Name: Donaczyniowa perfuzja tuszu z sadzy umożliwia wiarygodną wizualizację naczyń mózgowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: Poznaj metodę perfuzji tuszem z sadzy do wizualizacji naczyń mózgowych u myszy. Technika umożliwia analizę anastomoz tętnic mózgowych i badanie zmian naczyniowych w udarze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Britta Kaltwasser za doskonałą pomoc techniczną oraz Mahesh Kumar Teli za zorganizowanie przygotowań do nagrania wideo.

1. Zwierzęta
<ol>
	<li>Doświadczenia przeprowadzono zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i po uzyskaniu zgody lokalnych organów nadzorczych. We wszystkich eksperymentach wykorzystano myszy typu dzikiego C57Bl6/J, myszy ApolipoproteinE-/- (ApoE KO) oraz myszy SV129 (wiek 12-16 tygodni, masa ciała 26-30 g, 5-6 zwierząt na grupę eksperymentalną).</li>
</ol>
2. Barwienie naczyń mózgowych kolorowym lateksem
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę 25 μl tuszu z sadzy węglowej (Herlitz, Niemcy) i 0,5 ml związku lateksowego (Pebeo, Francja) w stosunku 1:20 w probówce EP, a następnie ogrzać mieszaninę do 37 °C w kąpieli wodnej. Przed znieczuleniem zwierzęcia pobrać mieszaninę do strzykawki 2 ml z igłą 28-30G.</li>
	<li>Rozpuścić 50 mg papawaryny chlorowodoranu w proszku w 1 ml sterylnej soli fizjologicznej. Pobrać roztwór do strzykawki insulinowej. Odłamać igłę od drugiej sterylnej strzykawki insulinowej. Umieścić tę igłę na końcu rurki PE10 o długości 20 cm. Następnie przyłączyć rurkę PE10 do igły strzykawki insulinowej zawierającej roztwór papawaryny chlorowodoranu, który zostanie wstrzyknięty przez żyłę udową w celu zapewnienia wazodylatacji i prawidłowego wypełnienia naczyń.</li>
	<li>Przygotować kolejne dwie strzykawki insulinowe, z których każda zawiera 1 ml soli fizjologicznej. Strzykawki insulinowe umożliwiają płynne podanie wstrzykiwanego płynu w precyzyjnej lokalizacji. Jednak ze względu na wysoką lepkość lateksu należy użyć alternatywnych strzykawek 1 ml z wymiennymi szerszymi igłami.</li>
	<li>Umieścić wszystkie strzykawki i wysterylizowane narzędzia sekcyjne w pobliżu stanowiska operacyjnego. Rozłożyć sterylne pole operacyjne wokół stanowiska. Stanowisko operacyjne powinno być odpowiednio oświetlone; w razie potrzeby można zastosować mikroskop operacyjny.</li>
	<li>Zmierzyć masę ciała myszy C57Bl6/J, a następnie wprowadzić w stan znieczulenia za pomocą 5% odparowanego izofluranu w 70% N2O i 30% O2. Kontynuować znieczulenie przy użyciu 1% odparowanego izofluranu. Po odpowiednim ułożeniu myszy na grzbiecie i unieruchomieniu kończyn ocenić głębokość znieczulenia. Następnie naciąć skórę nad lewą żyłą udową i zlokalizować żyłę. Wprowadzić ostry koniec igły umieszczonej na rurce PE10 i powoli wstrzyknąć roztwór papawaryny chlorowodoranu z prędkością 100 μl na minutę (50 mg/kg masy ciała).</li>
	<li>Po wstrzyknięciu naciąć jamę brzuszną i przebić przeponę. Przeciąć żebra, aby odsłonić serce, unikając jego uszkodzenia lub stłuczenia. Zaciąć zstępującą aortę piersiową kleszczykami naczyniowymi. Wykonać precyzyjne cięcie w obrębie prawego przedsionka, aby umożliwić odpływ krwi żylnej. Wstrzyknąć 2 ml soli fizjologicznej do lewej komory, a następnie ręcznie wstrzyknąć kolorowy lateks przy lekkim nacisku w czasie 18-20 s. Używać wcześniej napełnionych strzykawek jedna po drugiej. Unikać wstrzykiwania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu lateksu pozostawić zwierzę na 5 min. Dokonać dekapitacji zwierzęcia i ostrożnie usunąć cały mózg. Należy zadbać o to, aby nie uszkodzić architektury naczyń i kory podczas usuwania kości czaszki i opon mózgowych. Umieścić mózg w 60 mm naczyniu hodowlanym zawierającym 6-8 ml 4% PFA w celu wykonania zdjęcia. Pod przezroczyste naczynie podłożyć linijkę pomiarową. Wykonać zdjęcia grzbietowej i brzusznej powierzchni mózgu przy powiększeniu 25x za pomocą kamery przymocowanej do mikroskopu operacyjnego. Zdjęcia powinny być wykonane pod kątem 90° między naczyniem Petriego a obiektywem mikroskopu w celu określenia pierwotnej odległości.</li>
	<li>Powtórzyć procedurę na kolejnych 4-5 zwierzętach.</li>
</ol>
3. Barwienie naczyń mózgowych mieszaniną tuszów z sadzą
<ol>
	<li>Aby porównać wynik barwienia naczyń mózgowych z użyciem lateksu z naszym protokołem, przygotować mieszaninę 100 μl tuszu Herlitz Stempelfarbe (CB1) z 900 μl tuszu Pelican Scribtol Schwarz (CB2) w probówce EP 1,5 ml. Przygotować dwie probówki EP, aby uzyskać całkowitą objętość 2 ml mieszaniny CB1 i CB2 w stosunku 1:9. Pobrać mieszaninę do dwóch oddzielnych strzykawek insulinowych (po 1 ml każda). Zakręcić strzykawki i umieścić je w kąpieli wodnej w celu ogrzania do 37 °C. Pobrać 2 ml soli fizjologicznej do kolejnych dwóch strzykawek insulinowych i również umieścić je w kąpieli wodnej.</li>
