Name: Czas replikacji chromosomów w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 14 s
Description: Poznaj metodę analizy czasu replikacji chromosomów ssaków łączącą włączanie BrdU z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ. Technika umożliwia bezpośrednie porównanie chromosomów w tej samej komórce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została wsparta grantem z National Cancer Institute, CA131967.

1. Inkorporacja BrdU (etykietowanie terminali)
<ol>
 <li>Płytki do około 70% konfluencji w naczyniu do hodowli tkankowej 150 mm 24 godziny przed dodaniem BrdU.</li>
 <li>Zastąp pożywkę świeżą, kompletną pożywką zawierającą 20 μg/ml BrdU (Sigma) w odpowiednich punktach czasowych przed zbiorem. Czas, w którym komórki są hodowane w pożywce z BrdU, będzie się różnić w zależności od typu komórki i gatunku, zazwyczaj faza G2 trwa od 2 do 5 godzin (ryc. 1).</li>
</ol>
2. Pobieranie chromosomów z kultur komórek jednowarstwowych
<ol>
 <li>Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki i zebrać 10 ml do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wyrzuć pozostałe nośniki.</li>
 <li>Przepłukać komórki raz 10 ml Versine [lub HBSS (Sigma)].</li>
 <li>Dodaj 5 ml 0,25% trypsyny w Versine (lub HBSS) na płytkę. Inkubować w temperaturze pokojowej do momentu oderwania komórek od płytki.</li>
 <li>Dodać zawiesinę komórek trypsynizowanych do probówki zawierającej 10 ml pożywki z kroku 2.1.</li>
 <li>Wirować przy 400 x g przez 10 minut, aby granulować komórki. Odessać supernatant, pozostawiając 0,5 ml pożywki plus osad komórkowy.</li>
 <li>Dokładnie zawiesić komórki, pipetując pipetą Pasteura.</li>
 <li>Dodać 3 krople roztworu hipotonicznego (0,075 M KCl (Sigma) ogrzanego do 37 °C); wymieszać zawiesinę komórek za pomocą pipety Pasteura. Dodać 0,5 ml roztworu hipotonicznego i ponownie wymieszać pipetą Pasteura. Doprowadzić objętość roztworu hipotonicznego do 5 ml i ponownie wymieszać. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20-45 minut, w zależności od typu komórki.</li>
 <li>Wirować przy 400 x g przez 10 min. Odsysać supernatant, pozostawiając 0,5 ml pożywki plus osad komórkowy.</li>
 <li>Ponownie zawiesić osad komórkowy, delikatnie przesuwając rurkę. Osmotycznie spuchnięte komórki będą w tym momencie kruche, dlatego należy uważać, aby nie naruszyć błon cytoplazmatycznych.</li>
 <li>Dodać 3 krople utrwalacza Carnoy's (1:3 lodowaty kwas octowy: metanol); wymieszać, delikatnie pipetując pipetą Pasteura. Dodać 0,5 ml utrwalacza i delikatnie wymieszać, pipetując pipetą Pasteura. Doprowadzić objętość utrwalacza do 5 ml i ponownie wymieszać, delikatnie pipetując pipetą Pasteura. Stałe ogniwa mogą być przechowywane w ciemności w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.</li>
 <li>Odwirować i odsysać jak w kroku 2.8.</li>
 <li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżym utrwalaczu; oszacuj objętość osadu i dodaj ~10x objętość utrwalacza Carnoya.</li>
 <li>Dodaj zawiesinę komórek kroplami na mokre, lodowate szkiełka mikroskopowe; przytrzymaj szkiełko pod kątem ~45° i pozwól, aby zawiesina komórek przepływała po powierzchni szkiełka. Połóż szkiełko płasko na ręcznikach papierowych i zalej szkiełko utrwalaczem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Sprawdź szkiełka pod kątem obecności rozsiewów mitotycznych za pomocą odwróconego mikroskopu.</li>
</ol>
3. Leczenie RNazą i odwodnienie etanolu
<ol>
 <li>Umieścić 200 μl 10 μg/ml RNazy A (Sigma) w 2x SSC na każdym szkiełku; inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
 <li>Myć szkiełka 3 razy 2x SSC, pH 7,0 w temperaturze pokojowej przez 3 minuty każde.</li>
 <li>Dehydrate przesuwa się przez serię EtOH (Sigma) (70%, 90% i 100%) w temperaturze pokojowej przez 3 minuty każda.</li>
 <li>Suszyć szkiełka na powietrzu w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
4. Przygotowanie koktajli sondowych do sondy do oznaczania centromerów specyficznych dla chromosomu BAC Plus () lub do hybrydyzacji in situ do farb na całe chromosomy
<ol>
 <li>W przypadku jednoczesnej hybrydyzacji BAC/należy przygotować dwa oddzielne koktajle sondowe do wstępnej hybrydyzacji. Odkryliśmy, że wstępna hybrydyzacja sond BAC i oddzielnie pod różnymi rygorami skutkuje mniejszym tłem i większą intensywnością sygnału. Odkryliśmy również, że poszczególne Fosmidy mogą być również używane zamiast klonów BAC. Opisana poniżej formuła koktajlu reprezentuje objętość pojedynczego preparatu. W przypadku przetwarzania wielu slajdów przy użyciu tych samych sond po prostu odpowiednio zwiększ głośność.
 * Koktajl sondy DNA BAC: 
 11,5 μl buforu hybrydyzacyjnego (50% formamidu (Sigma) /2x SSC /siarczanu dekstranu (Sigma)) 2 μl dH2O
 2,5 μl DNA BAC/Cot1 w dH2O (patrz poniżej protokół znakowania) 15 μl objętości całkowitej 
 * Koktajl sondy: 
 7 μl buforu hybrydyzacyjnego (65% formamidu/2x SSC/siarczan dekstranu) 2 μl dH2O 
 1 μl DNA/Cot1 (zakupione wstępnie oznakowane Spectrum Orange/Cy3/Texas Red) 10 μl całkowitej objętości 
 *Po denaturacji i wstępnej hybrydyzacji (krok 5.1) zmieszać sondę BAC z sondą w stosunku 3:2 25 μl/szkiełko i wymieszać koktajle sondy. 
 LUB</li>
 <li>Podwielokrotność 20 μl/szkiełko sondy Whole Chromosome Paint (Cy3/Texas Red) do probówki. Przejdź do etapu denaturacji i wstępnej hybrydyzacji.</li>
</ol>
5. Denaturacja szkiełek i sond oraz hybrydyzacja in situ
<ol>
 <li>Sondę denaturacyjną należy przeprowadzić w temperaturze 75 °C przez 10 minut. Wstępnie zhybrydyzować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby umożliwić hybrydyzację DNA Cot1 do powtarzających się sekwencji i zapobiec późniejszej hybrydyzacji do chromosomów metafazy.</li>
 <li>Szkiełka denaturacyjne w słoikach Coplin w 70% Formamid/2x SSC, pH 7,0 w temperaturze 72 °C przez 3 min.</li>
