Proces obrazowania o wysokiej zawartości do badania kompleksów sygnalizacyjnych Grb2 poprzez klonowanie ekspresji

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest identyfikacja partnerów interakcji chwytu drugiego poprzez klonowanie ekspresji CD NA i obserwację zmian w białku zielonej fluorescencji oznaczonym jako Grab two. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw biblioteki CD NA z lizatów bakteryjnych jako drugiego kroku. CDNA są transfekowane w ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych, co spowoduje ekspresję konstruktu reporterowego wraz z genami będącymi przedmiotem zainteresowania.

Następnie transfekowane płytki są analizowane pod mikroskopem operacyjnym w celu uwidocznienia zmian w lokalizacji chwytania dwóch w komórkach, uzyskuje się wyniki, które pokazują, że rekrutacja GFP za pośrednictwem receptora naskórkowego czynnika wzrostu. Chwyć dwa do endosomów na podstawie mikroskopii fluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak te dwie hybrydy, jest to, że partnerzy interakcji chwytaka drugiego mogą być zidentyfikowani w sytuacji fizjologicznej, która uwzględnia subkomórkowy rozkład partnerów interakcji.

Cóż, ta metoda może być użyta do identyfikacji transdukcji sygnału przez Grab two. Może być również stosowany do innych układów, takich jak inne interesujące białka. Biblioteka CDNA jest dostarczana z pojedynczymi klonami bakteryjnymi w zapasach glicerolu.

W formacie 96 dołków za pomocą polecenia re ray w menu selektora lampy wyboru Hudson Rapid. Wybierz klony bakterii z płytki źródłowej i zaszczep w 1,5 mililitra funta ampera w płytce z 96 głębokimi dołkami. Późno uszczelnij płytki głębinowe uszczelką przepuszczającą gaz i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wytrząsarce Następnego dnia obracaj płytki głębinowe zawierające bakterie A 2000 obr./min przez 20 minut.

Za pomocą adapterów płytkowych w wirówce stołowej odessać pożywkę z dołków, pozostawiając nienaruszony osad bakteryjny. Następnie skonfiguruj pokład stacji roboczej Tecan Freedom Evo Automation, jak pokazano tutaj. Rozprowadź roztwory do przygotowania plazmidu w korytach od jednego do pięciu i umieść płytkę z głęboką studzienką na pokładzie.

Umieść koryto wielodołkowe z roztworem alucjańskim przylegające do końcówek obciążeniowych płytki głębokiej studzienki w stojakach na końcówki. Zamontuj kolektor próżniowy. Płytkę wiążącą plazmid umieszcza się wewnątrz kolektora, a płytkę filtra plazmidowego umieszcza się na górze kolektora Resus zawiesiny granulek z 250 mikrolitrami roztworu pierwszego.

Bufor zawiesiny Resus poprzez pipetowanie w górę i w dół. Upewnienie się, że granulki są całkowicie ponownie zawieszone, ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tej procedury. Wytrząsarka może być użyta, jeśli pieszczoty w górę iw dół nie powodują całkowitego ponownego zawieszenia pelletu.

Gdy granulki zostaną całkowicie ponownie zawieszone, bakterie leżą, dodając 250 mikrolitrów roztworu do buforu do lizy. Uszczelnij płytkę i odwróć, aby umożliwić całkowite wymieszanie. Ustaw minutnik na dwie minuty.

Następnie dodaj 350 mikrolitrów roztworu trzeciego. Bufor neutralizacyjny. Uszczelnij płytkę i odwróć trzy razy linie.

Przenieść lizaty bakteryjne na płytki filtracyjne plazmidu. Zastosuj próżnię przez pięć minut. Zdejmij płytkę filtracyjną i umieść płytkę wiążącą na górze kolektora.

Zastosuj próżnię na jedną minutę. Dodaj 500 mikrolitrów dodatkowego buforu do płukania i stosuj próżnię przez dwie minuty. Dodaj 900 mikrolitrów roztworu buforowego do mycia cztery i stosuj próżnię przez dwie minuty.

Następnie ponownie dodaj 900 mikrolitrów roztworu buforowego do mycia i zastosuj próżnię przez 15 minut. Umieścić płytkę do pobierania DNA wewnątrz kolektora. Dodać 100 mikrolitrów buforu Elucian do płytki wiążącej i inkubować przez dwie minuty.

