Name: Proces obrazowania o wysokiej zawartości do badania kompleksów sygnalizacyjnych Grb2 poprzez klonowanie ekspresji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Poznaj metodę mikroskopii wysokiej zawartości do identyfikacji partnerów interakcyjnych Grb2 w komórkach ssaczych przy użyciu klonowania ekspresji cDNA. Technika umożliwia wizualizację lokalizacji podkomórkowej białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez Medical Research Council oraz program grantowy Marie-Curie International Reintegration Grant (dla JKV).

1. Wybór klonów ekspresyjnych cDNA
<ol>
 <li>Biblioteka cDNA dostarczona jest w formie pojedynczych klonów bakteryjnych w zapasach glicerolowych w formacie 96-dołkowym. Używając polecenia Rearray w menu pickera urządzenia Norgen CP7200, należy pobrać klony bakteryjne z płytki źródłowej i zaszczepić je do 1,5 ml LB/amp w 96-dołkowej płytce typu deepwell (dołki 1 ml).</li>
 <li>Płytki deepwell należy zamknąć przepuszczalną dla gazów membraną uszczelniającą i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze wytrząsowym.</li>
</ol>
2. Przygotowanie biblioteki ekspresyjnej cDNA
<ol>
 <li>Wirować płytki głębokozwojowe zawierające bakterie przy 2,000 rpm przez 20 min, używając adapterów do płytek w wirówce stołowej.</li>
 <li>Odssać pożywkę z dołków, pozostawiając nienaruszony osad bakteryjny.</li>
 <li>Skonfigurować platformę stacji automatyzacji laboratoryjnej zgodnie z Rysunkiem 2. Roztwory do preparatyki plazmidów rozdzielić do koryt 1-5, a płytkę głębokozwojową umieścić na platformie. Korytko wielodołkowe z roztworem eluowania umieścić obok płytki głębokozwojowej. Załadować końcówki do stojaków na końcówki.</li>
 <li>Złożyć kolektor próżniowy. Płytkę do wiązania plazmidów umieścić wewnątrz kolektora, a płytkę filtracyjną do plazmidów położyć na górze kolektora.</li>
 <li>Resuspender osady w 250 μl Roztworu 1 (bufor do resuspensji) poprzez pipetowanie w górę i w dół.</li>
 <li>Zlizować bakterie poprzez dodanie 250 μl Roztworu 2 (bufor do lizy). Płytkę szczelnie zamknąć i odwrócić, aby umożliwić całkowite wymieszanie.</li>
 <li>Uruchomić czasomierz na 2 min.</li>
 <li>Dodać 350 μl Roztworu 3 (bufor neutralizujący). Szczelnie zamknąć płytkę i odwrócić 3 razy.</li>
 <li>Przenieść lizaty bakteryjne na płytki filtracyjne do plazmidów.</li>
 <li>Zastosować próżnię przez 5 min.</li>
 <li>Zdjąć płytkę filtracyjną i umieścić płytkę do wiązania na górze kolektora. Zastosować próżnię przez 1 min.</li>
 <li>Dodać 500 μl dodatkowego buforu do płukania (AW).</li>
 <li>Zastosować próżnię przez 2 min.</li>
 <li>Dodać 900 μl buforu do płukania Roztwór 4. Zastosować próżnię przez 2 min.</li>
 <li>Powtórzyć krok 2.14. Zastosować próżnię przez dodatkowe 15 min.</li>
 <li>Umieścić płytkę do zbierania DNA wewnątrz kolektora. Dodać 100 μl buforu do eluowania na płytkę do wiązania i inkubować przez 2 min.</li>
 <li>Zastosować próżnię przez 10 min.</li>
 <li>Wyjąć płytkę do zbierania i zmierzyć stężenie DNA za pomocą Nanodrop 8000. Typowo przy tej metodzie można oczekiwać wydajności ~100 ng/μl.</li>
</ol>
3. Wysiew komórek
<ol>
 <li>Komórki HEK293 poddaje się trypsynizacji i zliczeniu.</li>
 <li>Do każdej studzienki płytki PerkinElmer Viewplate nanosi się 2 x 104 komórek za pomocą dozownika wielokanałowego ThermoFisher 96-well multidrop.</li>
 <li>Komórki inkubuje się przez noc w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.</li>
</ol>
4. Transfekcja
<ol>
 <li>W okrągłodennym płytce 96-dołkowej przygotować w każdym dołku mieszaninę 100 ng plazmidowego DNA GFP-Grb2 i 100 ng cDNA w 25 μl pożywki bezsurowiczej.</li>
 <li>Do każdego dołka dodać 25 μl pożywki bezsurowiczej zawierającej 0,5 μl Transfectin.</li>
 <li>Wymieszać i uruchomić stoper na 30 min.</li>
 <li>Przenieść 50 μl mieszaniny cDNA/Transfectin do komórek, stosując delikatną metodę dozowania. Alternatywnie mieszaninę do transfekcji można dozować najpierw do płytek, a następnie dodać na nią komórki (transfekcja odwrócona).</li>
 <li>Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
</ol>
5. Pozyskiwanie obrazów
<ol>
 <li>Uruchom oprogramowanie Opera. Zrzut ekranu konfiguracji eksperymentu przedstawiono na Rysunku 3. Wybierz kartę „Configuration” i wybierz obiektyw 20x oraz odpowiedni typ płytki. Upewnij się, że wartość „collar” na obiektywie jest ustawiona prawidłowo, aby umożliwić ostrzenie przy różnych typach płytek.</li>
