Name: Izolacja limfocytów z błony śluzowej dróg rodnych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: Poznaj metodę izolacji limfocytów z dróg rodnych myszy przy użyciu trawienia kolagenazą i gradientu Percolla. Technika ta umożliwia charakterystykę komórek przez cytometrię przepływową i zastosowanie w badaniach nad chorobami reprodukcyjnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować NIH za przyznanie grantów R01-AI026328 (KAK) oraz R01-AI079004 (KAK).

1. Usunięcie dróg rodnych
<ol>
 <li>Uśmiercić mysz zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi. Wykonać niskie nacięcie w linii środkowej i odsunąć skórę.</li>
 <li>Wyizolować i usunąć cały układ rozrodczy, od jajowodów do ujścia pochwy.</li>
 <li>Rozciąć cały układ wzdłuż za pomocą nożyczek.</li>
 <li>Rozciąć układ rozrodczy precyzyjnymi nożyczkami chirurgicznymi na drobne kawałki (około &lt;1 mm) w szalce Petriego z Complete RPMI-10/EDTA (patrz poniższa receptura) i mieszać tkankę w kolbie o pojemności 125 ml w temperaturze pokojowej na mieszadle magnetycznym przez 15 min. Procedurę tę powtarzać dwukrotnie, a następnie odrzucić supernatant zawierający nabłonek i pozostałe zanieczyszczenia.</li>
 <li>Przełożyć zawartość kolby przez sitko komórkowe (40 μm). Wypłukać pozostałości EDTA kompletny medium. 
 Complete RPMI/10: RPMI 500 ml (Gibco), 10% płodowa surowica bydlęca (FBS), inaktywowana termicznie, 5 ml penicyliny/streptomycyny, 5 ml 1M HEPES. 
 Complete RPMI-10/EDTA: 10% RPMI (jak powyżej) z 5 μM EDTA </li>
</ol>
2. Trawienie tkanek dróg rodnych
<ol>
 <li>Przenieść fragmenty tkanki do nowej kolby z 20 ml świeżego medium RPMI-10/kolagenaza (patrz przepis poniżej) i trawić tkankę w temperaturze 37 °C przez 1 hr na mieszadle magnetycznym ustawionym na intensywne mieszanie tkanki. 
 Pełne medium RPMI-10/kolagenaza: Bezpośrednio przed użyciem zrekonstytuować kolagenazę typu VIII (Sigma; przechowywać w -20 °C lub zgodnie z instrukcją producenta), a następnie dodać do pełnego medium RPMI/10 do końcowego stężenia 450-500U/ml. </li>
 <li>Po pierwszej trawieniu zebrać nadsączniki przez sitko komórkowe 100 μm; komórki przechowywać w lodzie.</li>
 <li>Przenieść nietrawioną tkankę do nowej kolby i powtórzyć krok 2.1 jeszcze dwa razy, używając świeżego pełnego medium RPMI-10/kolagenaza, tak aby łącznie przeprowadzić 3 oddzielne trawienia. Na tym etapie w roztworze nie powinny znajdować się widoczne fragmenty tkanki.</li>
 <li>Połączyć wszystkie nadsączniki z jednej próbki i zebrać je przez sitko komórkowe 100 μm. Odwirować komórki. Osady komórkowe zostaną rozdzielone przy użyciu gradientów Percoll.</li>
</ol>
3. Separowanie komórek dróg rodnych przy użyciu gradientów Percoll
<ol>
 <li>Przed użyciem przygotować poszczególne stężenia Percollu:
 <ul>
 <li>izotoniczny Percoll 100%: zmieszać stokowy Percoll (Pharmacia Biotech) z 10x PBS w stosunku 9:1. Dostosować pH do 7,4 za pomocą HCl.</li>
