Name: Obustronne zamknięcie tętnicy szyjnej wspólnej jako odpowiedni bodziec kondycjonujący do wywołania wczesnej tolerancji niedokrwiennej na ogniskowe niedokrwienie mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Poznaj metodę dwustronnej okluzji tętnic szyjnych wspólnych jako bodźca kondycjonującego do wywołania wczesnej tolerancji niedokrwiennej na ogniskowe niedokrwienie mózgu u myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wszystkie procedury opisane w niniejszym artykule zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami Landesamt für Gesundheit und Soziales w Berlinie w Niemczech. 
Procedury przedoperacyjne
1. Przygotowanie monofilamentów
<ol>
 <li>Do przygotowania włókien śródświatowych wykorzystano nylonowe nici monofilamentowe 8-0, które przecięto na odcinki o długości 13 mm każdy.
 </li>
 <li>Do powlekania monofilamentów użyto silikonu Xantopren M mucosa (Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Niemcy), aktywowanego poprzez dodanie kropli roztworu aktywatora (Activator, Universal plus, Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Niemcy).</li>
 <li>Monofilament powoli przeciągano przez silikon, aż został nim całkowicie pokryty. Pozwoliło to na równomierne pokrycie monofilamentu silikonem. Należy unikać zbyt długiego oczekiwania, ponieważ aktywowany materiał powlekający szybko twardnieje i wysycha.</li>
 <li>Przed rozpoczęciem krzepnięcia silikonu zaleca się usunięcie nadmiaru materiału z włókna poprzez przeciągnięcie go po arkuszu papieru. W ten sposób warstwa silikonu może zostać zredukowana do grubości około 200 μm.
 </li>
 <li>Podstawę monofilamentu pokrytego silikonem wczepiono w plastelinę, aby go wysuszyć przez noc.</li>
</ol>
Komentarz: W idealnych warunkach do zapewnienia sterylności w miejscu operacyjnym należy używać wyłącznie monofilamentów sterylnych lub przynajmniej zdezynfekowanych. W praktyce sterylizacja lub dezynfekcja monofilamentów wykonanych ręcznie jest bardzo trudna, ponieważ może dojść do pogorszenia ich jakości 9. W związku z tym korzystniejsze może być zastosowanie dostępnych komercyjnie sterylnych monofilamentów.
2. Przygotowanie instrumentów chirurgicznych i zwierząt
<ol>
 <li>Wszystkie narzędzia chirurgiczne przechowywano w 70% alkoholu etylowym. Dodatkowo, przed każdym nowym zabiegiem chirurgicznym wszystkie narzędzia chirurgiczne były dokładnie czyszczone i dezynfekowane przy użyciu 70% alkoholu etylowego. </li>
 <li>U wszystkich zwierząt przed przecięciem dokładnie zdezynfekowano obszar operacyjny za pomocą 70% alkoholu etylowego. Przed wykonaniem nacięć pozwolono na całkowite wyschnięcie zdezynfekowanych miejsc. Nie wykonywano dodatkowego strzyżenia sierści, ponieważ może ono powodować powstawanie mikrośladów i wtórne stany zapalne skóry 9. </li>
</ol>
Procedury chirurgiczne
3. Pozycjonowanie sondy LDF i monitorowanie LDF
<ol>
 <li>W celu indukcji znieczulenia myszy poddano działaniu mieszaniny gazowej składającej się z 30% tlenu, 70% N2O oraz 2,5% izofluranu przy użyciu parownika. Do podtrzymania znieczulenia stężenie izofluranu zredukowano do 1,5%. Przez cały czas trwania procedury chirurgicznej myszy oddychały spontanicznie przez maskę tlenową. </li>
 <li>Wprowadzono rektalną sondę temperatury, a myszy unieruchomiono w aparacie stereotaktycznym, odsłaniając obszar ciemieniowy głowy. Podczas operacji myszy spoczywały na podgrzewanym podkładzie sterowanym termostatem, co zapewniało stałą temperaturę wewnętrzną ciała na poziomie 37,0 ± 0,5 °C. Wykonano cięcie w linii środkowej w płaszczyźnie strzałkowej (o długości ok. 1 cm), aby odsłonić kości ciemieniowe czaszki. </li>
 <li>Ostrożnie przedyssekpowano lewą stronę czaszki, a sondę światłowodową przymocowano bezpośrednio do czaszki 2 mm w kierunku kaudalnym i 5 mm bocznie od bregmy, używając kleju błyskawicznego. Następnie brzegi rany starannie zespolono, aby zapobiec hipotermii mózgu oraz infekcjom. </li>
 <li>Myszy odwrócono, aby odsłonić brzuszna stronę szyi. Sondę światłowodową podłączono do urządzenia LDF (PeriFLUX System 5000, Perimed, Järfälla, Szwecja) za pomocą adaptera sondy łączącej (Master Probe 418-1, Perimed; Järfälla, Szwecja). </li>
 </ol>
 Komentarz: Podczas obracania myszy należy ostrożnie zginać sondę światłowodową, aby zapobiec jej odłamaniu od czaszki.
 <ol start="5">
 <li>Urządzenie LDF zostało podłączone do komputera przenośnego. Rozpoczęto ciągły zapis wartości LDF przy użyciu oprogramowania PeriSoft dla systemu Windows (Wersja 2.50, Järfälla, Szwecja). Rysunek 1 przedstawia średni przebieg CBF uzyskany z dziesięciu pomiarów LDF podczas BCCAO i reperfuzji. </li>
</ol>
4.	Obustronne zamknięcie wspólnych tętnic szyjnych
<ol>
 <li>Znieczulenie utrzymywano zgodnie z opisem w punkcie 3.1. Myszy położono na grzbiecie. Ogon i łapy zwierzęcia przymocowano do maty grzewczej za pomocą taśmy klejącej. Wykonano nacięcie wzdłuż linii środkowej brzusznej w płaszczyźnie strzałkowej (długość ~ 1cm). </li>
