Identyfikacja lotnych substancji zapachowych przy użyciu chromatografii gazowej z wielokanałowym zapisem (GCMR) w płacie antenalnym owada

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja biologicznie czynnych substancji zapachowych w złożonym zapachu poprzez rejestrację aktywności w mózgu trzmiela. Jest to realizowane poprzez najpierw zebranie zapachów wywołujących reakcje behawioralne, a następnie przygotowanie chromatografu gazowego oraz wielokanałowych systemów rejestracji do eksperymentu. Trzecim krokiem jest przygotowanie i dysekcja mózgu trzmiela w celu przeprowadzenia rejestracji neuronalnych w płacie antenarycznym.

Następnie eksperyment przeprowadza się poprzez wprowadzenie elektrod do płata anteny i pomiar reakcji na podawane pod ciśnieniem substancje lotne poprzez analizę aktywności neuronalnej w odpowiedzi na zapachy złożone oraz ich poszczególne składniki. Można zidentyfikować biologicznie aktywne substancje zapachowe wyizolowane za pomocą chromatografii gazowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak G-C-E-A-G, jest czułość neuronów obciążenia anteny oraz możliwość scharakteryzowania sposobu, w jaki neurony w mózgu reagują na specyficzne lotne substancje kwiatowe.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ połączone etapy elektrofizjologiczne i analityczno-chemiczne są trudne do opanowania ze względu na technikę rejestracji preparatu elektrofizjologicznego oraz niezbędne kroki gromadzenia lotnych związków z przestrzeni nadpróbkowej. Choć technika ta może dostarczyć wiedzy na temat przetwarzania węchowego u trzmieli, można ją również zastosować w innych systemach, takich jak wektory chorób, np. komary lub pluskiewce z rodzaju Triatominae, lub szkodniki upraw, np. mszyce lub ćmy. Do tej procedury należy przygotować elektrodę odniesienia wykonaną z drutu wolframowego na mikromanipulatorze na drugim stanowisku.

Mikromanipulator posiada elektrodę wielokanałową, taką jak zwinięty drut, tede lub krzemową elektrodę wielokanałową, podłączoną do przedwzmacniacza, a chromatograf gazowy posiada wyjście na ekranowanym stole BNC. Wyjście detektora GC jest sprzężone ze wzmacniaczem i systemem akwizycji danych w taki sposób, aby sygnały neuronowe i sygnały GC były zsynchronizowane. W tym przykładzie gaz nośny GC to hel, a kolumna GC to DB five.

Chromatograf gazowy (GC) wykorzystuje wlot z podziałem (split), w którym temperaturę ustawiono na 200 °C, a temperaturę detektora jonizacji płomieniowej ustawiono na 230 °C. Po podgrzaniu próbek w GC, eluat z kolumny jest dzielony w stosunku jeden do jednego pomiędzy detektor jonizacji płomieniowej a antenę B za pomocą szklanego łącznika w kształcie litery Y. W tym przykładzie GC służy do dostarczania substancji lotnych zebranych metodą absorpcji dynamicznej z kwiatów Mimus lewisii, alpejskiego kwiatu polnego pochodzącego z Kalifornii.

Alternatywnie, zamiast korzystać z chromatografu gazowego, pojedyncze związki lotne lub ich mieszaniny można wprowadzać za pomocą impulsów powietrza. Odbywa się to poprzez przepuszczenie powietrza przez oddzielną strzykawkę szklaną zawierającą kawałek papieru filtracyjnego, na którym naniesiono związki. Impulsy powietrza są przekierowywane z ciągłego strumienia powietrza za pomocą zaworu elektromagnetycznego sterowanego komputerowo.

Przygotowania rozpocznij od odcięcia około jednego centymetra z końcówki końcówki do pipety o pojemności 1 ml. Umieść trutnia w podstawie końcówki pipety i delikatnie pchnij go w stronę przeciwległego końca, aż zostanie odsłonięta jedynie głowa. Używając roztopionego wosku dentystycznego, wykonaj odlew wokół odsłoniętej głowy.

Wosk musi przylegać do oczu złożonych, aby całkowicie unieruchomić głowę, jednak w razie potrzeby nie może on dotykać czułków. Do unieruchomienia czułków należy użyć małych szpilek. Następnie, za pomocą ostrego ostrza, np. mikroskalpela, wykonuje się w torebce głowy nacięcie w kształcie kwadratowego okna.

Rozpocznij cięcie bezpośrednio za czułkiem i obok jednego z oczu złożonych. Wytnij linię prostą pomiędzy oczami. Następnie tnij w kierunku grzbietowym, aż kapsuła głowy zakręci w stronę tułowia.

Kontynuuj cięcie do przeciwległego końca torebki głowowej. Na koniec przetnij tkankę z powrotem do miejsca rozpoczęcia, aby uzyskać kształt kwadratu. Używając pincety, usuń kutykulę.

