Name: Owad Galleria mellonella jako potężny model infekcji do badania patogenezy bakteryjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: Poznaj metody infekcji larw Galleria mellonella bakteriami patogennymi w celu badania czynników wirulencji. Ten model owadzi pozwala uniknąć etycznych problemów związanych z badaniami na ssakach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować Elisabeth Guillemet, Christophe’owi Buissonowi oraz Ludovicowi Bridoux za doskonałą pomoc techniczną. Jesteśmy bardzo wdzięczni Sylvie Salamitou i Sinda Fedhila za wstępną konfigurację systemu.

1. Hodowla owadów
Cały cykl od jaja do ostatniego stadium larwalnego trwa około 5 tygodni w temperaturze 25 °C. Uzyskanie dorosłych motyli wymaga dodatkowo 1 lub 2 tygodni.
<ol>
 <li>Umieść co najmniej 100 poczwarek lub nowo wyklutych dorosłych motyli G. mellonella w drucianej klatce o pojemności 5 litrów. Samce mają rozmiar od 10 do 15 mm. Dorosły samiec jest beżowy z bladymi jasnymi i ciemnymi oznaczeniami. Samice mają rozmiar około 20 mm. Samice są ciemniejsze od samców i mają kolor brązowo-szary.</li>
 <li>Zawieś w klatce dwa zestawy czterowarstwowego papieru do składania jaj. Po 2 dniach dorosła samica złoży jaja na krawędzi między arkuszami papieru.</li>
 <li>Dwa razy w tygodniu przenieś papier z jajami do nowych plastikowych pojemników hodowlanych z kratek umożliwiających cyrkulację powietrza, zawierających pyłek i wosk pszczeli. Jaja wykluwają się w ciągu około 3 dni, a małe larwy zaczynają się rozwijać, żywiąc się woskiem i pyłkiem. Alternatywnie larwy można umieścić na sztucznej pożywce składającej się z mieszanki 500 g płynnego miodu, 400 g gliceryny, 100 g suszonych drożdży piwnych, 250 g mąki pszennej, 200 g odtłuszczonego mleka w proszku i 400 g polenty.
 Aby zapewnić odpowiednią proporcję pokarmu na larwę, regularnie przenoś larwy do nowych pojemników i uzupełniaj pożywkę co dwa dni.</li>
 <li>Larwy są hodowane przez sześć stadiów larwalnych. Każde stadium charakteryzuje się zrzuceniem torebki głowowej larw. Gdy larwy osiągną ostatni etap przed przepoczwarczeniem, przestają żerować i zaczynają budować lekki jedwabny kokon.</li>
 <li>W ochronnych kokonach larwy przechodzą w stan spoczynku i przekształcają się w poczwarki. Wośniaki pozostają w stadium poczwarki od jednego do dwóch tygodni, aż wyklują się jako dorosłe ćmy. Dorosłe ćmy nie piją ani nie jedzą. Następuje kopulacja i cykl życiowy wośniaka rozpoczyna się od nowa.</li>
 <li>Aby zestandaryzować test patologiczny, pobierz larwy w ostatnim stadium larwalnym. W tym stadium przestają one żerować, przemieszczają się do pokrywy pojemnika hodowlanego i zaczynają wytwarzać jedwab. Etap ten trwa około 5 dni.</li>
</ol>
2. Wybór owadów do zakażenia
<ol>
 <li>Na 24 h przed zakażeniem należy wybrać larwy w ostatnim stadium rozwojowym, o długości 2-3 cm i masie 180-250 mg, a następnie umieścić je w pustym pudełku w celu ich zagłodzenia.</li>
 <li>Należy usunąć nascent silk cocoon otaczający larwy.</li>
</ol>
3. Przygotowanie bakterii
<ol>