 <li>Wybierz kartę „Microscope”. Zdefiniuj ekspozycję 1 jako FITC (laser 488) i ekspozycję 2 jako UV (laser 365). Aktywuj filtr UV dla obu ekspozycji i przypisz ekspozycję 1 do kamery 1 oraz ekspozycję 2 do kamery 2. Ustaw czasy ekspozycji na 800 msec dla ekspozycji 1 i 40 msec dla ekspozycji 2.</li>
 <li>Wybierz kartę „Microscope”. Zdefiniuj ekspozycję 1 jako FITC (laser 488) i ekspozycję 2 jako UV (laser 365). Aktywuj filtr UV dla obu ekspozycji i przypisz ekspozycję 1 do kamery 1 oraz ekspozycję 2 do kamery 2. Ustaw czasy ekspozycji na 800 msec dla ekspozycji 1 i 40 msec dla ekspozycji 2.</li>
 <li>Wybierz ekspozycję 1. Ustaw wysokość ostrzenia na 0 μm. Wybierz „Focus”. Po ustawieniu ostrości wykonaj zdjęcie kamerą 1. Dostosuj wysokość ostrzenia, aby zoptymalizować płaszczyznę ekspozycji, i kliknij „Take height”. Zmień czasy ekspozycji i moc lasera tak, aby maksymalna intensywność pikseli wynosiła ~3,000. Zapisz parametry ekspozycji. Powtórz czynność dla ekspozycji 2.</li>
 <li>Wybierz kartę „Experiment Definition”. Utwórz układ (layout) i podukład (sublayout). Przeciągnij i upuść odpowiedni układ, ekspozycję, obraz referencyjny, plik skewcrop oraz podukład. Zapisz eksperyment.</li>
 <li>Wybierz kartę „Automatic Experiment” i wykonaj akwizycję obrazów.</li>
</ol>
6. Analiza obrazu (Na podstawie wersji ImageJ 1.46h).
<ol>
 <li>Konwertuj zastrzeżone pliki .flex firmy PerkinElmer do formatu Tagged Image Format .tif za pomocą skryptu Flex2Volocity Acapella.</li>
 <li>
 <ol>
 <li>Zaimportuj obrazy do programu ImageJ jako sekwencję obrazów, tworząc stos (stack).</li>
 <li>Konwertuj stos na hiperstos (hyperstack) dwukanałowy, wybierając pozycję menu Image/Hyperstack/Stack to Hyperstack. Liczbę warstw (slices) należy ustawić na połowę zaimportowanego stosu.</li>
 <li>Zduplikuj kanał GFP za pomocą polecenia Image/Duplicate: zaznacz pole Duplicate hyperstack i określ Channels: 1-1. W dalszej części procedury używaj zduplikowanego stosu.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Wybierz Process/Enhance Contrast z ustawieniem 0,01% nasyconych pikseli, korzystając z histogramu stosu, a następnie konwertuj do 8 bitów za pomocą Image/Type/8-bit.</li>
 <li>Zdefiniuj lokalną segmentację adaptacyjną o promieniu 15 pikseli, stosując algorytm Bernsena z progiem kontrastu (Parameter 1) q = 30. W menu Image/Adjust/Auto Local Threshold zaznacz pole White objects on black background.</li>
 <li>Kontrola jakości segmentacji: wygeneruj nakładkę konturów segmentowanych obiektów na oryginalnych obrazach.</li>
 <li>Ekstrakcja cech poprzez analizę cząstek (analyse particles): pomiar powierzchni oraz średniej i całkowitej intensywności każdej organelli. Zapisz pliki z wynikami.</li>
 <li>Otwórz plik z wynikami cech w programie R i wygeneruj histogram.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
W warunkach normalnych Grb2 jest zlokalizowany w całej komórce. Po stymulacji receptora czynnika wzrostu translokuje się on do błony plazmatycznej, a następnie zostaje zinternalizowany do endosomów, co przedstawiono na Rysunku 4. Ekspresja receptora powierzchniowego komórki zdolnego do wiązania Grb2 jest wystarczająca, aby wywołać tę translokację. W typowym eksperymencie przesiewowym nie obserwuje się zmian w lokalizacji GFP-Grb2. Jednakże, gdy wyeksponowane zostanie białko rekrutujące Grb2 do konkretnego miejsca wewnątrzkomórkowego, następuje zmiana lokalizacji, którą można łatwo zwizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Na przykład ekspresja EGFR prowadzi do relokalizacji GFP-Grb2 do struktur przypominających endosomy (Rysunek 4). Zatem przy zastosowaniu biblioteki obejmującej cały genom można oczekiwać zidentyfikowania nowych białek powierzchniowych komórki wiążących Grb2.
Metoda ta nie ogranicza się jedynie do detekcji białek powierzchniowych komórki. Na przykład Dynamina2 indukuje zmianę lokalizacji subkomórkowej GFP-Grb2, wykazując rekrutację przypominającą endosomy (Rysunek 5). Dynamina2 wiąże się z domeną SH3 na C-końcu białka Grb2 i bierze udział w endocytozie tego kompleksu9,10. Zatem podejście to umożliwia identyfikację ogólnych kompleksów wiążących białka i nie ogranicza się tylko do identyfikacji partnerów interakcji dla domeny SH2.