 <li>Natychmiast odwadniane preparaty przepuszcza się przez serię EtOH (70%, 90% i 100%) w słoikach z kopliny w temperaturze 4 °C przez 3 minuty każdy.</li>
 <li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Wstępnie rozgrzane szkiełka do 45 °C na podgrzewaczu szkiełka przez ostatnie 10 minut wstępnej hybrydyzacji sondy (krok 5.1). W razie potrzeby wymieszaj wstępnie zhybrydyzowane koktajle z sondy i dodaj 25 ul do każdego szkiełka; Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na każdym szkiełku i uszczelnij wzdłuż wszystkich krawędzi cementem gumowym. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze, aby zapobiec parowaniu.</li>
</ol>
6. Mycie po hybrydyzacji
<ol>
 <li>Myć szkiełka w słoikach Coplin 3 razy w 50% formamidzie/2x SSC, pH 7,0 w temperaturze 38-40 °C przez 3 minuty każde. Temperatura prania może się różnić w zależności od sondy. Jeśli występuje wysoka hybrydyzacja tła, możesz zwiększyć temperaturę prania. I odwrotnie, jeśli sygnał jest słaby i nie ma tła, możesz obniżyć temperaturę tych prań.</li>
 <li>Umyj szkiełka 1 raz w buforze PN w temperaturze pokojowej przez 3 minuty i przejdź do etapu wykrywania BrdU.</li>
</ol>
7. Wykrywanie BrdU
<ol>
 <li>Blokuj szkiełka z buforem PNM przez 10 minut (200 μl/szkiełko) w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
 <li>Odcedź szkiełka, obracając krawędź na ręczniku papierowym. Dodać 100 μl anty-BrdU-FITC (50 μg/ml Roche lub Millipore) do buforu PNM na 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
 <li>Szkiełka przemyć 3 razy w buforze PN w temperaturze pokojowej przez 3 minuty każde.</li>
 <li>Odcedź nadmiar bufora PN na szkiełkach pojedynczo, obracając krawędź ręcznika papierowego. Dodać 20 μl DAPI/roztworu montażowego zapobiegającego blaknięciu (Invitrogen). Przykryj szkiełko ręcznikiem papierowym i dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby wypchnąć pęcherzyki powietrza i nadmiar roztworu montażowego. Przejdź do analizy obrazu.</li>
</ol>
8. Przechwytywanie obrazów i ilościowe określanie inkorporacji BrdU
<ol>
 <li>Obrazy są rejestrowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Olympus BX61 i kamery CCD Olympus, obiektywu 100x, automatycznego koła filtrów i oprogramowania Cytovision (Applied Imaging). BrdU jest wychwytywany za pomocą filtra FITC; farby chromosomowe (Texas Red, Metasystems lub Cytocell), sondy BAC (Cy3) i (Vysis Spectrum Orange) są wychwytywane przy użyciu filtra Texas Red lub Cy3; DAPI jest przechwytywany za pomocą filtra DAPI (patrz rysunki 2 i 3).</li>
 <li>Poszczególne chromosomy będące przedmiotem zainteresowania są identyfikowane za pomocą BAC/lub sond malarskich specyficznych dla chromosomów (ryc. 2B i 3B). Korzystając z oprogramowania Cytovision, każdy interesujący chromosom jest "wycinany" z metafazy rozprzestrzeniającej się jako całość, linia jest rysowana wzdłuż długości chromosomu od krótkiego ramienia do długiego ramienia (ryc. 2C i 3C). Oprogramowanie Cytovision służy do ilościowego określania profilu intensywności pikseli na całej długości każdego chromosomu. Oprogramowanie Cytovision oblicza obszar zajmowany przez piksele i określa ilościowo intensywność pikseli reprezentowanych przez sygnały BrdU lub DAPI na każdym izolowanym chromosomie. Średnia intensywność pikseli reprezentowana przez każdy chromosom jest następnie mnożona przez obszar zajmowany przez te piksele, aby uzyskać całkowitą liczbę pikseli (tabela 1 i rysunek 4). Ponadto protokół ten pozwala na wizualizację najnowszych replikujących się regionów chromosomów. W związku z tym prążkowany wzór inkorporacji BrdU pozwala na wykrycie aktywnie replikujących się regionów chromosomów, a różnice w czasie replikacji między parami chromosomów są postrzegane jako różnice w tym wzorcu prążkowania (ryc. 2 i 3). Wreszcie, te różnice we wzorcach wiązania można porównać ze znanymi mapami czasu replikacji dla każdego chromosomu6,7, co pozwala na oszacowanie różnicy czasu replikacji między chromosomami homologicznymi lub ramionami chromosomów4. Na przykład dwa chromosomy 6 na rycinie 3A wykazują różnicę we wzorze prążków wynoszącą >2 godziny w porównaniu z normalnym czasem replikacji chromosomu 64, 
 Ponadto procedura podobna do opisanej tutaj została z powodzeniem zastosowana do badania czasu replikacji asynchronicznej między nieaktywnymi i aktywnymi chromosomami X>8,9. Aktywne i nieaktywne chromosomy X zidentyfikowano za pomocą farb do chromosomów X. Obrazy uzyskano za pomocą oprogramowania Quips mFISH (Vysis), a liczba pikseli zajętych przez chromosomy X i liczba pikseli zajętych przez fluorescencyjnie znakowane BrdU zostały następnie obliczone za pomocą obrazu NIH (<a href="http://rsb.info.nih.gov/nihimage" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html</a>).</li>
</ol>
9. Nick Translacja DNA BAC do znakowania fluorescencyjnego (Vysis)
<ol>
 <li>Dodaj następującą mieszankę sondy do schłodzenia probówki do mikrofuge: 
 70 μl (4 μg DNA) w dH2O 
 10 μl .2 mM dUTP-pomarańczowy lub zielony 
 20 μl .1 mM dTTP 
 20 μl 10x bufor translacyjny Nick 
 40 μl NT dNTP (minus dTTP) 
 40 μl nick Enzym translacyjny 
 200 μl objętości całkowitej 
 Inkubować @ 16 °C O/N. Zatrzymać reakcję przez ogrzewanie w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Schładzać na lodzie przez 5 minut.</li>
 <li>Wytnij DNA etanolem, dodając następujące składniki do mieszanki sondy: 
 Sonda 200 μl Solution 
 48 μl 3 M NaOAc 
 160 μl Cot1DNA (.25 μg/ul) 
 1 200 μl 100% EtOH</li>
 <li>Przechowywać w temperaturze -80 °C przez 10 minut do O/N.</li>
 <li>Wirować na zimno w temperaturze 12 000 x g przez 20 minut. Zdekantować z EtOH. Umyć 1 raz z 70% EtOH. Zakręć jak poprzednio. Dekantacja EtOH. Suszyć na powietrzu tylko do momentu, aż EtOH odparuje. Zawiesić w 40 μl dH2O do końcowego stężenia 100 ng/μl DNA BAC.</li>
</ol>