 <li>Przygotować zawiesiny bakterii Bacillus, aby uzyskać stężenia końcowe w zakresie od 104 jednostek tworzących kolonie (cfu)/ml do 108 cfu/ml dla iniekcji do jam ciała (hemocelu) oraz od 3x106 cfu/ml do 1x108 cfu/ml w przypadku podania doustnego (liczba cfu niezbędna do uzyskania LD50 zależy od gatunku bakterii). W naszym przypadku B. cereus jest hodowany w bulionie Luria-Bertani (LB, 10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego, 10 g/l NaCl) w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem do momentu wejścia w fazę stacjonarną, co odpowiada zakrzywieniu krzywej wzrostu. Zmierzyć OD 600 nm (między 1 a 2 dla B. cereus) i wykorzystać tę wartość do oceny stężenia bakterii, posługując się wcześniej sporządzoną krzywą miareczkowania. Bakterie zebrać poprzez wirowanie przy 5,000 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej i resuspender w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS: 1M KH2PO4, 1M K2HPO4, 5M NaCl, pH 7.2). Każda larwa otrzyma 10 μl zawiesiny bakterii o pożądanym stężeniu.</li>
 <li>Alternatywnie do infekcji można przygotować zawiesinę przetrwalników. Przetrwalniki uzyskać poprzez hodowlę bakterii w pożywce do sporulacji HCT (5 g/L tryptonu, 2 g/L hydrolizatu kazeiny, 12.5 mM K2HPO4, 12.5 mM MgSO4, 0.05 mM MnSO4, 1.2 mM ZnSO4, 1.2 mM Fe2(SO4)3, 0.5% H2SO4, 25 mM CaCl2)20 w temperaturze 30 °C przez 3 dni. Przetrwalniki zebrać przez wirowanie (10,000 x g, 15 min) i dwukrotnie przemyć w sterylnej wodzie destylowanej. Osad z przetrwalników resuspender w sterylnej wodzie destylowanej i podgrzewać przez 15 min w temperaturze 78 °C w celu usunięcia pozostałych bakterii w formie wegetatywnej. Oznaczyć miano zawiesiny poprzez wysianie rozcieńczeń seryjnych na płytki z agarem LB. Każda larwa otrzyma 10 μl zawiesiny przetrwalników o pożądanym stężeniu.</li>
</ol>
4. Przygotowanie toksyny Cry
<ol>
 <li>Przygotować toksynę Cry1C z cepu B. thuringiensis 407 przekształconego plazmidem pHTF31C21 zawierającym gen kodujący Cry1C. Hodować cep w 100 ml pożywki HCT w temperaturze 30 °C przez 72 hr z dodatkiem antybiotyku (erytromycyna 10mg/ml), aby umożliwić pełną sporulację, produkcję kryształów toksyny oraz ich uwalnianie do supernatantu hodowli.</li>
 <li>Oczyścić kryształy z supernatantu na gradiencie sacharozy 72%-79%. Najpierw dodać 17 ml 79% sacharozy do probówki o pojemności 40 ml. Ostrożnie nałożyć 17 ml 72% sacharozy na warstwę 79% sacharozy. Na koniec nałożyć 5-6 ml 10X skoncentrowanej hodowli z przetrwalnikami i zamknąć probówkę. Wirować probówkę przez 14 hr przy 20,000 x g w temperaturze 4 °C, aby oddzielić kryształy od przetrwalników. Zebrać kryształy z granicy gradientu. Resuspender osad z kryształów w 25 ml zimnej sterylnej wody w celu ich wypłukania. Wirować przy 8,000 x g przez 20 min. Krok ten powtórzyć trzykrotnie, aby usunąć całą sacharozę przylegającą do kryształów. Resuspender kryształy w 5 ml sterylnej wody i obserwować pod mikroskopem w celu oceny czystości. </li>