	<li>Zanestezjować zwierzę i powtórzyć procedurę opisaną powyżej, z wyjątkiem wstrzyknięcia hydrochlorku papaweryny. Po wstrzyknięciu 2 ml soli fizjologicznej do lewej komory, wstrzyknąć 2 ml mieszaniny czarnych tuszy zamiast kolorowego lateksu. Iniekcje wykonywać ręcznie, wywierając lekki nacisk przez 18-20 sec na 1 ml. Przed wstrzyknięciem zacisnąć zstępującą aortę piersiową.</li>
	<li>Uśmiercić zwierzę, wyjąć mózg i wykonać zdjęcia.</li>
	<li>W celu długoterminowej konserwacji mózgu, umieścić go na noc w 4% PFA, a następnie inkubować w sacharozie o stopniowo zwiększanym stężeniu, aż pływający mózg całkowicie zatonie (5%, następnie 15% i 30%). Mózgi zwierząt perfundowanych kolorowym lateksem można konserwować w ten sam sposób.</li>
	<li>Przeprowadzić procedurę u kolejnych 4-5 zwierząt. Aby porównać różnice w anatomii naczyń mózgowych wynikające z różnego tła genetycznego lub szczepów, powtórzyć protokół odpowiednio u równej liczby myszy ApoE KO oraz SV129.</li>
	<li>Aby zbadać anatomię naczyń w warunkach niedokrwiennych, wywołać przejściowe ogniskowe niedokrwienie mózgu przez 45 min lub 90 min zgodnie ze standardowym protokołem wewnątrzluminalnej okluzji MCA pod głęboką narkozą (szczegółowy opis operacji wykracza poza zakres niniejszego artykułu; czytelników odsyła się do Doeppner et al., 2010). Po planowanym okresie reperfuzji (1 dzień lub 5 dni), wykonać barwienie naczyń wyłącznie tuszami CB1+CB2 i zbarwić cały mózg 2% roztworem TTC w 37 °C przez 5-10 min w celu zidentyfikowania objętości zawału. TTC jest redukowane do czerwonego formazanu przez enzymy mitochondrialne (w szczególności dehydrogenazę bursztynianową). Po barwieniu TTC tkanka metabolicznie aktywna barwi się na ciemnoczerwono, podczas gdy tkanka zawałowa pozostaje nieobarwiona i wydaje się biała z powodu dysfunkcyjnych i zdenaturowanych enzymów mitochondrialnych. Pozyskać obrazy w ten sam sposób, jak opisano powyżej.</li>
</ol>
4. Badanie obszarów unaczynienia mózgu
<ol>
	<li>Aby przeanalizować anatomię makroskopową naczyń mózgowych, obrazy grzbietowej powierzchni mózgu barwione kolorowym lateksem lub tuszami CB1+CB2 można analizować za pomocą oprogramowania ImageJ (publicznego oprogramowania opartego na Javie, służącego do przetwarzania i analizy obrazów). Mózgi perfundowane kolorowym lateksem mogą wykazywać różny stopień zabarwienia naczyń znajdujących się na powierzchni grzbietowej, natomiast perfuzja CB1+CB2 zabarwi wszystkie naczynia zarówno na powierzchni brzusznej, jak i grzbietowej.</li>
	<li>Otwórz plik obrazu w oprogramowaniu ImageJ. Zidentyfikuj wszystkie punkty anastomoz między ACA a MCA. Punkt anastomozy definiuje się jako miejsce, w którym średnica naczynia jest najmniejsza lub jako połowa odległości między najbliższymi punktami rozgałęzień odpowiednio gałęzi ACA i MCA2. Narysuj linię umowną (linię anastomoz), zaznaczając punkty anastomoz za pomocą narzędzia do rysowania linii segmentowych oraz wtyczki „Dotted Line”.</li>
	<li>Ustaw skalę w mm. Za pomocą narzędzia do rysowania linii prostych oraz narzędzia „measure” zmierz odległość między linią anastomoz a linią środkową w punkcie 4 mm w kierunku ogonowym od bieguna czołowego mózgu. Powtórz tę czynność w odległości 6 mm w kierunku ogonowym od bieguna czołowego. Przeanalizuj 3-4 obrazy na zwierzę i oblicz wartość średnią. Porównaj wartości pomiędzy różnymi grupami zwierząt, aby zidentyfikować zmienność anatomii naczyniowej mózgu. U zwierząt C57Bl6/J linia anastomoz między ACA a MCA może przebiegać bliżej linii środkowej w punkcie 4 mm niż w punkcie 6 mm w kierunku ogonowym od bieguna czołowego. U myszy ApoE KO nie będzie występować istotnej różnicy w tym zakresie. Przeciwnie, u myszy SV129 linia anastomoz będzie przebiegać dalej i równolegle do linii środkowej zarówno w odległości 4 mm, jak i 6 mm w kierunku ogonowym od bieguna czołowego.</li>
	<li>Aby przeanalizować anatomię naczyniową w warunkach niedokrwiennych, wykonaj te same obliczenia, o których wspomniano powyżej. Zidentyfikuj granicę zawału jako krawędź tkanek o kolorach czerwonym i białym, reprezentujących odpowiednio tkankę metabolicznie aktywną oraz niezabarwioną tkankę nekrotyczną. Zmierz odległość granicy zawału od linii środkowej w odległości 4 mm i 6 mm w kierunku ogonowym od bieguna czołowego mózgu. Wyznacz wartość średnią z 3-4 obrazów na zwierzę. Porównaj wyniki dla różnych okresów niedokrwienia i reperfuzji.</li>
</ol>