 <li>Obie ślinianki ostrożnie odseparowano i odsunęto, aby uwidocznić leżące pod nimi tętnice szyjne wspólne (CCA).</li>
 <li>Obie tętnice CCA ostrożnie oddzielono od odpowiadających im nerwów błędnych i towarzyszących żył, dbając o to, aby nie uszkodzić tych struktur. Manipulacje przy nerwach błędnych mogą prowadzić do przejściowej lub trwałej dysfunkcji przywspółczulnego układu nerwowego, co może skutkować wystąpieniem znacznej arytmii serca, a nawet nieodwracalnym zatrzymaniem akcji serca. Dlatego kluczowe jest unikanie jakichkolwiek manipulacji przy nerwach błędnych. Wokół każdej tętnicy CCA wykonano luźną pętlę z nici jedwabnej 5-0. 
 </li>
 <li>Między CCA a jedwabnymi szwami po każdej stronie wstawiono małą rurkę silikonową (średnica 2 mm). Rurka ta służyła jako szyna dla tętnic CCA, aby zapobiec uszkodzeniu ścian tętnic podczas zaciśkania szwów (Rycina 4). 
 </li>
 <li>Obie tętnice CCA zamknięto na jedną minutę poprzez zaciśnięcie jedwabnych szwów. Do badania włączono wyłącznie myszy, u których sygnał LDF spadł poniżej &lt;10% sygnału bazowego. Po ponownym otwarciu obu tętnic CCA rozpoczęto pięciominutowy okres reperfuzji. Za pomocą LDF upewniono się, że reperfuzja była pełna. Zwierzęta z niepełną reperfuzją (t.j. powrót CBF do poziomu &lt;90% w stosunku do bazowego CBF) zostały wykluczone. Sekwencję jednej minuty BCCAO i pięciu minut reperfuzji powtórzono dwukrotnie, osiągając całkowity czas BCCAO wynoszący 3 min. Rycina 1 przedstawia średni przebieg CBF uzyskany z dziesięciu pomiarów LDF podczas BCCAO i reperfuzji. Podczas procedury zaleca się utrzymywanie rany szyjnej w stanie wilgotnym przy użyciu soli fizjologicznej. 
 </li>
 <li>Po ostatniej reperfuzji usunięto wszystkie rurki i szwy, a także sondę światłowodową przymocowaną do czaszki; rany zaszyto, a w celu przeciwbólowego zarządzania wielokrotnie, w razie potrzeby, aplikowano na rany maść z lidokainą (Xylocain 2%; AstraZeneca GmbH, Wedel, Niemcy).
 </li>
 <li>Myszy przeniesiono do wstępnie podgrzanego (30 °C) boksu regeneracyjnego (MediHEAT, PecoServices Ltd., Brough, Cumbria, UK) do czasu odzyskania przez nie pełnej przytomności. Następnie myszy zwrócono do klatek. </li>
</ol>
5.	Zator w środkowej tętnicy mózgowej
<ol>
 <li>Myszy poddano ponownej anestezji, wprowadzono sondę do pomiaru temperatury rektalnej i ułożono zwierzęta na podgrzewanej podkładce, aby odsłonić brzuszna stronę szyi. Następnie unieruchomiono je zgodnie z opisem w sekcji BCCAO. </li>
 <li>Wykonano trwałe podwiązanie lewej proksymalnej tętnicy szyjnej wspólnej (CCA) za pomocą długiej nici jedwabnej 7-0, a następnie delikatnie pociągnięto nić w kierunku ogonowym za pomocą kleszczyków typu mosquito (Rysunek 4). </li>
 <li>Kolejne trwałe podwiązanie wykonano wokół lewej tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA), a nić pociągnięto w prawą stronę ciała zwierzęcia (Rysunek 4). </li>
 <li>Ostrożnie zmobilizowano tkankę łączną otaczającą lewą tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA), a nerw językowy delikatnie uniesiono, aby uzyskać dobry wgląd w dystalny przebieg ICA. Lewa ICA odchyla się w lewo, podczas gdy tętnica skrzydłowopodniebna (PPA) biegnie w prawo, podążając za przebiegiem proksymalnej ICA (Rysunek 4). </li>
 </ol>
 Komentarz: Należy zidentyfikować kolejną tętnicę, która skręca w prawo w kierunku ogonowym. Jest to tętnica potyliczna, która w zależności od osobniczego zróżnicowania odgałęzia się albo z miejsca rozdziału CCA, albo z proksymalnej części ECA (Rysunek 4). 
<ol start="5">
 <li>Za pomocą nici jedwabnej 5-0 wykonano luźną pętlę szwu wokół proksymalnego odcinka ICA. </li>
 <li>Używając małego zacisku mikrochirurgicznego, tymczasowo zamknięto światło ICA dystalnie względem luźnej pętli szwu 5-0 (Rycina 4). </li>
 <li>Za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych wykonano małe nacięcie w dystalnej części CCA, tuż przed rozwidleniem CCA (Rycina 4). </li>
 <li>Wcześniej wybrany monofilament w pokryciu silikonowym wprowadzono do CCA przez małe nacięcie i przesunięto w stronę ICA, aż dotarł do zacisku mikrochirurgicznego (Rycina 4). </li>
 <li>Zacisk mikrochirurgiczny ostrożnie usunięto z ICA, jednocześnie przesuwając monofilament głębiej do ICA, aż do momentu zatrzymania (Rycina 4).
 Komentarz: W tym momencie należy obrócić pęsetę w lewej ręce tak, aby nie trzymać jej jak długopisu. Ułatwia to chwytanie filamentu pęsetą. Aplikator zacisku naczyniowego powinien być trzymany w prawej ręce. Może być konieczne niemal całkowite zaciśnięcie luźnego szwu 5-0 wokół ICA, aby zapobiec krwawieniu z miejsca nacięcia.</li>
