyki.Modyfikacje chemiczne można rozszerzyć w celu załadowania nanocząsteczek wirusowych terapeutykami oraz środkami kontrastowymi do obrazowania klinicznego, takiego jak MRI. W niniejszej pracy przeprowadziliśmy badanie biodystrybucji nanocząsteczek wirusowych, podobnie jak w przypadku innych nanocząsteczek. Gromadzenie się nanocząsteczek wirusowych w guzie opiera się na zwiększonej przepuszczalności i retencji, co określa się jako pasywne celowanie do guza.Niedawno odkryliśmy, że profile biodystrybucji różnych wirusów roślinnych są odmienne. W tym pokazie wykorzystamy wirusa mozaiki tytoniu, który jest uważany za złoty standard w nanotechnologii wirusowej. Szczególnie zależy nam na opracowaniu, zaprojektowaniu i zbadaniu nanomateriałów pochodzących z wirusów roślinnych.Moje laboratorium koncentruje się na zdobyciu fundamentalnej wiedzy na temat tego, jak wirus mozaiki krowiej (Ed cow p mosaic virus), wirus mozaiki brązowej (brown mosaic virus), prętowaty wirus mozaiki bacca (rock shaped bacca mosaic virus) oraz nitkowaty wirus X ziemniaka (potato virus X) oddziałują z systemem ssaków. W szczególności chcemy dowiedzieć się, jak kształt i elastyczność wpływają na właściwości EVO oraz jak najlepiej dostosować je do zastosowań takich jak obrazowanie specyficzne dla tkanki i dostarczanie leków. Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje przygotowanie wirusa mozaiki kalp (kalp mosaic virus), wirusa X ziemniaka (potato virus X), wirusa mozaiki brązowej (brown mosaic virus) oraz wirusa mozaiki tytoniu (tobacco mosaic virus).Opisujemy funkcjonalizację oraz zastosowanie Vic, Gil i Nicotiana w przedklinicznym modelu mysim. W tej demonstracji wykorzystamy wirusa mozaiki krowiej P (cow P mosaic virus) w komorze inkubacyjnej. Posadź trzy nasiona cow P w jednej doniczce.W 10. dniu zainfekuj każdy liść CPMV w stężeniu 0,1 µg/µL poprzez inokulację mechaniczną, stosując lekkie opylenie kminem, a następnie delikatne pocieranie liści. Po 10 dniach zbierz liście i przechowuj w temperaturze -80 °C. W standardowym blenderze zhomogenizuj 100 g zamrożonych liści w dwóch objętościach zimnego 0,1 M buforu fosforanowego potasu o pH 7, przefiltruj homogenat przez trzy warstwy gazy i odwiruj przy 5 500 ×g przez 20 minut.Zebrać supernatant, a następnie przeprowadzić ekstrakcję organiczną materiału roślinnego przy użyciu 0,7 objętości mieszaniny chloroformu i butanolu w stosunku 1:1, mieszając zawiesinę przez co najmniej 30 minut. Po odwirowaniu roztworu przy 5 500 G przez 20 minut zebrać górną fazę wodną i poddać ją ultrawirowaniu.Wiruj przy 160 000 g przez trzy godziny. Następnie zawiesić osad w pięciu mililitrach buforu fosforanowego i inkubować próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Przygotować również gradient sacharozy od 10 do 40%, stosując równe objętości sacharozy o stężeniach 10, 20, 30 i 40% w buforze.Rozmieszczając najcięższe frakcje jako pierwsze, doprowadzić gradient do stanu równowagi przez noc w temperaturze pokojowej. Nanieść RESUSPENDOWANY osad na gradient sacharozy i wirować przy 100 000 G przez dwie godziny. Zebrać pasmo rozpraszania światła i dializować przeciwko buforowi w celu sprzęgnięcia barwników i PEG z resztami lizyny powierzchniowej przy 2 500 ekwiwalentach molowych Fluor oraz 4 500 ekwiwalentach NHS PEG w stosunku do CPMV.Po oczyszczeniu produktu reakcji, zmierz widmo absorbancji dwóch mikrolitrów próbki przy użyciu nanodropu, odnotowując wartości przy 260, 280 i 651 nanometrach. Następnie przeprowadź analizę cząstek metodą szybkiej chromatografii cieczowej białek z wykluczaniem sterycznym (SEC), stosując kolumnę Superdex 200 i system ÄKTA Explorer; nanieś od 50 do 100 mikrogramów próbki VNP w 200 mikrolitrach 0,1 molarnego buforu fosforanowego potasu.Przy pH 7,0 ustaw detektory na 260 nanometrów dla kwasów nukleinowych i 280 nanometrów dla białek. Ustaw również długość fali absorpcji dla wszelkich zastosowanych barwników. Przeprowadź rozdział przy szybkości przepływu 0,5 mililitrów na minutę przez 72 minuty.Profil elucji w stosunku 2:62:80 wskazuje, czy reakcja jest czysta oraz czy V NPS są w pełni zmontowane i nienaruszone. Następnie przygotuj denaturującą elektroforezę w żelu SDS, aby przeanalizować sprzęganie z poszczególnymi białkami otoczki. Do każdej próbki dodaj trzy µL 4× buforu do próbek SDS do 10 µg cząsteczek w dziewięciu µL buforu fosforanowego potasu i denaturuj w bloku grzewczym przez pięć minut w temperaturze 100 °C.Nanieś próbki na żel SDS i prowadź elektroforezę przy napięciu 200 V przez jedną godzinę. W buforze do prowadzenia MOPS 1X udokumentuj żel w świetle białym. Po barwieniu te nanocząsteczki wirusowe są gotowe do celowania w guzy i obrazowania