 <li>roztwór Percollu 40%: zmieszać 40 ml izotonicznego Percollu 100% i 60 ml kompletnego medium RPMI.</li>
 <li>roztwór Percollu 70%: zmieszać 70 ml izotonicznego Percollu 100% z 30 ml kompletnego medium RPMI.</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Każdy pellet komórkowy z kroku 6 resuspender w 40% roztworze Percollu. Do przygotowania gradientów należy użyć równą objętość 70% Percollu. Istnieją dwa sposoby przygotowania probówek z gradientem:
 <ol>
 <li>Warstwa dolna: najpierw dodać do probówki z gradientem zawiesinę komórkową w 40% Percollu, a następnie ostrożnie nałożyć pod spód 70% Percoll.</li>
 <li>Warstwa górna: najpierw dodać do probówki 70% Percoll, a następnie ostrożnie i powoli nałożyć na wierzch 40% Percoll zawierający komórki.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Próbki z gradientem należy wirować przy 900 x g w temperaturze pokojowej przez 20 min z wyłączonym hamulcem.</li>
 <li>Limfocyty znajdą się w warstwie przejściowej między warstwami 40% a 70% Percollu. Ostrożnie zebrać warstwę przejściową, przemyć medium RPMI w stosunku 1:3 i odwirować przy 740 x g. Limfocyty znajdą się w pelletcie komórkowym i będą gotowe do dalszego użycia.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Przykład izolacji limfocytów z dróg rodnych myszy oraz analizy cytometrii przepływowej (FACS) przedstawiono na Rysunku 1. Drogi rodne usunięto myszy zakażonej wewnątrzpochwowo Chlamydia muridarum 7 dni po zakażeniu. Dwie próbki dróg rodnych połączono, aby uzyskać odpowiednią liczbę limfocytów do badań funkcjonalnych i fenotypowych za pomocą FACS. Wypreparowane tkanki poddano etapom trawienia i izolacji opisanym powyżej. Zawiesinę pojedynczych komórek barwiono różnymi przeciwciałami monoklonalnymi sprzężonymi z fluorochromami przeciwko mysim CD3, CD4 i CD8. Rysunek 1 przedstawia wykres punktowy (dot-plot) komórek T CD4-dodatnich w stosunku do komórek T CD8-dodatnich, z bramkowaniem na limfocyty T CD3-dodatnie. Nasza procedura umożliwia badanie limfocytów izolowanych z dróg rodnych w różnych modelach chorób w celu oceny różnorodnych charakterystyk funkcjonalnych i fenotypowych komórek odpornościowych w różnych schorzeniach w modelu mysim. Obejmuje to różnorodne komórki odpornościowe, takie jak komórki dendrytyczne, neutrofile, makrofagi, komórki NK, NKT, limfocyty T (limfocyty T swoiste dla antygenu), limfocyty B itp.3-10.
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej, analiza rozkładu komórek CD4 vs. CD8, wyniki profilowania immunologicznego." src="/files/ftp_upload/4391/4391fig1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Limfocyty wyizolowano z dróg rodnych myszy zainfekowanych Chlamydia muridarum przy użyciu przedstawionej tutaj metody. Po zakończeniu procedury separacji limfocyty barwiono przeciwciałami CD3, CD4 i CD8 sprzężonymi z fluorochromami. Dane z kwadrantów wyznaczono dla limfocytów CD3+, przedstawiając zależność CD4+ względem CD8+ wraz z procentową zawartością komórek w bramce.

