Name: Identyfikacja lotnych substancji węchowych za pomocą chromatografii gazowej z zapisami wielojednostkowymi (GCMR) w płacie anteny owada owada (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji biologicznie aktywnych odorantów w złożonych zapachach za pomocą chromatografii gazowej z wielokanałowymi zapisami neuronów w płacie czułkowym trzmiela.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant NSF IOS 1121692 oraz przez Research Foundation Uniwersytetu Waszyngtońskiego.

1. Zbieranie substancji lotnych
 <ol>
 <li>W tym przykładzie wykorzystujemy próbki substancji lotnych z kwiatów M. lewisii – alpejskiego kwiatu pochodzącego z Kalifornii. Substancje lotne są zbierane przy użyciu metod dynamicznej sorpcji zgodnie z opisem Riffell et al.14. W skrócie, metoda ta wykorzystuje układ pułapek w obiegu zamkniętym, w którym kwiaty są zamknięte w torbie teflonowej. Za pomocą obojętnej pompy próżniowej powietrze wokół kwiatów jest zasysane przez „pułapkę” składającą się z pipety Pasteura wypełnionej macierzą Porapak Q. Powietrze powrotne z pompy jest filtrowane przez węgiel aktywny. Po określonym czasie, w naszym przypadku 24 h, macierz Porapak Q jest eluowana niepolarnym rozpuszczalnikiem, zazwyczaj heksanem, w celu zebrania skoncentrowanego ekstraktu. Ekstrakt jest następnie przechowywany w -80 °C do czasu analizy. W razie potrzeby próbki można skoncentrować przed analizą w strumieniu gazu azotowego. Jeśli próbka nie jest wcześniej dobrze scharakteryzowana, należy poddać jej alikwot analizie za pomocą chromatografu gazowego sprzężonego ze spektrometrem mas (GC-MS), aby zidentyfikować składniki lotne przed właściwym użyciem próbki.</li>
</ol>
 2. Przygotowanie elektrofizjologiczne
 <ol>
 <li>Odetnij około 1 cm od końcówki końcówki do pipety 1 000 μl. Umieść trutnia (Bombus impatiens) w podstawie końcówki pipety i delikatnie pchnij go w stronę przeciwległego końca, aż pozostanie odsłonięta tylko głowa.</li>
 <li>Roztop wosk dentystyczny i uformuj go wokół odsłoniętej głowy, upewniając się, że wosk przylega do oczu złożonych dla stabilizacji i całkowitego unieruchomienia głowy pszczoły. Należy uważać, aby nie doprowadzić do kontaktu wosku z czułkami pszczoły.</li>
 <li>Po unieruchomieniu głowy wykonaj kwadratowe, okienne nacięcie w torebce głowowej, używając łamacza żyletek lub skalpela o odpowiednim rozmiarze w celu przecięcia kutykuli. Używając łamacza żyletek, zacznij od strony grzbietowej torebki głowowej, bezpośrednio za czułkami i przylegając do jednego z oczu złożonych. Przecnij linię prostą od jednego oka złożonego do przeciwległego oka złożonego. Po przecięciu linii prostej do przeciwległego oka złożonego, zacznij wykonywać nacięcie w kierunku grzbietowym, aż torebka głowowa zakrzywi się i zakończy w pobliżu tułowia. W tym momencie zacznij ciąć w stronę przeciwległego końca torebki głowowej. Na koniec, po przecięciu linii do przeciwległego końca, wykonaj nacięcie z powrotem do punktu początkowego pierwszego nacięcia. Ważne jest usunięcie kutykuli przylegającej do czułek, ponieważ będzie ona utrudniać wprowadzenie elektrody.</li>
 <li>Po przecięciu kutykuli użyj pęsety, aby usunąć kutykulę pszczoły, co powinno odsłonić mózg pszczoły, a przede wszystkim płaty antenalne. Natychmiast rozpocznij perfuzję powierzchniową mózgu solą fizjologiczną dla owadów, aby zapobiec jego wysuszeniu. Po odsłonięciu mózgu ostrożnie użyj bardzo precyzyjnej pęsety, aby usunąć osłonkę okołonerwową bezpośrednio nad płatami antenalnymi. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie przebić mózgu pszczoły pęsetą.</li>
 </ol>
 3. Chromatografia gazowa z rejestracją wielokanałową
 <ol>
 <li>Przygotowany preparat pszczoły – unieruchomiony w probówce z odsłoniętym mózgiem – jest gotowy do rejestracji elektrofizjologicznej. Umieść pszczołę w uchwycie zamocowanym do podstawy magnetycznej, która znajduje się na stole pneumatycznym.</li>
 <li>Przygotuj worek z płynem, kontroler przepływu i przewody (wypełnione solą fizjologiczną dla owadów) w taki sposób, aby sól fizjologiczna stale przepłukiwała mózg.</li>
 <li>Za pomocą mikromanipulatora wprowadź elektrodę referencyjną, wykonaną z drutu wolframowego, do oka pszczoły.</li>
 <li>Za pomocą oddzielnego mikromanipulatora wprowadź elektrodę wielokanałową, taką jak tetroda z drutu spiralnego lub krzemowa elektroda wielokanałowa (Neuronexus Technologies), do płatów antennych pszczoły. Elektroda ta jest podłączona do przedwzmacniacza, np. z serii S-3 Z systemu TDT, a następnie do procesora bioamp Z-bus systemu TDT. Sygnał wyjściowy z detektora chromatografu gazowego (GC) poprzez ekranowany kabel BNC może zostać zinterfejsowany ze wzmacniaczem i systemem akwizycji danych w taki sposób, aby sygnał neuronalny i sygnał GC były zsynchronizowane.</li>
 <li>Odczekaj około 30-60 minut, aż rejestracje neuronalne się ustabilizują. Gdy aktywność spontaniczna i kształt przebiegu jednostek w kanałach rejestracji staną się spójne, użyj strzykawki z odorem, aby stymulować pszczołę i zaobserwować odpowiedź kanałów rejestracji na zapach.</li>