<ol><li>Meng, H., Peng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+contrast+angiography%3A+A+simple+method+for+morphological+characterization+of+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Nuclear contrast angiography: A simple method for morphological characterization of cerebral arteries.</a> Brain Research. 1261, 75-81 (2009).</li>
<li>Maeda, K., Hata, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+cerebrovascular+anatomy+of+C57black%2F6+and+SV129+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Differences in the cerebrovascular anatomy of C57black/6 and SV129 mice.</a> Neuroreport. 9 (7), 1317-1319 (1998).</li>
<li>Coyle, P., Jokelainen, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+cerebral+arterial+collaterals+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Dorsal cerebral arterial collaterals of the rat.</a> The Anatomical Record. 203, 397-404 (1982).</li>
<li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+cerebral+collaterals+of+stroke-prone+spontaneously+hypertensive+rats+%28SHRSP%29+and+Wistar+Kyoto+rats+%28WKY%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Dorsal cerebral collaterals of stroke-prone spontaneously hypertensive rats (SHRSP) and Wistar Kyoto rats (WKY).</a> The Anatomical Record. 218, 40-44 (1987).</li>
<li>Hasan, M. R., Herz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+macroscopic+cerebral+vessel+anatomy%E2%80%94A+new+and+reliable+technique+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualization of macroscopic cerebral vessel anatomy—A new and reliable technique in mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 204, 249-253 (2012).</li>
<li>Doeppner, T. R., Nagel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAT-Hsp70-mediated+neuroprotection+and+increased+survival+of+neuronal+precursor+cells+after+focal+cerebral+ischemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">TAT-Hsp70-mediated neuroprotection and increased survival of neuronal precursor cells after focal cerebral ischemia in mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 29, 1187-1196 (2009).</li>
<li>Todo, K., Kitagawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+enhances+leptomeningeal+collateral+growth+induced+by+common+carotid+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor enhances leptomeningeal collateral growth induced by common carotid artery occlusion.</a> Stroke. 39 (6), 1875-1882 (2008).</li>
<li>Sugiyama, Y., Yagita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte+colony-stimulating+factor+enhances+arteriogenesis+and+ameliorates+cerebral+damage+in+a+mouse+model+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Granulocyte colony-stimulating factor enhances arteriogenesis and ameliorates cerebral damage in a mouse model of ischemic stroke.</a> Stroke. 42 (3), 770-775 (2011).</li>
<li>Busch, H. J., Buschmann, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arteriogenesis+in+hypoperfused+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Arteriogenesis in hypoperfused rat brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 23 (5), 621-628 (2003).</li>
<li>Maeda, K., Hata, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+metabolic+disturbances+and+cerebrovascular+anatomy+after+permanent+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22in+C57black%2F6+and+SV129+mice.+Neurobiology+of+Diseases%22%5BJournal%5D)">Regional metabolic disturbances and cerebrovascular anatomy after permanent middle cerebral artery occlusion.</a> in C57black/6 and SV129 mice. Neurobiology of Diseases. 6, 101-108 (1999).</li>
<li>Wang, Y., Kilic, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+overexpression+induces+post-ischaemic+neuroprotection%2C+but+facilitates+haemodynamic+steal+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">VEGF overexpression induces post-ischaemic neuroprotection, but facilitates haemodynamic steal phenomena.</a> Brain. 128 (1), 52-63 (2005).</li>
<li>ElAli, A., Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+blood-brain+barrier+permeability+and+brain+edema+after+focal+cerebral+ischemia+induced+by+hyperlipidemia%3A+Role+of+lipid+peroxidation+and+calpain+1%2F2%2C+matrix+metalloproteinase-2%2F9%2C+and+RhoA+overoxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Increased blood-brain barrier permeability and brain edema after focal cerebral ischemia induced by hyperlipidemia: Role of lipid peroxidation and calpain 1/2, matrix metalloproteinase-2/9, and RhoA overoxidation.</a> Stroke. 42, (2011).</li>
<li>Coyle, P., Jokelainen, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+outcome+to+middle+cerebral+artery+occlusion+in+spontaneously+hypertensive+stroke-prone+rats+%28SHRSP%29+and+Wistar+Kyoto+%28WKY%29+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Differential outcome to middle cerebral artery occlusion in spontaneously hypertensive stroke-prone rats (SHRSP) and Wistar Kyoto (WKY) rats.</a> Stroke. 14, 605-611 (1983).</li>
<li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diameter+and+length+changes+in+cerebral+collaterals+after+middle+cerebral+artery+occlusion+in+the+young+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Diameter and length changes in cerebral collaterals after middle cerebral artery occlusion in the young rat.</a> The Anatomical Record. 210 (2), 357-364 (1984).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Perfuzja CB1+CB2 za pomocą wstrzykiwania ręcznego może zostać przeprowadzona pomyślnie bez intensywnego szkolenia, ponieważ nie wymaga ona zastosowania żadnego specjalistycznego urządzenia do wytwarzania określonego ciśnienia2,3. Heterogeniczność wyników perfuzji w naszym protokole jest również pomijalna. Tylko 1 na 16 zwierząt nieizschemicznych oraz 3 na 20 zwierząt izschemicznych wykazało niepełną perfuzję. W tych przypadkach przyczyną niepowodzenia było najprawdopodobniej wprowadzenie pęcherzyków powietrza ...