Można spodziewać się kilku różnych typów translokacji, takich jak lokalizacja w błonie komórkowej, w endosomach, w innych pęcherzykowych strukturach cytoplazmatycznych lub w jądrze komórkowym. Dlatego zaleca się, aby wszystkie obrazy zostały również poddane ocenie wizualnej. Jednakże, podczas przesiewania dużych zbiorów cDNA, bardziej praktyczny jest zautomatyzowany algorytm analizy obrazu. W takim przypadku pożądane jest zastosowanie kombinacji algorytmów, takich jak detekcja punktowa w celu identyfikacji endosomów, detekcja cytoplazmy/jądra w celu identyfikacji transportu jądrowego oraz ogólne algorytmy morfologiczne do identyfikacji zmian w kształcie komórek. Zastosowanie tych różnych metod detekcji fenotypowej zostało omówione bardziej szczegółowo w innym opracowaniu11.
<img alt="Schemat procesu amplifikacji biblioteki cDNA; użyty sprzęt: Tecan Freedom Evo, ImageJ, R." src="/files/ftp_upload/4382/4382fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Ogólny schemat eksperymentu. Eksperyment przedstawia kompletny przebieg przesiewania wysokoprzepustowego (high-content screening), rozpoczynający się od amplifikacji i przygotowania biblioteki cDNA, transfekcji wektorów cDNA wraz z konstruktami raportującymi, akwizycji obrazów oraz analizy obrazów przy użyciu bezpłatnego oprogramowania open-source IMAGEJ.
<img alt="Schemat przepływu pracy laboratoryjnej w interfejsie oprogramowania do przygotowania próbek; zawiera ikony procesu krok po kroku." src="/files/ftp_upload/4382/4382fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Konfiguracja platformy Tecan. (1) Po lewej stronie należy napełnić pięć koryt o pojemności 100 ml buforami 1 (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) oraz A4 (100 ml). Koryt A4 trzeba będzie uzupełnić raz w trakcie procedury. (2) Kolektor próżniowy znajduje się w tym przykładzie na pozycji 14. (3) Płytka deepwell z osadami bakteryjnymi znajduje się na pozycji 30, obok koryta z 25 ml buforu elucyjnego. (4) Jednorazowe końcówki do głowicy 8-kanałowej należy załadować do statywów z końcówkami po lewej stronie, a końcówki do głowicy wielokanałowej należy umieścić na pozycji 40. Automatyczny system dozujący Tecan FreedomEvo wykorzystany w tym doświadczeniu jest wyposażony w strzykawki 500 μl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig2large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<img alt="Interfejs oprogramowania do mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający konfigurację akwizycji i analizy danych, w tym panele sterowania." src="/files/ftp_upload/4382/4382fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Automatyzacja akwizycji obrazów w systemie Opera LX. A) Wybierz kartę Configuration (1). Aktywuj linie laserowe wymagane do eksperymentu (2). Wybierz kamery do akwizycji obrazów (3). Wybierz typ płytki i obiektyw do eksperymentu (4). B) Wybierz kartę Microscope (1). Zdefiniuj źródło światła i czas ekspozycji dla ekspozycji 1 (2,3). Ustaw ostrość na jednej studzience i zmierz wysokość (4). C) Wybierz kartę Experiment Definition (1). Przeciągnij i upuść pliki ekspozycji, skewcrop, referencyjne, układu (layout) oraz podukładu (sublayout) (2). Przeciągnij i upuść plik eksperymentu (3). D) Wybierz Automatic Experiment (1). Przeciągnij i upuść plik eksperymentu (2). Przypisz odpowiedni kod kreskowy (3). Rozpocznij akwizycję obrazów, klikając przycisk start (4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig3large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
<img alt="Ekspresja cDNA w komórkach, schemat endocytozy, oddziaływanie Grb2-GFP, wyniki mikroskopowe." src="/files/ftp_upload/4382/4382fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Translokacja GFP-Grb2 indukowana ekspresją cDNA. Po nadekspresji transbłonowego receptora czynnika wzrostu GFP-Grb2 przemieszcza się z przeważającej lokalizacji cytoplazmatycznej do struktur przypominających endosomy, a następnie ulega internalizacji do endosomów. Po lewej przedstawiono obrazy mikroskopowe komórek COS M6, które zostały przejściowo przetransfekowane GFP-Grb2 (góra) lub GFP-Grb2 wraz z EGFR (dół). Współekspresja EGFR skutkuje relokacją GFP-Grb2 do struktur przypominających endosomy.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna ukazująca markery komórkowe; kanały zielony i niebieski; analiza komórkowa." src="/files/ftp_upload/4382/4382fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Przykład translokacji GFP-Grb2 indukowanej przez cDNA. GTPaza Dynamina 2, uczestnicząca w endocytozie pośredniczonej przez Grb2, relokalizuje GFP-Grb2 do struktur przypominających endosomy (zakreślone kółkiem). W tym eksperymencie GFP-Grb2 został współtransfekowany z DNM2 do komórek HEK293T. Komórki barwiono Hoechst 33342 po 24 hr, a obrazy pozyskano za pomocą Opera LX. Przedstawiono jedno pole widzenia kanału zielonego (GFP) oraz UV (niebieskiego; Hoechst 33342).

