Name: Analiza i budowa struktur kwasów nukleinowych za pomocą 3DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 24 s
Description: Poznaj analizę struktur kwasów nukleinowych za pomocą oprogramowania 3DNA. Naucz się wizualizować i modyfikować struktury DNA oraz RNA w celu badania ich przestrzennej organizacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Jiřímu Šponerowi za udostępnienie współrzędnych podwójnych helis DNA wygenerowanych w symulacjach dynamiki molekularnej. Dziękujemy również Nadzie Spackovej za pomoc w pobieraniu tych struktur. Z wdzięcznością potwierdzamy wsparcie niniejszej pracy dzięki grantom badawczym USPHS GM34809 i GM096889.

<ol><li>Lu, X. -J., Olson, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3DNA%3A+a+software+package+for+the+analysis%2C+rebuilding%2C+and+visualization+of+three-dimensional+nucleic+acid+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">3DNA: a software package for the analysis, rebuilding, and visualization of three-dimensional nucleic acid structures.</a> Nucleic Acids Res. 31, 5108-5121 (2003).</li>
<li>Lu, X. -J., Olson, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3DNA%3A+a+versatile%2C+integrated+software+system+for+the+analysis%2C+rebuilding%2C+and+visualization+of+three-dimensional+nucleic-acid+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">3DNA: a versatile, integrated software system for the analysis, rebuilding, and visualization of three-dimensional nucleic-acid structures.</a> Nature Protocols. 3, 1213-1227 (2008).</li>
<li>Zheng, G., Lu, X. -J., Olson, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web+3DNA-a+web+server+for+the+analysis%2C+reconstruction%2C+and+visualization+of+three-dimensional+nucleic-acid+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Web 3DNA-a web server for the analysis, reconstruction, and visualization of three-dimensional nucleic-acid structures.</a> Nucleic Acids. Res. 37, W240-W246 (2009).</li>
<li>Xin, Y., Olson, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BPS%3A+a+database+of+RNA+base-pair+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BPS: a database of RNA base-pair structures.</a> Nucleic Acids Res. 37, D83-D88 (2009).</li>
<li>Zheng, G., Colasanti, A. V., Lu, X. -J., Olson, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3DNALandscapes%3A+a+database+for+exploring+the+conformational+features+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">3DNALandscapes: a database for exploring the conformational features of DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38, 267-274 (2010).</li>
<li>Tolstorukov, M. Y., Colasanti, A. V., McCandlish, D., Olson, W. K., Zhurkin, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+%27roll-and-slide%27+mechanism+of+DNA+folding+in+chromatin.+Implications+for+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel 'roll-and-slide' mechanism of DNA folding in chromatin. Implications for nucleosome positioning.</a> J. Mol. Biol. 371, 725-738 (2007).</li>
<li>Lu, X. -J., Olson, W. K., Bussemaker, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+backbone+plays+a+crucial+role+in+mediating+the+intrinsic+stability+of+the+GpU+dinucleotide+platform+and+the+GpUpA%2FGpA+miniduplex%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA backbone plays a crucial role in mediating the intrinsic stability of the GpU dinucleotide platform and the GpUpA/GpA miniduplex.</a> Nucleic Acids Res. 38, 4868-4876 (2010).</li>
<li>Mouw, K. W., Rice, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+Borrelia+burgdorferi+genome%3A+crystal+structure+and+binding+properties+of+the+DNA-bending+protein+Hbb%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shaping the Borrelia burgdorferi genome: crystal structure and binding properties of the DNA-bending protein Hbb.</a> Mol. Microbiol. 63, 1319-1339 (2007).</li>
<li>Burgdorfer, W., Barbour, A. G., Hayes, S. F., Benach, J. L., Grunwaldt, E., Davis, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyme+disease-a+tick-borne+spirochetosis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lyme disease-a tick-borne spirochetosis?</a> Science. 216, 1317-1319 (1982).</li>
<li>Benach, J. L., Bosler, E. M., Hanrahan, J. P., Coleman, J. L., Habicht, G. S., Bast, T. F., Cameron, D. J., Ziegler, J. L., Barbour, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spirochetes+isolated+from+the+blood+of+two+patients+with+Lyme+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Spirochetes isolated from the blood of two patients with Lyme disease.</a> N. Engl. J. Med. 308, 740-742 (1983).</li>
<li>Lankaš, F., Špačková, N., Moakher, M., Enkhbayar, P., Šponer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+measure+of+bending+in+nucleic+acids+structures+applied+to+A-tract+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A measure of bending in nucleic acids structures applied to A-tract DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3414-3422 (2010).</li>
<li>Romanuka, J., Folkers, G. E., Biris, N., Tishchenko, E., Wienk, H., Bonvin, A. M. J. J., Kaptein, R., Boelens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+affinity+of+Lac+repressor+for+the+auxiliary+operators+O2+and+O3+are+explained+by+the+structures+of+their+protein-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Specificity and affinity of Lac repressor for the auxiliary operators O2 and O3 are explained by the structures of their protein-DNA complexes.</a> J. Mol. Biol. 390, 478-489 (2009).</li>
<li>Berman, H. M., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G., Weissig, H., Shindyalov, I. N., Bourne, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Protein+Data+Bank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids. Res. 28, 235-242 (2000).</li>
<li>Joint, I. U. P. A. C. -I. U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commission+on+Biochemical+Nomenclature+%28JCBN%29+Abbreviations+and+symbols+for+the+description+of+conformations+of+polynucleotide+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) Abbreviations and symbols for the description of conformations of polynucleotide chains.</a> Eur. J. Biochem. 131, 9-15 (1983).</li>
<li>Altona, C., Sundaralingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+analysis+of+the+sugar+ring+in+nucleosides+and+nucleotides.+A+new+description+using+the+concept+of+pseudorotation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Conformational analysis of the sugar ring in nucleosides and nucleotides. A new description using the concept of pseudorotation.</a> J. Am. Chem. Soc. 94, 8205-8212 (1972).</li>
<li>Dickerson, R. E., Bansal, M., Calladine, C. R., Diekmann, S., Hunter, W. N., Kennard, O., von Kitzing, E., Lavery, R., Nelson, H. C. M., Olson, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitions+and+nomenclature+of+nucleic+acid+structure+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Definitions and nomenclature of nucleic acid structure parameters.</a> J. Mol. Biol. 205, 787-791 (1989).</li>