<ol><li>M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+perinatal+immune+development+on+mucosal+homeostasis+and+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The impact of perinatal immune development on mucosal homeostasis and chronic inflammation.</a> Nat. Rev Immunol. 12, 9-23 (2011).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%222010+Sexually+Transmitted+Diseases+Surveillance%22">2010 Sexually Transmitted Diseases Surveillance</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. (2010).</li>
<li>Jain, S., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+tandem+copies+of+conserved+gp41+epitopes+incorporated+in+gag+virus-like+particles+elicit+systemic+and+mucosal+antibodies+in+an+optimized+heterologous+vector+delivery+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Multiple tandem copies of conserved gp41 epitopes incorporated in gag virus-like particles elicit systemic and mucosal antibodies in an optimized heterologous vector delivery regimen.</a> Vaccine. 28, 7070-7080 (2010).</li>
<li>Tang, V. A., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravaginal+infection+with+herpes+simplex+virus+type-2+%28HSV-2%29+generates+a+functional+effector+memory+T+cell+population+that+persists+in+the+murine+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intravaginal infection with herpes simplex virus type-2 (HSV-2) generates a functional effector memory T cell population that persists in the murine genital tract.</a> J. Reprod. Immunol. 87, 39-44 (2010).</li>
<li>Gillgrass, A. E., Tang, V. A., Towarnicki, K. M., Rosenthal, K. L., Kaushic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+genital+herpes+infection+in+mice+immunized+under+different+hormonal+conditions+correlates+with+induction+of+vagina-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Protection against genital herpes infection in mice immunized under different hormonal conditions correlates with induction of vagina-associated lymphoid tissue.</a> J. Virol. 79, 3117-3126 (2005).</li>
<li>Sajic, D., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+delivery+of+CpG+oligodeoxynucleotides+expands+functional+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+vagina%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Mucosal delivery of CpG oligodeoxynucleotides expands functional dendritic cells and macrophages in the vagina.</a> Immunology. 114, 213-224 (2005).</li>
<li>Jiang, J. Q., Patrick, A., Moss, R. B., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-cell-mediated+cross-clade+protection+in+the+genital+tract+following+intranasal+immunization+with+inactivated+human+immunodeficiency+virus+antigen+plus+CpG+oligodeoxynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-cell-mediated cross-clade protection in the genital tract following intranasal immunization with inactivated human immunodeficiency virus antigen plus CpG oligodeoxynucleotides.</a> J. Virol. 79, 393-400 (2005).</li>
<li>Gill, N., Chenoweth, M. J., Verdu, E. F., Ashkar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+require+type+I+IFN+receptor+for+antiviral+responses+during+genital+HSV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection.</a> Cell Immunol. 269, 29-37 (2011).</li>
<li>Thatte, A., DeWitte-Orr, S. J., Lichty, B., Mossman, K. L., Ashkar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+IL-15+in+TLR-mediated+innate+antiviral+immunity+against+genital+HSV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A critical role for IL-15 in TLR-mediated innate antiviral immunity against genital HSV-2 infection.</a> Immunol. Cell Biol. 89, 663-669 (2011).</li>
<li>Kwant-Mitchell, A., Ashkar, A. A., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+innate+and+adaptive+immune+responses+against+herpes+simplex+virus+type+2+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mucosal innate and adaptive immune responses against herpes simplex virus type 2 in a humanized mouse model.</a> J. Virol. 83, 10664-10676 (2009).</li>
<li>Gallichan, W. S., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+estrous+cycle+on+local+humoral+immune+responses+and+protection+of+intranasally+immunized+female+nice+against+herpes+simplex+virus+type+2+infection+in+the+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Effects of the estrous cycle on local humoral immune responses and protection of intranasally immunized female nice against herpes simplex virus type 2 infection in the genital tract.</a> Virology. , 224-487 (1996).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym protokole pokazano, jak przygotować limfocyty z dróg rodnych myszy; metoda ta jest łatwa do opanowania. Najbardziej krytycznym punktem tego procesu jest zachowanie żywotności komórek poprzez utrzymywanie ich w lodzie. Wydajność komórkowa w tej metodzie zależy od techniki, umiejętności manipulacji, stanu zakażenia myszy (naiwna lub dzień po zakażeniu), patogenu (bakteryjny, wirusowy, grzybiczy) oraz badanego odcinka układu rozrodczego myszy (przewód jajowodowy, macica, odcinek pochwy lub cały układ rodny). Na...