z wykorzystaniem modelu mysiego z ksenoprzeszczepem.Zazwyczaj cząstki te podajemy dożylnie poprzez wstrzyknięcie do ogonowej żyły. Aby ocenić homing VN ps do guza, analizujemy tkanki za pomocą urządzenia do obrazowania fluorescencyjnego Maestro. W celu kwantyfikacji fluorescencji wykorzystujemy żółte filtry wzbudzenia i emisji z czasem ekspozycji 800 milisekund, aby wykryć sygnały fluorescencyjne pochodzące z etykiety A 6 47 sprzężonej z VN PS.Homogenizować tkanki przez dwie do trzech minut w PBS. Następnie przenieść homogenat do probówek do wirowania. Dla każdej formulacji PBS i VNP w danym punkcie czasowym przenieść 100 µL próbki do czarnej płytki UV z 384 dołkami. Zmierzyć intensywność fluorescencji, używając długości fali wzbudzenia 600 nm i emisji 665 nm.Pomyślną propagację VNP można określić po pojawieniu się symptomów mozaiki na liściach około tygodnia po inokulacji mechanicznej. Do oceny czystości cząsteczek można wykorzystać spektroskopię UV-vis. Absorbancja przy 260 nanometrach jest proporcjonalna do stężenia kwasów nukleinowych, a absorbancja przy 280 nanometrach jest proporcjonalna do stężenia białek.Te profile elucji z wykluczenia sterycznego dla VN PS uzyskano przy użyciu kolumny Superos six oraz urządzenia ACTA purifier. Podobnie jak w przypadku widm UV-widzialnych, stosunek A₂₆₀ do A₂₈₀ może być wykorzystany do oceny czystości preparatów VNP. Dodatkowo profil elucji może służyć do określenia czystości cząstek.Elektroforeza w żelu SDS rozdziela zdenaturowane podjednostki białka otoczki. Cząsteczki CPMV są tworzone przez dwa białka: duże białko o masie 42 kilodalton oraz małe białko o masie 24 kilodalton. Uwaga. Mniejsze białko występuje w dwóch formach elektroforetycznych na tych obrazach TEM cząsteczek wirusa.Siatki TEM poddano barwieniu negatywowemu 2% octanem uranylu, dzięki czemu cząsteczki są jasne na ciemnym tle. Cząsteczki CPMV mają rozmiar 30 nanometrów. Nanocząsteczki V NPS mogą być następnie funkcjonalizowane za pomocą chemii biokoniugacji.Na przykład CPMV posiadają lizyny, które mogą być wykorzystane do reakcji z funkcjonalizowanymi estrami NHS w celu potwierdzenia funkcjonalizacji V NPS; charakterystykę przeprowadza się przy użyciu tych samych metod, co wcześniej dla oczyszczonych cząsteczek. Przedstawione dane są reprezentatywne dla VN ps znakowanych fluorescencyjnie i pegylowanych. Funkcjonalizowane cząsteczki mogą następnie zostać wykorzystane w dalszych zastosowaniach, takich jak badanie biodystrybucji i celowania w nowotwory przy użyciu pegylowanych i znakowanych VN ps.W niniejszym badaniu oceniono biodystrybucję CPMV u myszy nago z wszczepionymi ksenograftami ludzkich komórek HT 29; biodystrybucję oraz homing do guza oceniono za pomocą obrazowania tkanek systemem Maestro. W badaniu ex vivo nie zaobserwowano fluorescencji w przypadku kontroli PBS. Natomiast dla CPMV sprzężonego z 6 47 i PEG odnotowano wyraźną fluorescencję w wątrobie oraz częściowo w śledzionie, co wynikało z eliminacji przez układ siateczkowo-śródbłonkowy.Wyraźna fluorescencja w guzie wskazuje na celowanie w nowotwór poprzez efekt zwiększonej przepuszczalności i retencji. Te dane ilościowe uzyskano poprzez pomiar fluorescencji homogenizowanych tkanek, z normalizacją względem masy tkanki. Zgodnie z oczekiwaniami dane wskazują na oczyszczanie z CPMV przez wątrobę i śledzionę.CPMV jest wykrywane również w guzie. Dalsza lokalizacja wewnątrzguzowa z wykorzystaniem barwienia immunologicznego tkanek ciętych kriostatem wykazuje lokalizację CPMV wewnątrz guza. CPMV jest zaznaczone na czerwono.Kolor niebieski oznacza jądra komórkowe, a zielony naczynie krwionośne wybarwione przeciwciałem anty-CD 31. CPMV znajdowało się głównie w pobliżu naczyń krwionośnych guza. Opisane techniki znalazły zastosowanie w szerokiej gamie systemów bionanocząsteczkowych.Laboratorium Steina bada VMP, takie jak wirus mozaiki krowiej, wirus mozaiki brokuła, wirus X ziemniaka oraz wirus mozaiki tytoniu. Metodologie te mogą być jednak zastosowane do dowolnych innych nanocząsteczek wirusowych lub nanostruktur białkowych, takich jak białka szoku cieplnego. Po wykonaniu tej procedury można zastosować dodatkowe metody, takie jak R-T-P-C-R lub Western Block, jako niezależne techniki.Kriosekcjonowanie i immunohistochemia mogą zostać wykorzystane do uzyskania dodatkowych informacji na temat wewnątrznowotworowej lokalizacji v ps oraz potencjalnej kolokalizacji z makrofagami związanymi z nowotworem lub innymi organellami. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak namnażać, oczyszczać, funkcjonalizować i charakteryzować wirusowe nanocząsteczki, a także jak badać ich biodystrybucję in vivo przy użyciu mysiego modelu nowotworowego.