<ol><li>Sastry, L., Cao, T., King, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Grb2-protein+complexes+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiple Grb2-protein complexes in human cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 70, 208-213 (1997).</li>
<li>Li, S., Couvillon, A. D., Brasher, B. B., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+of+Grb2+by+Bcr%2FAbl+and+epidermal+growth+factor+receptor%3A+a+novel+regulatory+mechanism+for+tyrosine+kinase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation of Grb2 by Bcr/Abl and epidermal growth factor receptor: a novel regulatory mechanism for tyrosine kinase signaling.</a> Embo. J. 20, 6793-6804 (2001).</li>
<li>Bisson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+reaction+monitoring+mass+spectrometry+reveals+the+dynamics+of+signaling+through+the+GRB2+adaptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Selected reaction monitoring mass spectrometry reveals the dynamics of signaling through the GRB2 adaptor.</a> Nat. Biotechnol. 29, 653-658 (2011).</li>
<li>Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Feynman+trajectories%3A+determining+the+path+of+a+protein+using+fixed-endpoint+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">The Feynman trajectories: determining the path of a protein using fixed-endpoint assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 321-326 (2010).</li>
<li>Yamazaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Grb2+in+EGF-stimulated+EGFR+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization.</a> J. Cell. Sci. 115, 1791-1802 (2002).</li>
<li>Antczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain-Based+Biosensor+Assay+to+Screen+for+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+Modulators%5BTitle%5D)+AND+%22in+Live+Cells.+ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Domain-Based Biosensor Assay to Screen for Epidermal Growth Factor Receptor Modulators.</a> in Live Cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 10, 24-36 (2012).</li>
<li>Su, J., Batzer, A., Sap, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+tyrosine+phosphatase+R-PTP-alpha+is+tyrosine-phosphorylated+and+associated+with+the+adaptor+protein+Grb2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Receptor tyrosine phosphatase R-PTP-alpha is tyrosine-phosphorylated and associated with the adaptor protein Grb2.</a> J. Biol. Chem. 269, 18731-18734 (1994).</li>
<li>Hertog, J. den, Tracy, S., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+receptor+protein-tyrosine+phosphatase+alpha+on+Tyr789%2C+a+binding+site+for+the+SH3-SH2-SH3+adaptor+protein+GRB-2+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of receptor protein-tyrosine phosphatase alpha on Tyr789, a binding site for the SH3-SH2-SH3 adaptor protein GRB-2 in vivo.</a> Embo. J. 13, 3020-3032 (1994).</li>
<li>Miki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Ash%2FGrb-2+with+dynamin+through+the+Src+homology+3+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Association of Ash/Grb-2 with dynamin through the Src homology 3 domain.</a> J. Biol. Chem. 269, 5489-5492 (1994).</li>
<li>Seedorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+binds+to+SH3+domains+of+phospholipase+C+gamma+and+GRB-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamin binds to SH3 domains of phospholipase C gamma and GRB-2.</a> J. Biol. Chem. 269, 16009-16014 (1994).</li>
<li>Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100(2006).</li>
<li>Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+expression+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Developments in expression cloning.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 567-573 (1995).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Klonowanie ekspresyjne jest potężnym narzędziem, które w przeszłości służyło do identyfikacji nowych komponentów komórkowych, takich jak receptory wirusowe i antygeny krwinek12. W niniejszej pracy opisujemy metodę ułatwiającą identyfikację nowych, domniemanych receptorów transdukcji sygnału, które wiążą się z Grb2.
 W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków.
 <ol>
 <li>W przypadku zautomatyzowanej preparatyki plazmidów absolutnie niezbędne jest całkowite resuspensowanie osadu bakteryjnego. Czasami konieczne jest wprowadzenie etapu intensywnego wstrząsania lub dodatkowego mieszania za pomocą pipet.</li>
 <li>Po dodaniu roztworów 2 i 3 niezbędne jest całkowite wymieszanie; stwierdzono, że ręczne odwracanie zamkniętej płytki jest bardziej efektywne niż użycie automatycznego wytrząsarki. Na tym etapie należy unikać pipetowania, ponieważ mogłoby to doprowadzić do fragmentacji DNA.</li>
 <li>W każdym kroku z zastosowaniem próżni należy upewnić się, że ciecz została całkowicie odprowadzona z płytki. W przeciwnym razie należy spodziewać się niskich wydajności.</li>
 <li>Podczas elucji często zdarza się, że na dnie płytki do wiązania plazmidów tworzą się krople eluatu. Krople te muszą zostać zebrane do płytki elucyjnej, dlatego zaleca się ostrożne podniesienie płytki do wiązania plazmidów i uważne przeniesienie wszelkich pozostałych kropel z dna do płytki z eluatem.</li>
 <li>Podczas transfekcji krytyczny jest czas tworzenia kompleksów. Zazwyczaj stosujemy czas 20-30 min. Dłuższe czasy, do 1 hr, są dopuszczalne bez zmniejszenia wydajności, natomiast nie zaleca się stosowania krótszych czasów.</li>
 <li>W przypadku mikroskopii ważny jest wybór powiększenia. W systemie Opera LX użytym w tej procedurze rozdzielczość przy 20x jest wystarczająca do uzyskania wysokiej jakości obrazów. Jeśli wymagane są obrazy o wyższej rozdzielczości, można zmienić obiektyw, jednak w celu uzyskania statystycznie istotnej liczby komórek wymagana jest większa liczba pól widzenia oraz dłuższy czas akwizycji. Generalnie dążymy do obrazowania co najmniej 100 komórek na studzienkę.</li>
 </ol>
 Test translokacji Grb2 był wykorzystywany przez inne grupy badawcze do identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów aktywacji kinazy EGFR6. W tym przypadku EGFR jest specyficznie aktywowany ligandem, co powoduje rekrutację Grb2 do błony plazmatycznej. Następnie można badać zaburzenie tej interakcji przy użyciu związków małocząsteczkowych. Podobnie można założyć, że przesiewy siRNA mogą zostać zastosowane do identyfikacji genów endogennych zaangażowanych w sygnalizację EGFR-Grb2 lub innych receptorów czynników wzrostu wiążących Grb2, takich jak c-KIT lub receptor erytropoetyny. Zatem technika ta ma wiele potencjalnych zastosowań. Analogiczne podejście można zastosować do systemów reporterowych z GFP dla innych cząsteczek adapterowych, takich jak Shc, Gab lub IRS.
 Główną zaletą zastosowania tego testu opartego na komórkach ssaczych jest możliwość identyfikacji oddziaływań istotnych fizjologicznie. Test ten służy do wykrywania tworzenia kompleksów białkowych, ale co ważniejsze, odpowiednie oddziaływania są monitorowane w prawidłowym miejscu wewnątrzkomórkowym. W tym względzie technika ta eliminuje artefakty występujące w innych metodach badania oddziaływań białko-białko, takich jak system dwuhybrydowy drożdżowy czy testy in vitro. Należy jednak zauważyć, że do rekrutacji Grb2 mogą prowadzić również oddziaływania pośrednie. Podobnie, ekspresja cDNA może indukować transkrypcyjną upregulację partnerów wiążących. Aby rozróżnić te możliwości, konieczne jest przeprowadzenie odpowiednich testów wtórnych w celu odróżnienia bezpośrednich od pośrednich efektów wiązania.
 Podsumowując, test translokacji cząsteczki adaptera GFP wykazuje wysoki potencjał w zastosowaniach związanych z przesiewaniem całego genomu oraz poszukiwaniem nowych leków.