<li>Olson, W. K., Bansal, M., Burley, S. K., Dickerson, R. E., Gerstein, M., Harvey, S. C., Heinemann, U., Lu, X. -J., Neidle, S., Shakked, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standard+reference+frame+for+the+description+of+nucleic+acid+base-pair+geometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A standard reference frame for the description of nucleic acid base-pair geometry.</a> J. Mol. Biol. 313, 229-237 (2001).</li>
<li>Lavery, R., Moakher, M., Maddocks, J. H., Petkeviciute, D., Zakrzewska, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+analysis+of+nucleic+acids+revisited%3A+Curves%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Conformational analysis of nucleic acids revisited: Curves+.</a> Nucleic Acids Res. 37, 5917-5929 (2009).</li>
<li>Franklin, R. E., Gosling, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+configuration+in+sodium+thymonucleate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular configuration in sodium thymonucleate.</a> Nature. 171, 740-741 (1953).</li>
<li>Watson, J. D., Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetical+implications+of+the+structure+of+deoxyribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid.</a> Nature. 171, 964-967 (1953).</li>
<li>Marvin, D. A., Spencer, M., Wilkins, M. H. F., Hamilton, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+configuration+of+deoxyribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new configuration of deoxyribonucleic acid.</a> Nature. 182, 387-388 (1958).</li>
<li>Berman, H. M., Olson, W. K., Beveridge, D. L., Westbrook, J., Gelbin, A., Demeny, T., Hsieh, S. -H., Srinivasan, A. R., Schneider, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nucleic+Acid+Database%3A+a+comprehensive+relational+database+of+three-dimensional+structures+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The Nucleic Acid Database: a comprehensive relational database of three-dimensional structures of nucleic acids.</a> Biophys. J. 63, 751-759 (1992).</li>
<li>Stella, S., Cascio, D., Johnson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+shape+of+the+DNA+minor+groove+directs+binding+by+the+DNA-bending+protein+Fis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The shape of the DNA minor groove directs binding by the DNA-bending protein Fis.</a> Genes Dev. 24, 814-826 (2010).</li>
<li>Swigon, D., Coleman, B. D., Olson, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+Lac+repressor-operator+assembly%3A+the+influence+of+DNA+looping+on+Lac+repressor+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Modeling the Lac repressor-operator assembly: the influence of DNA looping on Lac repressor conformation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 9879-9884 (2006).</li>
<li>Czapla, L., Swigon, D., Olson, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+nucleoid+protein+HU+on+the+structure%2C+flexibility%2C+and+ring-closure+properties+of+DNA+deduced+from+Monte-Carlo+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Effects of the nucleoid protein HU on the structure, flexibility, and ring-closure properties of DNA deduced from Monte-Carlo simulations.</a> J. Mol. Biol. 382, 353-370 (2008).</li>
<li>Czapla, L., Peters, J. P., Rueter, E. M., Olson, W. K., Maher, L. J. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+apparent+DNA+flexibility+enhancement+by+HU+and+HMGB+proteins%3A+experiment+and+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Understanding apparent DNA flexibility enhancement by HU and HMGB proteins: experiment and simulation.</a> J. Mol. Biol. 409, 278-289 (2011).</li>
<li>Auffinger, P., Hashem, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SwS%3A+a+solvation+web+service+for+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SwS: a solvation web service for nucleic acids.</a> Bioinformatics. 23, 1035-1037 (2007).</li>
<li>Dror, O., Nussinov, R., Wolfson, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ARTS+web+server+for+aligning+RNA+tertiary+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The ARTS web server for aligning RNA tertiary structures.</a> Nucleic Acids Res. 34, 412-415 (2006).</li>
<li>Dixit, S. B., Beveridge, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+bioinformatics+of+DNA%3A+a+web-based+tool+for+the+analysis+of+molecular+dynamics+results+and+structure+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Structural bioinformatics of DNA: a web-based tool for the analysis of molecular dynamics results and structure prediction.</a> Bioinformatics. 22, 1007-1009 (2006).</li>
<li>de Vries, S. J., van Dijk, M., Bonvin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HADDOCK+web+server+for+data-driven+biomolecular+docking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The HADDOCK web server for data-driven biomolecular docking.</a> Nat. Protoc. 5, 883-897 (2010).</li>
<li>Capriotti, E., Marti-Renom, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARA%3A+a+server+for+function+annotation+of+RNA+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SARA: a server for function annotation of RNA structures.</a> Nucleic Acids Res. 37, 260-265 (2009).</li>
<li>van Dijk, M., Bonvin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-DART%3A+a+DNA+structure+modelling+server%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">3D-DART: a DNA structure modelling server.</a> Nucleic Acids Res. 37, W235-W239 (2009).</li>
<li>Contreras-Moreira, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-footprint%3A+a+database+for+the+structural+analysis+of+protein-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">3D-footprint: a database for the structural analysis of protein-DNA complexes.</a> Nucleic Acids Res. 38, D91-D97 (2010).</li>
<li>Popenda, M., Szachniuk, M., Blazewicz, M., Wasik, S., Burke, E. K., Blazewicz, J., Adamiak, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+FRABASE+2.0%3A+an+advanced+web-accessible+database+with+the+capacity+to+search+the+three-dimensional+fragments+within+RNA+structures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RNA FRABASE 2.0: an advanced web-accessible database with the capacity to search the three-dimensional fragments within RNA structures.</a> BMC Bioinformatics. 11, 231(2010).</li>
<li>Čech, P., Svozil, D., Hoksza, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SETTER%3A+web+server+for+RNA+structure+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SETTER: web server for RNA structure comparison.</a> Nucleic Acids Res. , (2012).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Zestaw protokołów przedstawionych w niniejszym artykule ukazuje jedynie część możliwości pakietu programów 3DNA. Narzędzia te można zastosować do struktur RNA w celu identyfikacji niekanonicznych par zasad, określenia kontekstów struktury drugorzędowej, w których występuje takie parowanie, ilościowego określenia dyspozycji przestrzennej fragmentów helikalnych, pomiaru nakładania się zasad wzdłuż szkieletu łańcucha i tak dalej. Komenda rebuild umożliwia użytkownikowi stworzenie prostych i informacyjnych reprezentacji blok...