<table><tbody><tr><td>Tusz kreślarski czarny (CB2)</td><td>Pelican, Niemcy</td><td>221 135</td><td></td></tr><tr><td>Tusz do pieczątek (CB1)</td><td>Herlitz PBS AG, Niemcy</td><td>10417202</td><td></td></tr><tr><td>Lateks Gedeo</td><td>Pebeo, Francja</td><td>13042B</td><td></td></tr></tbody></table>

dożylna perfuzja tuszem z sadzy pozwala na wiarygodną wizualizację naczyń mózgowych

Intravascular Perfusion of Carbon Black Ink Allows Reliable Visualization of Cerebral Vessels

Budowa anatomiczna naczyń mózgowych jest kluczowym czynnikiem determinującym hemodynamikę mózgu, a także stopień nasilenia uszkodzeń po niedokrwiennych obrażeniach. Układ naczyniowy mózgu dynamicznie reaguje na różne stany patofizjologiczne i wykazuje znaczne różnice między szczepami oraz w warunkach manipulacji genetycznych. W związku z tym, aby badać patogenezę udaru niedokrwiennego, niezbędna jest wiarygodna technika barwienia naczyń wewnątrzczaszkowych. Do niedawna stosowano zestaw różnych technik wizualizacji naczyń mózgowych, w tym wstrzykiwanie żywicy o niskiej lepkości, araldite F, żelatyny zmieszanej z różnymi barwnikami1 (np. karmin czerwoną, tusz indyjski) lub lateksu z2 lub bez3 sadzą. Perfuzję białego związku lateksowego przez aortę wstępującą po raz pierwszy opisali Coyle i Jokelainen3. Maeda et al.2 zmodyfikowali ten protokół, dodając do związku lateksowego tusz z sadzą w celu poprawy kontrastu wizualizacji naczyń po perfuzji mózgu solą fizjologiczną. Jednak ze względu na wysoką lepkość związku lateksowego często zdarza się niewydajna perfuzja i niepełne wypełnienie naczyń4. Dlatego opisaliśmy prostą i kosztowo efektywną technikę z wykorzystaniem mieszaniny dwóch komercyjnie dostępnych tuszy z sadzą (CB1 i CB2), pozwalającą na powtarzalną wizualizację układu naczyniowego mózgu5. Wykazaliśmy, że perfuzja mieszaniną CB1+CB2 u myszy skutkuje zabarwieniem znacznie mniejszych naczyń mózgowych przy wyższej gęstości w porównaniu z perfuzją lateksem5. W niniejszym pracy opisujemy nasz protokół identyfikacji punktów anastomozy między przednią (ACA) a środkową tętnicą mózgową (MCA) w celu badania zmienności naczyń u myszy o różnych tłach genetycznych. Na koniec demonstrujemy wykonalność naszej techniki w modelu przejściowego ogniskowego niedokrwienia mózgu u myszy, łącząc barwienie naczyń za pomocą CB1+CB2 z barwieniem TTC w różnych stopniach uszkodzeń niedokrwiennych.

