Izolacja limfocytów z błony śluzowej dróg rodnych myszy

Opisany jest skuteczny sposób izolowania limfocytów z dróg rodnych myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne i separację w gradinie Percoll, aby umożliwić wydajną izolację. Technikę tę można również dostosować do stosowania u innych gatunków

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie limfocytów z układu rozrodczego myszy. Osiąga się to poprzez najpierw usunięcie całych dróg rodnych i zmielenie tkanki na małe kawałki, aby uwolnić limfocyty z tkanki. Drobno zmieloną tkankę trawi się kolagenazą ósemką i energicznie miesza tkankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Za pomocą mieszania magnetycznego limfocyty są następnie izolowane za pomocą gradientu dla każdego wywołania. Ostatecznie limfocyty można scharakteryzować za pomocą cytometrii przepływowej Implikacje tej techniki rozszerzyły się w kierunku diagnozy i terapii chorób rozrodczych. Ponieważ metoda ta pozwala nam zrozumieć zachowanie limfocytów tkankowych, które często różnią się od limfocytów, które zostały wyizolowane z układu krążenia.

Chociaż metoda ta zapewnia wgląd w układ błony śluzowej rozrodczości, może mieć również zastosowanie do innych układów, takich jak systemy błony śluzowej jelit i dróg oddechowych. Po eutanazji samicy myszy użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać niskie nacięcie w linii środkowej, a następnie otwórz skórę. Delikatnie odsuń jelita na bok, zidentyfikuj wzj, a następnie wyizoluj i usuń całe drogi rodne od wzjg do otwartej pochwy.

Umieść drogi rodne na szalce Petriego. Użyj nożyczek, aby otworzyć cały trakt wzdłużnie. Następnie przenieś tkankę na szalkę Petriego z kompletną pożywką RPMI 10.

Teraz pokrój drogi rodne na drobne kawałki, a następnie przenieś je do kolby zawierającej pełne RPMI 10 i EDTA. Umieścić kolbę na mieszadle magnetycznym i mieszać tkankę dwa razy przez 15 minut w temperaturze pokojowej za każdym razem, aby pozbyć się komórek nabłonka po ostatnim okresie mieszania, wyrzucić supernatant, a następnie przelać kawałki tkanki przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Zmyć pozostałość EDTA za pomocą kompletnego podłoża.

Teraz przenieś przefiltrowane kawałki tkanki do nowej kolby ze świeżym RPMI 10 i kolagenazą i strawij kawałki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na mieszadle magnetycznym ustawionym do energicznego mieszania tkanki po godzinie, przelej supernatant przez sitko do komórek o średnicy 100 mikrometrów do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i utrzymuj przefiltrowaną zawiesinę komórek na lodzie. Dodaj świeży RPMI 10 z kolagenazą do oryginalnej kolby i wymieszaj tkankę jeszcze dwa razy, używając za każdym razem świeżego kompletnego RPMI 10 i kolagenazy. Po trzecim trawieniu w roztworze nie powinny być widoczne fragmenty tkanki.

Teraz połącz ze sobą supernatanty z trzech procesów trawienia. Wirować komórki przez pięć minut w temperaturze 410 G i czterech stopniach Celsjusza, a następnie wyrzucić supernatant. Zacznij od ponownego zawieszenia osadu komórkowego w świeżym roztworze 40% na połączenie.

Dodaj zawiesinę komórkową z 40% na połączenie do probówki gradientowej, a następnie ostrożnie podkład i równą objętość świeżo przygotowanego. 70% na rozmowę. Teraz odwirować próbki gradientu przez 20 minut w temperaturze pokojowej z odłamaniem.

Po odwirowaniu ostrożnie zbierz limfocyty w warstwie granicy między gradientami perolu. Następnie umyj odzyskane komórki za pomocą RPMI od jednego do trzech przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec, po odrzuceniu sup natantu, ponownie zawiesić limfocyty w odpowiednim roztworze zgodnie z pożądaną procedurą doświadczalną.

Ten wykres punktowy jest przykładem populacji limfocytów, która została wyizolowana z dróg rodnych myszy zakażonej dopochwowo chlamydią uredermalną. Siedem dni po zakażeniu zawiesinę pojedynczej komórki bramkowano na limfocytach CD trzech dodatnich i analizowano pod kątem ekspresji komórek CD 4 i CD 8 po jego rozwinięciu. Technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania funkcji limfocytów rozrodczych i charakterystyki komórek w modelu choroby wirusa myszy, który naśladuje choroby ludzkie.