 <li>Rejestruj potencjały zewnątrzkomórkowe z neuronów, stosując automatyczne progowanie kanałów rejestracji na poziomie od 3,5 do 5 sigma sygnału w poszczególnych kanałach. W przypadku niektórych kanałów może być wymagane ręczne progowanie, aby uniknąć zanieczyszczenia szumem elektrycznym. Potencjały czynnościowe neuronów będą widoczne jako skoki napięcia w kanale rejestracji. Gdy napięcie w kanale przekroczy próg, system buforuje i zapisuje kilka milisekund przed i po przekroczeniu progu, wykonując w ten sposób migawkę przebiegu, czyli spike'a.</li>
 <li>Bezpośrednio obok stołu pneumatycznego znajduje się GC. Przed wstrzyknięciem ekstraktu kwiatowego do GC upewnij się, że metoda rampy temperaturowej analizy GC jest poprawna. W naszym przykładzie stosujemy metodę temperaturową rozpoczynającą się od 50 °C przez 4 min, a następnie wzrost temperatury w tempie 10 °C/min do 220 °C, przy czym utrzymujemy tę temperaturę w GC przez dodatkowe 6 min. Używamy kolumny GC DB-5 (J&amp;W Scientific, Folsom, CA, USA) z helem jako gazem nośnym. Wlot jest bezpodziałowy (splitless), z temperaturą ustawioną na 200 °C. Temperatura detektora jonizacji płomieniowej jest ustawiona na 230 °C.</li>
 <li>Wstrzyknij próbkę ekstraktu z przestrzeni nad kwiatami do podgrzewanego portu wtryskowego GC, aby uwolnić zaadsorbowane substancje lotne do kolumny GC. Eluent z kolumny jest dzielony w stosunku 1:1 między detektor jonizacji płomieniowej (FID) a antenę pszczoły za pomocą szklanego łącznika w kształcie litery „Y” (J&amp;W Scientific). Rozpocznij rejestrację z elektrody w momencie wstrzykiwania próbki do GC.</li>
 <li>Po zakończeniu analizy GC pozostaw preparat do odpoczynku na 5 do 15 min. Następnie wstrzyknij kolejną próbkę do GC lub stymuluj preparat za pomocą pojedynczych związków lotnych lub ich mieszanin. W tej drugiej metodzie stymulacji preparatu impulsy powietrza z ciągłego strumienia są kierowane przez szklaną strzykawkę zawierającą kawałek papieru filtracyjnego, na którym naniesiono związki. Bodziec zapachowy był podawany impulsowo za pomocą zaworu elektromagnetycznego sterowanego przez oprogramowanie.</li>
 <li>Jeśli aktywność jednostek nagle ustanie lub ulegnie zmianie, sprawdź kroplownik z solą fizjologiczną i pozostaw preparat do odpoczynku na 15 min. Jeśli aktywność spontaniczna nie powróci do poprzedniego poziomu, preparat należy odrzucić i, jeśli jest dostępna, użyć kolejnej pszczoły.</li>
 <li>Po zakończeniu eksperymentu utrwal mózg w 5% formalinie przez 20 min, pozostawiając sondę w tkance. Następnie wyizoluj mózg i umieść go w 2% glutaraldehydzie na 4 h, a następnie przeprowadź stopniową serię odwodnienia w etanolu i przejaśnij mózg za pomocą salicylanu metylu. Na podstawie utrwalenia i przejaśnienia tkanki miejsca w AL, w których elektrody przebiły tkankę, powinny być wyraźnie widoczne w mikroskopii konfokalnej.</li>
 </ol>
 4. Analiza danych
 <ol>
 <li>Po zakończeniu eksperymentu przeanalizować zgromadzone dane w celu wyizolowania i zidentyfikowania zarejestrowanych jednostek neuronalnych. Użyć typowych programów komputerowych (Offline Sorter, MClust i SClust) do rozdzielenia kształtów fal, tzw. „spikes” (wyładowań), w oparciu o ich morfologię, np. amplitudę szczytu lub doliny, szerokość połówkową szczytu itp., lub miary zredukowane (analiza głównych składowych)17,18 (Rysunek 2). Do dalszej analizy wykorzystać wyłącznie te klastry wyładowań, które zostały rozdzielone w przestrzeni trójwymiarowej (PC1-PC3) i różnią się od siebie statystycznie (wielowymiarowa ANOVA; p &lt; 0,05) (Rysunek 2). Pełny opis metodologii rejestracji tetrodowej oraz sortowania wyładowań znajduje się w cytowaniach 17-19.</li>
 <li>Przypisać znaczniki czasu do wyładowań w każdym klastrze, a następnie wyeksportować te dane do analizy w programie MATLAB lub Neuroexplorer (Nex Technologies, Winston-Salem, NC) w celu utworzenia wykresów rastrowych oraz odpowiedzi częstotliwości wyładowań (Rysunki 2, 3A).</li>
 <li>Zidentyfikować czasy retencji substancji lotnych, korzystając z jednocześnie zarejestrowanych danych GC. Wykorzystać czasy retencji tych substancji, określone przez wierzchołek piku na chromatogramie, aby zbadać odpowiedzi jednostek w tych punktach czasowych.</li>
 <li>Aby zbadać odpowiedzi poszczególnych jednostek podczas przebiegu GC, pogrupować liczbę wyładowań w przedziałach 100 msec i przeanalizować przebieg czasowy odpowiedzi częstotliwości wyładowań w odniesieniu do czasu retencji eluowanych substancji lotnych. Grupowanie wyładowań w przedziałach 100 msec zapewnia wystarczającą szczegółowość sygnału dotyczącą przebiegu czasowego odpowiedzi neuronalnej na substancję zapachową eluowaną z GC.</li>
 <li>Aby zbadać odpowiedzi populacyjne na różne eluowane substancje lotne, zintegrować odpowiedzi częstotliwości wyładowań poszczególnych jednostek w 3 s oknie próbkowania (1,5 s przed i 1,5 s po czasie retencji substancji lotnej) (Rysunek 3). Okres ten jest typowy dla czasu elucji substancji lotnej z GC. Odpowiedzi częstotliwości wyładowań jednostek przedstawiono za pomocą kodowania kolorami (kolor czerwony oznacza wysoką częstotliwość wyładowań, niebieski – niską) i ułożono w formie macierzy aktywności, w której każdy wiersz reprezentuje odpowiedź zespołu na efluent GC (kolumny) (Rysunek 3).</li>
 </ol>