Zrozumienie trójwymiarowych struktur DNA, RNA oraz ich kompleksów z białkami, lekami i innymi ligandami jest kluczowe dla rozszyfrowania ich różnorodnych funkcji biologicznych oraz umożliwia racjonalne projektowanie terapeutyków. Badanie takich struktur obejmuje trzy odrębne, lecz ściśle powiązane ze sobą elementy: analizę (w celu wyodrębnienia wzorców w kształtach i oddziaływaniach), modelowanie (do oceny energetyki i dynamiki molekularnej) oraz wizualizację. Analiza strukturalna i budowanie modeli są w zasadzie dwiema stronami tej samej monety, a wizualizacja uzupełnia oba te procesy.
Zestaw programów komputerowych 3DNA to coraz popularniejszy zestaw narzędzi bioinformatyki strukturalnej, umożliwiający analizę, konstrukcję i wizualizację trójwymiarowych struktur kwasów nukleinowych. Wcześniejsze publikacje opisały możliwości oprogramowania1, przedstawiły procedury wykonywania wybranych zadań2, wprowadziły interfejs internetowy do popularnych funkcji oprogramowania3, zaprezentowały bazy danych cech strukturalnych zebranych przy użyciu 3DNA4, 5 oraz zilustrowały użyteczność oprogramowania w analizie struktur zarówno DNA, jak i RNA6, 7.
Celem niniejszego artykułu jest udostępnienie pakietu oprogramowania 3DNA naukowcom laboratoryjnym oraz innym osobom zainteresowanym i/lub potrzebującym badania organizacji przestrzennej DNA i RNA przy użyciu najnowocześniejszych narzędzi obliczeniowych. Przedstawione tutaj protokoły zawierają instrukcje krok po kroku dotyczące: (i) pobierania i instalacji oprogramowania w systemie Mac OS X, (ii-iii) analizy i modyfikacji struktur DNA na poziomie poszczególnych stopni par zasad, (iv-v) analizy i wyrównywania zestawów powiązanych struktur DNA oraz (vi) konstruowania modeli łańcuchów DNA z przyłączonymi białkami za pomocą przyjaznego dla użytkownika interfejsu internetowego w3DNA. Oprogramowanie to umożliwia analizę pojedynczych struktur rozwiązanych metodami krystalografii rentgenowskiej, a także dużych zespołów struktur wyznaczonych metodami magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) lub generowanych za pomocą technik symulacji komputerowych.
Struktury analizowane w niniejszej pracy obejmują (i) krystaliczną strukturę o wysokiej rozdzielczości DNA związanego z białkiem Hbb z Borrelia burgdorferi8 (bakterii przenoszonej przez kleszcze, która wywołuje u ludzi boreliozę9, 10), (ii) dwa duże zestawy sekwencyjnie powiązanych cząsteczek DNA wytworzonych za pomocą symulacji molekularnych11 – 4500 migawek d(GGCAAAATTTTGCC)2 oraz d(CCGTTTTAAAACGG)2 zarejestrowanych w odstępach 100-psec podczas obliczeń, oraz (iii) niewielki zespół struktur opartych na NMR operatora DNA O3 związanego z domenami głowic białka represora Lac z Escherichia coli12. Poniższe instrukcje zawierają informacje o tym, jak uzyskać dostęp do plików współrzędnych atomowych powiązanych z każdą z tych struktur, a także jak używać programu 3DNA (kopia tego pliku znajduje się na forum 3DNA pod adresem <a href="http://forum.x3dna.org/jove" target="_blank">http://forum.x3dna.org/jove</a>) do badania i modyfikowania tych struktur.