<table><tbody><tr><td>biblioteka cDNA</td><td>Origene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB+amp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uszczelki przepuszczalne dla gazów</td><td>ThermoScientific</td><td>AB-0718</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Nucleospin 96 Plasmid Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740625.4</td><td></td></tr><tr><td>Transfectin</td><td>BioRad</td><td>170-3351</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst33342</td><td>Molecular Probes</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Płytka Viewplate 96 F TC</td><td>PerkinElmer</td><td>6005182</td><td></td></tr><tr><td>RapidPick</td><td>Hudson</td><td></td><td>Norgren CP7200</td></tr><tr><td>Freedom Evo</td><td>Tecan</td><td></td><td>Z kolektorem próżniowym</td></tr><tr><td>Multidrop 384</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opera LX</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przepływ pracy obrazowania wysokotreściowego do badania kompleksów sygnalizacyjnych grb2 za pomocą klonowania ekspresyjnego

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Przekazywanie sygnałów przez receptory czynników wzrostu jest niezbędne do utrzymania proliferacji i różnicowania komórek i wymaga ścisłej kontroli. Przekazywanie sygnałów jest inicjowane przez wiązanie zewnętrznego liganda do receptora transbłonowego i aktywację kaskad sygnałowych downstream. Kluczowym regulatorem sygnalizacji mitogennej jest Grb2, białko modularne składające się z wewnętrznej domeny SH2 (Src Homology 2) flankowanej przez dwie domeny SH3, które nie wykazuje aktywności enzymatycznej. Grb2 jest konstytutywnie związany z GTPazą Son-Of-Sevenless (SOS) poprzez swoją N-terminalną domenę SH3. Domena SH2 białka Grb2 wiąże się z receptorami czynników wzrostu w miejscach fosforylowanych reszt tyrozyny, łącząc w ten sposób aktywację receptora z kaskadą sygnalizacyjną SOS-Ras-MAP kinaza. Ponadto opisano inne role Grb2 jako pozytywnego lub negatywnego regulatora sygnalizacji i endocytozy receptorów. Modularna budowa Grb2 sugeruje, że może on dokować do wielu różnych receptorów i przekazywać sygnały za pomocą licznych, odmiennych szlaków1-3.
	Opisano tutaj prosty test mikroskopowy monitorujący rekrutację białka Grb2 do błony komórkowej. Został on zaadaptowany z testu mierzącego zmiany w subkomórkowej lokalizacji Grb2 znakowanego zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w odpowiedzi na bodziec4-6. Receptory błony komórkowej wiążące Grb2, takie jak aktywowany receptor Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR), rekrutują GFP-Grb2 do błony komórkowej po ekspresji cDNA, a następnie relokalizują go do przedziałów endosomalnych w komórce. W celu identyfikacji kompleksów białkowych Grb2 in vivo, technikę tę można wykorzystać do przeprowadzenia genomowego wysokoprzepustowego przesiewu (high-content screen) opartego na zmianach w subkomórkowej lokalizacji Grb2. Przygotowanie klonów ekspresyjnych cDNA, transfekcja oraz akwizycja obrazów zostały szczegółowo opisane poniżej. W porównaniu z innymi metodami genomicznymi stosowanymi do identyfikacji partnerów interakcji białkowych, takimi jak system dwuhybrydowy w drożdżach, technika ta pozwala na wizualizację kompleksów białkowych w komórkach ssaków w subkomórkowym miejscu interakcji za pomocą prostego testu mikroskopowego. Dzięki temu można ocenić zarówno cechy jakościowe, takie jak wzorce lokalizacji, jak i ilościową siłę oddziaływania.