<ol><li>Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+olfactory%3A+converging+evidence+for+common+principles+across+phyla%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla.</a> Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).</li>
<li>Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+effects+of+floral+scent+in+an+insect-plant+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Antagonistic effects of floral scent in an insect-plant interaction.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 2371-2379 (2010).</li>
<li>Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Hildebrand, J. G. International Symposium on Olfaction and Taste. 1170, 462-467 (2009).</li>
<li>Alarcón, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congruence+between+visitation+and+pollen-transport+networks+in+a+California+plant-pollinator+community%5BTitle%5D)+AND+%22Oikos%22%5BJournal%5D)">Congruence between visitation and pollen-transport networks in a California plant-pollinator community.</a> Oikos. 119, 35-44 (2010).</li>
<li>Alarcón, R., Waser, N. M., Ollerton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Year-to-year+variation+in+the+topology+of+a+plant-pollinator+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Oikos%22%5BJournal%5D)">Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network.</a> Oikos. 117, 1796-1807 (2008).</li>
<li>Riffell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+consequences+of+innate+preferences+and+olfactory+learning+in+hawkmoth-flower+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions.</a> P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).</li>
<li>De Moraes, C. M., Lewis, W. J., Pare, P. W., Alborn, H. T., Tumlinson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbivore-infested+plants+selectively+attract+parasitoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids.</a> Nature. 393, 570(1998).</li>
<li>Carey, A. F., Wang, G., Su, C. -Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+reception+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Nature. 464, 66-71 (2010).</li>
<li>Turner, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-prolonged+activation+of+CO2-sensing+neurons+disorients+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes.</a> Nature. 474, 87-91 (2011).</li>
<li>Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+sensillum+recordings+in+the+insects+Drosophila+melanogaster+and+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae.</a> J Vis Exp. (36), e1725(2010).</li>
<li>Syed, Z., Leal, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+measurements+from+a+moth+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological measurements from a moth olfactory system.</a> J. Vis. Exp. (49), e2489(2011).</li>
<li>Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+attractant+of+the+codling+moth%3A+characterization+with+electroantennogram+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique.</a> Science. 174, 297-299 (1971).</li>
<li>Riffell, J. A., Lei, H., Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+coding+of+behaviorally+significant+odor+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization and coding of behaviorally significant odor mixtures.</a> Current Biology. 19, 335-340 Forthcoming.</li>
<li>Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+correlates+of+behavior+in+the+moth+Manduca+sexta+in+response+to+complex+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).</li>
<li>Raguso, R. A., Pellmyr, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+headspace+analysis+of+floral+volatiles%3A+a+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Oikos%22%5BJournal%5D)">Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods.</a> Oikos. 81, 238-254 (1998).</li>
<li>Rodriguez-Saona, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbivore-induced+blueberry+volatiles+and+intra-plant+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling.</a> J Vis Exp. , e3440(2011).</li>
<li>Nguyen, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-drive+array+for+chronic+in+vivo+recording%3A+tetrode+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly.</a> J Vis Exp. , e1098(2009).</li>
<li>Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+large-scale+neuronal+ensembles+with+silicon+probes+in+the+anesthetized+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat.</a> J Vis Exp. , e3282(2011).</li>
<li>Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+representation+of+olfactory+mixtures+in+the+honeybee+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe.</a> European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).</li>
<li>Stökl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deceptive+pollination+system+targeting+drosophilids+through+olfactory+mimicry+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast.</a> Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).</li>
<li>Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elektrophysiologische+untersuchungen+von+chemo-+und+mechanorezeptoren+der+antenne+des+seidenspinners+Bombyx+mori+L%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+A%3A+Neuroethology%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L.</a> Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).</li>
<li>Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electroantennographic+detector%3A+a+selective+and+senstitive+tool+in+the+gas+chromatographic+analysis+of+insect+pheromones%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Naturforschung%22%5BJournal%5D)">The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones.</a> Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).</li>
<li>Schneider, D., Boeckh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rezeptorpotential+und+nervenimpulse+einzelner+olfaktorischer+sensillen+der+insektenantenne%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+A%3A+Neuroethology%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne.</a> Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).</li>
<li>Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antennal+perception+of+oilseed+rape+Brassica+napus+%28Brassicaceae%29+volatiles+by+the+cabbage+seed+weevil+Ceutorhynchus+assimilis+%28Coleoptera%2C+Curculionidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae).</a> Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).</li>
<li>Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representation+of+natural+stimuli+in+the+rodent+main+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb.</a> Neuron. 50, 937-949 (2006).</li>
<li>Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+patterns+and+their+functional+implications+in+the+antennal+lobe+of+the+tobacco+hornworm+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta.</a> PLoS ONE. 6, e23382(2011).</li>
<li>Syed, Z., Leal, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+olfactory+response+of+Culex+mosquitoes+to+a+human-+and+bird-derived+attractant%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Zachowania owadów sterowane węchem napędzają wiele różnych procesów, w tym rozród, wybór miejsca gospodarza oraz identyfikację odpowiednich zasobów pokarmowych. Badanie tych procesów wymaga umiejętności identyfikacji substancji lotnych emitowanych przez źródło, a także zdolności do rozpoznania związków, które pośredniczą w tych zachowaniach. Sytuację komplikuje fakt, że zapachy składają się z dziesiątek lub setek poszczególnych związków, które wspólnie tworzą unikalny aromat, postrzegany inaczej niż jego poszczególne skł...