Opisany tutaj protokół pokonuje ograniczenia techniczne konwencjonalnej wizualizacji naczyń mózgowych gryzoni z wykorzystaniem lateksu. Rysunek 1A pokazuje, że po perfuzji barwionego lateksu zabarwiają się jedynie duże naczynia na powierzchni brzusznej, podczas gdy cała powierzchnia grzbietowa pozostaje niezabarwiona. Wynik jest również wysoce zmienny. Tylko jedno z sześciu zwierząt wykazało częściowe zabarwienie ACA i MCA widocznych na powierzchni grzbietowej mózgu (dane niepoddane prezentacji). Z kolei...

Analiza anatomii naczyń mózgowych gryzoni odgrywa istotną rolę w eksperymentalnych badaniach nad udarem. W tym kontekście perfuzja wewnątrz naczyniowa barwionym lateksem jest uważana za standardowe narzędzie od wielu lat. Technika ta wiąże się jednak z wyraźnymi ograniczeniami technicznymi, które obniżają jej powtarzalność. Opisujemy tutaj prostą metodę umożliwiającą powtarzalną wizualizację naczyń mózgowych. Wstrzyknięcie mieszaniny dwóch dostępnych w handlu tuszy na bazie sadzy poprzez lewą komorę mięśnia sercowego skutkuje odpowiednim wypełnieniem naczyń mózgowych z wysokokontrastową wizualizacją. Z sukcesem zastosowaliśmy tę technikę do identyfikacji punktów anastomozy pomiędzy terytoriami naczyniowymi mózgu u myszy o różnym tle genetycznym. Na koniec przedstawiamy dowody na to, że ta nowa i prosta metoda barwienia naczyń może być łączona z barwieniem chlorkiem trifenylotetrazolu (TTC) – powszechnie stosowanym narzędziem do obserwacji i analizy objętości zawałów u myszy.

Dożylna perfuzja tuszem z sadzy pozwala na wiarygodną wizualizację naczyń mózgowych

Budowa anatomiczna naczyń mózgowych jest kluczowym czynnikiem determinującym hemodynamikę mózgu, a także stopień nasilenia uszkodzeń po incydentach niedokrwiennych.