 <li>Ocenić stężenie białka toksyny za pomocą klasycznego barwienia metodą Bradforda w roztworze kryształów uprzednio rozpuszczonych w 50 mM NaOH. Kryształy toksyny można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia. </li>
</ol>
5. Przygotowanie wtryskiwacza
<ol>
 <li>Aby kontrolować precyzyjną objętość wstrzykiwania, należy użyć automatycznej pompy strzykawkowej (np. KD Scientific KDS 100), ustawiając prędkość na 1 μl/sec (Rycina 1A).</li>
 <li>Napełnij strzykawkę podskórną o pojemności 1 ml ilością 300 μl wody lub roztworu bakteryjnego (1 strzykawka na jeden wariant) do zakażenia 20-25 larw. Usuń pęcherzyki powietrza, ostrożnie stukując strzykawkę, a następnie przymocuj do niej igłę o rozmiarze 0.45 x 12 mm.</li>
 <li>Umieść strzykawkę w injektorze.</li>
 <li>Wykonaj kontrolne wstrzyknięcie 10 μl do pustej probówki, aby sprawdzić objętość wstrzykiwanej cieczy.</li>
</ol>
6. Iniekcja do hemocelu owadów
<ol>
 <li>Przymocuj owada ręcznie między kciukiem a palcem wskazującym. Następnie wprowadź igłę zamocowaną w injektorze w skórę (kutykulę) larwy (Rysunek 1C).</li>
 <li>Przytrzymaj owada w miejscu podczas wstrzykiwania 10 μl roztworu bakteryjnego (zarodników lub bakterii w formie wegetatywnej).</li>
 <li>Ostrożnie zdejmij owada z igły.</li>
 <li>Umieść zainfekowanego owada w małej szalce Petriego (średnica 5 cm), po 5 larw na szalkę.</li>
 <li>Zainfekuj co najmniej 20 larw dla każdego warunku eksperymentalnego.</li>
 <li>Umieść szalki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 48 hr.</li>
</ol>
7. Przymusowe karmienie owadów (podawanie doustne)
<ol>
 <li>W probówce Eppendorfa o pojemności 2 ml zmieszać toksynę Cry1C o stężeniu 0,2 μg/μl z zawiesiną przetrwalników lub komórek wegetatywnych, aby uzyskać stężenia końcowe w zakresie od 3x104 do 1x107 na 10 μl.</li>
 <li>Napełnić strzykawkę 1 ml z igłą hipodermiczną 30G o długości 25 mm ilością 300 μl roztworu bakterii i toksyny Cry1C w celu zakażenia 20–25 larw. Usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki.</li>
 <li>Umieścić owada ręcznie w taki sposób, aby jego aparat gębowy znalazł się w igle zamocowanej w injektorze (Rysunek 1D), a następnie podać mu przymusowo 10 μl roztworu bakteryjnego przy użyciu zautomatyzowanej pompy strzykawkowej.</li>
 <li>Zakaź co najmniej 20 larw dla każdego wariantu doświadczalnego.</li>
 <li>Umieścić zakażone owady w małej szalce Petriego o średnicy 5 cm (po 5 larw na szalkę). Inkubować szalki w temperaturze 37 °C przez 48 hr.</li>
</ol>
8. Rejestracja śmiertelności owadów
<ol>
 <li>Po eksperymentach z przymusowym karmieniem lub iniekcjami, należy utrzymywać larwy w szalce Petri bez pożywienia w temperaturze 25 °C lub 37 °C. Śmiertelność larw należy sprawdzać regularnie w okresie 48 hr. Martwe larwy są nieaktywne i zazwyczaj czernieją (Rysunek 1B). </li>
 <li>Dane dotyczące śmiertelności można analizować za pomocą programu log-Probit14. Program ten testuje liniowość krzywych śmiertelności w zależności od dawki i wyznacza dawki letalne (LD50). Alternatywnie można zastosować inne programy, takie jak Prism (Graph Pad), służące do analizy danych dotyczących przeżywalności lub śmiertelności. </li>
</ol>