<table><tbody><tr><td>Porapak Type Q 80-100 mesh</td><td>Waters</td><td>WAT027060</td><td></td></tr><tr><td>Worki do piekarnika Reynolds</td><td>Reynolds</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC</td><td>Agilent</td><td>7820A</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna GC</td><td>J&amp;amp;W Scientific, Folsom, CA, USA</td><td>DB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 &amp;#956;m)</td><td></td></tr><tr><td>Analityczny hel jako gaz nośny</td><td>Praxair</td><td>HE K</td><td>1 cc/min</td></tr><tr><td>16-kanałowa elektroda krzemowa</td><td>Neuronexus Technologies</td><td>a4x4-3mm50-177</td><td></td></tr><tr><td>Cienki drut NiCr, średnica 0.012 mm) </td><td>Sandvik Kanthal HP Reid</td><td>PX000004</td><td>Do wykonania niestandardowych tetrod i steretrod</td></tr><tr><td>Przedwzmacniacz</td><td>Tucker-Davis System</td><td>PZ-2</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz </td><td>Tucker-Davis System</td><td>RZ-2</td><td></td></tr><tr><td>System akwizycji danych - pakiet OpenEx</td><td>Tucker-Davis System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do sortowania impulsów online - SpikePac</td><td>Tucker-Davis System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do sortowania impulsów offline - Mclust Spike-sorting toolbox </td><td>David Redish, Department of Neuroscience, University of Minnesota</td><td>Bezpłatne pobieranie ze strony &lt;a href=&quot;http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html&quot; target=&quot;_blank">http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html&lt;/a&gt;</td><td>Narzędzia MATLAB</td></tr></tbody></table>

identyfikacja lotnych substancji zapachowych przy użyciu chromatografii gazowej z wielokanałowym zapisem (gcmr) w płacie antenalnym owada