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie anatomii naczyń mózgowych myszy w sposób powtarzalny. W pierwszej kolejności naczynia mózgowe barwi się kolorowym lateksem w celu późniejszego porównania z barwieniem tuszem węglowym. Następnie miesza się tusze węglowe, a zwierzęta poddaje perfuzji PBS-PF oraz mieszaniną tuszu węglowego poprzez lewą komorę.W ostatnim kroku pobiera się mózg i wykonuje zdjęcia w celu porównania oraz analizy zabarwionych naczyń mózgowych. Następnie wykorzystuje się oprogramowanie Image J do analizy punktów anastomoz pomiędzy środkową a przednią tętnicą mózgową. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię chorób naczyniowych mózgu, w szczególności udaru, ponieważ może być ona użyta do analizy gęstości naczyń oraz angiogenezy.Obecnie metoda ta pozwala na wgląd w układ naczyniowy mózgu, ale może być również zastosowana do innych układów, na przykład do wizualizacji mikronaczyń w sercu, wątrobie lub nerkach. Po wymieszaniu lateksu z tuszem z sadzą w probówce typu EP należy ogrzać mieszaninę w temperaturze 37 °C w kąpieli wodnej. Do pobrania ogrzanego lateksu do strzykawki o pojemności 2 ml należy użyć igły o rozmiarze od 23 do 25 G.Następnie rozpuścić 12,5 mg proszku chlorowodorku papiny w 1 ml sterylnej soli fizjologicznej, a po wymieszaniu w wirówce (vortex) zebrać otrzymany roztwór do strzykawki insulinowej. Dalej odłamać igłę od drugiej sterylnej strzykawki insulinowej i umieścić oddzieloną igłę na końcu 20 cm rurki PE 10. Następnie połączyć rurkę PE 10 z igłą strzykawki insulinowej zawierającej roztwór chlorowodorku papiny.Następnie napełnij dwie kolejne strzykawki insulinowe jednym mililitrem soli fizjologicznej, a potem przenieś wszystkie strzykawki wraz ze sterylnymi narzędziami sekcyjnymi na stół operacyjny przed rozpoczęciem anestezji. Zważ mysz, a następnie ułóż znieczulonego zwierzęcia na plecach. Unieruchom kończyny i nacinaj skórę nad lewą żyłą udową.Następnie zlokalizuj żyłę udową i wprowadź końcówkę igły połączonej z rurką PE 10. Następnie powoli wstrzyknij roztwór chlorowodorku papainy z prędkością około 100 µL na minutę w dawce 50 mg na kilogram masy ciała. Po wstrzyknięciu rozetnij jamę brzuszną, a następnie przebij przeponę.Następnie przetnij żebra, aby odsłonić serce, i zacisnąć zstępującą aortę piersiową kleszczykami naczyniowymi. Dalej wykonaj precyzyjne nacięcie nad prawym przedsionkiem, aby odprowadzić krew żylną. Następnie wstrzyknij 2 mL soli fizjologicznej do lewej komory.Obecność powietrza w roztworach Profil lub w połączonej mieszaninie tuszu może skutkować wystąpieniem niebarwionych obszarów naczyniowych mózgu. Aby zapewnić powodzenie procedury, należy bardzo dokładnie sprawdzić, czy wszystkie strzykawki są całkowicie pozbawione pęcherzyków powietrza. Następnie, powoli podaj zawartość przygotowanych strzykawek, jedna po drugiej, w przypadku ręcznego wstrzykiwania kolorowego lateksu w czasie od 18 do 20 s; pozostaw zwierzę na pięć minut.Następnie, po dekapitacji zwierzęcia, usunąć kości czaszki oraz opony mózgowe, dbając o to, aby nie uszkodzić kory mózgowej ani architektury naczyń, a następnie ostrożnie wyizolować cały mózg. Umieścić mózg w 60 milimetrowej płytce do hodowli komórkowej zawierającej od sześciu do ośmiu mililitrów 4% PFA, a następnie, korzystając z kamery przymocowanej do mikroskopu operacyjnego, umieścić pod płytką linijkę pomiarową. Wykonać zdjęcia grzbietowej i brzusznej powierzchni mózgu przy powiększeniu 25x, zachowując kąt 90 stopni między obiektywem mikroskopu a płytką Petriego.Aby określić pierwotną odległość, należy rozpocząć procedurę barwienia tuszem z sadzy węglowej, mieszając dwie 100 µL alikwoty tuszu herts stemple farba lub CB one z dwiema 900 µL alikwotami tuszu pelican scribal schwartz lub CB two w dwóch oddzielnych probówkach EP o pojemności 1,5 mL. Pobrać mieszaniny tuszy do dwóch oddzielnych strzykawek insulinowych o pojemności 1 mL. Następnie zakapslować strzykawki i umieścić je w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, wraz z dwiema innymi strzykawkami insulinowymi, z których każda zawiera 1 mL soli fizjologicznej.Po potraktowaniu myszy zgodnie z wcześniejszą demonstracją, przy użyciu lekkiego nacisku wstrzyknij oba roztwory tuszu z sadzą do lewej komory w tempie od 18 do 20 sekund na mililitr. Po wyjęciu mózgu i wykonaniu zdjęć zgodnie z wcześniejszą demonstracją, umieść mózg w 4% PFA na noc, a następnie inkubuj w stopniowo zwiększających się stężeniach sacharozy, aż pływający mózg całkowicie utonie. Rozpocznij ten etap od wywołania przejściowego ogniskowego niedokrwienia mózgu.Zgodnie ze standardowym protokołem wewnątrzświatowego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu, po