Przepływ pracy obrazowania wysokotreściowego do badania kompleksów sygnalizacyjnych Grb2 za pomocą klonowania ekspresyjnego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest identyfikacja partnerów interakcji dla białka grab two za pomocą klonowania ekspresyjnego cDNA oraz obserwacji zmian w białku Grab two znakowanym zielonym białkiem fluorescencyjnym. Osiąga się to poprzez przygotowanie biblioteki cDNA z lizatów bakteryjnych w drugim kroku. cDNA są transfekowane do ludzkich komórek embrionalnej nerki, co skutkuje ekspresją konstruktu reporterowego wraz z genami zainteresowania.

Następnie płytki z transfekcją analizuje się pod mikroskopem Opera w celu wizualizacji zmian w lokalizacji Grb2 w komórkach; wyniki wykazują rekrutację Grb2 znakowanego GFP do endosomów zapśredniczoną przez receptor epidermalnego czynnika wzrostu, co stwierdzono na podstawie mikroskopii fluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak system dwuhybrydowy, jest możliwość identyfikacji partnerów interakcji białka Grb2 w warunkach fizjologicznych, z uwzględnieniem ich rozmieszczenia wewnątrzkomórkowego.

Choć metoda ta może być wykorzystana do identyfikacji transdukcji sygnału przez Grab two, można ją również zastosować w innych układach, na przykład w odniesieniu do innych białek docelowych. Biblioteka cDNA jest dostarczana w postaci pojedynczych klonów bakteryjnych w zapasach glicerynowych.

W formacie 96-dołkowym, korzystając z polecenia re ray w menu urządzenia picker systemu Hudson Rapid pick light, należy wyłowić klony bakteryjne z płytki źródłowej i zaszczepić je do 1,5 ml pożywki LB amp w 96-dołkowej płytce głębokiej. Następnie płytki głębokie należy zamknąć szczelnie za pomocą membrany przepuszczającej gazy i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem. Następnego dnia płytki głębokie zawierające bakterie należy wirować z prędkością 2000 RPM przez 20 minut.

Używając adapterów do płytek w wirówce stołowej, odessaj medium z dołków, pozostawiając nienaruszone osady bakteryjne. Następnie skonfiguruj platformę roboczą stacji automatyzacji Tecan Freedom Evo, jak pokazano tutaj. Rozdziel roztwory do preparatyki plazmidów do koryt od jeden do pięciu i umieść na platformie płytkę głębokodołkową.

Umieścić korytko wielodołkowe z roztworem alucian obok płytki głębokodołkowej i załadować końcówki do statywów. Złożyć kolektor próżniowy. Płytkę do wiązania plazmidów umieszcza się wewnątrz kolektora, a płytkę filtrującą do plazmidów nakłada się na górę kolektora. Resuspendować osady w 250 µL roztworu jeden.

Bufor do resuspensji Resus należy wymieszać, pipetując go w górę i w dół. Całkowita resuspensja osadów jest kluczowa dla powodzenia tej procedury. Jeśli pipetowanie w górę i w dół nie doprowadzi do pełnej resuspensji osadu, można zastosować shaker.

Po całkowitym resuspensowaniu osadów należy poddać bakterie lizie, dodając 250 µL buforu do lizy. Uszczelnij płytkę i odwróć ją, aby zapewnić całkowite wymieszanie. Ustaw czasomierz na dwie minuty.

Następnie dodaj 350 µL roztworu trzy, czyli buforu neutralizującego. Zamknij płytkę i odwróć ją trzy razy.

Przenieś lizaty bakteryjne do płytek z filtrami do plazmidów. Zastosuj podciśnienie przez pięć minut. Wyjmij płytkę z filtrami i umieść płytkę do wiązania na kolektorze próżniowym.

Stosuj próżnię przez jedną minutę. Dodaj 500 µL dodatkowego buforu do płukania i stosuj próżnię przez dwie minuty. Dodaj 900 µL roztworu buforu do płukania 4 i stosuj próżnię przez dwie minuty.

Następnie ponownie dodaj 900 µL roztworu buforu płuczącego cztery i zastosuj próżnię przez 15 minut. Umieść płytkę do zbierania DNA w manifoldzie. Dodaj 100 µL buforu Elucian do płytki wiążącej i inkubuj przez dwie minuty.