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

Wszystkie organizmy zamieszkują świat pełen bodźców sensorycznych, które determinują ich reakcje behawioralne i fizjologiczne na otoczenie. Węch jest szczególnie istotny u owadów, które wykorzystują swoje systemy olfaktoryczne do reagowania na złożone bodźce zapachowe i odróżniania ich od siebie. Zapachy te wywołują zachowania pośredniczące w takich procesach jak reprodukcja i dobór siedlisk1-3. Ponadto chemorecepcja u owadów pośredniczy w zachowaniach o dużym znaczeniu dla rolnictwa i zdrowia ludzi, w tym w zapylaniu4-6, żerowaniu na uprawach roślin spożywczych7 oraz transmisji chorób8,9. Identyfikacja sygnałów olfaktorycznych i ich roli w zachowaniu owadów jest zatem kluczowa dla zrozumienia zarówno procesów ekologicznych, jak i zasobów żywnościowych oraz dobrostanu ludzi.
	Do tej pory identyfikacja lotnych związków sterujących zachowaniem owadów była trudna i często żmudna. Obecne techniki obejmują rejestrację elektroantenogramu sprzężoną z chromatografią gazową (GC-EAG) oraz rejestrację z pojedynczego sensillum sprzężoną z chromatografią gazową (GC-SSR)10-12. Techniki te okazały się kluczowe w identyfikacji związków bioaktywnych. Opracowaliśmy metodę wykorzystującą chromatografię gazową sprzężoną z wielokanałowymi rejestracjami elektrofizjologicznymi (nazwaną „GCMR”) z neuronów w płacie antennym (AL; głównym ośrodku węchowym owada)13,14. Ta nowoczesna technika pozwala nam badać, w jaki sposób informacje zapachowe są reprezentowane w mózgu owada. Co więcej, ponieważ odpowiedzi neuronalne na zapachy na tym poziomie przetwarzania węchowego są bardzo czułe ze względu na stopień konwergencji neuronów receptorowych anteny do neuronów AL, rejestracje z AL pozwolą na wydajne i czułe wykrywanie aktywnych składników naturalnych zapachów. W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę GCMR i przedstawiamy przykład jej zastosowania.
	Wykrywanie lotnych substancji bioaktywnych oraz analiza reakcji owadów obejmują kilka ogólnych etapów. W pierwszej kolejności należy zebrać substancje lotne z wybranych źródeł (w tym przykładzie wykorzystujemy kwiaty z rodzaju Mimulus (Phyrmaceae)), a następnie scharakteryzować je w razie potrzeby, stosując standardowe techniki GC-MS14-16. Owady przygotowuje się do badań poprzez minimalną dyssekcję, po której elektrodę rejestrującą wprowadza się do płata antenalnego i rozpoczyna wielokanałowy zapis aktywności neuronalnej. Następnie post-processing danych neuronalnych pozwala ustalić, które konkretne substancje zapachowe wywołują istotne odpowiedzi neuronalne w układzie nerwowym owada.
	Choć przedstawiony tutaj przykład dotyczy konkretnie badań nad zapylaniem, metodę GCMR można rozszerzyć na szeroki zakres organizmów badawczych i źródeł substancji lotnych. Przykładowo, metoda ta może być wykorzystana do identyfikacji substancji zapachowych przyciągających lub odstraszających owady będące wektorami chorób oraz szkodniki upraw. Co więcej, GCMR może służyć do identyfikacji atraktantów dla owadów pożytecznych, takich jak zapylacze. Technikę tę można rozszerzyć również na obiekty inne niż owady.

W teście GCMR z wykorzystaniem zapachu kwiatowego M. lewisii wstrzykujemy 3 μl ekstraktu do GC. Całkowita liczba substancji lotnych eluujących z GC wynosi zazwyczaj 60-70. Zapach M. lewisii składa się głównie z monoterpenoidów, w tym z β-myrcenu (acyklicznego) i α-pinenu, natomiast resztę zapachu stanowią substancje lotne sześciowęglowe, takie jak 2-heksanol, oraz seskwiterpenoidy, które stanowią &lt; 1% przestrzeni nadpróbkowej.
 GCMR wykorzystuje czułość n...

Bodźce węchowe pośredniczą w wielu różnych zachowaniach owadów i często stanowią złożone mieszaniny składające się z dziesiątek lub setek lotnych związków. Wykorzystując chromatografię gazową z wielokanałowym zapisem w płacie antenalnym owada, opisujemy metodę identyfikacji związków biologicznie czynnych.