<ol><li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosome+dosage+compensation%3A+how+mammals+keep+the+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).</li>
<li>Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation+induces+frequent+translocations+with+delayed+replication+and+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation.</a> Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).</li>
<li>Smith, L., Plug, A., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+Replication+Timing+Leads+to+Delayed+Mitotic+Chromosome+Condensation+and+Chromosomal+Instability+of+Chromosome+Translocations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).</li>
<li>Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autosomal+locus+that+controls+chromosome-wide+replication+timing+and+mono-allelicexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).</li>
<li>Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+translocations+with+delayed+replication%3A+evidence+for+cis+control+of+chromosome+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).</li>
<li>Camargo, M., Cervenka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+DNA+replication+of+human+chromosomes.+II.+Replication+map+and+replication+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model.</a> Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).</li>
<li>Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+chromosomal+bands+replicating+early+in+the+S+phase+of+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts.</a> Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).</li>
<li>Diaz-Perez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+element%28s%29+at+the+nontranscribed+Xist+locus+of+the+active+X+chromosome+controls+chromosomal+replication+timing+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse.</a> Genetics. 171, 663-672 (2005).</li>
<li>Diaz-Perez, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deletion+at+the+mouse+Xist+gene+exposes+trans-effects+that+alter+the+heterochromatin+of+the+inactive+X+chromosome+and+the+replication+time+and+DNA+stability+of+both+X+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes.</a> Genetics. 174, 1115-1133 (2006).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li>
<li>Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+inactivation+of+rDNA+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Allelic inactivation of rDNA loci.</a> Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).</li>
<li>Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman">http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman</a> (2006).</li>
<li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+checkpoint+response+to+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">The checkpoint response to replication stress.</a> DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Przygotowanie rozprzestrzeniania się chromosomów jest kluczowym krokiem dla pomyślnego testu czasu replikacji opisanego tutaj. Włączenie etapu wstępnego leczenia colcemidem przed leczeniem hipotonicznym może pomóc w częstości występowania i rozprzestrzenianiu się komórek mitotycznych. Zazwyczaj wystawiamy komórki na działanie colcemdi przez 1-3 godziny przed pobraniem i stosujemy colcemid w końcowym stężeniu 10 ug/ml. Jednakże włączenie etapu wstępnej obróbki colcemidem może zmienić długość G2, a w konsekwencji może zmie...