Należy usunąć kutykulę sąsiadującą z czułkiem, w przeciwnym razie będzie ona utrudniać dostęp elektrody, gdy tylko mózg zostanie odsłonięty. Natychmiast przemyj tkankę solą fizjologiczną dla owadów. Upewnij się, że płaty czułków są dobrze wyeksponowane.

Następnie, używając bardzo precyzyjnej pęsety, ostrożnie usuń osłonkę okołonerwową bezpośrednio nad płatami antenowymi. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie przebić pęsetą mózgu pszczoły. Preparat pszczoły jest teraz gotowy do rejestracji elektrofizjologicznej.

Zacznij od przymocowania przygotowanej pszczoły do zacisku zamocowanego na podstawie magnetycznej. Utrzymuj nadmierne nawilżenie za pomocą soli fizjologicznej dla owadów podawanej z rezerwuaru wyposażonego w kontroler przepływu. Następnie wprowadź elektrodę odniesienia do przeciwległej tkanki mózgowej.

Następnie wprowadź elektrodę wielokanałową do płatów anten pszczoły. Po umieszczeniu elektrod odczekaj od 30 do 60 minut, aż zapisy się ustabilizują.

W tym czasie należy przygotować pozakomórkowe impulsy (spikes) z neuronów, stosując również progowanie. W przypadku niektórych kanałów rejestracyjnych, ze względu na szum, może być wymagane ręczne ustawienie progu. Następnie należy zweryfikować, czy rampy temperatury w przebiegu analizy GC są prawidłowe.

W tym przykładzie temperatura rozpoczyna się od 50 °C przez cztery minuty, a następnie wzrasta o 10 °C na minutę do temperatury końcowej 220 °C lub jest utrzymywana przez sześć minut. Rejestracje neuronalne uznaje się za stabilne, gdy kształty przebiegów jednostek w kanałach rejestrujących staną się spójne. Po ustabilizowaniu należy napełnić strzykawkę aromatem z przestrzeni nad kwiatami i wstrzyknąć go do portu wtryskowego gc.

Następnie, niezwłocznie po zakończeniu analizy GC, rozpocznij pomiar z elektrod. Pozostaw preparat w spoczynku od pięciu do 15 minut. Następnie wstrzyknij kolejną próbkę do GC lub stymuluj preparat za pomocą pojedynczych związków lotnych lub ich mieszanin.

Jeśli w którymkolwiek momencie aktywność spontaniczna nagle ustanie lub ulegnie zmianie, należy sprawdzić kroplówkę z solą fizjologiczną i pozostawić preparat na 15 minut. Następnie, jeśli aktywność nie powróci do poprzedniego poziomu, preparat należy zutylizować. Po zakończeniu eksperymentu utrwal mózg z sondami wciąż znajdującymi się w tkance, a następnie wyjmij mózg, wypłucz utrwalacz i przeprowadź dehydratację mózgu.

Lokalizacje kanałów rejestrujących można następnie zidentyfikować za pomocą mikroskopii konfokalnej z zapachu kwiatowego mimus Luci. Całkowita liczba substancji lotnych jest analizowana. W GC jest to zazwyczaj od 60 do 70 związków.

Zapach Mimus Luci składa się głównie z monoterpeneidów, w tym beta miosyny i alfa pinenu. Pozostałą część zapachu stanowią lotne związki sześciowęglowe. Kilka preparatów stymulowano trzema mikrolitrami ekstraktu z oka Mimus Lewis.

Nagranie z jednej z ośmiu jednostek neuronalnych zarejestrowanych przez elektrodę wielokanałową pokazuje, jak selektywnie neuron reaguje na konkretne substancje lotne. W tym przykładzie przedstawiono związek, jakim jest dine. Oto odpowiedzi ośmiu jednostek neuronalnych.

Około połowa zespołu była nieaktywna. Jest to zaskakujące, biorąc pod uwagę różnorodność związków lotnych uwalnianych z przestrzeni nadkwiatowej, jednak wynik ten jest spójny pomiędzy preparatami i został odnotowany w innych badaniach. Znormalizowana częstotliwość wyładowań jednostek responsywnych wskazuje na silną selektywność względem grupy substancji zapachowych.

Substancje zapachowe wskazane strzałkami wywołały najsilniejsze reakcje. Są to demine oraz trans beta osain. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować owada do doświadczenia, a następnie przeprowadzić eksperyment z wykorzystaniem chromatografii gazowej z rejestracją wielokanałową.

Celem jest zatem zidentyfikowanie domniemanych behawioralnie aktywnych substancji zapachowych w złożonym bukiecie zapachowym. Po opanowaniu tej techniki, jej wykonanie zajmuje od dwóch do trzech godzin, pod warunkiem prawidłowego przestrzegania opisanej procedury. W celu pełnego określenia skuteczności lotnych substancji w pośredniczeniu w odpowiedzi behawioralnej owada można przeprowadzić inne metody, takie jak testy behawioralne z wykorzystaniem zidentyfikowanych substancji zapachowych.