analiza i budowanie struktur kwasów nukleinowych przy użyciu programu 3dna

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

Pakiet oprogramowania 3DNA to popularne i wszechstronne narzędzie bioinformatyczne umożliwiające analizę, konstrukcję i wizualizację trójwymiarowych struktur kwasów nukleinowych. Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowe protokoły dla wybranych nowych i popularnych funkcji dostępnych w 3DNA, które mają zastosowanie zarówno do pojedynczych struktur, jak i zespołów struktur powiązanych. Protokół 1 zawiera zestaw instrukcji niezbędnych do pobrania i zainstalowania oprogramowania. Następnie w Protokole 2 opisano analizę struktury kwasu nukleinowego, w tym przypisywanie par zasad oraz wyznaczanie parametrów sztywnych ciał opisujących strukturę, a w Protokole 3 przedstawiono rekonstrukcję modelu atomowego struktury na podstawie jej parametrów sztywnych ciał. Najnowsza wersja 3DNA, wersja 2.1, posiada nowe funkcje służące do analizy i manipulacji zespołami struktur, takimi jak te uzyskane z pomiarów magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) oraz symulacji dynamiki molekularnej (MD); funkcje te zostały zaprezentowane w Protokołach 4 i 5. Oprócz samodzielnego pakietu oprogramowania 3DNA, serwer WWW w3DNA, znajdujący się pod adresem <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, zapewnia przyjazny interfejs użytkownika do wybranych funkcji oprogramowania. Protokół 6 demonstruje nową funkcję strony służącą do budowania modeli długich cząsteczek DNA z białkami związanymi w określonych przez użytkownika miejscach.

Narzędzia programowe 3DNA są rutynowo wykorzystywane do analizy struktur kwasów nukleinowych. Na przykład tożsamość par zasad oraz parametry ciał sztywnych, które charakteryzują ułożenie zasad w fragmentach podwójnych helis struktur DNA i RNA, są automatycznie obliczane i przechowywane dla każdego nowego wpisu w Nucleic Acid Database22, będącej światowym repozytorium informacji strukturalnych o kwasach nukleinowych. Wartości parametrów ciał sztywnych wyznaczone zgodnie z Protokołem 2 łatwo ujawniają zniekształ...

Pakiet oprogramowania 3DNA jest popularnym i wszechstronnym narzędziem bioinformatycznym umożliwiającym analizę, konstrukcję i wizualizację trójwymiarowych struktur kwasów nukleinowych. Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowe protokoły dla wybranych nowych i popularnych funkcji dostępnych w 3DNA, które można zastosować zarówno do pojedynczych struktur, jak i zespołów struktur powiązanych.