<table><tbody><tr><td>Anty-BrdU-FITC</td><td>Roche Millipore</td><td>11202593001 MAB326F</td><td>50 &mu; g/&mu; l</td></tr><tr><td>Zestaw tłumaczeniowy Nicka</td><td>Abbott Molecular (Vysis)</td><td>07J00-0001</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum Orange dUTP</td><td>Abbott Molecular (Vysis)</td><td>02N33-050</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Abbott Molecular (Vysis)</td> <td>Zmienia</td><td></td></tr> bufor <tr><td>hybrydyzacyjny LSI/WCP</td><td>Abbott Molecular (Vysis)</td><td>06J67-011</td><td></td></tr><tr><td>Bufor hybrydyzacyjny</td><td>Abbott Molecular (Vysis)</td><td>07J36-001</td><td></td></tr><tr><td>Farby chromosomowe</td><td>Grupa MetaSystems</td><td>D-14NN-050-TR</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX61 Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>BX61TRF-1-5</td><td></td></tr><tr><td>System oprogramowania do obrazowania mikroskopu</td><td>Obrazowanie stosowane</td><td>Cytovision 3.93.1</td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>Olympus</td><td>UCMAD3</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> IN SITU PRZEPISY HYBRYDYZACYJNE Roztwory formamidu 70% Formamidu/2x SSC 35 ml Formamidu* (Sigma) 10 ml 10x SSC 5 ml d2H 20 pH do 7,0 z HCl (Sigma) * Ważne jest, aby używać formamidu, który był przechowywany w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Długotrwałe przechowywanie w temperaturze pokojowej spowoduje powstanie kwasu mrówkowego, a pH będzie zbyt niskie. 50% formamidu/2x SSC 25 ml formamidu (Sigma) 10 ml SSC 15 ml dH2O pH do 7,0 z HCl (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) 358 g Na Cytrynian (Sigma) dH2O do objętości PN Bufor [0,1 M NaP04 0,1% NP_40 (Sigma)] Przygotuj po 0,1 M roztworu fosforanu sodu (Filtruj sterylizuj i przechowuj w 500 ml podwielokrotności). 0.1 M NaH2P04 , 1 L 13.8 g NaH2P04 (Sigma): dH2O do objętości 0,1 M NaH2P04 1 L 14.2 g NaH2P04 (Sigma) dH2O do objętości. PN: Dostosuj pH 0,1 M Na2HP04 do pH 8,0 za pomocą .1 M NaH2P04. Przefiltruj, wysterylizuj i dodaj 1 ml NP-40. PNM 50 ml 1,25 g Beztłuszczowe mleko w proszku (Sigma) 25 ml buforu PN (Przepis powyżej) Mix przez 15-20 minut przy ciągłym mieszaniu. Wirować 2 razy przy 400 x g przez 10 min. Użyj supernatantu i upewnij się, że nie przeszkadzasz wytrąconym białkom mleka.</td></tr></tbody></table>