 <li>Określono dokładną lokalizację końcówki monofilamentu, aby sprawdzić, czy został on wprowadzony do ICA, a nie do PPA. Jeśli końcówka monofilamentu trafiła do proksymalnego PPA, filament delikatnie wycofano tuż przed rozwidleniem ICA/PPA. Ponowiono próbę wprowadzenia monofilamentu do ICA, delikatnie odciągając proksymalny odcinek ICA nieco w prawą stronę. W ten sposób symulowano naturalny przebieg dystalnego ICA, co ułatwiło dostęp do tego naczynia. </li>
 <li>Po niemal całkowitym wprowadzeniu monofilamentu do ICA zaciśnięto luźną pętlę szwu 5-0 wokół proksymalnego ICA, aby unieruchomić filament. Następnie wszystkie nici jedwabne skrócono, a ranę skórną zaszyto. </li>
 <li>Utratę płynów podczas operacji uzupełniono poprzez wstrzyknięcie 1,0 ml soli fizjologicznej i.p. Następnie mysz przeniesiono do wstępnie podgrzanej klatki rekonwalescencyjnej aż do pełnego odzyskania przytomności.</li>
 <li>W celu reperfuzji myszy ponownie zanestetyzowano, a monofilament usunięto po ostrożnym poluzowaniu szwu jedwabnego 5-0 wokół proksymalnego ICA. Następnie szew 5-0 ponownie ostrożnie zaciśnięto, aby zapobiec krwawieniu. </li>
 <li>Po potwierdzeniu całkowitej hemostazy zaszyto ranę szyi. </li>
 <li>W razie potrzeby w celu uśmierzenia bólu miejscowo i wielokrotnie aplikowano maść z lidokainą, a mysz przeniesiono do wstępnie podgrzanej (30 °C) klatki rekonwalescencyjnej aż do pełnego odzyskania przytomności. </li>
 <li>Pierwszą oznaką udanego zabiegu MCAO było obserwowane krążenie zwierzęcia zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Stopień deficytu funkcjonalnego określono za pomocą skali Bedersona zmodyfikowanej dla myszy 10. Zgodnie z tą zmodyfikowaną skalą Bedersona, oceny neurologiczne stopniurowano następująco: 0 (prawidłowa funkcja motoryczna), 1 (zgięcie tułowia i przeciwległej kończyny przedniej podczas podnoszenia myszy za ogon), 2 (krążenie w stronę przeciwległą podczas trzymania myszy za ogon na płaskiej powierzchni, ale prawidłowa postawa w spoczynku), 3 (pochylenie w stronę przeciwległą w spoczynku) oraz 4 (brak spontanicznej aktywności motorycznej lub śmierć). </li>
</ol>
6.	Operacja pozorowana BCCAO
W przypadku procedur pozorowanych BCCAO, myszy znieczulono na czas trwania rzeczywistej procedury BCCAO PC, zmobilizowano gruczoły ślinowe i odsłonięto tętnice szyjne wspólne (CCA). Kluczowe jest, aby podczas procedury pozorowanej unikać bezpośrednich manipulacji przy tętnicach szyjnych lub nerwach błędnych. Manipulacje przy CCA mogą uszkodzić warstwę śródbłonka, co może skutkować uwalnianiem związków wazoaktywnych ze śródbłonka lub wywołać miejscową zakrzepicę w świetle tętnicy. W konsekwencji po operacji pozorowanej mogą wystąpić zdarzenia zakrzepowo-zatorowe, co stanowiłoby istotny czynnik zakłócający procedurę. Z drugiej strony, manipulacje przy nerwach błędnych mogą prowadzić do przejściowej lub trwałej dysfunkcji układu nerwowego przywspółczulnego, co stwarza ryzyko wystąpienia znacznych arytmii serca, a nawet nieodwracalnego zatrzymania akcji serca. Dlatego niezwykle ważne jest unikanie jakichkolwiek manipulacji przy nerwach błędnych podczas BCCAO.
Procedury pooperacyjne
7. Pomiary objętości zawału
W celu oceny wielkości zawałów myszy przeżyły 72 h po MCAO. Następnie zwierzęta poddano głębokiej anestezji, usunięto mózgi, zamrożono je gwałtownie w metylobutanie, wykonano przekroje i zabarwiono hematoksyliną (zgodnie z protokołem Papanicolau) w celu pomiaru objętości zawału. Przekroje mózgu pobrano w odstępach 600 μm, a objętości zawałów wyznaczono za pomocą analizatora obrazu (MCID core 7.0 Rev.2.0, GE Healthcare Niagara Inc) i skorygowano o obrzęk zgodnie z metodą Lin et al. 7,11.
8.	Kryteria włączenia
Do badania włączono wyłącznie zwierzęta, u których podczas każdego z trzech epizodów BCCAO odnotowano redukcję CBF zmierzoną za pomocą LDF o ponad 90%. W idealnych warunkach monitorowanie LDF powinno być prowadzone w obu półkulach mózgu podczas BCCAO. Ze względów praktycznych monitorowanie LDF przeprowadzono wyłącznie w lewych półkulach, które zostaną później poddane MCAO. Podejście to było opisywane wcześniej 6,12. Wymagano, aby reperfuzja po każdym epizodzie BCCAO była całkowita (t.j. powrót do wartości bazowych). Aby skrócić czas przebywania myszy pod narkozą, nie monitorowano CBF podczas operacji MCAO. Jednak w badaniu pilotażowym z oddzielną grupą zwierząt monitorowano CBF za pomocą LDF podczas operacji MCAO. W tej grupie myszy konsekwentnie mierzono redukcję CBF o 90% w porównaniu z wartością bazową przed okluzją CCA. Dodatkowo, po usunięciu monofilamentów CBF powrócił do &gt;90% odpowiednich wartości bazowych po okluzji CCA. Kryteria LDF te są ugruntowane w literaturze i prowadzą do uzyskania spójnych objętości zawałów 7. Włączono tylko zwierzęta, które po wybudzeniu z narkozy po MCAO uzyskały wynik w skali Bedersona co najmniej 1. Ponadto do badania włączono wyłącznie zwierzęta, które przeżyły 72 h po MCAO i nie wykazywały objawów krwawienia wewnątrzczaszkowego.