<ol><li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 697-743 (2007).</li>
<li>Vodovar, N., Acosta, C., Lemaitre, B., Boccard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%3A+a+polyvalent+model+to+decipher+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila: a polyvalent model to decipher host-pathogen interactions.</a> Trends Microbiol. 12, 235-242 (2004).</li>
<li>Dalhammar, G., Steiner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+inhibitor+A%2C+a+protease+from+Bacillus+thuringiensis+which+degrades+attacins+and+cecropins%2C+two+classes+of+antibacterial+proteins+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterization of inhibitor A, a protease from Bacillus thuringiensis which degrades attacins and cecropins, two classes of antibacterial proteins in insects.</a> Eur. J. Biochem. 139, 247-252 (1984).</li>
<li>Jander, G., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+correlation+between+virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+mutants+in+mice+and+insects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Positive correlation between virulence of Pseudomonas aeruginosa mutants in mice and insects.</a> J. Bacteriol. 182, 3843-3845 (2000).</li>
<li>Purves, J., Cockayne, A., Moody, P. C., Morrissey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+regulation%2C+metabolic+functions%2C+and+roles+in+virulence+of+the+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+homologues+gapA+and+gapB+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Comparison of the regulation, metabolic functions, and roles in virulence of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase homologues gapA and gapB in Staphylococcus aureus.</a> Infect. Immun. 78, 5223-5232 (2010).</li>
<li>Chadwick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+responses+of+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Fed.+Proc%22%5BJournal%5D)">Serological responses of insects.</a> Fed. Proc. 26, 1675-1679 (1967).</li>
<li>Chadwick, J. S., Caldwell, S. S., Chadwick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adherence+patterns+and+virulence+for+Galleria+mellonella+larvae+of+isolates+of+Serratia+marcescens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invertebr.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Adherence patterns and virulence for Galleria mellonella larvae of isolates of Serratia marcescens.</a> J. Invertebr. Pathol. 55, 133-134 (1990).</li>
<li>Gao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+novel+point+mutations+in+clinical+Staphylococcus+aureus+reduce+linezolid+susceptibility+and+switch+on+the+stringent+response+to+promote+persistent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Two novel point mutations in clinical Staphylococcus aureus reduce linezolid susceptibility and switch on the stringent response to promote persistent infection.</a> PLoS Pathog. 6, e1000944(2010).</li>
<li>Peleg, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+susceptibility+to+vancomycin+influences+pathogenicity+in+Staphylococcus+aureus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Reduced susceptibility to vancomycin influences pathogenicity in Staphylococcus aureus infection.</a> J. Infect. Dis. 199, 532-536 (2009).</li>
<li>Salamitou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plcR+regulon+is+involved+in+the+opportunistic+properties+of+Bacillus+thuringiensis+and+Bacillus+cereus+in+mice+and+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The plcR regulon is involved in the opportunistic properties of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus in mice and insects.</a> Microbiology. 146, 2825-2832 (2000).</li>
<li>Cadot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InhA1%2C+NprA+and+HlyII+as+candidates+to+differentiate+pathogenic+from+non-pathogenic+Bacillus+cereus+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">InhA1, NprA and HlyII as candidates to differentiate pathogenic from non-pathogenic Bacillus cereus strains.</a> J. Clin. Microbiol. 48, 1358-1365 (2010).</li>
<li>Rejasse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependent+production+of+various+PlcR-controlled+virulence+factors+in+Bacillus+weihenstephanensis+strain+KBAB4%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependent production of various PlcR-controlled virulence factors in Bacillus weihenstephanensis strain KBAB4.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 2553-2557 (2012).</li>
<li>Jones, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorhabdus+adhesion+modification+protein+%28Pam%29+binds+extracellular+polysaccharide+and+alters+bacterial+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photorhabdus adhesion modification protein (Pam) binds extracellular polysaccharide and alters bacterial attachment.</a> BMC Microbiol. 10, 141(2010).</li>
<li>Finney, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFinney%2C+DJ+%22Probit+analysis%22">Probit analysis</a>. , Cambridge University Press. (1971).</li>
<li>Fedhila, S., Nel, P., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+InhA2+metalloprotease+of+Bacillus+thuringiensis+strain+407+is+required+for+pathogenicity+in+insects+infected+via+the+oral+route%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The InhA2 metalloprotease of Bacillus thuringiensis strain 407 is required for pathogenicity in insects infected via the oral route.</a> J. Bacteriol. 184, 3296-3304 (2002).</li>