Identyfikacja lotnych substancji zapachowych przy użyciu chromatografii gazowej z wielokanałowym zapisem (GCMR) w płacie antenalnym owada

Wszystkie organizmy zamieszkują świat pełen bodźców sensorycznych, które determinują ich odpowiedź behawioralną i fizjologiczną na środowisko. Olfaksja to...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja biologicznie czynnych substancji zapachowych w złożonym zapachu poprzez rejestrację aktywności w mózgu trzmiela. Jest to realizowane poprzez najpierw zebranie zapachów wywołujących reakcje behawioralne, a następnie przygotowanie chromatografu gazowego oraz wielokanałowych systemów rejestracji do eksperymentu. Trzecim krokiem jest przygotowanie i dysekcja mózgu trzmiela w celu przeprowadzenia rejestracji neuronalnych w płacie antenarycznym.Następnie eksperyment przeprowadza się poprzez wprowadzenie elektrod do płata anteny i pomiar reakcji na podawane pod ciśnieniem substancje lotne poprzez analizę aktywności neuronalnej w odpowiedzi na zapachy złożone oraz ich poszczególne składniki. Można zidentyfikować biologicznie aktywne substancje zapachowe wyizolowane za pomocą chromatografii gazowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak G-C-E-A-G, jest czułość neuronów obciążenia anteny oraz możliwość scharakteryzowania sposobu, w jaki neurony w mózgu reagują na specyficzne lotne substancje kwiatowe.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ połączone etapy elektrofizjologiczne i analityczno-chemiczne są trudne do opanowania ze względu na technikę rejestracji preparatu elektrofizjologicznego oraz niezbędne kroki gromadzenia lotnych związków z przestrzeni nadpróbkowej. Choć technika ta może dostarczyć wiedzy na temat przetwarzania węchowego u trzmieli, można ją również zastosować w innych systemach, takich jak wektory chorób, np. komary lub pluskiewce z rodzaju Triatominae, lub szkodniki upraw, np. mszyce lub ćmy. Do tej procedury należy przygotować elektrodę odniesienia wykonaną z drutu wolframowego na mikromanipulatorze na drugim stanowisku.Mikromanipulator posiada elektrodę wielokanałową, taką jak zwinięty drut, tede lub krzemową elektrodę wielokanałową, podłączoną do przedwzmacniacza, a chromatograf gazowy posiada wyjście na ekranowanym stole BNC. Wyjście detektora GC jest sprzężone ze wzmacniaczem i systemem akwizycji danych w taki sposób, aby sygnały neuronowe i sygnały GC były zsynchronizowane. W tym przykładzie gaz nośny GC to hel, a kolumna GC to DB five.Chromatograf gazowy (GC) wykorzystuje wlot z podziałem (split), w którym temperaturę ustawiono na 200 °C, a temperaturę detektora jonizacji płomieniowej ustawiono na 230 °C. Po podgrzaniu próbek w GC, eluat z kolumny jest dzielony w stosunku jeden do jednego pomiędzy detektor jonizacji płomieniowej a antenę B za pomocą szklanego łącznika w kształcie litery Y. W tym przykładzie GC służy do dostarczania substancji lotnych zebranych metodą absorpcji dynamicznej z kwiatów Mimus lewisii, alpejskiego kwiatu polnego pochodzącego z Kalifornii.Alternatywnie, zamiast korzystać z chromatografu gazowego, pojedyncze związki lotne lub ich mieszaniny można wprowadzać za pomocą impulsów powietrza. Odbywa się to poprzez przepuszczenie powietrza przez oddzielną strzykawkę szklaną zawierającą kawałek papieru filtracyjnego, na którym naniesiono związki. Impulsy powietrza są przekierowywane z ciągłego strumienia powietrza za pomocą zaworu elektromagnetycznego sterowanego komputerowo.Przygotowania rozpocznij od odcięcia około jednego centymetra z końcówki końcówki do pipety o pojemności 1 ml. Umieść trutnia w podstawie końcówki pipety i delikatnie pchnij go w stronę przeciwległego końca, aż zostanie odsłonięta jedynie głowa. Używając roztopionego wosku dentystycznego, wykonaj odlew wokół odsłoniętej głowy.Wosk musi przylegać do oczu złożonych, aby całkowicie unieruchomić głowę, jednak w razie potrzeby nie może on dotykać czułków. Do unieruchomienia czułków należy użyć małych szpilek. Następnie, za pomocą ostrego ostrza, np. mikroskalpela, wykonuje się w torebce głowy nacięcie w kształcie kwadratowego okna.Rozpocznij cięcie bezpośrednio za czułkiem i obok jednego z oczu złożonych. Wytnij linię prostą pomiędzy oczami. Następnie tnij w kierunku grzbietowym, aż kapsuła głowy zakręci w stronę tułowia.Kontynuuj cięcie do przeciwległego końca torebki głowowej. Na koniec przetnij tkankę z powrotem do miejsca rozpoczęcia, aby uzyskać kształt kwadratu. Używając pincety, usuń kutykulę.Należy usunąć kutykulę sąsiadującą z czułkiem, w przeciwnym razie będzie ona utrudniać dostęp elektrody, gdy tylko mózg zostanie odsłonięty. Natychmiast przemyj tkankę solą fizjologiczną dla owadów. Upewnij się, że płaty czułków są dobrze wyeksponowane.Następnie, używając bardzo precyzyjnej pęsety, ostrożnie usuń osłonkę okołonerwową bezpośrednio nad płatami antenowymi. