Dożylna perfuzja tuszem z sadzy pozwala na wiarygodną wizualizację naczyń mózgowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie anatomii naczyń mózgowych myszy w sposób powtarzalny. W pierwszej kolejności naczynia mózgowe barwi się kolorowym lateksem w celu późniejszego porównania z barwieniem tuszem węglowym. Następnie miesza się tusze węglowe, a zwierzęta poddaje perfuzji PBS-PF oraz mieszaniną tuszu węglowego poprzez lewą komorę.

W ostatnim kroku pobiera się mózg i wykonuje zdjęcia w celu porównania oraz analizy zabarwionych naczyń mózgowych. Następnie wykorzystuje się oprogramowanie Image J do analizy punktów anastomoz pomiędzy środkową a przednią tętnicą mózgową. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię chorób naczyniowych mózgu, w szczególności udaru, ponieważ może być ona użyta do analizy gęstości naczyń oraz angiogenezy.

Obecnie metoda ta pozwala na wgląd w układ naczyniowy mózgu, ale może być również zastosowana do innych układów, na przykład do wizualizacji mikronaczyń w sercu, wątrobie lub nerkach. Po wymieszaniu lateksu z tuszem z sadzą w probówce typu EP należy ogrzać mieszaninę w temperaturze 37 °C w kąpieli wodnej. Do pobrania ogrzanego lateksu do strzykawki o pojemności 2 ml należy użyć igły o rozmiarze od 23 do 25 G.

Następnie rozpuścić 12,5 mg proszku chlorowodorku papiny w 1 ml sterylnej soli fizjologicznej, a po wymieszaniu w wirówce (vortex) zebrać otrzymany roztwór do strzykawki insulinowej. Dalej odłamać igłę od drugiej sterylnej strzykawki insulinowej i umieścić oddzieloną igłę na końcu 20 cm rurki PE 10. Następnie połączyć rurkę PE 10 z igłą strzykawki insulinowej zawierającej roztwór chlorowodorku papiny.

Następnie napełnij dwie kolejne strzykawki insulinowe jednym mililitrem soli fizjologicznej, a potem przenieś wszystkie strzykawki wraz ze sterylnymi narzędziami sekcyjnymi na stół operacyjny przed rozpoczęciem anestezji. Zważ mysz, a następnie ułóż znieczulonego zwierzęcia na plecach. Unieruchom kończyny i nacinaj skórę nad lewą żyłą udową.

Następnie zlokalizuj żyłę udową i wprowadź końcówkę igły połączonej z rurką PE 10. Następnie powoli wstrzyknij roztwór chlorowodorku papainy z prędkością około 100 µL na minutę w dawce 50 mg na kilogram masy ciała. Po wstrzyknięciu rozetnij jamę brzuszną, a następnie przebij przeponę.

Następnie przetnij żebra, aby odsłonić serce, i zacisnąć zstępującą aortę piersiową kleszczykami naczyniowymi. Dalej wykonaj precyzyjne nacięcie nad prawym przedsionkiem, aby odprowadzić krew żylną. Następnie wstrzyknij 2 mL soli fizjologicznej do lewej komory.

Obecność powietrza w roztworach Profil lub w połączonej mieszaninie tuszu może skutkować wystąpieniem niebarwionych obszarów naczyniowych mózgu. Aby zapewnić powodzenie procedury, należy bardzo dokładnie sprawdzić, czy wszystkie strzykawki są całkowicie pozbawione pęcherzyków powietrza. Następnie, powoli podaj zawartość przygotowanych strzykawek, jedna po drugiej, w przypadku ręcznego wstrzykiwania kolorowego lateksu w czasie od 18 do 20 s; pozostaw zwierzę na pięć minut.

Następnie, po dekapitacji zwierzęcia, usunąć kości czaszki oraz opony mózgowe, dbając o to, aby nie uszkodzić kory mózgowej ani architektury naczyń, a następnie ostrożnie wyizolować cały mózg. Umieścić mózg w 60 milimetrowej płytce do hodowli komórkowej zawierającej od sześciu do ośmiu mililitrów 4% PFA, a następnie, korzystając z kamery przymocowanej do mikroskopu operacyjnego, umieścić pod płytką linijkę pomiarową. Wykonać zdjęcia grzbietowej i brzusznej powierzchni mózgu przy powiększeniu 25x, zachowując kąt 90 stopni między obiektywem mikroskopu a płytką Petriego.

Aby określić pierwotną odległość, należy rozpocząć procedurę barwienia tuszem z sadzy węglowej, mieszając dwie 100 µL alikwoty tuszu herts stemple farba lub CB one z dwiema 900 µL alikwotami tuszu pelican scribal schwartz lub CB two w dwóch oddzielnych probówkach EP o pojemności 1,5 mL. Pobrać mieszaniny tuszy do dwóch oddzielnych strzykawek insulinowych o pojemności 1 mL. Następnie zakapslować strzykawki i umieścić je w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, wraz z dwiema innymi strzykawkami insulinowymi, z których każda zawiera 1 mL soli fizjologicznej.

Po potraktowaniu myszy zgodnie z wcześniejszą demonstracją, przy użyciu lekkiego nacisku wstrzyknij oba roztwory tuszu z sadzą do lewej komory w tempie od 18 do 20 sekund na mililitr. Po wyjęciu mózgu i wykonaniu zdjęć zgodnie z wcześniejszą demonstracją, umieść mózg w 4% PFA na noc, a następnie inkubuj w stopniowo zwiększających się stężeniach sacharozy, aż pływający mózg całkowicie utonie. Rozpocznij ten etap od wywołania przejściowego ogniskowego niedokrwienia mózgu.