<li>Guillemet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+InhA+metalloproteases+of+Bacillus+cereus+contribute+concomitantly+to+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The InhA metalloproteases of Bacillus cereus contribute concomitantly to virulence.</a> J. Bacteriol. 192, 286-294 (2010).</li>
<li>Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lereclus, D., Givaudan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+insect+pathogen+bacteria+Bacillus+thuringiensis+and+Xenorhabdus%2FPhotorhabdus+occupy+their+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 1-12 (2012).</li>
<li>Bottone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+cereus%2C+a+volatile+human+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacillus cereus, a volatile human pathogen.</a> Clin. Microbiol. Rev. 23, 382-398 (2010).</li>
<li>Stenfors Arnesen, L., Fagerlund, A., Granum, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+soil+to+gut%3A+Bacillus+cereus+and+its+food+poisoning+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">From soil to gut: Bacillus cereus and its food poisoning toxins.</a> FEMS Microbiol. Rev. 32, 579-606 (2008).</li>
<li>Lecadet, M., Blondel, M. O., Ribier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+transduction+in+Bacillus+thuringiensis+var.+berliner+1715%2C+using+bacteriophage+CP54%5BTitle%5D)+AND+%22Ber.+J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Generalized transduction in Bacillus thuringiensis var. berliner 1715, using bacteriophage CP54.</a> Ber. J. Gen. Microbiol. 121, 203-212 (1980).</li>
<li>Sanchis, V., Agaisse, H., Chaufaux, J., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+new+insecticidal+Bacillus+thuringiensis+recombinant+strains+by+using+the+sporulation+non-dependent+expression+system+of+cryIIIA+and+a+site+specific+recombination+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction of new insecticidal Bacillus thuringiensis recombinant strains by using the sporulation non-dependent expression system of cryIIIA and a site specific recombination vector.</a> J. Biotechnol. 48, 81-96 (1996).</li>
<li>Tran, S. L., Guillemet, E., Gohar, M., Lereclus, D., Ramarao, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CwpFM+%28EntFM%29+is+a+Bacillus+cereus+potential+cell+wall+peptidase+implicated+in+adhesion%2C+biofilm+formation+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">CwpFM (EntFM) is a Bacillus cereus potential cell wall peptidase implicated in adhesion, biofilm formation and virulence.</a> J. Bacteriol. 192, 2638-2642 (2010).</li>
<li>Tran, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolysin+II+is+a+Bacillus+cereus+virulence+factor+that+induces+apoptosis+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hemolysin II is a Bacillus cereus virulence factor that induces apoptosis of macrophages.</a> Cell Microbiol. 13, 92-108 (2011).</li>
<li>Fedhila, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+virulence+of+invertebrate+and+mammalian+pathogenic+bacteria+in+the+oral+insect+infection+model+Galleria+mellonella%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invertebr.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the virulence of invertebrate and mammalian pathogenic bacteria in the oral insect infection model Galleria mellonella.</a> J. Invertebr. Pathol. 103, 24-29 (2010).</li>
<li>Daou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IlsA%2C+a+unique+surface+protein+of+Bacillus+cereus+required+for+iron+acquisition+from+heme%2C+hemoglobin+and+ferritin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">IlsA, a unique surface protein of Bacillus cereus required for iron acquisition from heme, hemoglobin and ferritin.</a> PLoS Pathog. 5, e1000675(2009).</li>
<li>Mason, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+commensal+to+pathogen%3A+translocation+of+Enterococcus+faecalis+from+the+midgut+to+the+hemocoel+of+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">From commensal to pathogen: translocation of Enterococcus faecalis from the midgut to the hemocoel of Manduca sexta.</a> MBio. 2, e00065-00011(2011).</li>
<li>Goldsmith, M. R., Shimada, T., Abe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+and+genomics+of+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">The genetics and genomics of the silkworm, Bombyx mori.</a> Annu. Rev. Entomol. 50, 71-100 (2005).</li>
<li>Fraser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+transgenesis%3A+current+applications+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Insect transgenesis: current applications and future prospects.</a> Annu. Rev. Entomol. 57, 267-289 (2012).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Wykorzystanie owadów, a w szczególności stadium larwalnego, jako modeli zakażeń dla wielu patogenów staje się coraz powszechniejsze. Modelem preferowanym w niektórych aspektach jest Drosophila (model muszki), wykorzystywana zarówno w stadium imago, jak i larwalnym1,2. Owad z rzędu motyli G. mellonella jest również głównym modelem stosowanym do oceny wirulencji bakterii poprzez wstrzykiwanie. Przewagą jest tolerancja wyższych temperatur (powyżej 37 °C) niż w przypadku Drosophila (maks...