<ol><li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2011+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 123, e18-e209 (2011).</li>
<li>Khaja, A. M., Grotta, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Established+treatments+for+acute+ischaemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Established treatments for acute ischaemic stroke.</a> Lancet. 369, 319-330 (2007).</li>
<li>Foerch, C., Sitzer, M., Steinmetz, H., Neumann-Haefelin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+demographic+trends+decrease+the+proportion+of+ischemic+stroke+patients+receiving+thrombolytic+therapy%3A+a+call+to+set-up+therapeutic+studies+in+the+very+old%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Future demographic trends decrease the proportion of ischemic stroke patients receiving thrombolytic therapy: a call to set-up therapeutic studies in the very old.</a> Stroke. 40, 1900-1902 (2009).</li>
<li>Gidday, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+preconditioning+and+ischaemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 437-448 (2006).</li>
<li>Atochin, D. N., Clark, J., Demchenko, I. T., Moskowitz, M. A., Huang, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cerebral+ischemic+preconditioning+in+mice+deficient+in+endothelial+and+neuronal+nitric+oxide+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Rapid cerebral ischemic preconditioning in mice deficient in endothelial and neuronal nitric oxide synthases.</a> Stroke. 34, 1299-1303 (2003).</li>
<li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obligatory+role+of+inducible+nitric+oxide+synthase+in+ischemic+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood.+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Obligatory role of inducible nitric oxide synthase in ischemic preconditioning.</a> J. Cereb. Blood. Flow Metab. 25, 493-501 (2005).</li>
<li>Kunz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+protection+by+ischemic+tolerance%3A+role+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurovascular protection by ischemic tolerance: role of nitric oxide and reactive oxygen species.</a> J. Neurosci. 27, 7083-7093 (2007).</li>
<li>Dirnagl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+operating+procedures+%28SOP%29+in+experimental+stroke+research%3A+SOP+for+middle+cerebral+artery+occlusion+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Precedings%22%5BJournal%5D)">Standard operating procedures (SOP) in experimental stroke research: SOP for middle cerebral artery occlusion in the mouse.</a> Nature Precedings. , (2010).</li>
<li>Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+stroke+in+mice+-+middle+cerebral+artery+occlusion+with+the+filament+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model.</a> J. Vis. Exp. (47), e2423(2011).</li>
<li>Bederson, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+middle+cerebral+artery+occlusion%3A+evaluation+of+the+model+and+development+of+a+neurologic+examination%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination.</a> Stroke. 17, 472-476 (1986).</li>
<li>Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+brain+edema+on+infarct+volume+in+a+focal+cerebral+ischemia+model+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats.</a> Stroke. 24, 117-121 (1993).</li>
<li>Kawano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iNOS-derived+NO+and+nox2-derived+superoxide+confer+tolerance+to+excitotoxic+brain+injury+through+peroxynitrite%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">iNOS-derived NO and nox2-derived superoxide confer tolerance to excitotoxic brain injury through peroxynitrite.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 27, 1453-1462 (2007).</li>
<li>Qi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublethal+cerebral+ischemia+inhibits+caspase-3+activation+induced+by+subsequent+prolonged+ischemia+in+the+C57Black%2FCrj6+strain+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Sublethal cerebral ischemia inhibits caspase-3 activation induced by subsequent prolonged ischemia in the C57Black/Crj6 strain mouse.</a> Neurosci. Lett. 315, 133-136 (2001).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+forebrain+ischemic+preconditioning+model+established+in+C57Black%2FCrj6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A forebrain ischemic preconditioning model established in C57Black/Crj6 mice.</a> J. Neurosci. Methods. 107, 101-106 (2001).</li>
<li>Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+Stroke+Model+Guidelines+for+Preclinical+Stroke+Trials+%281st+Edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Stroke+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Rodent Stroke Model Guidelines for Preclinical Stroke Trials (1st Edition).</a> J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).</li>
<li>Nishio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermia-induced+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Hypothermia-induced ischemic tolerance.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 890, 26-41 (1999).</li>
<li>DeBow, S., Colbourne, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+temperature+measurement+and+regulation+in+awake+and+freely+moving+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Brain temperature measurement and regulation in awake and freely moving rodents.</a> Methods. 30, 167-171 (2003).</li>
<li>Colbourne, F., Sutherland, G. R., Auer, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+system+for+regulating+brain+temperature+in+awake+and+freely+moving+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">An automated system for regulating brain temperature in awake and freely moving rodents.</a> J. Neurosci. Methods. 67, 185-190 (1996).</li>
<li>Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+induced+prolonged+protection+against+cerebral+ischemia+in+mice%3A+a+redox+sensitive+mechanism%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism?</a> Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).</li>
<li>Li, L., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+preconditioning+improves+short-term+and+long-term+neurological+outcome+after+focal+brain+ischemia+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Isoflurane preconditioning improves short-term and long-term neurological outcome after focal brain ischemia in adult rats.</a> Neuroscience. 164, 497-506 (2009).</li>
<li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preconditioning+with+isoflurane+produces+dose-dependent+neuroprotection+via+activation+of+adenosine+triphosphate-regulated+potassium+channels+after+focal+cerebral+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth.+Analg%22%5BJournal%5D)">Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats.</a> Anesth. Analg. 96, 233-237 (2003).</li>
<li>Spratt, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+method+of+thread+manufacture+improves+stroke+induction+rate+and+reduces+mortality+after+thread-occlusion+of+the+middle+cerebral+artery+in+young+or+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Modification of the method of thread manufacture improves stroke induction rate and reduces mortality after thread-occlusion of the middle cerebral artery in young or aged rats.</a> J. Neurosci. Methods. 155, 285-290 (2006).</li>
<li>Zarow, G. J., Karibe, H., States, B. A., Graham, S. H., Weinstein, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endovascular+suture+occlusion+of+the+middle+cerebral+artery+in+rats%3A+effect+of+suture+insertion+distance+on+cerebral+blood+flow%2C+infarct+distribution+and+infarct+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol.+Res%22%5BJournal%5D)">Endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in rats: effect of suture insertion distance on cerebral blood flow, infarct distribution and infarct volume.</a> Neurol. Res. 19, 409-416 (1997).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