Opisano metodę wysokoprzepustowego screeningu służącą do identyfikacji nowych kompetentnych sygnałowo receptorów błonowych. Metoda ta nadaje się do automatyzacji na dużą skalę i pozwala na przewidywanie wiązania białek in vivo oraz subkomórkowej lokalizacji kompleksów białkowych w komórkach ssaków.

Przepływ pracy obrazowania wysokotreściowego do badania kompleksów sygnalizacyjnych Grb2 za pomocą klonowania ekspresyjnego

Przekaźnictwo sygnałowe za pośrednictwem receptorów czynników wzrostu jest niezbędne dla utrzymania proliferacji i różnicowania komórek i wymaga ścisłej kontroli. Sygnał...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest identyfikacja partnerów interakcji dla białka grab two za pomocą klonowania ekspresyjnego cDNA oraz obserwacji zmian w białku Grab two znakowanym zielonym białkiem fluorescencyjnym. Osiąga się to poprzez przygotowanie biblioteki cDNA z lizatów bakteryjnych w drugim kroku. cDNA są transfekowane do ludzkich komórek embrionalnej nerki, co skutkuje ekspresją konstruktu reporterowego wraz z genami zainteresowania.Następnie płytki z transfekcją analizuje się pod mikroskopem Opera w celu wizualizacji zmian w lokalizacji Grb2 w komórkach; wyniki wykazują rekrutację Grb2 znakowanego GFP do endosomów zapśredniczoną przez receptor epidermalnego czynnika wzrostu, co stwierdzono na podstawie mikroskopii fluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak system dwuhybrydowy, jest możliwość identyfikacji partnerów interakcji białka Grb2 w warunkach fizjologicznych, z uwzględnieniem ich rozmieszczenia wewnątrzkomórkowego.Choć metoda ta może być wykorzystana do identyfikacji transdukcji sygnału przez Grab two, można ją również zastosować w innych układach, na przykład w odniesieniu do innych białek docelowych. Biblioteka cDNA jest dostarczana w postaci pojedynczych klonów bakteryjnych w zapasach glicerynowych.W formacie 96-dołkowym, korzystając z polecenia re ray w menu urządzenia picker systemu Hudson Rapid pick light, należy wyłowić klony bakteryjne z płytki źródłowej i zaszczepić je do 1,5 ml pożywki LB amp w 96-dołkowej płytce głębokiej. Następnie płytki głębokie należy zamknąć szczelnie za pomocą membrany przepuszczającej gazy i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem. Następnego dnia płytki głębokie zawierające bakterie należy wirować z prędkością 2000 RPM przez 20 minut.Używając adapterów do płytek w wirówce stołowej, odessaj medium z dołków, pozostawiając nienaruszone osady bakteryjne. Następnie skonfiguruj platformę roboczą stacji automatyzacji Tecan Freedom Evo, jak pokazano tutaj. Rozdziel roztwory do preparatyki plazmidów do koryt od jeden do pięciu i umieść na platformie płytkę głębokodołkową.Umieścić korytko wielodołkowe z roztworem alucian obok płytki głębokodołkowej i załadować końcówki do statywów. Złożyć kolektor próżniowy. Płytkę do wiązania plazmidów umieszcza się wewnątrz kolektora, a płytkę filtrującą do plazmidów nakłada się na górę kolektora. Resuspendować osady w 250 µL roztworu jeden.Bufor do resuspensji Resus należy wymieszać, pipetując go w górę i w dół. Całkowita resuspensja osadów jest kluczowa dla powodzenia tej procedury. Jeśli pipetowanie w górę i w dół nie doprowadzi do pełnej resuspensji osadu, można zastosować shaker.Po całkowitym resuspensowaniu osadów należy poddać bakterie lizie, dodając 250 µL buforu do lizy. Uszczelnij płytkę i odwróć ją, aby zapewnić całkowite wymieszanie. Ustaw czasomierz na dwie minuty.Następnie dodaj 350 µL roztworu trzy, czyli buforu neutralizującego. Zamknij płytkę i odwróć ją trzy razy.Przenieś lizaty bakteryjne do płytek z filtrami do plazmidów. Zastosuj podciśnienie przez pięć minut. Wyjmij płytkę z filtrami i umieść płytkę do wiązania na kolektorze próżniowym.Stosuj próżnię przez jedną minutę. Dodaj 500 µL dodatkowego buforu do płukania i stosuj próżnię przez dwie minuty. Dodaj 900 µL roztworu buforu do płukania 4 i stosuj próżnię przez dwie minuty.Następnie ponownie dodaj 900 