viral-nanoparticles-for-in-vivo-tumor-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wirusowe Nanocząstki do in vivo Obrazowania Guzów

Przedstawiamy nowatorskie podejście do ilościowego określania lokalizacji nanocząsteczek w naczyniach krwionośnych ludzkich guzów ksenoprzeszczepionych z wykorzystaniem dynamicznego obrazowania intravitalnego w czasie rzeczywistym w modelu zarodka ptaka.

Ocena wychwytu nanocząsteczek w guzach w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem obrazowania intravitalnego

Źródło: Kim, B. D., et al. Dostarczanie nanocząstek ładunku oligonukleotydowego w modelu zwierzęcym glejaka wielopostaciowego. J. Vis. Exp. (2024)Ten film pokazuje dożylne wstrzyknięcie terapeutycznych nanocząstek myszy z glejakiem. Metoda umożliwia celowane dostarczanie przez barierę krew-mózg i wspiera nieinwazyjne obrazowanie w celu oceny biodystrybucji nanocząstek i skuteczności terapeutycznej w guzach mózgu.

Dożylne podawanie terapeutycznych nanocząstek w modelu glejaka mysiego

Film demonstruje metodę obrazowania fluorescencyjnego do lokalizacji przeciwciał in vivo w modelu ksenoprzeszczepu guza myszy. Polega na wstrzyknięciu komórek nowotworowych myszy w celu wytworzenia solidnych ksenoprzeszczepów pod skórą. Późniejsze wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych potwierdza specyficzną lokalizację poprzez wzmocnione sygnały fluorescencyjne w obrębie ksenoprzeszczepu guza.