<table><tbody><tr><td>Wosk i pyłek</td><td>La Ruche Roanaise</td><td>303000</td><td>Dowolny producent miodu</td></tr><tr><td>Automatyczna pompa strzykawkowa</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 100</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Terumo</td><td>BS 01T</td><td></td></tr><tr><td>Igła 0,45 x 12 mm</td><td>Terumo</td><td>NN 2613R</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 5 cm</td><td>VWR</td><td>89000-300</td><td></td></tr><tr><td>Igła podskórna 30G, 25 mm</td><td>Burkard Mfg. Co. Ltd.</td><td>PDE0005</td><td></td></tr></tbody></table>

owad galleria mellonella jako potężny model infekcji do badania patogenezy bakteryjnej

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Badanie wirulencji bakterii często wymaga odpowiedniego modelu zwierzęcego. Ssące modele infekcji są kosztowne i mogą budzić problemy etyczne. Wykorzystanie owadów jako modeli infekcji stanowi cenną alternatywę. W porównaniu z innymi bezkręgowymi organizmami modelowymi, takimi jak nicienie, owady posiadają stosunkowo zaawansowany system obrony przeciwdrobnoustrojowej, dzięki czemu z większym prawdopodobieństwem dostarczają informacji istotnych dla procesu infekcji u ssaków. Podobnie jak ssaki, owady posiadają złożony wrodzony układ odpornościowy1. Komórki w hemolimfie są zdolne do fagocytozy lub enkapsulacji najeźdźców mikrobialnych, a odpowiedzi humoralne obejmują indukowaną produkcję lizozymu i małych peptydów antybakteryjnych2,3. Ponadto analogie występują pomiędzy komórkami nabłonkowymi jelita środkowego larw owadów a komórkami jelitowymi układów trawiennych ssaków. Wreszcie, kilka podstawowych komponentów niezbędnych dla procesu infekcji bakteryjnej, takich jak adhezja komórkowa, oporność na peptydy przeciwdrobnoustrojowe, degradacja tkanek i adaptacja do stresu oksydacyjnego, prawdopodobnie odgrywa istotną rolę zarówno u owadów, jak i u ssaków1. Zatem owady są wszechstronnymi narzędziami do identyfikacji i charakteryzacji czynników wirulencji mikrobów biorących udział w infekcjach u ssaków.
Wykazano, że larwy omacnicy pszczelej Galleria mellonella pozwalają na przydatną analizę patogenezy szerokiego zakresu infekcji mikrobiologicznych, w tym ssaczych patogenów grzybiczych (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) oraz bakteryjnych, takich jak Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes lub Enterococcus faecalis4-7. Niezależnie od gatunku bakterii, wyniki uzyskane z larw Galleria zainfekowanych poprzez bezpośredni wtrysk przez kutykulę konsekwentnie korelują z wynikami podobnych badań na ssakach: szczepy bakteryjne, które są atenuowane w modelach ssaczych, wykazują niższą zjadliwość w modelu Galleria, a szczepy wywołujące ciężkie infekcje u ludzi są również wysoce zjadliwe w modelu Galleria8-11. Infekcja doustna Galleria jest znacznie rzadziej stosowana i wymagane są dodatkowe związki, takie jak specyficzne toksyny, aby osiągnąć śmiertelność.
G. mellonella wykazują szereg zalet technicznych: są stosunkowo duże (larwy ostatniego stadium przed przepoczwarczeniem mają około 2 cm długości i ważą 250 mg), co umożliwia wstrzykiwanie określonych dawek bakterii; mogą być hodowane w różnych temperaturach (od 20 °C do 30 °C), a badania nad infekcjami można prowadzić w zakresie od 15 °C do powyżej 37 °C12,13, co pozwala na przeprowadzanie eksperymentów naśladujących środowisko ssaków. Ponadto hodowla owadów jest łatwa i stosunkowo tania. Infekcja larw umożliwia monitorowanie wirulencji bakterii za pomocą kilku metod, w tym obliczanie LD5014, pomiar przeżywalności bakterii15,16 oraz badanie procesu infekcji17. W niniejszej pracy opisujemy hodowlę owadów, obejmującą wszystkie stadia życiowe G. mellonella. Przedstawiamy szczegółowy protokół infekcji za pomocą dwóch dróg podania: doustnej i do jamy hemolimfatycznej. Modelem bakteryjnym wykorzystanym w tym protokole jest Bacillus cereus, patogen Gram-dodatni wywołujący infekcje żołądkowo-jelitowe, a także inne ciężkie, miejscowe lub systemiczne zakażenia oportunistyczne18,19.