<table><tbody><tr><td>Kollagenaza</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>C2139-1G</td><td> </td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-0891-01</td><td> </td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>11875</td><td> </td></tr></tbody></table>

izolacja limfocytów z błony śluzowej dróg rodnych myszy

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Powierzchnie śluzówkowe, w tym w przewodach pokarmowym, moczowo-płciowym i oddechowym, stanowią wrota wejścia dla patogenów, takich jak wirusy i bakterie 1. Błonony śluzowe są również miejscami indukcji odpowiedzi immunologicznej gospodarza przeciwko patogenom, czego przykładem są kępki Peyera w przewodzie pokarmowym oraz tkanka limfatyczna związana z jamą nosową w przewodzie oddechowym. Ta unikalna cecha sprawia, że odporność śluzówkowa odgrywa kluczową rolę w systemie obronnym organizmu. Wiele badań koncentrowało się na obszarach śluzówkowych przewodu pokarmowego i oddechowego. Jednakże miejsca śluzówkowe układu rozrodczego były badane w niewielkim stopniu. Śluzówka dróg rodnych jest głównym miejscem zakażenia w przypadku chorób przenoszonych drogą płciową (STD), w tym infekcji bakteryjnych i wirusowych. Choroby przenoszone drogą płciową stanowią jedno z najpoważniejszych wyzwań zdrowotnych współczesnego świata. Według szacunków Centers for Disease Control and Prevention w Stanach Zjednoczonych każdego roku dochodzi do 19 milionów nowych zakażeń. Choroby przenoszone drogą płciową kosztują amerykański system opieki zdrowotnej 17 miliardów dolarów rocznie 2, a dla poszczególnych osób generują jeszcze wyższe koszty w postaci bezpośrednich i dożywotnich następstw zdrowotnych. Aby stawić czoła temu wyzwaniu, konieczne jest lepsze zrozumienie odporności śluzówkowej układu rozrodczego, a izolacja limfocytów jest niezbędnym elementem tych badań. W niniejszym materiale przedstawiamy metodę powtarzalnej izolacji limfocytów z żeńskich dróg rodnych myszy do badań immunologicznych, która może zostać zmodyfikowana i dostosowana do innych gatunków. Opisana poniżej metoda została opracowana dla jednej myszy.

Opisano wydajną metodę izolacji limfocytów z dróg rodnych myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne oraz separację w gradiencie Percoll w celu zapewnienia efektywnej izolacji. Technikę tę można również dostosować do zastosowania u innych gatunków

Izolacja limfocytów z błony śluzowej dróg rodnych myszy

Powierzchnie śluzowe, w tym w obrębie przewodu pokarmowego, układu moczowo-płciowego oraz dróg oddechowych, stanowią bramy wnikania dla patogenów, takich jak wirusy i ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie limfocytów z dróg rodnych myszy. Osiąga się to poprzez najpierw usunięcie całego układu rozrodczego i posiekanie tkanki na małe kawałki, aby uwolnić limfocyty z tkanki. Drobno posiekaną tkankę trawi się kolagenazą ósmą przy jednoczesnym energicznym mieszaniu tkanki w temperaturze 37 °C.Przy zastosowaniu mieszania magnetycznego limfocyty są następnie izolowane za pomocą gradientu gęstości Percoll. Ostatecznie limfocyty mogą zostać scharakteryzowane metodą cytometrii przepływowej. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na diagnostykę i terapię chorób reprodukcyjnych. Metoda ta pozwala zrozumieć zachowanie limfocytów tkankowych, które często różnią się od limfocytów izolowanych z krwiobiegu.Chociaż metoda ta pozwala na analizę błony śluzowej układu rozrodu, można ją zastosować również do innych układów, takich jak błony śluzowe jelit i dróg oddechowych. Po uśmierceniu samicy myszy, używając nożyczek chirurgicznych, wykonaj niskie nacięcie w linii środkowej, a następnie rozchyl skórę. Delikatnie odsuń jelita, zlokalizuj ucs, a następnie wyizoluj i usuń cały układ rodny, od ucs aż do ujścia pochwy.Umieść drogi rodne w szalce Petriego.

isolation-of-lymphocytes-from-mouse-genital-tract-mucosa

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja limfocytów z błony śluzowej narządów płciowych myszy

Izolacja limfocytów przy użyciu zestawu Miltenyi MACs jest niezawodną metodą oczyszczania komórek z homogenatów całych tkanek limfatycznych. Komórki oczyszczone za pomocą systemu Miltenyi charakteryzują się zazwyczaj czystością ≥ 96%. W niniejszym materiale przedstawiamy kroki niezbędne do izolacji komórek T CD4+, wykorzystując jeden z wielu zestawów oferowanych przez firmę Miltenyi.

Izolacja limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem oczyszczania metodą Miltenyi MACS

W tym filmie pokazujemy izolację limfocytów z pobranej myszy łaty Peyera. Wyizolowane limfocyty można wykorzystać do dalszej analizy.

