Czas replikacji chromosomów w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ

Niniejsze podejście eksperymentalne łączy wbudowywanie BRDU z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ. Służy ono do ilościowej analizy czasu replikacji chromosomów ssaków. W pierwszej kolejności należy wbudować BRDU w żywe komórki, a następnie zebrać chromosomy w metafazie.

Następnie wykonaj hybrydyzację in situ fluorescencyjną (FISH) DNA w połączeniu z sekwencyjnym barwieniem przeciwciałami przeciwko BrdU, aby zidentyfikować poszczególne replikujące się chromosomy. Następnie wykorzystaj mikroskopię fotograficzną do zarejestrowania obrazów sygnałów FISH oraz wbudowania BrdU w poszczególnych postaciach mitotycznych. Przy użyciu oprogramowania CytoVision oblicz pole powierzchni i intensywność pikseli reprezentowanych przez sygnały BrdU lub DPI na każdym wyizolowanym chromosomie.

Wyniki pozwalają na ilościowe określenie i porównanie wbudowywania BRDU w poszczególnych przegrupowanych chromosomach oraz ich holochromosomach. Ponieważ opisana tutaj metoda ocenia pojedyncze komórki, posiada ona zdolność wykrywania zmian w replikacji i czasie jej przebiegu w obrębie przegrupowań chromosomalnych występujących tylko w niewielkiej frakcji komórek w populacji, w przeciwieństwie do niedawno opracowanych wysokoprzepustowych protokołów mikroarray oraz sekwencjonowania DNA. Metoda ta umożliwia bezpośrednie porównanie chromosomów homologicznych znajdujących się w tej samej komórce.

Posiada ono również zdolność do jednoznacznej identyfikacji rearanżacji chromosomowych, które wpływają na replikację chromosomów. Procedurę na całych chromosomach zaprezentuje Leslie Smith, pracownik naukowy w moim laboratorium. Wysiej komórki do poziomu konfluencji około 70% w 150-milimetrowej płytce do hodowli tkanek i umieść w inkubatorze komórkowym na 24 godziny w odpowiednim czasie.

Punkty przed zbiorem. Uzupełnić pożywkę świeżą pożywką kompletną zawierającą 10 µg/mL BRDU. Czas hodowli komórek w pożywce z BRDU będzie różnić się w zależności od typu komórek i gatunku.

Zazwyczaj faza G2 trwa od dwóch do pięciu godzin. Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki, zachowując 10 ml w stożkowej probówce do wirowania o pojemności 15 ml. Przepłukać komórki 10 ml soli fizjologicznej i usunąć pozostałą sól za pomocą aspiracji próżniowej.

Następnie dodać 5 ml 0,25% trypsyny i inkubować w temperaturze pokojowej do czasu odklejenia się komórek od płytki. Zebrać komórki i przenieść zawiesinę do 10 ml zarezerwowanego medium. Odwirować komórki, a następnie odessać całe medium z wyjątkiem 0,5 ml.

Teraz dokładnie resuspenduj komórki, używając pipety, a następnie, aby wywołać osmotyczne obrzęknięcie komórek, dodaj trzy krople 75 millimolarnego chlorku potasu ogrzanego do 37 °C i wymieszaj zawiesinę komórkową za pomocą pipety. Następnie dodaj dodatkowe 0,5 ml roztworu hipotonicznego. Doprowadź całkowitą objętość roztworu hipotonicznego do 5 ml i wymieszaj poprzez pipetowanie.

Inkubować zawiesinę komórek w temperaturze 37 °C przez 20 do 45 minut, w zależności od typu komórek. Progi inkubować pod kątem, aby utrzymać komórki w zawiesinie. Następnie wirować przy 400 ×g przez 10 minut.

Odssać znad osadu cały nadsącz z wyjątkiem 0,5 mm i za pomocą pipety Pasteura delikatnie resuspendować pellet komórkowy. Komórki obrzęknięte osmotycznie będą w tym momencie kruche, dlatego należy uważać, aby nie uszkodzić błon cytoplazmatycznych. Następnie dodać trzy krople fiksaty Carnoy'a i delikatnie wymieszać.

Po dodaniu kolejnych 0,5 mililitra utrwalacza, uzupełnić objętość utrwalacza do 5 mililitrów i pipetować do uzyskania jednorodnej zawiesiny komórek. Tak utrwalone komórki można przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy. Zebrać utrwalone komórki poprzez wirowanie, odessać utrwalacz i resuspender osad w 10 objętościach utrwalacza, utrzymując mikroskop w chłodzeniu na wilgotnym lodzie.