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie przebić pęsetą mózgu pszczoły. Preparat pszczoły jest teraz gotowy do rejestracji elektrofizjologicznej.Zacznij od przymocowania przygotowanej pszczoły do zacisku zamocowanego na podstawie magnetycznej. Utrzymuj nadmierne nawilżenie za pomocą soli fizjologicznej dla owadów podawanej z rezerwuaru wyposażonego w kontroler przepływu. Następnie wprowadź elektrodę odniesienia do przeciwległej tkanki mózgowej.Następnie wprowadź elektrodę wielokanałową do płatów anten pszczoły. Po umieszczeniu elektrod odczekaj od 30 do 60 minut, aż zapisy się ustabilizują.W tym czasie należy przygotować pozakomórkowe impulsy (spikes) z neuronów, stosując również progowanie. W przypadku niektórych kanałów rejestracyjnych, ze względu na szum, może być wymagane ręczne ustawienie progu. Następnie należy zweryfikować, czy rampy temperatury w przebiegu analizy GC są prawidłowe.W tym przykładzie temperatura rozpoczyna się od 50 °C przez cztery minuty, a następnie wzrasta o 10 °C na minutę do temperatury końcowej 220 °C lub jest utrzymywana przez sześć minut. Rejestracje neuronalne uznaje się za stabilne, gdy kształty przebiegów jednostek w kanałach rejestrujących staną się spójne. Po ustabilizowaniu należy napełnić strzykawkę aromatem z przestrzeni nad kwiatami i wstrzyknąć go do portu wtryskowego gc.Następnie, niezwłocznie po zakończeniu analizy GC, rozpocznij pomiar z elektrod. Pozostaw preparat w spoczynku od pięciu do 15 minut. Następnie wstrzyknij kolejną próbkę do GC lub stymuluj preparat za pomocą pojedynczych związków lotnych lub ich mieszanin.Jeśli w którymkolwiek momencie aktywność spontaniczna nagle ustanie lub ulegnie zmianie, należy sprawdzić kroplówkę z solą fizjologiczną i pozostawić preparat na 15 minut. Następnie, jeśli aktywność nie powróci do poprzedniego poziomu, preparat należy zutylizować. Po zakończeniu eksperymentu utrwal mózg z sondami wciąż znajdującymi się w tkance, a następnie wyjmij mózg, wypłucz utrwalacz i przeprowadź dehydratację mózgu.Lokalizacje kanałów rejestrujących można następnie zidentyfikować za pomocą mikroskopii konfokalnej z zapachu kwiatowego mimus Luci. Całkowita liczba substancji lotnych jest analizowana. W GC jest to zazwyczaj od 60 do 70 związków.Zapach Mimus Luci składa się głównie z monoterpeneidów, w tym beta miosyny i alfa pinenu. Pozostałą część zapachu stanowią lotne związki sześciowęglowe. Kilka preparatów stymulowano trzema mikrolitrami ekstraktu z oka Mimus Lewis.Nagranie z jednej z ośmiu jednostek neuronalnych zarejestrowanych przez elektrodę wielokanałową pokazuje, jak selektywnie neuron reaguje na konkretne substancje lotne. W tym przykładzie przedstawiono związek, jakim jest dine. Oto odpowiedzi ośmiu jednostek neuronalnych.Około połowa zespołu była nieaktywna. Jest to zaskakujące, biorąc pod uwagę różnorodność związków lotnych uwalnianych z przestrzeni nadkwiatowej, jednak wynik ten jest spójny pomiędzy preparatami i został odnotowany w innych badaniach. Znormalizowana częstotliwość wyładowań jednostek responsywnych wskazuje na silną selektywność względem grupy substancji zapachowych.Substancje zapachowe wskazane strzałkami wywołały najsilniejsze reakcje. Są to demine oraz trans beta osain. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować owada do doświadczenia, a następnie przeprowadzić eksperyment z wykorzystaniem chromatografii gazowej z rejestracją wielokanałową.Celem jest zatem zidentyfikowanie domniemanych behawioralnie aktywnych substancji zapachowych w złożonym bukiecie zapachowym. Po opanowaniu tej techniki, jej wykonanie zajmuje od dwóch do trzech godzin, pod warunkiem prawidłowego przestrzegania opisanej procedury. W celu pełnego określenia skuteczności lotnych substancji w pośredniczeniu w odpowiedzi behawioralnej owada można przeprowadzić inne metody, takie jak testy behawioralne z wykorzystaniem zidentyfikowanych substancji zapachowych.