W naszym badaniu wykazaliśmy, że trzy serie BCCAO, z których każda trwała jedną minutę i była poprzedzona reperfuzją przez pięć minut, stanowią odpowiedni izchemiczny bodziec PC do indukowania wczesnego IT.
Ponadto wykazaliśmy, że zastosowany protokół prekondycjonowania jest bezpieczną i mało inwazyjną procedurą, niewykazującą istotnej zachorowalności pooperacyjnej, oznak apoptozy w mózgu ani śmiertelności. Wcześniej opisano kilka różnych protokołów prekondycjonowania 6-7,12. Inni a...

Udar niedokrwienny jest chorobą o wysokiej śmiertelności i ogromnym obciążeniu społeczno-ekonomicznym 1. Mimo intensywnych wysiłków naukowych, zarówno w badaniach eksperymentalnych, jak i klinicznych w ostatnich dziesięcioleciach, opcje terapeutyczne dla pacjentów w stanie ostrym udaru niedokrwiennego pozostają bardzo ograniczone 2. W przeciwieństwie do tego, wzrost odsetka osób starszych w krajach rozwiniętych drastycznie zwiększy zapadalność i chorobowość udarów niedokrwiennych w nadchodzących dziesięcioleciach 3. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania nowych strategii leczenia pacjentów z udarem niedokrwiennym.
Jednym z podejść jest pogłębienie zrozumienia mechanizmów endogennej adaptacji mózgu w celu radzenia sobie z bodźcem uszkadzającym. Ta pochodząca z mózgu neuroprotekcja jest znana również jako prekondycjonowanie niedokrwienne (PC) lub tolerancja niedokrwienna (IT) i opisuje zjawisko, w którym nieuszkadzający bodziec szkodliwy przyłożony do mózgu indukuje przejściową oporność na późniejszy, uszkadzający incydent niedokrwienny 4. IT występuje w dwóch różnych oknach czasowych: wczesna IT, która pojawia się od kilku minut do kilku godzin po PC, oraz opóźniona IT, która wymaga okresu utajenia wynoszącego kilka godzin 4.
Dotychczas badania nad IT w mózgu koncentrowały się na opóźnionej IT. Mechanizmy wczesnej IT są znacznie słabiej poznane. Celem niniejszego badania jest ustalenie, czy obustronna okluzja tętnic szyjnych wspólnych (BCCAO), która jest uznanym bodźcem indukującym opóźnioną IT, stanowi odpowiedni bodziec PC do indukcji wczesnej IT w odpowiedzi na przejściową ogniskową ischemię mózgu (wywołaną okluzją tętnicy środkowej mózgu, MCAO) u myszy C57Bl6/J.
Podczas obu procedur chirurgicznych (BCCAO i MCAO) przeprowadzono monitorowanie przepływu krwi w mózgu (CBF) za pomocą laserowej flowmetrii dopplerowskiej (LDF).
Procedurę BCCAO przeprowadzono u znieczulonych myszy oddychających spontanicznie. Obie tętnice szyjne wspólne (CCA) zostały odsłonięte i zamknięte na 60 sec, po czym nastąpiły 5 min reperfuzji. Sekwencję BCCAO/reperfuzji powtórzono dwukrotnie. Po operacji myszy szybko doszły do siebie i nie wykazywały objawów upośledzenia czynnościowego. Aby wykluczyć możliwość, że opisany powyżej protokół BCCAO doprowadził do opóźnionej śmierci komórek w mózgu, przeprowadzono barwienie TUNEL (TdT-mediated dUTP-biotin nick end labelling) 72 hr po BCCAO (lub operacji pozorowanej) w oddzielnej grupie.
Model MCAO jest powszechnie stosowanym modelem indukcji ogniskowego niedokrwienia mózgu u gryzoni 5-7. Procedury chirurgiczne przeprowadzono zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi (SOP) 8. Po odsłonięciu lewej CCA, do dystalnej części CCA wprowadzono pokryty silikonem monofilament, przesuwając go przez wewnętrzną tętnicę szyjną (ICA) do kręgu Willisa, aż do momentu zamknięcia tętnicy przedniej mózgu (ACA), a tym samym ujścia tętnicy środkowej mózgu (MCA) na określony czas. W niniejszym badaniu zastosowano MCAO przez 45 min, co zazwyczaj prowadzi do powstania zmiany niedokrwiennej w obszarze MCA obejmującej prążkowie oraz obszary korowe mózgu.
W naszym badaniu przeanalizowano profil czasowy wczesnej IT, wykorzystując BCCAO jako bodziec PC. Uzyskane dane wskazały, że optymalny odstęp czasu między BCCAO a MCAO w celu wywołania wczesnej IT wynosi 30 min.
W tym filmie zaprezentujemy obie procedury chirurgiczne, t.j. BCCAO oraz MCAO.

