Identyfikacja lotnych substancji węchowych za pomocą chromatografii gazowej z zapisami wielojednostkowymi (GCMR) w płacie anteny owada owada

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie biologicznie skutecznych substancji zapachowych w złożonym sensie poprzez zapisy w mózgu trzmiela. Osiąga się to po pierwsze, zbierając zmysły efektu behawioralnego, a po drugie, przygotowując chromatograf gazowy i wielokanałowe systemy nagrywania do eksperymentu. Trzecim krokiem jest przygotowanie i wypreparowanie mózgu trzmiela pod kątem nagrań neuronowych w antenie płata fabrycznego.

Eksperyment jest następnie przeprowadzany poprzez włożenie elektrod do płata anteny i zmierzenie reakcji na nadmuchiwane substancje lotne poprzez analizę aktywności neuronalnej w odpowiedzi na złożone zmysły i ich indywidualne składniki. Można zidentyfikować biologicznie aktywne substancje zapachowe otrzymane metodą chromatografii gazowej. Tak więc główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi technikami, takimi jak G-C-E-A-G, jest czułość neuronów obciążenia anteny i możliwość scharakteryzowania, w jaki sposób neurony w mózgu reagują na określone lotne substancje kwiatowe.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ połączone elektrofizjologiczne i chemiczne etapy analityczne są trudne do nauczenia ze względu na technikę zapisu przygotowania elektrofizjologicznego i niezbędne etapy zbierania substancji lotnych w przestrzeni nad głową. Chociaż technika ta może dostarczyć informacji na temat przetwarzania węchowego trzmieli, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak czynniki chorobotwórcze, takie jak komary lub pluskwy całujące, lub szkodniki upraw, takie jak mszyce lub. Do tej procedury przygotuj elektrodę odniesienia wykonaną z drutu wolframowego na mikromanipulatorze na drugim.

Mikromanipulator posiada elektrodę wielokanałową, taką jak drut spiralny, tede lub elektroda wielokanałowa z krzemu podłączona do przedwzmacniacza posiada chromatograf gazowy z wyjściem na ekranowanym stole BNC. Wyjście detektora GCs jest sprzężone ze wzmacniaczem i systemem akwizycji danych w taki sposób, że zarówno sygnały neuronowe, jak i GC są zsynchronizowane. W tym przykładzie gazem nośnym GC jest hel i znajduje się w kolumnie DB pięć GC.

GC wykorzystuje wlot z dzieloną listą z temperaturą ustawioną na 200 stopni Celsjusza i ma temperaturę detektora płomieniowo-jonizacyjnego ustawioną na 230 stopni Celsjusza. Po podgrzaniu próbek w gc, ścieki z kolumny są rozdzielane jeden do jednego między detektorem płomieniowo-jonizacyjnym a anteną B za pomocą szklanego łącznika Y. W tym przykładzie GC jest używany do dostarczania substancji lotnych zebranych w procesie dynamicznej absorpcji z kwiatów oka Mimus Lewis, dzikiego kwiatu alpejskiego pochodzącego z Kalifornii.

Alternatywnie, zamiast używać gc, pojedyncze lotne związki lub mieszaniny związków mogą być dostarczane za pomocą impulsów powietrza. Przestrzelić przez oddzielną szklaną strzykawkę zawierającą kawałek bibuły filtracyjnej, na której osadzono związki. Impulsy powietrza są kierowane ze stałego strumienia powietrza za pomocą zaworu aktywowanego elektromagnesem sterowanego przez komputer.

Przygotowania należy rozpocząć od odcięcia około jednego centymetra od końca końcówki pipety o pojemności jednego mililitra. Umieść trzmiela u podstawy końcówki pipety i delikatnie popchnij go w kierunku przeciwległego końca końcówki, aż odsłonięta zostanie tylko główka. Używając stopionego wosku dentystycznego, wykonaj formę wokół odsłoniętej głowy.

Wosk musi przylegać do złożonych oczu, aby całkowicie unieruchomić głowę, ale w razie potrzeby nie może stykać się z anteną. Użyj małych szpilek, aby unieruchomić anteny. Następnie wykonaj kwadratowe nacięcie przypominające okno w torebce głowy za pomocą ostrego ostrza, takiego jak mikroskalpel.

Rozpocznij cięcie bezpośrednio za anteną i w sąsiedztwie jednego z oczu złożonych. Wytnij linię prostą między oczami. Następnie przetnij grzbietowo, aż torebka głowy zakrzywi się do klatki piersiowej.

Kontynuuj cięcie do przeciwległego końca torebki na głowę. Na koniec wróć do początku, aby ukończyć kwadrat. Użyj kleszczy, aby usunąć naskórek.