zakończeniu okresu reperfuzji, należy zabarwić naczynia krwionośne tuszami CB one oraz CB two, tak jak właśnie zaprezentowano, a następnie zabarwić cały mózg 2% roztworem TTC w temperaturze 37 °C przez okres od 5 do 10 minut. W celu określenia objętości zawału należy pamiętać, że obszar zawału pozostanie biały, podczas gdy obszar nieischemiczny zabarwi się na czerwono. Należy zebrać obrazy, zgodnie z wcześniejszą prezentacją, aby przeanalizować anatomię makroskopową naczyń mózgowych, zaczynając od otwarcia obrazu zabarwionej powierzchni mózgu.Przy użyciu oprogramowania ImageJ mózgi perfundowane kolorowym lateksem mogą wykazywać różny stopień barwienia naczyń zlokalizowanych na powierzchni brzusznej. Natomiast perfuzja CB one plus CB two zabarwi wszystkie naczynia zarówno na powierzchni brzusznej, jak i grzbietowej. Należy ustawić skalę w milimetrach, a następnie zaznaczyć punkty anastomozy między przednią tętnicą mózgową (aCA) a środkową tętnicą mózgową (MCA), aby stworzyć linię urojoną łączącą wszystkie te punkty anastomozy.Następnie zmierz odległość między linią anastomozy a linią środkową w odległości czterech, a następnie sześciu milimetrów od bieguna czołowego mózgu. Po przeanalizowaniu od trzech do czterech obrazów na zwierzę oblicz wartość średnią. Porównaj wartości pomiędzy różnymi grupami zwierząt, aby zidentyfikować zmienność w anatomii naczyniowej mózgu.U zwierząt C 57 black six J linię anastomotyczną między a CA a MCA można prześledzić bliżej linii środkowej w odległości 4 mm niż 6 mm od bieguna czołowego, podczas gdy u myszy z nokautem apolipoproteiny e nie stwierdzono w tym zakresie istotnych różnic. Z kolei u myszy SV 1 29, w analizie anatomii naczyniowej, linia anastomotyczna znajduje się dalej i bardziej równolegle do linii środkowej, zarówno w odległości 4 mm, jak i 6 mm od bieguna czołowego. W warunkach niedokrwiennych należy zidentyfikować granicę zawału jako krawędź tkanki o barwie czerwonej i białej, reprezentującą odpowiednio tkankę metabolicznie aktywną oraz tkankę martwiczą, a następnie zmierzyć odległość granicy zawału od linii środkowej w odległości 4 mm oraz 6 mm od bieguna czołowego mózgu.Opisany tutaj protokół pozwala przezwyciężyć ograniczenia techniczne konwencjonalnej wizualizacji naczyń mózgowych gryzoni z wykorzystaniem lateksu. Jak pokazuje ten pierwszy obraz po perfuzji barwionego lateksu, zabarwione zostały jedynie duże naczynia na powierzchni brzusznej, podczas gdy cała powierzchnia grzbietowa pozostała niezatłuszczona. Z kolei perfuzja CB one plus CB two skutkuje równomiernym wypełnieniem zarówno małych, jak i dużych naczyń.Barwienie pozostaje stabilne przez siedem dni bez żadnej zmiany jakości. Przy użyciu programu Image J można przeanalizować odległość punktów anastomotycznych między A CA a MCA od linii środkowej we wszystkich różnych grupach myszy, które zostały przepłukane tuszami w celu oceny różnic w regionalnej anatomii naczyniowej. Chociaż nokaut POE nie wpływa na strukturę anatomiczną naczyń mózgowych u myszy C 57 black six J, można zauważyć znaczącą różnicę między szczepami C 57 black six J i SV 1 29.W eksperymentalnych modelach udaru u gryzoni barwienie TTC jest szeroko stosowane do wizualizacji objętości zawału. Barwienie CB one plus CCB two jest również stosowalne w warunkach niedokrwienia w celu obserwacji zmian strukturalnych w naczyniach krwionośnych i wykazuje wysoką stabilność w połączeniu z barwieniem TTC. Zwróć uwagę na jednoczesną wizualizację naczyń mózgowych i objętości zawału w mózgach niedokrwiennych indukowanych przez różne czasy niedokrwienia mózgu i punkty czasowe reperfuzji.Analiza punktów anastomozy pomiędzy tętnicą środkową mózgu (MCA) a tętnicą przednią mózgu (ACA) po 45 lub 90 minutach niedokrwienia w połączeniu z jednodniowym lub pięciodniowym okresem reperfuzji wykazuje, zgodnie z oczekiwaniami, że średnia różnica między linią środkową a punktami anastomozy nie wykazywała istotnych różnic pomiędzy grupami. Co więcej, średnia odległość znajdowała się w tym samym zakresie, co u zwierząt niedokrwiennych. Jednak odległość od linii środkowej do granicy zawału różni się istotnie pomiędzy grupami, co odzwierciedla zwiększoną objętość zawału przy wyższym stopniu uszkodzenia reperfuzyjnego po niedokrwieniu.Technika ta ma potencjał, aby utorować drogę badaczom w dziedzinie eksperymentalnego udaru mózgu w celu eksploracji obszarów naczyniowych w mózgu myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat badania anatomii naczyniowej mózgu u myszy poprzez perfuzję mózgu tuszami lateksowymi lub sadzą węglową, a także wiedzieć, jak analizować uzyskane barwione tkanki mózgu przy użyciu oprogramowania Image J.