<table><tbody><tr><td>Binokularowy mikroskop chirurgiczny</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000 C</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła do mikroskopu</td><td>Zeiss</td><td>SteREO CL 1500 ECO</td><td></td></tr><tr><td>Mata grzewcza z sondą rektalną</td><td>FST</td><td>21061-10</td><td></td></tr><tr><td>Rama stereotaktyczna</td><td>David Kopf</td><td>Model 930</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont nr 5</td><td>FST</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont nr 7</td><td>FST</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyk mikronaczyniowy</td><td>FST</td><td>00398-02</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator do kleszczyków</td><td>FST</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>FST</td><td>15372-62</td><td></td></tr><tr><td>Igłotrzymacz</td><td>FST</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>Igły</td><td>Feuerstein, Suprama</td><td>BER 562-20</td><td></td></tr><tr><td>Nici jedwabne 5-0</td><td>Feuerstein, Suprama</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nici jedwabne 7-0</td><td>Feuerstein,Suprama</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nici jedwabne 8-0</td><td>Feuerstein, Suprama</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dwustronne zamknięcie wspólnych tętnic szyjnych jako odpowiedni bodziec prekondycjonujący w celu indukcji wczesnej tolerancji niedokrwiennej na ogniskowe niedokrwienie mózgu