Ustaw slajd pod kątem około 45 stopni. Dodawaj zawiesinę komórkową kroplami, aby ją rozprowadzić. Zalej slajd utrwalaczem, a następnie odlej nadmiar.

Następnie należy położyć preparat płasko na ręcznikach papierowych do wyschnięcia na powietrzu. Próbki należy ocenić pod kątem obecności rozprzestrzeń mitotycznych, używając mikroskopu odwróconego. Do każdego preparatu należy dodać 2 µL RNase A o stężeniu 10 µg/mL w 2X SSC i inkubować w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.

Przeprowadź trzy trzyminutowe płukania w roztworze 2X SSC o pH 7.0 w temperaturze pokojowej. Następnie odwodnij próbki, stosując serię stężeń etanolu w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Osusz każdą z próbek na powietrzu w temperaturze pokojowej, przenosząc je do schłodzonej probówki do wirówki.

Dodać 4 µg znakowanego nukleotydu substratu DNA, 10 X bufor translacyjny NIC, mieszaninę dNTP oraz enzym translacyjny NIC. Inkubować reakcję w temperaturze 16 °C przez noc, a następnie podgrzać do 70 °C przez 10 minut w celu zatrzymania reakcji. Następnie schłodzić na lodzie przez pięć minut.

Aby wytrącić DNA etanolem, należy dodać 48 µL 3 M octanu sodu, 160 µL cot-1 DNA o stężeniu 0,25 µg/µL oraz 1,2 ml 100% etanolu. Próbkę przechowywać w temperaturze -80 °C przez 10 minut lub przez noc, następnie wytrącić DNA poprzez wirowanie i przemyć osad 70% etanolem. Po wysuszeniu DNA w powietrzu, resuspender sondę w 40 µL wody dwukrotnie destylowanej, aby uzyskać końcowe stężenie 100 ng/µL znakowanego DNA w celu przeprowadzenia jednoczesnej hybrydyzacji BacSEP. Przygotować dwa oddzielne koktajle sond zawierające cot-1 DNA, zgodnie ze szczegółami opisanymi w towarzyszącym manuskrypcie.

Denaturuj koktajle sond w temperaturze 75 °C przez 10 minut. Następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby związać cot 1D NA z sekwencjami powtarzalnymi. Teraz połącz sondę wsteczną z sondą S w stosunku trzy do dwóch, stosując 25 µL na próbkę.

Przesuń szkiełka, aby zdenaturować próbki. Zanurz szkiełka w 70% formamidzie w 2X SSC w temperaturze 72 °C i inkubuj przez trzy minuty. Natychmiast odwodnij próbki, przepuszczając je przez serię stężeń etanolu w temperaturze 4 °C przez trzy minuty.

Każdą z próbek wysuszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej przez około 10 minut przed zakończeniem przygotowania sondy. Przerównoważyć preparaty na podgrzewaczu do szkiełek w temperaturze 45 °C. Następnie dodać 25 µL mieszaniny sondy back S.

Na każdy preparat delikatnie nałóż szkiełko cover slip i uszczelnij wszystkie krawędzie gumą arabską przed etapem hybrydyzacji. Próbki inkubuj przez noc w temperaturze 37°C w komorze wilgotnościowej. Wykonaj trzy przemycia po hybrydyzacji, po trzy minuty każde, w 50% IDE 2X SSC pH 7,0 w temperaturze od 38 do 40°C.

Optymalna temperatura przemywań zależy od zastosowanej sondy. W przypadku wystąpienia silnej hybrydyzacji tła należy zwiększyć temperaturę przemywań. I odwrotnie, jeśli sygnał sondy jest słaby i nie występuje tło, należy obniżyć temperaturę przemywań.

Przeprowadź jedno płukanie w buforze PN w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. W celu detekcji BRDU dodaj 200 µl buforu blokującego PNM na każdy preparat. Inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, a następnie osusz preparaty na ręczniku papierowym.

Następnie dodaj 100 µL przeciwciała sprzężonego z anti B-R-D-U-F-E w stężeniu 50 µg/mL i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Przeprowadź trzy tryminutowe przemycia w buforze PN w temperaturze pokojowej. Usuń nadmiar buforu PN z każdego preparatu.

Następnie należy dodać 20 µL medium montażowego dappy Antifa. Przykryć preparat ręcznikiem papierowym i docisnąć szkiełko nakrywkowe, aby usunąć pęcherzyki powietrza i nadmiar medium montażowego. Obrazy należy zarejestrować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę CCD.