Obrazowanie fluorescencyjne in vivo w celu zlokalizowania przeciwciał w mysim modelu ksenoprzeszczepu guza

Ten artykuł szczegółowo opisuje procedury analizy obrazowania optycznego nanocząsteczki HerDox, ukierunkowanej na nowotwór.  W szczególności opisano tutaj szczegółowe zastosowanie wielomodowego urządzenia do obrazowania do wykrywania celowania w guz i oceny penetracji guza.

Analiza celowanych nanocząstek białek wirusowych dostarczanych do guzów HER2+

Opisujemy system wielokątowego rotacyjnego obrazowania optycznego (MAROI) do ilościowego oznaczania in vivo markera fluorescencyjnego dostarczanego przez nanopęcherzyki saposyny C (SapC)-dioleoilofosfatydyloseryny (DOPS). Wykorzystując mysie modele raka i zapalenia stawów, pokazujemy, w jaki sposób analiza krzywej sygnału MAROI może być wykorzystana do precyzyjnego mapowania i biologicznej charakterystyki procesów chorobowych.

In vivo (in vivo) Obrazowanie optyczne guzów mózgu i zapalenia stawów za pomocą fluorescencyjnych nanopęcherzyków SapC-DOPS

Ten protokół określa kroki wymagane do przeprowadzenia walidacji ex vivo eksperymentów obrazowania ksenoprzeszczepów w bliskiej podczerwieni in vivo na myszach przy użyciu nanociał znakowanych fluoroforem i konwencjonalnych przeciwciał.

Walidacja eksperymentów obrazowania NIRF in vivo na podstawie ksenoprzeszczepu nowotworowego na myszach przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii ex vivo

Słabe zrozumienie skuteczności nanoleków in vivo utrudnia ich kliniczne tłumaczenie. Opisano tutaj procedury oceny zachowania in vivo nanoleków przeciwnowotworowych na poziomie ogólnoustrojowym, tkankowym, jednokomórkowym i subkomórkowym u myszy immunokompetentnych z nowotworem. Podejście to może pomóc naukowcom w zidentyfikowaniu obiecujących nanoleków przeciwnowotworowych do zastosowania klinicznego.

Kompleksowa procedura oceny skuteczności in vivo nanoleków przeciwnowotworowych

Opisujemy protokół przedklinicznego śledzenia in vivo przerzutów nowotworowych. Opiera się on na reporterze radionuklidowo-fluorescencyjnym łączącym symporter jodku sodu, wykrywany przez nieinwazyjny [18F]tetrafluoroboran-PET, oraz białko fluorescencyjne w celu usprawnionego potwierdzenia ex vivo. Metoda ma zastosowanie do przedklinicznego śledzenia komórek in vivo poza biologią guza.

Obrazowanie genu reporterowego radionuklidowo-fluorescencyjnego w celu śledzenia progresji guza w modelach guzów gryzoni

Tutaj prezentujemy szczegółowe metody przygotowania i oceny nosowej samoorganizującej się szczepionki przeciwnowotworowej z nanoemulsji in vitro i in vivo.

Przygotowanie, charakterystyka, toksyczność i skuteczność oceny samoorganizującej się szczepionki przeciwnowotworowej z nanoemulsją do nosa in vitro i in vivo

Prezentujemy nowatorskie podejście do dwufotonowej mikroskopii dostarczania przez nowotwór znakowanych fluorescencyjnie nanocząstek tlenku żelaza do glejaka w modelu mysim.

Dwufotonowa mikroskopia przyżyteczna glejaka w modelu mysim

Bariera krew-mózg jest znaczącą przeszkodą w dostarczaniu terapii glejaka, choroby, na którą nie ma lekarstwa. W tym miejscu przedstawiamy sterowaną obrazem in vivo terapeutyczną platformę nano tlenku żelaza, która może ominąć tę fizjologiczną barierę ze względu na rozmiar i gromadzić się w guzie.

Dostarczanie nanocząstek ładunku oligonukleotydowego w modelu zwierzęcym glejaka wielopostaciowego

Poznaj metodę nanocząstek wirusowych do obrazowania nowotworów in vivo. Technika obejmuje propagację, modyfikację fluorescencyjną i ocenę biodystrybucji w modelu mysim.

Nanocząsteczki wirusowe do obrazowania guzów in vivo

Przeglądaj więcej filmów