Zgodnie ze standardowym protokołem wewnątrzświatowego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu, po zakończeniu okresu reperfuzji, należy zabarwić naczynia krwionośne tuszami CB one oraz CB two, tak jak właśnie zaprezentowano, a następnie zabarwić cały mózg 2% roztworem TTC w temperaturze 37 °C przez okres od 5 do 10 minut. W celu określenia objętości zawału należy pamiętać, że obszar zawału pozostanie biały, podczas gdy obszar nieischemiczny zabarwi się na czerwono. Należy zebrać obrazy, zgodnie z wcześniejszą prezentacją, aby przeanalizować anatomię makroskopową naczyń mózgowych, zaczynając od otwarcia obrazu zabarwionej powierzchni mózgu.

Przy użyciu oprogramowania ImageJ mózgi perfundowane kolorowym lateksem mogą wykazywać różny stopień barwienia naczyń zlokalizowanych na powierzchni brzusznej. Natomiast perfuzja CB one plus CB two zabarwi wszystkie naczynia zarówno na powierzchni brzusznej, jak i grzbietowej. Należy ustawić skalę w milimetrach, a następnie zaznaczyć punkty anastomozy między przednią tętnicą mózgową (aCA) a środkową tętnicą mózgową (MCA), aby stworzyć linię urojoną łączącą wszystkie te punkty anastomozy.

Następnie zmierz odległość między linią anastomozy a linią środkową w odległości czterech, a następnie sześciu milimetrów od bieguna czołowego mózgu. Po przeanalizowaniu od trzech do czterech obrazów na zwierzę oblicz wartość średnią. Porównaj wartości pomiędzy różnymi grupami zwierząt, aby zidentyfikować zmienność w anatomii naczyniowej mózgu.

U zwierząt C 57 black six J linię anastomotyczną między a CA a MCA można prześledzić bliżej linii środkowej w odległości 4 mm niż 6 mm od bieguna czołowego, podczas gdy u myszy z nokautem apolipoproteiny e nie stwierdzono w tym zakresie istotnych różnic. Z kolei u myszy SV 1 29, w analizie anatomii naczyniowej, linia anastomotyczna znajduje się dalej i bardziej równolegle do linii środkowej, zarówno w odległości 4 mm, jak i 6 mm od bieguna czołowego. W warunkach niedokrwiennych należy zidentyfikować granicę zawału jako krawędź tkanki o barwie czerwonej i białej, reprezentującą odpowiednio tkankę metabolicznie aktywną oraz tkankę martwiczą, a następnie zmierzyć odległość granicy zawału od linii środkowej w odległości 4 mm oraz 6 mm od bieguna czołowego mózgu.

Opisany tutaj protokół pozwala przezwyciężyć ograniczenia techniczne konwencjonalnej wizualizacji naczyń mózgowych gryzoni z wykorzystaniem lateksu. Jak pokazuje ten pierwszy obraz po perfuzji barwionego lateksu, zabarwione zostały jedynie duże naczynia na powierzchni brzusznej, podczas gdy cała powierzchnia grzbietowa pozostała niezatłuszczona. Z kolei perfuzja CB one plus CB two skutkuje równomiernym wypełnieniem zarówno małych, jak i dużych naczyń.

Barwienie pozostaje stabilne przez siedem dni bez żadnej zmiany jakości. Przy użyciu programu Image J można przeanalizować odległość punktów anastomotycznych między A CA a MCA od linii środkowej we wszystkich różnych grupach myszy, które zostały przepłukane tuszami w celu oceny różnic w regionalnej anatomii naczyniowej. Chociaż nokaut POE nie wpływa na strukturę anatomiczną naczyń mózgowych u myszy C 57 black six J, można zauważyć znaczącą różnicę między szczepami C 57 black six J i SV 1 29.

W eksperymentalnych modelach udaru u gryzoni barwienie TTC jest szeroko stosowane do wizualizacji objętości zawału. Barwienie CB one plus CCB two jest również stosowalne w warunkach niedokrwienia w celu obserwacji zmian strukturalnych w naczyniach krwionośnych i wykazuje wysoką stabilność w połączeniu z barwieniem TTC. Zwróć uwagę na jednoczesną wizualizację naczyń mózgowych i objętości zawału w mózgach niedokrwiennych indukowanych przez różne czasy niedokrwienia mózgu i punkty czasowe reperfuzji.

Analiza punktów anastomozy pomiędzy tętnicą środkową mózgu (MCA) a tętnicą przednią mózgu (ACA) po 45 lub 90 minutach niedokrwienia w połączeniu z jednodniowym lub pięciodniowym okresem reperfuzji wykazuje, zgodnie z oczekiwaniami, że średnia różnica między linią środkową a punktami anastomozy nie wykazywała istotnych różnic pomiędzy grupami. Co więcej, średnia odległość znajdowała się w tym samym zakresie, co u zwierząt niedokrwiennych. Jednak odległość od linii środkowej do granicy zawału różni się istotnie pomiędzy grupami, co odzwierciedla zwiększoną objętość zawału przy wyższym stopniu uszkodzenia reperfuzyjnego po niedokrwieniu.

Technika ta ma potencjał, aby utorować drogę badaczom w dziedzinie eksperymentalnego udaru mózgu w celu eksploracji obszarów naczyniowych w mózgu myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat badania anatomii naczyniowej mózgu u myszy poprzez perfuzję mózgu tuszami lateksowymi lub sadzą węglową, a także wiedzieć, jak analizować uzyskane barwione tkanki mózgu przy użyciu oprogramowania Image J.