Używając obiektywu 100 x, automatycznego koła filtrów oraz oprogramowania CytoVision, należy zarejestrować sygnał BRDU za pomocą filtra FITC, a malowania chromosomów i sond centromerowych za pomocą filtra TRITC lub Texas Red. Do barwienia jąder należy użyć filtra DAPI. W oprogramowaniu CytoVision należy zidentyfikować poszczególne chromosomy zainteresowania, korzystając z sond centromerowych lub specyficznych sond do malowania chromosomów.

Wytnij każdy interesujący chromosom z preparatu metafazy w całości. Skopiuj i wklej obrazy chromosomów DPI oraz FITZY do nowego okna. Wybierz ikonę wykresu w menu narzędzi, co umożliwi wygenerowanie wykresu przedstawiającego powierzchnię i intensywność barwienia Fitz oraz dappy wzdłuż każdego poszczególnego chromosomu.

Wykonuje się to poprzez poprowadzenie linii wzdłuż chromosomu od ramienia krótkiego do ramienia długiego. W menu narzędzi należy wybrać ikonę danych i wygenerować tabelę wyświetlającą obliczoną powierzchnię i intensywność dla ZI oraz dpi. Następnie należy wybrać sygnały ZI i DPI dla interesujących nas chromosomów.

Następnie kliknij przyciski intensywności i pola (intensity i area) na ikonie tabeli. Oprogramowanie wygeneruje pomiar liczbowy pikseli na cal kwadratowy dla każdego sygnału. W kolejnym kroku średnia intensywność pikseli każdego chromosomu zostaje pomnożona przez pole zajmowane przez te piksele.

Aby uzyskać całkowitą liczbę pikseli dla wizualizacji najpóźniej replikujących się regionów chromosomów, należy ocenić prążkowany wzór wbudowywania BRDU dla aktywnie replikujących się regionów chromosomów. Następnie oblicza się różnice w czasie replikacji między parami chromosomów na podstawie różnic we wzorze prążkowania BRDU. Chromosomy w komórkach ssaków replikują się zgodnie z programem czasowym, w którym replikacja wczesna i późna zachodzą odpowiednio na początku i na końcu fazy S.

Typowa faza S w komórkach ssaków trwa od ośmiu do 10 godzin, a faza G2 zazwyczaj od dwóch do pięciu godzin. W tym systemie eksperymentalnym BrdU jest dodawany przez coraz dłuższe okresy czasu, aby znakować ostatnie fragmenty chromosomów ulegających replikacji. Komórki te posiadają delecję ludzkiego genu SAR6 zlokalizowanego w obrębie 6q16.1. Po pięciogodzinnej inkubacji z BrdU pobrano komórki mitotyczne i poddano je analizie wbudowania BrdU oraz hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH) z użyciem sondy malującej chromosom 6; dwa chromosomy 6 wykazują trzy sygnały fluorescencyjne.

Wyraźna różnica w wzorcu prążkowania BRDU jest zgodna z opóźnieniem czasu replikacji o ponad dwie godziny dla jednego z chromosomów sześć. Oprogramowanie CytoVision przedstawia różnice w profilach intensywności sygnału dla DPI i BRDU na dwóch chromosomach sześć, co wskazuje na asynchroniczną replikację. Ponadto występuje istotna różnica w całkowitej ilości wbudowanego BRDU w porównaniu z analogiczną analizą barwienia DPI.

Zastosowanie sondy odwrotnej zawierającej ludzki gen AR six uwydatnia pojedynczy chromosom 6 z delecją w ramieniu długim w tej komórce. Co interesujące, wbudowanie BrdU jest bardziej intensywne, a wzór pasmowy wbudowania BrdU jest bardziej rozległy niż w przypadku chromosomu 6 bez ED. Przygotowano preparaty rozcierów mitotycznych z siedmiu różnych komórek w celu ilościowego określenia różnic w czasie replikacji między chromosomami 6.

Poziomy BRDU wykazują ponad dwukrotną różnicę w całkowitych wartościach pikseli pomiędzy chromosomami szóstymi z delecją a tymi bez ED. Po opanowaniu techniki, można ją prawidłowo przeprowadzić w ciągu trzech dni. Mamy nadzieję, że posiadają Państwo teraz dobrą wiedzę na temat pomiaru replikacji i czasu replikacji chromosomów homologicznych znajdujących się w tej samej komórce, a także sposobu jednoznacznej identyfikacji rearanżacji chromosomalnych korelujących ze zmianami w replikacji.

Okresy replikacji całych chromosomów.