Wstrzyknięcie bakterii do hemocelu G. mellonella okazało się bardzo użyteczne w identyfikacji wielu czynników wirulencji związanych z uszkadzaniem tkanek oraz opornością na czynniki odporności wrodzonej u kilku ludzkich patogenów. Jako przykład, rycina 2A przedstawia śmiertelność owadów po wstrzyknięciu różnych dawek bakterii B. cereus (szczepy dzikie i mutanty)22. Rycina 2B przedstawia przeżywalność bakterii po zakażeniu G. mellonella przez Pseu...

Opisano doustną i wewnątrzhemokoliczną infekcję larw mchowca dużego Galleria mellonella. Owad ten może być wykorzystywany do badania czynników wirulencji bakterii entomopatogennych, a także oportunistycznych bakterii ssaków. Opisano hodowlę owadów, metody infekcji oraz przykłady analiz in vivo.

Owad Galleria mellonella jako potężny model infekcji do badania patogenezy bakteryjnej

Badanie wirulencji bakterii często wymaga odpowiedniego modelu zwierzęcego. Ssącze modele infekcji są kosztowne i mogą budzić kwestie etyczne. Zastosowanie ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zakażenie larw owadów Galleria melanoma bakteriami patogennymi. W tym celu larwy owadów doprowadza się do odpowiedniego stadium wzrostu i przygotowuje roztwór bakteryjny. Następnie larwy zakaża się bakteriami poprzez wstrzyknięcie do hemolimfy lub przymusowe karmienie, a następnie monitoruje się śmiertelność larw w okresie 48 godzin.Analiza uzyskanych danych opisuje wirulencję bakterii w owadzim modelu infekcji. Owady dają tę przewagę, że posiadają zaawansowany system obrony przeciwdrobnoustrojowej, a w szczególności złożony wrodzony układ odpornościowy, dzięki czemu pozwalają uniknąć kosztów i kwestii etycznych, które mogą wystąpić przy stosowaniu modeli ssaków. Owady stanowią doskonały alternatywny model dla infekcji u ssaków.Pracujemy z larwami moli woskowki *Galleria mellonella*, które są stosunkowo duże i mogą być wykorzystywane w badaniach nad infekcjami prowadzonych w temperaturze od 15 do ponad 37 stopni. Aby odwzorować środowisko ssaków, Carina NI zaprezentuje procedurę hodowli, a Elizabeth GME i Christophe Beon zaprezentują protokoły zakażania. Cały cykl od jaja do larwy piątego stadium trwa około pięciu tygodni.W temperaturze 25°C

the-insect-galleria-mellonella-as-powerful-infection-model-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Owada-Karashima et al. opisali szczegółowo odpowiedź odpornościową G. mellonella na zakażenie różnymi szczepami A. baumannii [18].

Ten film demonstruje metodę tworzenia modelu infekcji Mycobacterium bovis u larw woskowej większej, Galleria mellonella. Bioluminescencyjny szczep Mycobacterium bovis BCG jest wstrzykiwany do hemolimfy larwy w celu wywołania infekcji, a bioluminescencja jest mierzona w określonych odstępach czasu w celu zbadania postępu infekcji.

Technika tworzenia modelu infekcji bakteryjnej u larw owadów

Larwa woskowej Galleria mellonella została niedawno ustanowiona jako model in vivo do badania infekcji Legionella pneumophila. W tym miejscu demonstrujemy podstawowe techniki charakteryzujące patogenezę Legionelli w larwach, w tym inokulację, pomiar zjadliwości i replikacji bakterii, a także ekstrakcję i analizę zakażonych hemocytów.