Zastosuj próżnię przez 10 minut. Na koniec wyjmij płytkę zbiorczą i zmierz stężenie DNA za pomocą NanoDrop 8 000. Zazwyczaj przy tej metodzie można oczekiwać wydajności około 100 nanogramów na mikrolitr, aby rozpocząć tę procedurę.

Po hec 2 9 3 komórki są trypy, inizowane i liczone. Użyj automatycznego dozownika, aby dozować dwa razy po 10 do czterech komórek do każdej studzienki Perkin Elmer. Zobacz płytkę inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla do transfekcji.

Za pomocą zautomatyzowanej maszyny do obsługi cieczy przygotować następującą mieszaninę w każdym dołku z 96-dołkową płytką okrągłodenną 100 nanogramów GFP. Chwyć dwa plazmidowe DNA ze 100 nanogramami CD NA w 25 mikrolitrach wolnego podłoża w surowicy. Następnie dodaj 25 mikrolitrów pożywki wolnej od surowicy zawierającej 0,5 mikrolitra transfekcji na dołek i uruchom minutnik na 30 minut.

Po 30 minutach przenieść 50 mikrolitrów w transfekcie CDNA w mieszaninie do komórek. Za pomocą delikatnej metody dozowania. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Aby rozpocząć pobieranie obrazu, uruchom oprogramowanie Opera. Wybierz zakładkę konfiguracji i wybierz obiektyw 20 razy oraz odpowiedni typ płyty. Upewnij się, że kołnierz jest ustawiony na odpowiednią wartość na obiektywie, aby umożliwić ustawienie ostrości na różnych typach płytek.

Następnie wybierz zakładkę mikroskop. Zdefiniuj ekspozycję pierwszą jako laser fite 4 88, a ekspozycję drugą jako laser UV 365. Aktywuj filtr UV na obu ekspozycjach i przypisz ekspozycję.

Jeden do aparatu pierwszego i ekspozycji. Dwa do kamery drugiej. Ustaw czas ekspozycji na 800 milisekund dla ekspozycji, jedną i 40 milisekund dla ekspozycji.

Po drugie, wybierz ekspozycję, jeden ustaw wysokość ostrości na zero mikronów. Wybierz ostrość po ustawieniu ostrości. Wystaw kamerę pierwszą.

Dostosuj wysokość ostrości, aby zoptymalizować płaszczyznę ekspozycji i kliknij weź wysokość. Zapisz parametry ekspozycji, powtórz dla ekspozycji. Po drugie, wybierz kartę definicji eksperymentu, utwórz układ i układ podrzędny.

Przeciągnij i upuść odpowiedni układ, ekspozycję, obraz referencyjny, pochylenie, plik kadrowania i układ podrzędny. Zapisz eksperyment. Wybierz zakładkę automatycznego eksperymentu i uzyskaj obrazy w normalnych warunkach.

Chwyt drugi jest zlokalizowany w całej komórce. Po stymulacji receptora czynnika wzrostu przemieszcza się on do błony plazmatycznej, a następnie jest internalizowany do endosomów. Na tym rysunku górny panel pokazuje sześć komórek CO M, które zostały przejściowo transfekowane GFP chwyta drugi i zgodnie z oczekiwaniami fluorescencja jest rozprowadzana w całej komórce.

Jednak w komórkach przejściowo transfekowanych GFP chwyć dwa plus receptor powierzchniowy komórki IT EGFR chwyta dwa przemieszcza się do struktur podobnych do endosomów, jak pokazano w dolnym panelu. W związku z tym, stosując bibliotekę obejmującą cały genom, można oczekiwać, że uda się zidentyfikować nowe białka powierzchniowe komórek wiążących dwa chwytaki. Metoda ta nie ogranicza się do wykrywania białek powierzchniowych komórek.

Na przykład DYNAMIN dwa GPA, który bierze udział w endocytozie, w której pośredniczy chwyt drugi, indukuje translokację chwytu drugiego. W tym eksperymencie GFP grab two zostało transfekowane DNM dwa do limfocytów T HEC 2 93. Przemieszczenie GFP chwyć dwa do struktur podobnych do endosomów jest zilustrowane przez komórki w czerwonych okręgach.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak immunoprecypitacja lub testy biochemiczne, aby odpowiedzieć na dalsze pytania, takie jak to, czy interakcja jest bezpośrednia, czy pośrednia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać klonowania ekspresji w celu identyfikacji subkomórkowych interakcji białkowych.