czas replikacji chromosomów w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Replikacja DNA ssaków rozpoczyna się w wielu miejscach wzdłuż chromosomów w różnym czasie podczas fazy S, zgodnie z programem replikacji czasowej. Uważa się, że specyfikacja czasu replikacji jest procesem dynamicznym regulowanym przez sygnały specyficzne dla tkanek i rozwoju, które reagują na modyfikacje epigenetyczne. Jednak mechanizmy regulujące miejsce i czas inicjacji replikacji DNA wzdłuż chromosomów pozostają słabo poznane. Chromosomy homologiczne zwykle replikują się synchronicznie, jednak istnieją godne uwagi wyjątki od tej reguły. Na przykład w komórkach samic ssaków jeden z dwóch chromosomów X ulega późnej replikacji w procesie znanym jako inaktywacja X1. Wraz z tym opóźnieniem w czasie replikacji, szacowanym na 2-3 godziny, większość genów ulega wyciszeniu transkrypcyjnemu na jednym chromosomie X. Ponadto dyskretne locus cis, znane jako centrum inaktywacji chromosomu X, reguluje ten proces inaktywacji chromosomu X, w tym indukcję opóźnionego czasu replikacji na całym nieaktywnym chromosomie X. Ponadto niektóre rearanżacje chromosomów występujące w komórkach nowotworowych i w komórkach narażonych na promieniowanie jonizujące wykazują znaczne opóźnienie w czasie replikacji wynoszące >3 godziny, co wpływa na cały chromosom2,3. Ostatnie prace z naszego laboratorium wskazują, że zakłócenie dyskretnych loci autosomalnych działających cis skutkuje niezwykle późnym fenotypem replikacji, który wpływa na cały chromosom4. Dodatkowe badania "inżynierii chromosomowej" wskazują, że pewne rearanżacje chromosomów wpływające na wiele różnych chromosomów skutkują tym nieprawidłowym fenotypem czasu replikacji, co sugeruje, że wszystkie chromosomy ssaków zawierają dyskretne loci cis, które kontrolują prawidłowy czas replikacji poszczególnych chromosomów5.
Tutaj prezentujemy metodę analizy ilościowej czasu replikacji chromosomów w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ. Metoda ta pozwala na bezpośrednie porównanie czasu replikacji między homologicznymi chromosomami w tej samej komórce i została zaadaptowana z6. Ponadto metoda ta pozwala na jednoznaczną identyfikację rearanżacji chromosomów, które korelują ze zmianami w czasie replikacji, które wpływają na cały chromosom. Metoda ta ma przewagę nad niedawno opracowanymi protokołami mikromacierzy lub sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, które nie są w stanie rozróżnić homologicznych alleli obecnych na przegrupowanych i nieprzegrupowanych chromosomach. Ponadto, ponieważ opisana tutaj metoda ocenia pojedyncze komórki, może wykrywać zmiany w czasie replikacji chromosomów w przypadku rearanżacji chromosomów, które są obecne tylko we frakcji komórek w populacji.