Stosuj próżnię przez 10 minut. Na koniec wyjmij płytkę zbierającą i zmierz stężenie DNA za pomocą NanoDrop 8, 000. W tej metodzie, aby rozpocząć procedurę, można zazwyczaj oczekiwać wydajności na poziomie około 100 ng/µL.

Po trypsynizacji i przeliczeniu komórek hec 2 9 3, należy użyć automatycznego dozownika, aby nanieść 2 × 10⁴ komórek do każdej studzienki płytki Perkin Elmer View. Komórki należy inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide przed transfekcją.

Użyj zautomatyzowanego systemu do dozowania cieczy, aby w każdym dołku okrągłodنnej płytki 96-dołkowej przygotować następującą mieszaninę: 100 ng GFP. Pobierz dwa plazmidy DNA z 100 ng CD NA w 25 µL medium bezsurowiczego. Następnie dodaj 25 µL medium bezsurowiczego zawierającego 0,5 µL transfectina na dołek, wymieszaj i uruchom timer na 30 minut.

Po 30 minutach przenieś 50 µL mieszaniny do transfekcji cDNA do komórek, stosując metodę delikatnego dozowania. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 °C i w atmosferze 5% CO2.

Aby rozpocząć akwizycję obrazu, uruchom oprogramowanie Opera. Wybierz kartę konfiguracji, a następnie wybierz obiektyw 20x oraz odpowiedni typ płytki. Upewnij się, że pierścień korekcyjny obiektywu jest ustawiony na właściwą wartość, aby umożliwić ostrzenie przy różnych typach płytek.

Następnie wybierz zakładkę mikroskopu. Zdefiniuj ekspozycję pierwszą jako laser fite 4 88, a ekspozycję drugą jako laser UV 365. Aktywuj filtr UV dla obu ekspozycji i przypisz ekspozycję.

Pierwszy kanał do kamery pierwszej i ekspozycji. Drugi kanał do kamery drugiej. Ustaw czasy ekspozycji na 800 ms dla ekspozycji 1 oraz 40 ms dla ekspozycji 2.

Następnie wybrać ekspozycję, a następnie ustawić wysokość ostrości na zero mikronów. Po uzyskaniu ostrości wybrać funkcję focus. Wykonać ekspozycję kamery pierwszej.

Dostosuj wysokość ogniskowej, aby zoptymalizować płaszczyznę ekspozycji, a następnie kliknij przycisk pobrania wysokości. Zapisz parametry ekspozycji i powtórz czynność dla ekspozycji dwa. Wybierz kartę definicji eksperymentu, a następnie utwórz układ oraz układ pomocniczy.

Przeciągnij i upuść odpowiedni układ, ekspozycję, obraz referencyjny, plik skosu, plik przycinania oraz podukład. Zapisz eksperyment. Wybierz kartę automatycznego eksperymentu i wykonaj akwizycję obrazów w warunkach normalnych.

Grab two jest zlokalizowany w całej komórce. Po stymulacji receptora czynnika wzrostu przemieszcza się on do błony plazmatycznej, a następnie jest internalizowany do endosomów. Na powyższej rycinie górny panel przedstawia komórki CO M six, które zostały przejściowo przetransfekowane GFP grab two; zgodnie z oczekiwaniami fluorescencja jest rozłożona w całej komórce.

Jednak w komórkach przejściowo przetransfekowanych GFP-Grb2 oraz receptorem powierzchniowym EGFR, Grb2 relokuje się do struktur przypominających endosomy, co pokazano na dolnym panelu. Zatem przy zastosowaniu biblioteki obejmującej cały genom można spodziewać się zidentyfikowania nowych białek powierzchniowych komórki wiążących Grb2. Metoda ta nie ogranicza się wyłącznie do wykrywania białek powierzchniowych komórek.

Na przykład GTPaza DYNAMIN 2, która bierze udział w endocytozie pośredniczonej przez Grb2, indukuje translokację Grb2. W tym eksperymencie GFP-Grb2 został współtransfekowany z DNM2 do komórek HEK 293 T. Relokacja GFP-Grb2 do struktur przypominających endosomy została zilustrowana w komórkach objętych czerwonymi okręgami.

Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak immunoprecypitacja lub testy biochemiczne, aby odpowiedzieć na dalsze pytania, na przykład czy interakcja jest bezpośrednia czy pośrednia. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat wykorzystania klonowania ekspresyjnego w celu identyfikacji wewnątrzkomórkowych interakcji białkowych.