Analiza i budowanie struktur kwasów nukleinowych przy użyciu programu 3DNA

Pakiet oprogramowania 3DNA to popularne i wszechstronne narzędzie bioinformatyczne umożliwiające analizę, konstrukcję i wizualizację trójwymiarowych struktur kwasów nukleinowych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest udostępnienie pakietu programów 3D NA naukowcom laboratoryjnym oraz innym badaczom w celu analizy organizacji przestrzennej DNA i RNA przy użyciu nowoczesnych narzędzi obliczeniowych. Jest to realizowane poprzez pobranie oprogramowania z forum 3D NA i jego instalację na lokalnym komputerze. Drugim krokiem jest analiza reprezentatywnej struktury DNA na poziomie poszczególnych kroków par zasad.Następnie ta sama struktura DNA zostaje zmodyfikowana na poziomie parametrów kroków par zasad, a potem przebudowana z wykorzystaniem nowo zdefiniowanych parametrów. Kolejnym krokiem jest analiza dużego zespołu powiązanych struktur. Ostatnim etapem jest dopasowanie zestawu powiązanych struktur DNA do wspólnego układu odniesienia w celu wizualizacji globalnych zniekształceń struktur.W ostateczności narzędzia 3D NA służą do badania, w jaki sposób poszczególne kroki par zasad, w tym te związane z lekami i białkami, wpływają na ogólne zwijanie się DNA oraz do identyfikacji miejsc i kierunków znacznych zniekształceń globalnych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że oprogramowanie jest odporne i szeroko stosowalne do różnorodnych struktur zawierających kwasy nukleinowe. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biochemii i biofizyki, takie jak sposób organizacji genomów w trzech wymiarach oraz rodzaje deformacji, jakie może przyjąć DNA.Aby rozpocząć instalację pakietu oprogramowania, połącz się ze stroną internetową three DA pod adresem @xthreed. org i kliknij link do forum 3D NA. W obrębie forum wybierz link do rejestracji i postępuj zgodnie z instrukcjami w celu utworzenia nowego konta.Po utworzeniu nazwy użytkownika i hasła zaloguj się na forum, wybierz łącze do pobierania w sekcji powitalnej, a na nowej stronie wybierz pobieranie 3D NA. Kliknij dwukrotnie plik tar gz, aby utworzyć folder o nazwie X 3D NA dash V 2.1, który zawiera oprogramowanie 3D NA. Otwórz aplikację terminala, zazwyczaj znajdującą się w narzędziach w systemie Macintosh, i przejdź do katalogu X 3D NA dash V 2.1.Uruchom skrypt konfiguracyjny niezbędny do prawidłowego funkcjonowania 3D NA. Wszystkie polecenia wykorzystane w tym filmie znajdują się w protokole tekstowym. Następnie skopiuj dwuliniowe ustawienia eksportu, które wyświetlają się na ekranie.Jeśli użytkownik umieścił oprogramowanie w katalogu aplikacji, dwie linie powinny pojawić się tak, jak pokazano tutaj. Otwórz aplikację do edycji tekstu znajdującą się w katalogu aplikacji. W menu formatu wybierz opcję Utwórz zwykły tekst.Jeśli istnieje plik .bashrc, otwórz go w edytorze tekstu, a następnie wklej ustawienia eksportu na końcu pliku. Jeśli plik .bashrc nie istnieje, wklej ustawienia eksportu do pustego pliku i zapisz go pod nazwą .bashrc w katalogu domowym. Aby nowe ustawienia były dostępne, uruchom nowo zapisany plik .bashrc w programie terminala.Niniejszy film demonstruje analizę reprezentatywnej struktury kwasu nukleinowego, mianowicie DNA związanego z białkiem HBB z bakterii Borrelia bergdorfii. Pierwszym krokiem w analizie 3D kwasów nukleinowych jest utworzenie pliku zawierającego listę wszystkich sparowanych zasad. Odbywa się to poprzez wpisanie polecenia uruchamiającego program Find pair dla struktury atomowej zapisanej w pliku NP two, MP two pdb.Kolejnym krokiem analizy jest wyznaczenie parametrów geometrycznych charakteryzujących strukturę. Polecenie analyze przyjmuje jako dane wejściowe plik par zasad i tworzy kilka plików wyjściowych, które pojawiają się w katalogu roboczym. Wartości geometryczne można następnie obliczyć, wpisując analyze two MP two bps.Wygenerowane pliki wyjściowe obejmują plik mp2out, który zawiera przegląd obliczonych parametrów, oraz bpco_steppar, zawierający listę parametrów ciał sztywnych. Oprócz analizy struktury kwasów nukleinowych, oprogramowanie 3D NA umożliwia budowę modelu strukturalnego na podstawie parametrów ciał sztywnych za pomocą polecenia rebuild, aby