Przykład analizy czasu replikacji dla ludzkiego chromosomu 6 przedstawiono na Rysunku 2. Komórki z delecją genu ASAR64, zlokalizowanego w regionie 6q16.1, poddano działaniu BrdU przez 5 hr, a następnie wyizolowano komórki w fazie mitozy i przeprowadzono analizę FISH z użyciem sondy malującej chromosom 6 (Vysis) oraz analizę wbudowania BrdU. Należy zauważyć, że występuje istotna różnica w wzorze prążkowania BrdU pomiędzy dwoma chromosomami 6, co jest zgodne z opóźnieniem czasu replikacji o &gt;...

Opisana jest ilościowa metoda analizy czasu replikacji chromosomów. Metoda wykorzystuje inkorporację BrdU w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu oceny czasu replikacji chromosomów ssaków. Technika ta pozwala na bezpośrednie porównanie przegrupowanych i nieprzegrupowanych chromosomów w tej samej komórce.

Czas replikacji chromosomów w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Niniejsze podejście eksperymentalne łączy wbudowywanie BRDU z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ. Służy ono do ilościowej analizy czasu replikacji chromosomów ssaków. W pierwszej kolejności należy wbudować BRDU w żywe komórki, a następnie zebrać chromosomy w metafazie.Następnie wykonaj hybrydyzację in situ fluorescencyjną (FISH) DNA w połączeniu z sekwencyjnym barwieniem przeciwciałami przeciwko BrdU, aby zidentyfikować poszczególne replikujące się chromosomy. Następnie wykorzystaj mikroskopię fotograficzną do zarejestrowania obrazów sygnałów FISH oraz wbudowania BrdU w poszczególnych postaciach mitotycznych. Przy użyciu oprogramowania CytoVision oblicz pole powierzchni i intensywność pikseli reprezentowanych przez sygnały BrdU lub DPI na każdym wyizolowanym chromosomie.Wyniki pozwalają na ilościowe określenie i porównanie wbudowywania BRDU w poszczególnych przegrupowanych chromosomach oraz ich holochromosomach. Ponieważ opisana tutaj metoda ocenia pojedyncze komórki, posiada ona zdolność wykrywania zmian w replikacji i czasie jej przebiegu w obrębie przegrupowań chromosomalnych występujących tylko w niewielkiej frakcji komórek w populacji, w przeciwieństwie do niedawno opracowan

chromosome-replicating-timing-combined-with-fluorescent-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Czas replikacji chromosomu w połączeniu z fluorescencyjną in situ hybrydyzacją

Źródło: Schumacher, D., i Sogaard-Andersen, L. Obrazowanie żywymi komórkowymi fluorescencji pełnego wegetatywnego cyklu komórkowego wolno rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje wykorzystanie obrazowania żywych komórek do śledzenia pochodzenia chromosomów oznaczonych fluorescencją podczas podziału komórek bakteryjnych. Rejestruje dynamikę segregacji chromosomów za pomocą mikroskopii poklatkowej fazowo-kontrastowej oraz fluorescencji.

Obrazowanie poklatkowe segregacji chromosomów u bakterii znakowanych fluorescencją

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) pozwala na wykrywanie kwasów nukleinowych w ich naturalnym środowisku w komórkach. Opisujemy tutaj protokół połączonego, jednoczesnego wykrywania RNA i DNA za pomocą FISH, który może być wykorzystany do badania inaktywacji chromosomu X w embrionalnych komórkach macierzystych myszy.