intravascular-perfusion-carbon-black-ink-allows-reliable

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Intravaskularna perfuzyjna wizualization węgla drzewnego pozwala na niezawodną wizualizacje naczyń mózgowych

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

W niniejszym artykule przedstawiamy prostą i praktyczną technikę odlewu naczyniowego mózgu, która jest łatwa w wykonaniu i może być wykorzystana do obrazowania drzewa naczyniowego mózgu dorosłej myszy.

Odlewanie naczyń mózgowych dorosłej myszy do obrazowania 3D i analizy morfologicznej

Wykonaj nacięcie szyi, aby odsłonić i luźno podwiązać obustronne tętnice szyjne wspólne.

Wizualizacja przepływu krwi w mózgu podczas niedokrwienia u myszy za pomocą znacznika fluorescencyjnego

Źródło: Kim, D. E., et al. Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i mikrotomografia komputerowa do bezpośredniej wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni (NIRF) w celu wizualizacji skrzeplin w wyciętej tkance mózgowej znakowanej sondą specyficzną dla fibryny. Światło bliskiej podczerwieni pobudza sondę, powodując fluoryzację skrzepliny, umożliwiając wizualizację skrzeplin o...

Wizualizacja zakrzepów mózgowych myszy za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni

Ten protokół opisuje zastosowanie połączonego obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni (NIRF) i mikrotomografii komputerowej (microCT) do wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. Technika ta pozwala na ilościowe określenie obciążenia skrzepliną i ewolucji. Technika obrazowania NIRF wizualizuje znakowaną fluorescencyjnie skrzeplinę w wyciętym mózgu, podczas gdy technika mikroCT wizualizuje skrzeplinę wewnątrz żywych zwierząt za pomocą nanocząstek złota.

Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i tomografia mikrokomputerowa do bezpośredniej wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu

Ten manuskrypt opisuje procedurę śledzenia przebudowy układu naczyniowo-mózgowego podczas gromadzenia się blaszek amyloidowych in vivo za pomocą podłużnej mikroskopii dwufotonowej. Preparat z rozcieńczoną czaszką umożliwia wizualizację barwników fluorescencyjnych w celu oceny postępu uszkodzenia naczyń mózgowych w mysim modelu choroby Alzheimera.

Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN

Wprowadzamy metodę obrazowania in vivo przy użyciu dwóch różnych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamicznych zmian naczyniowych kręgosłupa po kontuzji rdzenia kręgowego u dorosłych szczurów Sprague-Dawley.

Badanie in vivo Dwukolorowa metoda obrazowania dynamiki naczyń krwionośnych po kontuzyjnym urazie rdzenia kręgowego

Artykuł opisuje szybki protokół oznaczania naczyń krwionośnych u ryby teleost za pomocą perfuzji serca DiI rozcieńczonego w utrwalacza, używając medaka (Oryzias latipes) jako modelu i skupiając się na tkance mózgu i przysadki mózgowej.

Znakowanie naczyń krwionośnych w mózgu teleostowym i przysadce mózgowej za pomocą perfuzji serca z utrwalaczem DiI

Ten protokół przedstawia kroki do pozyskiwania i analizy fluorescencyjnych obrazów wapnia z perycytów otaczających mózg oraz danych o przepływie krwi z pobliskich naczyń krwionośnych u znieczulonych myszy. Techniki te są przydatne do badań nad fizjologią komórek szkieletowych i mogą być dostosowane do badania stanów przejściowych wapnia w dowolnym typie komórki.

Obrazowanie wapnia i hemodynamiki perycytów mózgu u myszy transgenicznych in vivo

Wstępne dochodzenie potwierdza, że krwotok podpajęczynówkowy (SAH) powoduje zanik perycytów mózgu. Ocena kurczliwości perycytów po SAH wymaga rozróżnienia między żywotnymi i nieżywotnymi perycytami mózgu. W związku z tym opracowano procedurę oznaczania żywotnych i nieżywotnych perycytów mózgu jednocześnie w wycinkach mózgu, ułatwiając obserwację przy użyciu mikroskopu konfokalnego o wysokiej rozdzielczości.

Obrazowanie ważnych i nieistotnych perycytów mózgu w wycinkach mózgu po krwotoku podpajęczynówkowym

Aby badać regulację przepływu krwi w mózgu in vivo, tradycyjne metody farmakologiczne są inwazyjne, często uszkadzając czaszkę, oponę twardą i opony mózgowo-rdzeniowe. W ramach tej pracy opracowaliśmy minimalnie inwazyjną technikę, która łączy wstrzykiwanie intracisternal magna (ICM) pod kontrolą nanoiniektora z laserowym obrazowaniem kontrastowym, zachowując integralność czaszki i opon mózgowo-rdzeniowych.

Sparowany test obrazowania Cisterna Magna Nanoinjection i laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym w celu zbadania regulacji przepływu krwi w mózgu in vivo

Poznaj metodę perfuzji tuszem z sadzy do wizualizacji naczyń mózgowych u myszy. Technika umożliwia analizę anastomoz tętnic mózgowych i badanie zmian naczyniowych w udarze.

Dożylna perfuzja tuszem z sadzy pozwala na wiarygodną wizualizację naczyń mózgowych

Przeglądaj więcej filmów