stworzyć przybliżony model atomowy, który zawiera współrzędne zarówno dla atomów szkieletu, jak i zasad. Wpisz polecenie wymienione w tekście. Polecenie to instruuje program 3D NA do wprowadzenia standardowej konformacji szkieletu B-DNA podczas konstruowania modeli z parametrów ciał sztywnych.Model podwójnej helisy z parametrami ciała sztywnego znalezionymi w strukturze H-B-B-D-N-A można następnie zbudować, wpisując odpowiednią komendę. Plik par kroku bpco można edytować w celu wygenerowania zmodyfikowanej struktury. W tym przypadku zmodyfikowano ekstremalne kąty roll powstałe w dwóch miejscach największego zgięcia.Następnie budowana jest struktura, wykorzystując zmodyfikowany zestaw parametrów kroków jako plik wejściowy. Oba modele można wyświetlić w standardowym programie do wizualizacji cząsteczkowej, w przeciwieństwie do analizy pojedynczej struktury zawierającej kwas nuklenowy. Ta część filmu pokaże, jak analizować duży zespół struktur w zestawie plików, zaczynając od nazw MD_set1.pdb i kończąc na numerze.Pierwszym krokiem w analizie jest identyfikacja sparowanych zasad poprzez uruchomienie programu find pair zgodnie z wcześniejszą procedurą; ponieważ cały zestaw struktur posiada ten sam schemat parowania zasad, należy uruchomić find pair tylko raz na reprezentatywnym pliku, w tym przypadku pliku kończącym się na 1001. Generuje to informacje o parowaniu zasad i zapisuje je w pliku MD at set one BPS PS. Kolejnym krokiem jest wyznaczenie parametrów geometrycznych dla całego zestawu struktur za pomocą polecenia X 3D ncore ensemble.Analyze. Następnie żądane parametry ciała sztywnego można wyodrębnić z pliku wyjściowego z przeglądem MD at set one out.Procedurę tę wykonuje się przy użyciu funkcji Command X three DCO ensemble extract. Wyodrębniane są kąty roll, a następnie tworzony jest plik tekstowy z kątami roll rozdzielonymi przecinkami. Plik ten może zostać wczytany do innych programów w celu przeprowadzenia dalszej analizy i wygenerowania wykresów.Najnowsza wersja 3D NA posiada nową funkcję, która umożliwia użytkownikowi analizę wielu struktur z wspólnej perspektywy. Polecenie X three DCO ensemble reorient superponuje zbiór powiązanych struktur na wspólnej parze zasad lub stopniu parowania zasad, analogicznie do wcześniejszych protokołów. Pierwszym krokiem jest obliczenie parowania zasad DNA za pomocą programu find pair.W tym przypadku plikiem wejściowym jest plik PDB z KEK zawierający 10 struktur operatora O 3D NA z C. coli związanego z częścią głową białka represora LAC. Komenda X three DCO ensemble reorient wyrówna poszczególne modele w strukturze wielomodelowej względem wspólnej ramy odniesienia. Komenda ta wymaga jako dane wejściowe zarówno pliku PDB, jak i pliku par zasad z poprzedniego kroku.W poleceniu zawarto również tożsamość stopnia pary zasad, względem którego wyrównane są wszystkie struktury. Interfejs internetowy W 3D NA zawiera niektóre popularne funkcje pakietu oprogramowania 3D NA. Ta część filmu zwraca uwagę na możliwość konstruowania za pomocą serwera internetowego trójwymiarowych modeli DNA z przyłączonymi białkami.Pierwszym krokiem w budowaniu modelu DNA udekorowanego białkiem jest odwiedzenie strony internetowej W 3D NA dostępnej pod adresem W three d.rutgers.edu. Wybranie opcji Reconstruction z menu w lewym górnym rogu strony aktywuje funkcje budowania modeli online. Następnie należy kliknąć łącze bound protein DNA template znajdujące się w jasno zaznaczonym polu na środku nowej strony.Ten wybór aktywuje menu rozwijane, które pozwala użytkownikowi określić liczbę związanych białek. Wybór liczby związanych białek prowadzi do nowej strony specyfikacji. Użytkownik może następnie wpisać lub wkleić żądaną sekwencję.W polu tekstowym, na środku nowej strony, znajduje się rozwijane menu poniżej pola tekstowego, służące do wyboru konformacji helikalnej nie związanych obszarów DNA. W dolnej części strony specyfikacji znajduje się pole tekstowe do wpisania pozycji wiązania i nazw plików związanych białek. Pozycja wiązania określa położenie środka fragmentu białka związanego z sekwencją DNA.Na dole strony specyfikacji znajduje się pole umożliwiające użytkownikowi wygenerowanie podglądu DNA związanego z białkiem. W