Analiza i budowa struktur kwasów nukleinowych za pomocą 3DNA

Ogólnym celem tej procedury jest udostępnienie pakietu programów 3D NA naukowcom laboratoryjnym i innym osobom w celu zbadania organizacji przestrzennej DNA i RNA za pomocą najnowocześniejszych narzędzi obliczeniowych. W tym celu należy najpierw pobrać oprogramowanie z forum 3D NA i zainstalować je na komputerze lokalnym. Drugim krokiem jest analiza reprezentatywnej struktury DNA na poziomie kroków składowych par zasad.

Następnie ta sama struktura DNA jest modyfikowana na poziomie kroku pary zasad, a następnie jest odbudowywana przy użyciu nowo zdefiniowanych parametrów kroku pary zasad. Kolejnym krokiem jest analiza dużego zespołu powiązanych ze sobą struktur. Ostatnim krokiem jest ustawienie zestawu powiązanych struktur DNA we wspólnym układzie odniesienia w celu wizualizacji globalnych zniekształceń struktur.

Ostatecznie, narzędzia 3D NA są wykorzystywane do zbadania, w jaki sposób poszczególne etapy par zasad, w tym te związane z lekami i białkami, przyczyniają się do ogólnego fałdowania DNA oraz do identyfikacji miejsc i kierunków znacznych globalnych zniekształceń. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że oprogramowanie jest solidne i ma szerokie zastosowanie do wielu różnych struktur zawierających kwasy nukleinowe. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biochemii i biofizyki, takie jak to, w jaki sposób genomy są zorganizowane w trzech wymiarach i jaki rodzaj deformacji może przyjąć DNA.

Aby rozpocząć instalację pakietu oprogramowania, połącz się z trzema website@xthreed. org DA i kliknij link do forum 3D NA na forum. Wybierz link do rejestracji i postępuj zgodnie z instrukcjami, aby utworzyć nowe konto.

Po ustaleniu nazwy użytkownika i hasła zaloguj się na forum, wybierz link do pobrania w sekcji powitalnej, a na nowej stronie wybierz opcję pobierania 3D NA. Kliknij dwukrotnie plik tar gz, aby utworzyć folder o nazwie X 3D NA dash V 2.1, który zawiera oprogramowanie 3D NA. Otwórz aplikację terminala, zwykle znajdującą się w narzędziach na komputerze Macintosh, i przejdź do katalogu X 3D NA dash V 2.1.

Uruchom skrypt instalacyjny wymagany do poprawnego działania 3D NA. Wszystkie polecenia użyte w tym filmie można znaleźć w protokole tekstowym. Następnie skopiuj dwa ustawienia eksportu wierszy, które są wyświetlane na ekranie.

Jeśli użytkownik umieścił oprogramowanie w katalogu aplikacji, dwie linie powinny pojawić się tak, jak pokazano tutaj. Otwórz aplikację do edycji tekstu znajdującą się w katalogu aplikacji. W menu formatu wybierz opcję Utwórz zwykły tekst.

Jeśli plik BRC istnieje, otwórz go w formacie tekstowym, edytuj i wklej ustawienia eksportu na końcu pliku. Jeśli nie, plik bash RC istnieje, wklej ustawienia eksportu do pustego pliku i zapisz pod nazwą pliku bash RC w katalogu domowym. Aby nowe ustawienia były dostępne, uruchom nowo zapisany plik Bash RC w programie terminala.

Ten film przedstawia analizę reprezentatywnej struktury kwasu nukleinowego, DNA związanego z białkiem HBB z oka bakterii Borrelia bergdorf. Pierwszym krokiem w analizie 3D NA jest utworzenie pliku, który zawiera listę wszystkich sparowanych baz. Odbywa się to poprzez wpisanie polecenia, aby zastosować program Znajdź para do struktury atomowej przechowywanej w pliku do NP dwa, MP dwa pdb.

Kolejnym krokiem w analizie jest określenie parametrów geometrycznych, które charakteryzują konstrukcję. Polecenie analyze przyjmuje jako dane wejściowe plik pary podstawowej i tworzy kilka plików wyjściowych, które pojawiają się w katalogu roboczym. Wartości geometryczne można następnie obliczyć, wpisując, przeanalizować dwa MP dwa bps.

Wygenerowane pliki wyjściowe obejmują dwa MP two out, który zawiera przegląd obliczonych parametrów oraz bpco step par, który zawiera listę parametrów ciała sztywnego oprócz analizy struktury kwasu nukleinowego, oprogramowanie 3D NA zapewnia możliwość zbudowania modelu konstrukcyjnego z parametrów ciała sztywnego za pomocą polecenia przebudowy w celu stworzenia przybliżonego modelu atomowego, który zawiera współrzędne zarówno dla atomów szkieletu, jak i podstawy. Wpisz polecenie wymienione w tekście. To polecenie instruuje 3D NA, aby wprowadziło standardowe potwierdzenie szkieletu BDNA w konstrukcji modeli na podstawie parametrów ciała sztywnego.