Izolacja limfocytów z mysiego plastra Peyera

Rośnie zainteresowanie zrozumieniem funkcji immunologicznych określonych subpopulacji komórek w łatach Peyera (PP), głównych miejscach indukcyjnych tkanek limfatycznych związanych z jelitami.  W tym miejscu przedstawiamy równoległe protokoły przygotowania preparatów pojedynczych komórek PP do analizy cytometrii przepływowej i kriosekcji PP do barwienia immunologicznego.

Izolowanie i barwienie immunologiczne limfocytów i komórek dendrytycznych z mysich plastrów Peyera

Z funkcjami efektorowymi odmiennymi od innych podzbiorów limfocytów T, komórki Th17 są centralnie zaangażowane w autoimmunizację zapalną. Ten protokół różnicowania Th17 in vitro zapewnia środki do określenia, czy naiwne limfocyty T CD4 + mogą różnicować się w komórki Th17 i dalszego badania ich roli w autoimmunizacji i odpowiedzi gospodarza.

Izolacja i różnicowanie Th17 naiwnych limfocytów T CD4

Izolacja komórek zrębu węzłów chłonnych to wieloetapowa procedura obejmująca trawienie enzymatyczne i mechaniczną dezagregację w celu uzyskania fibroblastycznych komórek siatkowatych, limfatycznych i komórek śródbłonka krwi. W opisanej procedurze krótkie trawienie jest połączone z automatyczną dezagregacją mechaniczną w celu zminimalizowania degradacji markerów powierzchniowych żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych.

Izolacja komórek zrębu mysich węzłów chłonnych

Opisujemy tutaj protokół izolacji komórek szpikowych ze skóry myszy i drenowania węzłów chłonnych po śródskórnym wstrzyknięciu sporozoitów Plasmodium. Cytometria przepływowa pobranych komórek zapewnia wiarygodny test charakteryzujący reakcję zapalną skóry i węzłów chłonnych drenujących na pasożyta.

Izolacja komórek szpikowych ze skóry myszy i drenaż węzłów chłonnych po szczepieniu śródskórnym żywymi atenuowanymi sporozoitami zarodźca

Rośnie zainteresowanie ilościową charakterystyką limfocytów jelitowych ze względu na coraz większą świadomość, że komórki te odgrywają kluczową rolę w różnych chorobach jelitowych i ogólnoustrojowych. W tym protokole opisujemy, jak izolować populacje pojedynczych komórek z różnych przedziałów jelita cienkiego w celu późniejszej charakterystyki cytometrii przepływowej.

Izolacja i charakterystyka cytometryczna mysich limfocytów jelita cienkiego

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych, w tym tkanki limfatycznej związanej z jelitami, plam Peyera i drenujących węzłów chłonnych krezkowych, oraz miejsc efektorowych, w tym blaszki właściwej i nabłonka jelitowego układu odpornościowego jelita cienkiego.

Izolowanie limfocytów od układu odpornościowego myszy w jelicie cienkim

W tym badaniu prezentujemy nowatorski i skuteczny protokół izolacji limfocytów z plastrów Peyera (PPs), który może być następnie wykorzystany do testów funkcjonalnych in vivo i in vitro, a także do badań cytometrycznych komórek T pomocniczych pęcherzyków i komórek B centrum rozrodczego.

Odkrywanie kluczowych graczy odporności humoralnej: zaawansowany i zoptymalizowany protokół izolacji limfocytów z plastrów mysich Peyera

Ten artykuł opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka z naczyń włosowatych limfatycznych skóry za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane komórki śródbłonka limfatycznego można wykorzystać do dalszych eksperymentów in vitro i analizy ekspresji białek.

Mysia izolacja komórek śródbłonka limfatycznego skóry

Poznaj metodę izolacji limfocytów z dróg rodnych myszy przy użyciu trawienia kolagenazą i gradientu Percolla. Technika ta umożliwia charakterystykę komórek przez cytometrię przepływową i zastosowanie w badaniach nad chorobami reprodukcyjnymi.

Izolacja limfocytów z błony śluzowej dróg rodnych myszy

Przeglądaj więcej filmów