µL roztworu buforu płuczącego cztery i zastosuj próżnię przez 15 minut. Umieść płytkę do zbierania DNA w manifoldzie. Dodaj 100 µL buforu Elucian do płytki wiążącej i inkubuj przez dwie minuty.Stosuj próżnię przez 10 minut. Na koniec wyjmij płytkę zbierającą i zmierz stężenie DNA za pomocą NanoDrop 8, 000. W tej metodzie, aby rozpocząć procedurę, można zazwyczaj oczekiwać wydajności na poziomie około 100 ng/µL.Po trypsynizacji i przeliczeniu komórek hec 2 9 3, należy użyć automatycznego dozownika, aby nanieść 2 × 10⁴ komórek do każdej studzienki płytki Perkin Elmer View. Komórki należy inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide przed transfekcją.Użyj zautomatyzowanego systemu do dozowania cieczy, aby w każdym dołku okrągłodنnej płytki 96-dołkowej przygotować następującą mieszaninę: 100 ng GFP. Pobierz dwa plazmidy DNA z 100 ng CD NA w 25 µL medium bezsurowiczego. Następnie dodaj 25 µL medium bezsurowiczego zawierającego 0,5 µL transfectina na dołek, wymieszaj i uruchom timer na 30 minut.Po 30 minutach przenieś 50 µL mieszaniny do transfekcji cDNA do komórek, stosując metodę delikatnego dozowania. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 °C i w atmosferze 5% CO2.Aby rozpocząć akwizycję obrazu, uruchom oprogramowanie Opera. Wybierz kartę konfiguracji, a następnie wybierz obiektyw 20x oraz odpowiedni typ płytki. Upewnij się, że pierścień korekcyjny obiektywu jest ustawiony na właściwą wartość, aby umożliwić ostrzenie przy różnych typach płytek.Następnie wybierz zakładkę mikroskopu. Zdefiniuj ekspozycję pierwszą jako laser fite 4 88, a ekspozycję drugą jako laser UV 365. Aktywuj filtr UV dla obu ekspozycji i przypisz ekspozycję.Pierwszy kanał do kamery pierwszej i ekspozycji. Drugi kanał do kamery drugiej. Ustaw czasy ekspozycji na 800 ms dla ekspozycji 1 oraz 40 ms dla ekspozycji 2.Następnie wybrać ekspozycję, a następnie ustawić wysokość ostrości na zero mikronów. Po uzyskaniu ostrości wybrać funkcję focus. Wykonać ekspozycję kamery pierwszej.Dostosuj wysokość ogniskowej, aby zoptymalizować płaszczyznę ekspozycji, a następnie kliknij przycisk pobrania wysokości. Zapisz parametry ekspozycji i powtórz czynność dla ekspozycji dwa. Wybierz kartę definicji eksperymentu, a następnie utwórz układ oraz układ pomocniczy.Przeciągnij i upuść odpowiedni układ, ekspozycję, obraz referencyjny, plik skosu, plik przycinania oraz podukład. Zapisz eksperyment. Wybierz kartę automatycznego eksperymentu i wykonaj akwizycję obrazów w warunkach normalnych.Grab two jest zlokalizowany w całej komórce. Po stymulacji receptora czynnika wzrostu przemieszcza się on do błony plazmatycznej, a następnie jest internalizowany do endosomów. Na powyższej rycinie górny panel przedstawia komórki CO M six, które zostały przejściowo przetransfekowane GFP grab two; zgodnie z oczekiwaniami fluorescencja jest rozłożona w całej komórce.Jednak w komórkach przejściowo przetransfekowanych GFP-Grb2 oraz receptorem powierzchniowym EGFR, Grb2 relokuje się do struktur przypominających endosomy, co pokazano na dolnym panelu. Zatem przy zastosowaniu biblioteki obejmującej cały genom można spodziewać się zidentyfikowania nowych białek powierzchniowych komórki wiążących Grb2. Metoda ta nie ogranicza się wyłącznie do wykrywania białek powierzchniowych komórek.Na przykład GTPaza DYNAMIN 2, która bierze udział w endocytozie pośredniczonej przez Grb2, indukuje translokację Grb2. W tym eksperymencie GFP-Grb2 został współtransfekowany z DNM2 do komórek HEK 293 T. Relokacja GFP-Grb2 do struktur przypominających endosomy została zilustrowana w komórkach objętych czerwonymi okręgami.Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak immunoprecypitacja lub testy biochemiczne, aby odpowiedzieć na dalsze pytania, na przykład czy interakcja jest bezpośrednia czy pośrednia. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat wykorzystania klonowania ekspresyjnego w celu identyfikacji wewnątrzkomórkowych interakcji białkowych.