Model podwójnej z parametrami ciała sztywnego znajdującymi się w konstrukcji H-B-B-D-N-A można następnie zbudować, wpisując odpowiednie polecenie. Plik par kroku bpco można edytować w celu wygenerowania zmodyfikowanej struktury. W tym przypadku modyfikowane są ekstremalne kąty przechyłu utworzone w dwóch miejscach największego zginania.

Struktura jest następnie budowana ze zmodyfikowanym zestawem parametrów kroku jako plikiem wejściowym. Oba modele można oglądać za pomocą standardowej przeglądarki molekularnej, w przeciwieństwie do analizy pojedynczej struktury zawierającej kwas nukleinowy. W tej części filmu pokazano, jak analizować duży zestaw struktur w zestawie plików, zaczynając od nazw MD underscore set one PDB, a kończąc na liczbie.

Pierwszym krokiem w analizie jest identyfikacja sparowanych zasad uzyskana przez uruchomienie programu znajdź parę jak poprzednio, ponieważ cały zestaw struktur ma ten sam schemat parowania zasad, należy uruchomić find pair raz na reprezentatywnym pliku, tutaj plik kończący się na 1001. Spowoduje to wygenerowanie podstawowych informacji o parowaniu i zapisanie ich w pliku MD w zestawie pierwszym BPS PS. Następny krok znajduje parametry geometryczne całego zestawu struktur za pomocą zespołu Command X 3D ncore. Analizować. Następnie żądane parametry ciała sztywnego można wyodrębnić z pliku wyjściowego przeglądu MD na pierwszym miejscu.

Jest to wykonywane przy użyciu ekstraktu zespołu Command X three DCO. Kąty przechyłu są wyodrębniane i tworzony jest plik tekstowy z kątami przechylenia oddzielony przecinkami. Plik ten można wczytać do innych programów w celu dalszej analizy i wykreślenia.

Najnowsza wersja 3D NA ma nową funkcję, która pozwala użytkownikowi spojrzeć na wiele struktur ze wspólnej perspektywy. Polecenie reorientacji zespołu X trzy DCO nakłada kolekcję powiązanych struktur na wspólną parę podstaw lub krok pary podstaw, tak jak w poprzednich protokołach. Pierwszym krokiem jest obliczenie parowania zasad DNA za pomocą programu do znajdowania par.

W tym przypadku plikiem wejściowym są dwa KEK pdb plik zawierający 10 struktur CIA coli, operatora O 3D NA związanego z głowicą białka represorowego LAC. Reorientacja zespołu Command X three DCO wyrówna poszczególne modele w strukturę wielomodelową na wspólnym układzie odniesienia. To polecenie wymaga zarówno pliku PDB, jak i podstawowego pliku parowania z poprzedniego kroku jako danych wejściowych.

W poleceniu zawarta jest również tożsamość kroku pary podstaw, względem którego są wyrównane wszystkie struktury. Interfejs sieciowy W 3D NA zawiera kilka popularnych funkcji pakietu oprogramowania 3D NA. Ta część filmu zwraca uwagę na możliwość konstruowania trójwymiarowych modeli DNA ozdobionego białkiem za pomocą serwera internetowego.

Pierwszym krokiem do zbudowania modelu DNA ozdobionego białkiem jest odwiedzenie strony internetowej W 3D NA znajdującej się pod adresem W three d.rutgers.edu. Wybór rekonstrukcji z menu w lewym górnym rogu strony aktywuje możliwość budowania modelu online. Następnym krokiem jest wybranie linku do matrycy związanego białka DNA, który znajduje się w lekko zacienionym polu na środku nowej strony.

Ten wybór aktywuje menu rozwijane, które pozwala użytkownikowi określić liczbę związanych białek. Wybór liczby związanych białek prowadzi do nowej strony ze specyfikacją. Użytkownik może następnie wpisać lub wkleić żądaną sekwencję.

W polu tekstowym, w środku nowej strony, znajduje się menu rozwijane poniżej pola tekstowego, aby wybrać spiralne potwierdzenie niezwiązanych regionów DNA. U dołu strony specyfikacji znajduje się pole tekstowe, w którym można wprowadzić pozycje wiązania i nazwy plików związanych białek. Pozycja wiązania określa położenie środka fragmentu związanego z białkiem w sekwencji DNA.