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

Narasta liczba dowodów na to, że prekondycjonowanie niedokrwienne – niedrzcząca stymulacja niedokrwienna mózgu – zapewnia przejściową ochronę przed kolejnym, uszkadzającym incydentem niedokrwiennym. Opracowaliśmy dwustronne zamknięcie wspólnej tętnicy szyjnej jako bodziec prekondycjonujący w celu wywołania wczesnej tolerancji niedokrwiennej na przejściowe ogniskowe niedokrwienie mózgu u myszy C57Bl6/J. W tym filmie zaprezentujemy metodologię zastosowaną w tym badaniu.

Zastosowany przez nas protokół BCCAO doprowadził do natychmiastowego i głębokiego (&gt;90%) zmniejszenia CBF w przypadku okluzji obu tętnic CCA (Rysunek 1). Ponowne otwarcie tętnic CCA doprowadziło do całkowitej reperfuzji, co monitorowano za pomocą LDF (Rysunek 1). Po PC u zwierząt nie zaobserwowano oznak niepełnosprawności funkcjonalnej. Ponadto nie wystąpiła śmiertelność. Barwienie TUNEL przeprowadzone 72 h po BCCAO w oddzielnej grupie zwierząt nie wykazało oznak opóźnionej śmierci ko...

Przybywa dowodów na to, że przeciwwarunkowanie niedokrwienne (PC) – nieuszkadzający bodziec niedokrwienny dla mózgu – zapewnia przejściową ochronę przed następującym po nim uszkadzającym niedokrwieniem. Zastosowaliśmy obustronną okluzję wspólnej tętnicy szyjnej (BCCAO) jako bodziec przeciwwarunkujący w celu wywołania wczesnej tolerancji na niedokrwienie (IT) w odpowiedzi na przejściowe ogniskowe niedokrwienie mózgu (wywołane okluzją środkowej tętnicy mózgowej, MCAO) u myszy C57Bl6/J.

Dwustronne zamknięcie wspólnych tętnic szyjnych jako odpowiedni bodziec prekondycjonujący w celu indukcji wczesnej tolerancji niedokrwiennej na ogniskowe niedokrwienie mózgu

Narasta liczba dowodów na to, że prekondycjonowanie niedokrwienne – niedodatkowy, niedoraźny stres niedokrwienny w obrębie mózgu – zapewnia przejściową ochronę przed...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wykazanie, że obustronna okluzja wspólnych tętnic szyjnych indukuje przejściowy stan tolerancji niedokrwiennej na niedokrwienie mózgu we wczesnym oknie czasowym. Osiąga się to poprzez umieszczenie światłowodowej sondy laserowo-dopplerowskiej nad korą w celu ciągłego monitorowania przepływu krwi w mózgu. W drugim kroku przeprowadza się obustronną okluzję wspólnych tętnic szyjnych, co indukuje wczesną tolerancję niedokrwienną.Następnie przeprowadza się okluzję środkowej tętnicy mózgowej w celu wywołania ogniskowego niedokrwienia mózgu. Uzyskane wyniki wykazują różnice w wielkości zmian niedokrwiennych między zwierzętami poddanymi prekondycjonowaniu a zwierzętami niepoddanymi prekondycjonowaniu na podstawie histologicznych pomiarów objętości zawału. Opisane metody zostaną wykorzystane do odpowiedzi na pytanie, czy tolerancja niedokrwienna, będąca utrwalonym bodźcem w opóźnionym oknie czasowym, może również indukować tolerancję niedokrwienną we wczesnym oknie czasowym. Po indukcji znieczulenia z użyciem 2,5% izofluranu, zwierzę unieruchamia się w aparacie stereotaktycznym, a następnie wprowadza sondę temperatury odbytniczej w celu monitorowani

bilateral-common-carotid-artery-occlusion-as-an-adequate

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Okultyzacja wspólnej tętnicy szyjnej jako adekwatne bodźce prekondycjonujące do wywołania wczesnej tolerancji na izochemię ogniskową mózgu

Model intraluminalnego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) jest najczęściej stosowanym modelem wśród eksperymentalnych modeli udaru niedokrwiennego. W niniejszym materiale szczegółowo zaprezentujemy cały model z wykorzystaniem laserowej flowmetrii dopplerowskiej oraz przedstawimy reprezentatywne wyniki.

Model wewnątrznaczyniowego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) w udarze niedokrwiennym u myszy z prowadzeniem za pomocą laserowej dopplerometrii przepływu

Ten film przedstawia procedurę wykonywania trwałej dystalnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu lub MCAO z tętnicą szyjną wspólną lub podwiązaniem CCA u starszych szczurów w celu modelowania udaru niedokrwiennego. Blokuje to przepływ krwi do mózgu, prowadząc do śmierci neuronów i generowania modelu do badania mechanizmów udaru i potencjalnych metod leczenia.