a-high-content-imaging-workflow-to-study-grb2-signaling-complexes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przepływ pracy z wysoką zawartością obrazów w celu badania kompleksów sygnałowych Grb2 przez klonowanie ekspresji

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Niniejszy artykuł opisuje metodologię wyznaczania odpowiedzi chemotaktycznej leukocytów na specyficzne ligandy oraz identyfikacji oddziaływań między receptorami powierzchniowymi komórek a białkami cytozolowymi przy użyciu technik obrazowania żywych komórek.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym migracji komórek zapośredniczonej przez leukotrien B4 oraz oddziaływań BLT1 z β-arrestyną

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Opisujemy metodę obrazowania żywych komórek, która dostarcza wglądu w dynamikę białek podczas procesu aktywacji limfocytów T. Demonstrujemy połączone zastosowanie testu rozprzestrzeniania się komórek T, mikroskopii konfokalnej i analizy obrazowania w celu uzyskania wyników ilościowych w celu śledzenia tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego podczas aktywacji komórek T.

Obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego limfocytów T

Kodujemy genetycznie nienaturalny aminokwas, p-azydo-L-fenyloalaninę w różnych docelowych miejscach w GPCR i pokazujemy wszechstronność grupy azydologicznej w różnych zastosowaniach. Obejmują one ukierunkowaną technologię fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR oraz specyficzną dla miejsca bioortogonalną modyfikację GPCR za pomocą znacznika peptydowo-epitopowego lub sondy fluorescencyjnej.

Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Presented to elastyczny przepływ pracy w informatyce, umożliwiający multipleksowaną analizę obrazów fluorescencyjnie znakowanych komórek. Przepływ pracy określa ilościowo markery jądrowe i cytoplazmatyczne oraz oblicza translokację markerów między tymi przedziałami. Przedstawiono procedury perturbacji komórek z wykorzystaniem siRNA oraz wiarygodną metodologię wykrywania markerów za pomocą immunofluorescencji pośredniej w formatach 96-dołkowych.

Przepływ pracy dla wysokiej zawartości, indywidualnej kwantyfikacji komórek markerów fluorescencyjnych na podstawie danych z mikroskopu uniwersalnego, wspierany przez oprogramowanie Open Source

Celem obecnego protokołu było opracowanie metody, która pozwoli na funkcjonalne analizy genomiczne wydzielania komórek tucznych. Protokół opiera się na ilościowej ocenie uwalniania fluorescencyjnego genu reporterowego skotransfekowanego z genem będącym przedmiotem zainteresowania oraz analizach morfologii granulki wydzielniczej w czasie rzeczywistym.

badanie granulek wydzielniczych komórek tucznych; od biosyntezy do egzocytozy

Interakcje białko-białko są wizualizowane w komórkach z nanometrową rozdzielczością przestrzenną poprzez połączenie dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) z fotoaktywowaną mikroskopią lokalizacyjną (PALM). Opisano tutaj zastosowanie BiFC-PALM do obrazowania oddziaływań Ras-Raf w komórkach U2OS do wizualizacji klastrowania i dyfuzji w nanoskali poszczególnych kompleksów Ras-Raf.

Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM)

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania komórek wyrażających receptory angiotensyny typu 1a znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym podczas endocytozy zainicjowanej przez leczenie angiotensyną II. Technika ta obejmuje znakowanie lizosomów drugim markerem fluorescencyjnym, a następnie wykorzystanie oprogramowania do analizy kolokalizacji receptora i lizosomu w trzech wymiarach w czasie.

Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Poznaj metodę mikroskopii wysokiej zawartości do identyfikacji partnerów interakcyjnych Grb2 w komórkach ssaczych przy użyciu klonowania ekspresji cDNA. Technika umożliwia wizualizację lokalizacji podkomórkowej białek.

Przepływ pracy obrazowania wysokotreściowego do badania kompleksów sygnalizacyjnych Grb2 za pomocą klonowania ekspresyjnego

Przeglądaj więcej filmów