tym przypadku pole to zostaje zaznaczone, a następnie kliknięto przycisk kontynuuj. Czynność ta generuje stronę przeglądu zawierającą listę wybranych parametrów, a także wszelkie błędy, które mogły wystąpić w wyniku nakładania się wybranych miejsc wiązania.Użytkownik może wybrać przycisk powrotu, jeśli wymagane są jakiekolwiek zmiany, lub przycisk buduj, aby kontynuować. Następna strona wyświetla statyczny obraz kompleksu białko-DNA w jego najbardziej rozciągniętej konfiguracji oraz umożliwia interaktywną wizualizację online przez sieć WWW. Użytkownik może również pobrać plik zawierający współrzędne atomowe.Narzędzia programistyczne 3D NA są rutynowo wykorzystywane do analizy struktur kwasów nukleinowych. Wartości parametrów bryły sztywnej ujawniają zniekształcenia w strukturze trójwymiarowej, takie jak dwa miejsca ekstremalnego wygięcia DNA w kierunku bruzdy większej z dużymi dodatnimi kątami roll, stwierdzone na stopniach 13 i 22. W kompleksie krystalicznym DNA z białkiem Borrelia Bergdorf, RHBB.Zdolność oprogramowania do rekonstrukcji struktur na podstawie tych wartości umożliwia określenie, w jaki sposób poszczególne zasady oraz kroki par zasad wpływają na ogólne zwinięcie cząsteczki. Jak pokazano tutaj, globalne zgięcie DNA indukowane przez HBB odzwierciedla więcej niż dwa ekstremalne zniekształcenia ról wspomniane powyżej. DNA pozostaje silnie zakrzywione po zrekonstruowaniu z wyprostowanymi krokami tych par zasad.Dzieje się tak, gdy dwie największe wartości roli zostają ustawione na zero. Nowa możliwość badania w 3D NA dużych liczb powiązanych struktur pozwala na wyodrębnienie wzorców zależnych zarówno od sekwencji, jak i czasu w rozmieszczeniu przestrzennym symulowanych cząsteczek DNA i RNA. Na przykład, żółta kolorystyka kątów obrotu między kolejnymi parami zasad w dwóch dużych zestawach symulowanych struktur DNA ujawnia preferencyjne zginanie tych cząsteczek na stopniach par zasad purynowych Permian.Wyższe wartości rollu przedstawione na czerwono, które utrzymują się przez krótkie okresy na końcach DNA, sugerują lokalne topnienie i ponowne zwijanie się struktury podwójnej helisy. Zmienne wzorce innych parametrów ciała sztywnego, takich jak kąty i odległości między komplementarnymi zasadami, mogą pomóc w rozszyfrowaniu precyzyjnych zniekształceń strukturalnych. Zdolność oprogramowania 3D NA do reorientacji powiązanych cząsteczek w wspólnej ramie odniesienia ujawnia cechy ogólnej struktury ukryte w wielu plikach przechowywanych w banku danych białek.Na przykład konwencjonalne dopasowanie powiązanych struktur na podstawie średniokwadratowego odchylenia (RMSD) odpowiadających atomów daje serię podobnych ścieżek przestrzennych, które w tym przypadku niemal całkowicie się pokrywają – są to 10 modeli opartych na NMR operatora O₃ E. coli związany z domenami głowowymi białka represora LAC; natomiast superpozycja tych samych struktur w jednej ramie współrzędnych względem pary zasad na końcu 5' każdego dupleksu ujawnia znaczne zniekształcenia struktury globalnej, w których cząsteczki wyginają się w wyraźnie różnych kierunkach. Zmienność strukturalna może wpływać na łatwość, z jaką białko represora LAC E. coli wiąże się z O₃ i indukuje pętlę między O₃ a sekwencyjnie oddalonymi operatorami w operonie LAC. Jak pokazano tutaj, precyzyjne rozmieszczenie białka architektonicznego, takiego jak HBB z Borrelia burgdorferi, może mieć drastyczny wpływ na ogólny sposób zwinięcia DNA.Jeśli dwie kopie znanej struktury o wysokiej rozdzielczości są oddzielone od siebie 43 parami zasad, fragment DNA o długości 81 par zasad zamyka się w ciasnej, niemal kolistej konfiguracji. Jeśli dwa białka są oddzielone dodatkowymi pięcioma parami zasad, DNA przyjmuje otwartą, meandrującą formę. Te bardzo odmienne układy dupleksu z przyłączonymi białkami pokazują, w jaki sposób rozmieszczenie białek architektonicznych może wpływać na cyklizację lub zapętlenie DNA po jego sformowaniu.Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii strukturalnej kwasów nukleinowych do badania oddziaływań białek z DNA, RNA, fałdowania oraz projektowania nanocząsteczek, aby lepiej zrozumieć wady rozwojowe i choroby, takie jak nowotwory, oraz opracować nowe metody terapeutyczne.