identification-olfactory-volatiles-using-gas-chromatography-multi

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Oznaczanie lotnych związków zapachowych za pomocą chromatografii gazowej z rejestracją wielokanałową (GCMR) w płacie czułkowym owada

Reakcje elektrofizjologiczne neuronów sensorycznych węchu na odoranty u owadów można mierzyć za pomocą rejestracji z pojedynczych sensyli. W tym artykule wideo zademonstrujemy, jak przeprowadzić rejestrację z pojedynczych sensyli w czułkach muszki owocowej (Drosophila melanogaster) oraz w palpach szczękowych komara malarycznego (Anopheles gambiae).

Rejestracja z pojedynczych sensyli u owadów Drosophila melanogaster oraz Anopheles gambiae

Rejestracje za pomocą macierzy mikroelektrod (MEA) stanowią metodę badania aktywności elektrycznej dużych populacji neuronów. W niniejszym materiale przedstawiamy szczegóły przygotowania MEA do rejestracji sygnałów z nabłonka womeronasalnego myszy przy jednoczesnej stymulacji tkanki.

Rejestracje z macierzy wieloelektrodowej nabłonka narządu Jacobsona

Układy węchowe owadów zapewniają wyjątkowe możliwości rejestrowania odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w formie elektroantenogramów (EAG) oraz rejestracji z pojedynczych sensyli (SSR), które stanowią odpowiednio sumaryczne odpowiedzi wszystkich neuronów receptorowych zapachowych (ORNs) zlokalizowanych na antenie oraz tych znajdujących się w poszczególnych sensylach.

Pomiary elektrofizjologiczne z systemu węchowego ćmy

Przedstawiono metodę szybkiego przesiewania substancji lotnych roślin żywicielskich poprzez pomiar odpowiedzi elektrofizjologicznej czułków dorosłych osobników omacnicy brzoskwiniowej (Amyelois transitella) na pojedyncze składniki oraz mieszaniny za pomocą analizy elektroantenograficznej.

Bioassay elektroantenograficzny jako narzędzie przesiewowe dla lotnych substancji rośliny żywicielskiej

Pokazujemy różne warianty techniki wewnątrzkomórkowego zapisu wielojednostkowego, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech etapach szlaku węchowego bezkręgowców. Techniki te można łatwo zaadaptować do badania aktywności zespołu również w innych systemach neuronowych.

Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana)

Opisujemy protokół używania anten owadów w postaci elektroantennogramów (EAG) na autonomicznych robotach. Nasza eksperymentalna konstrukcja pozwala na stabilne nagrania w ciągu jednego dnia i rozwiązuje indywidualne plamy zapachowe do 10 Hz. Skuteczność czujników EAG w poszukiwaniu węchu jest wykazywana poprzez kierowanie robota w kierunku źródła zapachu.

Wykorzystanie czujników elektroantennogramu owadów w autonomicznych robotach do wyszukiwania węchowego

Ogólnym celem tego protokołu jest pokazanie, jak prezentować substancje zapachowe o niskiej lotności do rejestracji pojedynczej sensyllum z neuronów receptora węchowego Drosophila, które reagują na długołańcuchowe feromony kutykularne.

Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila trichoid Sensilla w odpowiedzi na substancje zapachowe o niskiej lotności

Niepełnoletni robotnicy gatunku mrówek Colobopsis explodens są preparowani w celu wyizolowania woskowej zawartości przechowywanej w ich przerośniętych zbiornikach gruczołów żuchwowych w celu późniejszej ekstrakcji rozpuszczalnikiem i analizy za pomocą chromatografii gazowej i spektrometrii mas. Opisano również adnotację i identyfikację składników lotnych za pomocą oprogramowania open source MetaboliteDetector.

Izolacja zawartości rezerwuaru gruczołów żuchwowych od borneańskich "eksplodujących mrówek" (Formicidae) w celu analizy objętości za pomocą GC-MS i MetaboliteDetector

Ten artykuł opisuje szczegółowy i wysoce skuteczny protokół dla pojedynczych nagrań sensillum z sensilla basiconica na palpach aparatów gębowych owadów.

Single Sensillum Recordings dla Locust Palp Sensilla Basiconica

Tutaj prezentujemy protokół zbierania substancji lotnych o zapachu kwiatowym z kwitnących kwiatów, przy użyciu nieniszczącej procedury pobierania próbek.

Szybkie zbieranie lotnych substancji zapachowych o kwiatowych zapachach przy użyciu techniki zbierania lotnych substancji w przestrzeni nad powierzchnią do pobierania próbek desorpcji termicznej GC-MS

Fizjologicznie, receptory zapachowe są aktywowane przez cząsteczki odorantu wdychane w fazie gazowej. Jednak większość systemów in vitro wykorzystuje stymulację odorantem w fazie ciekłej. W tym artykule przedstawiamy metodę, która pozwala na monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego po stymulacji odoranta w fazie gazowej.

Monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego przez nawaniacz w fazie gazowej

Poznaj metodę identyfikacji biologicznie aktywnych odorantów w złożonych zapachach za pomocą chromatografii gazowej z wielokanałowymi zapisami neuronów w płacie czułkowym trzmiela.

Identyfikacja lotnych substancji węchowych za pomocą chromatografii gazowej z zapisami wielojednostkowymi (GCMR) w płacie anteny owada owada (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja lotnych substancji zapachowych przy użyciu chromatografii gazowej z wielokanałowym zapisem (GCMR) w płacie antenalnym owada

Przeglądaj więcej filmów