Naskórek przylegający do anteny musi zostać usunięty, w przeciwnym razie utrudni to działanie elektrody, gdy tylko mózg zostanie odsłonięty. Natychmiast połącz tkankę z solą fizjologiczną z owadów. Upewnij się, że krzywki anteny są dobrze odsłonięte.

Następnie ostrożnie użyj pary bardzo cienkich kleszczyków, aby usunąć osłonkę okołonerwową bezpośrednio nad płatami anteny. Uważaj, aby nie przebić mózgu pszczoły kleszczami. Preparat pszczeli jest teraz gotowy do rejestracji elektrofizjologicznej.

Zacznij od przymocowania przygotowanej pszczoły do zacisku, który jest przymocowany do podstawy magnetycznej. Utrzymuj go w doskonałej fuzji z solą fizjologiczną dostarczaną ze zbiornika ze zbiornikiem z regulatorem przepływu. Teraz włóż elektrodę referencyjną do przeciwległej tkanki mózgowej.

Następnie włóż elektrodę wielokanałową do płatów antenowych pszczoły. Gdy elektrody są na swoim miejscu. Poczekaj od 30 do 60 minut, aż nagrania się ustabilizują.

W tym czasie przygotuj się na zewnątrzkomórkowe skoki z neuronów, również poprzez progowanie. Poszczególne kanały nagrywania W przypadku niektórych kanałów może być wymagane ręczne progowanie ze względu na szum w kanałach nagrywania. Następnie sprawdź, czy rampa temperatury przebiegu GC jest poprawna.

W tym przykładzie temperatura zaczyna się od 50 stopni Celsjusza przez cztery minuty, a następnie wzrasta o 10 stopni na minutę do temperatury końcowej 220 stopni Celsjusza lub jest utrzymywana przez sześć minut. Gdy kształty fal jednostek w kanałach nagrywających stają się spójne, nagrania neuronowe są uważane za stabilne. Po ustabilizowaniu załaduj strzykawkę kwiatowym zapachem przestrzeni nad głową i wstrzyknij zapach do portu iniekcyjnego głowicy gc.

Następnie natychmiast rozpocznij nagrywanie z elektrod po zakończeniu przebiegu GC. Odstaw preparat na pięć do 15 minut. Następnie wstrzyknąć kolejną próbkę do GC lub stymulować preparat za pomocą pojedynczych lotnych związków lub mieszanin związków.

Jeśli w którymkolwiek momencie spontaniczna aktywność nagle usta lub zmieni się, sprawdź kroplówkę z soli fizjologicznej i pozwól preparatowi odpocząć przez 15 minut. Następnie, jeśli aktywność nie odzyska poprzedniego poziomu, wyrzuć preparat. Po eksperymencie napraw mózg za pomocą sond nadal w tkance, a następnie wytnij mózg, oczyść utrwalacz i odwodnij mózg.

Lokalizacje kanałów rejestrujących można następnie zidentyfikować za pomocą mikroskopii konfokalnej na podstawie kwiatowego zapachu mimus Luci. Cała liczba substancji lotnych jest plądrowana. GC wynosi zwykle od 60 do 70 związków.

Zapach Mimus Luci składa się głównie z mono terpenoidów, w tym beta miozyny i alfa pininy. Pozostała część zapachu składa się z sześciu substancji lotnych węgla. Kilka preparatów stymulowano trzema mikrolitrami ekstraktu z oka Mimus Lewis.

To nagranie z jednej z ośmiu jednostek nerwowych zarejestrowanych przez elektrodę wielokanałową pokazuje, jak selektywnie neuron konkuruje z określonymi substancjami lotnymi. W tym przykładzie dine jest pokazanym związkiem. Oto odpowiedzi ośmiu jednostek neuronowych.

Mniej więcej połowa zespołu nie reagowała. Jest to zaskakujące, biorąc pod uwagę różnorodność lotnych związków, o których wspomina się w przestrzeni kwiatowej, ale jest to spójne między preparatami i jest zgłaszane w innych badaniach. Znormalizowana szybkość wypalania jednostek reagujących pokazuje, że istnieje silna selektywność dla grupy substancji zapachowych.

Substancje zapachowe podkreślone strzałkami wywołały najmocniejsze reakcje. Są to demine i trans beta osaina. Tak więc po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować owada do eksperymentu, a następnie przeprowadzić eksperyment za pomocą chromatografii gazowej z nagrywaniem wielokanałowym.

Celem jest zatem zidentyfikowanie przypuszczalnie skutecznych behawioralnie substancji zapachowych w złożonym bukiecie. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu dwóch do trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak testy behawioralne ze zidentyfikowanymi zapachami, mogą być przeprowadzone w celu pełnego określenia skuteczności substancji lotnych w pośredniczeniu w reakcji behawioralnej owada.