analyzing-and-building-nucleic-acid-structures-with-3dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza i budowanie struktur kwasów nukleinowych za pomocą 3DNA

Kafelkowanie DNA jest skutecznym podejściem do tworzenia programowalnych nanostruktur. Opisujemy protokoły konstruowania złożonych dwuwymiarowych kształtów poprzez samoorganizację jednoniciowych płytek DNA.

Samoorganizacja złożonych dwuwymiarowych kształtów z jednoniciowych płytek DNA

Przedstawiono protokół do badania online relacji sekwencja-struktura-dynamika białek za pomocą Bio3D-web.

Badanie zależności między sekwencją, strukturą i dynamiką białek za pomocą Bio3D-web

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół ligacji T4 i denaturacji PAGE oczyszczania małych kolistych cząsteczek DNA, wyżarzania i natywnej analizy PAGE okrągłych płytek, montażu i obrazowania AFM nanostruktur DNA 1D i 2D, a także elektroforezy w żelu agarozowym i wirowania oczyszczania skończonych nanostruktur DNA.

Stabilne motywy DNA, nanostruktury 1D i 2D zbudowane z małych kolistych cząsteczek DNA

3D wielokolorowe DNA FISH reprezentuje narzędzie do wizualizacji wielu loci genomowych w zachowanych jądrach 3D, jednoznacznie definiując ich wzajemne oddziaływania i lokalizację w przestrzeni jądrowej na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu opisano protokół krok po kroku dla szerokiego spektrum ludzkich komórek pierwotnych.

Wielokolorowe narzędzie 3D DNA FISH do badania architektury jądrowej w ludzkich komórkach pierwotnych

Protokół zawiera instrukcję modyfikacji RNA za pomocą siarczanu dimetylu do eksperymentów z profilowaniem mutacji. Obejmuje ona sondowanie in vitro i in vivo z dwiema alternatywnymi metodami przygotowania biblioteki.

Sondowanie struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem in vitro i w komórkach

Nanomaszyny oparte na DNAzyme mogą być używane do wysoce selektywnego i czułego wykrywania kwasów nukleinowych. W artykule opisano szczegółowy protokół projektowania nanomaszyn opartych na DNAzyme z rdzeniem 10-23 przy użyciu wolnego oprogramowania i ich zastosowania w wykrywaniu fragmentu wirusa Epsteina-Barr jako przykładu.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

Manipulowanie cieczami i zawieszonymi cząstkami w skali mikro i nano staje się coraz bardziej realne dzięki dalszemu rozwojowi technologii umożliwiających, takich jak elektrokinetyka prądu przemiennego (AC electrokinetics). W niniejszym opracowaniu omawiamy podstawy fizyczne elektrokinetyki AC, sposób wytwarzania tych urządzeń oraz metodę interpretacji obserwacji eksperymentalnych.

Zjawiska elektrokinetyczne AC generowane przez struktury mikroelektrodowe

W niniejszym opracowaniu opisujemy podstawowy protokół fluorescencyjnego znakowania różnych elementów cewek serca larw i osobników dorosłych Drosophila melanogaster. Próbki te są dobrze dostosowane do obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej. Technika ta umożliwia szczegółową analizę strukturalną cech serc tego potężnego organizmu modelowego.

Fluorescencyjne znakowanie struktur serca Drosophila

Do generowania koherentnego rozpraszania antystokesowskiego Ramana (CARS) oraz dwukrotnie rezonansowego CARS (DR-CARS) wykorzystuje się kombinację trzech krótkopulsowych laserów o pojedynczej długości fali. Różnica między tymi sygnałami zapewnia zwiększoną czułość w przypadku sygnałów koherentnego rozpraszania Ramana, które w przeciwnym razie byłyby trudne do wykrycia, co umożliwia obrazowanie słabych rozpraszaczy ramanowskich.

Obrazowanie różnicowe struktur biologicznych z wykorzystaniem dwustrojonego koherentnego antystokesowego rozpraszania Ramanowskiego (CARS)

Zastosowanie systemów mikroobjętościowych NanoDrop jako praktycznych i wydajnych alternatyw dla tradycyjnej metodologii oznaczania ilości kwasów nukleinowych opisano poprzez prezentację dwóch protokołów mikroobjętościowego oznaczania ilości kwasów nukleinowych.

Mikroobjętościowe oznaczanie ilościowe kwasów nukleinowych za pomocą NanoDrop

Poznaj analizę struktur kwasów nukleinowych za pomocą oprogramowania 3DNA. Naucz się wizualizować i modyfikować struktury DNA oraz RNA w celu badania ich przestrzennej organizacji.

Analiza i budowanie struktur kwasów nukleinowych przy użyciu programu 3DNA

Przeglądaj więcej filmów