Połączona fluorescencyjna hybrydyzacja in situ DNA-RNA (FISH) w celu zbadania inaktywacji chromosomu X w zróżnicowanych żeńskich embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Opracowaliśmy łatwo dostosowany protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w połączeniu z immunofluorescencją. Pozwala to na szczegółowe badanie dynamiki RNA z jednoczesnym wglądem w strukturę chromatyny, organizację jądra i regulację transkrypcji na poziomie pojedynczej komórki.

Protokół szybkiej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ dla Xist RNA w połączeniu z immunofluorescencją modyfikacji histonów w inaktywacji chromosomu X

Tutaj prezentujemy prostą metodę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji DNA in situ (DNA ISH) w celu wizualizacji powtarzających się sekwencji heterochromatycznych na chromosomach montowanych na szkiełkach. Metoda wymaga minimalnej ilości odczynników i jest uniwersalna w użyciu z krótkimi lub długimi sondami, różnymi tkankami oraz detekcją za pomocą sygnałów fluorescencyjnych lub nieopartych na fluorescencji.

Prosta metoda fluorescencji DNA Hybrydyzacja in situ do zgniecionych chromosomów

Opisujemy tutaj system wykorzystujący specyficzny dla miejsca, odwracalny blok białkowy in vivo do zatrzymywania i zwijania widełek replikacyjnych u Escherichia coli. Ustanowienie bloku replikacji ocenia się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a do wizualizacji produktów pośrednich replikacji stosuje się neutralno-neutralną 2-wymiarową elektroforezę w żelu agarozowym.

Indukowanie specyficznej dla miejsca blokady replikacji u E. coli przy użyciu systemu operatora represora fluorescencyjnego

Opisany protokół hybrydyzacji RNA in situ pozwala na wykrycie RNA w całych zarodkach Drosophila lub wypreparowanych tkankach. Korzystając z 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych i wzmocnienia sygnału tyramidu, transkrypty mogą być wykrywane z wysoką rozdzielczością, czułością i przepustowością oraz przy stosunkowo niskich kosztach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

Ten manuskrypt przedstawia szczegółową metodę generowania sond ramienia chromosomu X i przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu zbadania stanu kohezji chromatydy siostrzanej w oocytach Drosophila zatrzymanych w prometafazie i metafazie I. Protokół ten jest odpowiedni do określenia, czy spójność ramienia mejotycznego jest nienaruszona, czy zakłócona w różnych genotypach.

Wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do monitorowania stanu kohezji ramienia w oocytach prometafazy i metafazy I drosophila

Ten protokół hybrydyzacji fluorescencji in situ jest zoptymalizowany do ilościowego określenia liczby cząsteczek RNA w pączkujących drożdżach podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy.

Analiza fluorescencji pojedynczej cząsteczki hybrydyzacji in situ (smFISH) w pączkującym wzroście wegetatywnym drożdży i mejozie

Ten protokół opisuje zastosowanie hybrydyzacji in situ fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFISH) do pomiaru kinetyki in vivo syntezy i degradacji mRNA.

Sondowanie kinetyki mRNA w czasie i przestrzeni u Escherichia coli przy użyciu dwukolorowej hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

Ten protokół ilustruje chemicznie indukowany system dimeryzacji białek w celu tworzenia kondensatów na chromatynie. Pokazano tworzenie ciała jądrowego białaczki promielocytowej (PML) na telomerach za pomocą chemicznych dimeryzatorów. Wzrost, rozpuszczanie, lokalizacja i skład kropel są monitorowane za pomocą obrazowania żywych komórek, immunofluorescencji (IF) i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Kondensaty białkowe wywołane dimeryzacją chemiczną na telomerach

Ten protokół prezentuje technikę mapowania miejsc replikacji w strukturalnie zachowanej chromatynie in situ, która wykorzystuje kombinację wstępnego znakowania EdU-streptawidyny-Nanogold i ChromEMT.

Obrazowanie domen replikacyjnych w ultrastrukturalnie zachowanej chromatynie za pomocą tomografii elektronowej

Poznaj metodę analizy czasu replikacji chromosomów ssaków łączącą włączanie BrdU z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ. Technika umożliwia bezpośrednie porównanie chromosomów w tej samej komórce.

Czas replikacji chromosomów w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ

Przeglądaj więcej filmów