Wykorzystanie Galleria mellonella jako organizmu modelowego do badania zakażenia Legionella pneumophila

Galleria mellonella służy jako model bezkręgowców dla rozsianej kandydozy. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół infekcji i podajemy dane pomocnicze dotyczące skuteczności modelu.

Model zakażenia robakiem woskowym Galleria mellonella dla rozsianej kandydozy

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół dla modelu doustnego podawania z użyciem larw Galleria mellonella i jak scharakteryzować indukowane wrodzone reakcje immunologiczne. Korzystając z tego protokołu, naukowcy bez praktycznego doświadczenia będą mogli stosować metodę wymuszonego karmienia G. mellonella.

Model doustnego podawania Galleria mellonella do badania wrodzonych odpowiedzi immunologicznych wywołanych komensalem

Galleria mellonella została niedawno uznana za powtarzalny, tani i etycznie akceptowalny model infekcji dla kompleksu Mycobacterium tuberculosis. W tym miejscu opisujemy i demonstrujemy kroki podjęte w celu ustalenia skutecznego zakażenia G. mellonella bioluminescencyjnym Mycobacterium bovis BCG lux.

Wykorzystanie bezkręgowców Galleria mellonella jako modelu infekcji do badania kompleksu Mycobacterium tuberculosis

Niniejsze badanie przedstawia ustandaryzowane ramy optymalizacji modeli zakażenia G. mellonella do zastosowań w przedklinicznej ocenie antybakteryjnej. Zastosowanie modelu G. mellonella w ramach przedklinicznego procesu rozwoju środków przeciwdrobnoustrojowych może zmniejszyć liczbę nieskutecznych związków przechodzących do badań klinicznych.

Galleria mellonella jako model przesiewowy przeciwdrobnoustrojów

Współistnienie infekcji wirusem grypy A jest jednym z czynników uwikłanych w indukcję inwazyjnej choroby pneumokokowej podczas bezobjawowego nosicielstwa Streptococcus pneumoniae. W niniejszej pracy opisujemy metodę infekcji mieszanej z wykorzystaniem myszy noworodkowych w celu zbadania synergizmu między tymi dwoma patogenami dróg oddechowych.

Wykorzystanie obrazowania bioluminescencyjnego do badania synergizmu pomiędzy Streptococcus pneumoniae a wirusem grypy typu A u młodych myszy

Niniejszy artykuł opisuje procedurę tworzenia i wizualizacji biofilmu bakteryjnego hodowanego w szkiełku przedmiotowym z komorą...

In vitro tworzenie biofilmu w szkiełku przedmiotowym z 8-komorowym układem

Opisano metody obrazowania bioluminescencyjnego infekcji bakteryjnych u żywych zwierząt. Patogeny są modyfikowane w celu ekspresji lucyferazy, co umożliwia optyczne obrazowanie całego ciała w celu wykrycia infekcji u żywych zwierząt. Modele zwierzęce mogą zostać zainfekowane patogenami wykazującymi ekspresję lucyferazy, a wynikający z tego przebieg choroby może być wizualizowany w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Wykorzystanie lucyferazy do obrazowania infekcji bakteryjnych u myszy

Podczas procesu infekcji kluczowym etapem jest adhezja patogenów do komórek gospodarza. W większości przypadków etap adhezji ten zachodzi w obecności stresu mechanicznego generowanego przez przepływającą ciecz. Opisujemy technikę, która wprowadza naprężenie ścinające jako istotny parametr w badaniu adhezji bakteryjnej.

Wprowadzenie naprężenia ścinającego w badaniach nad adhezją bakteryjną

Poznaj metody infekcji larw Galleria mellonella bakteriami patogennymi w celu badania czynników wirulencji. Ten model owadzi pozwala uniknąć etycznych problemów związanych z badaniami na ssakach.

Owad Galleria mellonella jako potężny model infekcji do badania patogenezy bakteryjnej

Przeglądaj więcej filmów