Na dole strony ze specyfikacją znajduje się pole, które pozwala użytkownikowi wygenerować podgląd DNA związanego z białkiem. W takim przypadku to pole jest zaznaczone i klikany jest przycisk kontynuacji. Ta akcja powoduje wygenerowanie strony przeglądu z listą wybranych parametrów, a także wszelkich błędów, które mogły wyniknąć z nakładania się wybranych witryn powiązań.

Użytkownik może wybrać przycisk Wstecz, jeśli konieczne jest wprowadzenie jakichkolwiek zmian, lub przycisk kompilacji, aby kontynuować. Następna strona wyświetla statyczny obraz kompleksu białkowego DNA w jego najbardziej rozbudowanym układzie i pozwala na interaktywną wizualizację online za pośrednictwem i Internetu. Użytkownik może również pobrać plik zawierający współrzędne atomowe.

Narzędzia programowe 3D NA są rutynowo używane do analizy struktur kwasów nukleinowych. Wartości parametrów ciała sztywnego ujawniają zniekształcenia w strukturze trójwymiarowej, takie jak dwa miejsca ekstremalnego DNA wyginającego się w główny rowek z dużymi dodatnimi kątami przechyłu znalezionymi w krokach 13 i 22. W kompleksie krystalicznym DNA z Borrelia Bergdorf, białko RHBB.

Zdolność oprogramowania do odbudowy struktur z tych wielkości umożliwia określenie, w jaki sposób poszczególne etapy zasad i par zasad przyczyniają się do ogólnego fałdowania molekularnego. Jak pokazano tutaj, globalne wygięcie DNA wywołane przez HBB odzwierciedla więcej niż dwa ekstremalne zniekształcenia ról wymienione powyżej. DNA pozostaje wysoce zakrzywione po rekonstrukcji z wyprostowanymi krokami par zasad.

Dzieje się tak, gdy dwie największe wartości roli zostały ustawione na zero. Nowa zdolność 3D NA do badania dużej liczby powiązanych struktur umożliwia wyodrębnienie wzorców zależnych zarówno od sekwencji, jak i czasu w układach przestrzennych symulowanych cząsteczek DNA i RNA. Na przykład żółta powłoka kątów przechyłu między kolejnymi parami zasad w dwóch dużych zestawach symulowanych struktur DNA ujawnia preferencyjne zginanie tych cząsteczek na etapach par zasad purynowych w permie.

Wyższe wartości rolki przedstawione na czerwono, które utrzymują się przez krótki czas na końcach DNA, sugerują miejscowe topnienie i ponowne klęczenie struktury podwójnej helisy. Wzorce wariacyjne innych parametrów ciała sztywnego, takie jak kąty i odległości między uzupełniającymi się podstawami, mogą pomóc w rozszyfrowaniu precyzyjnych zniekształceń strukturalnych. Zdolność oprogramowania 3D NA do reorientacji powiązanych cząsteczek we wspólnym układzie odniesienia ujawnia cechy ogólnej struktury ukryte w wielu plikach przechowywanych w banku danych o białkach.

Na przykład, konwencjonalne wyrównanie powiązanych struktur na podstawie średniego kwadratowego dopasowania odpowiednich atomów wytwarza serię podobnych ścieżek przestrzennych, które z grubsza nakładają się na siebie tutaj, 10 modeli opartych na NMR Esia coli, operatora O 3D NA związanego z częściami głowy białka represorowego LAC, Szybkie położenie tych samych struktur na wspólnym układzie współrzędnych na pięciu parach zasad końcowych każdego dupleksu ujawnia znaczne zniekształcenia struktury globalnej, w której cząsteczki wyginają się w znacznie różnych kierunkach. Zmienność strukturalna może wpływać na łatwość, z jaką białko represorowe CIA coli LAC wiąże O 3 i indukuje pętlę między O 3 a sekwencyjnie odległymi operatorami w operacji LAC. Jak pokazano tutaj, precyzyjne rozmieszczenie białka architektonicznego, takiego jak HBB z Borrelia burgdorferi, może mieć dramatyczny wpływ na ogólne fałdowanie DNA.

Jeśli dwie kopie znanej struktury o wysokiej rozdzielczości są oddzielone 43 parami zasad, fragment DNA składający się z 81 par zasad zamyka się w ciasną, prawie okrągłą konfigurację. Jeśli te dwa białka są oddzielone dodatkowymi pięcioma parami zasad, DNA podąża otwartym meandrującym szlakiem. Bardzo różne układy dupleksu zdobionego białkiem pokazują, w jaki sposób odstępy między białkami architektonicznymi mogą wpływać na cyklizację lub zapętlanie DNA po jego rozwoju.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią strukturalną kwasów nukleinowych do zbadania interakcji białek DNA, RNA, fałdowania i projektowania nanocząstek, aby lepiej zrozumieć wady rozwojowe i choroby, takie jak rak, oraz opracować nowe terapie.