Wywoływanie niedokrwienia poprzez niedrożność środkowej części mózgu i tętnicy szyjnej wspólnej w modelu szczurzym

Źródło: Zheng, Y., et al. Modele eksperymentalne do badania neuroprotekcji kwaśnego kondycjonowania końcowego przed niedokrwieniem mózgu. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia zastosowanie kwaśnego kondycjonowania końcowego (APC) w celu oceny jego neuroprotekcyjnego działania przeciwko uszkodzeniu niedokrwiennemu w mysim modelu niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO). Przedstawiono w nim etapy związane z reperfuzją w modelu MCAO i zastosowaniem APC podczas reperfuzji w celu złagodzenia...

 Ocena neuroprotekcyjnego wpływu kwaśnego kondycjonowania końcowego w mysim modelu niedokrwienia mózgu

Ten protokół opisuje powtarzające się wstępne kondycjonowanie hipoksyjne, czyli krótkie ekspozycje na niedotlenienie ogólnoustrojowe, które zmniejszają objętość zawału i zaburzenie bariery krew-mózg po przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu u myszy. Szczegółowo opisano również podwójną kwantyfikację objętości zawału i przerwania bariery krew-mózg po udarze, aby ocenić skuteczność ochrony nerwowo-naczyniowej.

Kwantyfikacja ochrony nerwowo-naczyniowej po powtarzającym się kondycjonowaniu wstępnym hipoksyjnym i przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu u myszy

Tutaj prezentujemy protokół do trwałego zamknięcia dystalnej tętnicy środkowej mózgu u starszych samic szczurów z jednoczesnym zamknięciem tętnic szyjnych w celu wygenerowania dużych zawałów korowych i utrzymujących się deficytów. Pokazujemy potwierdzenie wielkości zmiany za pomocą strukturalnego rezonansu magnetycznego po 24 godzinach i 8 tygodniach po udarze.

Wykonywanie stałej dystalnej środkowej części mózgu z niedrożnością tętnicy szyjnej wspólnej u starszych szczurów w celu zbadania niedokrwienia kory mózgowej z trwałą niepełnosprawnością

Wewnątrzświateł okluzja włókien środkowej tętnicy mózgowej jest najczęściej używanym modelem in vivo eksperymentalnego udaru mózgu u gryzoni. Wykonuje się tutaj alternatywne podejście chirurgiczne umożliwiające naprawę tętnicy szyjnej wspólnej, które umożliwia reperfuzję tętnicy szyjnej wspólnej i pełną reperfuzję do obszaru tętnicy środkowej mózgu.

Niedrożność tętnicy środkowej mózgu umożliwiająca reperfuzję poprzez wspólną naprawę tętnicy szyjnej u myszy

Ten protokół przedstawia przewodnik krok po kroku dla badaczy, jak przeprowadzić procedurę zamknięcia tętnicy środkowej mózgu na myszach przy użyciu zmodyfikowanej metody Longa tętnicy szyjnej zewnętrznej. Modyfikacje przedstawione w artykule mają na celu zwiększenie dokładności niedrożności tętnicy środkowej mózgu i zapewnienie pełnej reperfuzji.

Optymalizacja metody zamykania tętnic środkowych Longa w celu uzyskania pełnej reperfuzji

Ten protokół opisuje proces przygotowania do reperfuzji niedrożności tętnicy środkowej mózgu przez tętnicę szyjną wspólną.

Zmodyfikowany model preparatu do reperfuzji niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Metoda igłowa asymetrycznego obustronnego zwężenia tętnicy szyjnej wspólnej jest proponowana do stworzenia mysiego modelu dla naczyniowego zaburzenia poznawczego i demencji. Skutkuje długoterminowymi wynikami w porównaniu z wcześniej ustalonymi modelami i jest kompatybilny z MRI na żywo. Wizualna reprezentacja przedstawiająca procedurę stanowi wskazówkę do opanowania operacji.

Mysi model naczyniowych zaburzeń poznawczych i otępienia oparty na asymetrycznym obustronnym zwężeniu tętnicy szyjnej wspólnej prowadzonym igłą

Ten protokół opisuje proces wywoływania modelu śpiączki niedokrwiennej mózgu przy użyciu zmodyfikowanej metody okluzji czterech naczyń.

Model śpiączki niedokrwiennej mózgu wywołany zmodyfikowaną okluzją czterech naczyń

Poznaj metodę dwustronnej okluzji tętnic szyjnych wspólnych jako bodźca kondycjonującego do wywołania wczesnej tolerancji niedokrwiennej na ogniskowe niedokrwienie mózgu u myszy.

Obustronne zamknięcie tętnicy szyjnej wspólnej jako odpowiedni bodziec kondycjonujący do wywołania wczesnej tolerancji niedokrwiennej na ogniskowe niedokrwienie mózgu (Wideo) | JoVE Journal

Dwustronne zamknięcie wspólnych tętnic szyjnych jako odpowiedni bodziec prekondycjonujący w celu indukcji wczesnej tolerancji niedokrwiennej na ogniskowe niedokrwienie mózgu

Przeglądaj więcej filmów