Name: Autologiczny przeszczep chondrocytów wspomagany matrycą w celu przebudowy i naprawy ubytków chrzęstnych w modelu królika (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj metodę autologicznego przeszczepu chondrocytów wspomaganego matrycą do naprawy ubytków chrzęstnych w stawie kolanowym królika. Technika MACT pozwala uzyskać jednorodną i trwałą tkankę naprawczą po 12 tygodniach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt ten był finansowany przez Niemiecką Agencję Badawczą (DFG, HE 4578/3-1).

A. Biopsja chrząstki (sala operacyjna; kroki 1-5 w niesterylnym pomieszczeniu przygotowawczym)
<ol>
	<li>Przeprowadź końcową kontrolę masy ciała królika (królik nowozelandzki biały, samica, masa ciała 3,5-4,0 kg, wiek 6 miesięcy), aby umożliwić prawidłowe dawkowanie leków oraz monitorowanie masy ciała po operacji.</li>
	<li>Wprowadź królika w stan znieczulenia poprzez dożylny wtrysk 10 mg/kg propofolu.</li>
	<li>Po intubacji utrzymuj znieczulenie dożylnie za pomocą 1,5 mg/kg/min propofolu i 0,05 mg/kg fentanylu. Monitoruj znieczulenie, korzystając z kapnografii, pulsoksymetrii oraz pomiaru tętna.</li>
	<li>Ogól kolano, które ma zostać poddane operacji, za pomocą trymera elektrycznego i odessij sierść odkurzaczem.</li>
	<li>Dokładnie zdezynfekuj ogolone kolano i przykryj resztę ciała królika jałowym opatrunkiem.</li>
	<li>Zmierz palcami rzepkę i wykonaj nacięcie skóry po stronie przyśrodkowej rzepki.</li>
	<li>Otwórz staw kolanowy poprzez przyśrodkową artrotomię oko-rzepkową w warunkach sterylnych. Staraj się uniknąć przecięcia małych powierzchownych naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Przemieść rzepkę bocznie.</li>
	<li>Obejrzyj staw kolanowy pod kątem ewentualnych anomalii i makroskopowych uszkodzeń chrząstki.</li>
	<li>Ostrożnie wyciąć małe fragmenty chrząstki (2-3 mm) z bloczka kości udowej za pomocą jałowego skalpela (Rysunek 1).</li>
	<li>Natychmiast umieść pobrane biopsje chrząstki w probówce 50 ml z pełną pożywką (DMEM + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FCS) + 1% penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep)), aby kontynuować hodowlę in vitro bezpośrednio po operacji.</li>
	<li>Oczyść ubytki i przepłucz je jałową solą fizjologiczną.</li>
	<li>Przywróć rzepkę do położenia w bruździe bloczka.</li>
	<li>Zamknij ranę warstwowo za pomocą pojedynczych szwów węzełkowych (4-0 Vicryl) i ciągłego szwu skórnego (4-0 Monocryl). Użyj wchłanialnego materiału szewnego.</li>
	<li>Na koniec zabezpiecz ranę przepuszczalnym dla pary wodnej opatrunkiem w sprayu.</li>
</ol>
B. Hodowla in vitro
<ol>
	<li>Przetworzyć pobrane fragmenty chrząstki biopsyjnej tak szybko, jak to możliwe po operacji, w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza do hodowli tkanek.</li>
	<li>Przemyć sterylną, pobraną chrząstkę 2x w PBS, a następnie odwirować przy 500 x g przez 3 min w RT.</li>
	<li>Pokroić chrząstkę na fragmenty o objętości 1 mm3, przenieść do probówki Falcon 50 ml i trawić na wytrząsarce przez 30 min w 10 ml trypsyny-EDTA (0,25%) i 10 ml PBS przez 30 min.</li>
	<li>Po 30 min przerwać trypsynizację poprzez dodanie pożywki kompletnej. Następnie inkubować fragmenty chrząstki na wytrząsarce przez kolejne 12 hr z kolagenazą A (0,21 U/mg) w pożywce bezsurowiczej (DMEM + 1% Pen/Strep).</li>
	<li>Odwirować otrzymany roztwór przy 170 x g przez 3 min w RT.</li>
	<li>Resuspendować osad komórkowy w 5 ml pożywki kompletnej.</li>
	<li>Zasiać wyizolowane chondrocyty do kolb do hodowli tkanek o powierzchni 25 cm2 w 5 ml pożywki kompletnej i inkubować w nawilżonym inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2.</li>
	<li>Hodować chondrocyty do osiągnięcia gęstości 80%.</li>
	<li>Uwolnić komórki z kolb, przemywając je 2x w PBS, a następnie poddać działaniu 0,05% trypsyny-EDTA przez 3 min. Po odczepieniu się chondrocytów przerwać trypsynizację poprzez dodanie 10 μl pożywki kompletnej.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę przy 300 x g (3 min) i resuspendować osad w pożywce kompletnej.</li>
	<li>Zasiać komórki w kolbach do hodowli tkanek (75 cm2) i pasażować w stosunku 1:3 (∼5 000 komórek/cm2) co 5ty dzień lub po osiągnięciu 80% konfluencji.</li>
	<li>Określić liczbę i żywotność komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym.</li>
</ol>
C. Zasiewanie komórek na matrycy
<ol>
	<li>Przed implantacją wypłukać i uwolnić komórki zgodnie z powyższym opisem. Przeprowadzić zliczanie komórek i przenieść 5 x 104 komórek do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Następnie wirować przy 500 x g przez 5 min w RT.</li>
	<li>Resuspendować osad w 15 μl pożywki kompletnej, aby uzyskać pełne nasycenie matrycy.</li>
	<li>Wyciąć dwuwarstwowy rusztowanie kolagenowe o wymiarach dokładnie odpowiadających defektowi bloczka przy użyciu sterylnego wycinaka do biopsji.</li>
	<li>Umieścić matrycę w naczyniu do hodowli tkankowej o odpowiednim rozmiarze (np. płytkach 24-dołkowych).</li>
	<li>Zasiać komórki na porowatej, adhezyjnej stronie matrycy. Zapobiega to migracji komórek poza obszar matrycy.</li>
	<li>Pozostawić zasiane komórkami matryce bez dodatkowej pożywki hodowlanej w inkubatorze przez 1 hr, aby umożliwić pełną adhezję chondrocytów.</li>
	<li>Następnie umieścić konstrukty komórka-matryca w naczyniach hodowlanych (np. płytkach 24-dołkowych) ze świeżą pożywką kompletną. Należy uważać, aby nie wypłukać komórek z matrycy, mimo oczekiwanej silnej adhezji.</li>
	<li>Obecnie konstrukty komórka-matryca mogą zostać przeniesione do sali operacyjnej w celu reimplantacji.</li>
</ol>
D. Autologiczna transplantacja chondrocytów wspomagana macierzą
<ol>
	<li>Wykonaj artrotomię parapatelarną kolana przeciwległego zgodnie z powyższym opisem (A. 1-8).</li>
	<li>Utwórz dwa odizolowane defekty chrzęstne w bruździe międzykłykciowej za pomocą sterylnego pneumatycznego wiertła chirurgicznego (o średnicy 3,6 mm).</li>
	<li>Oczyść defekt i wypłucz sterylną solą fizjologiczną.</li>
	<li>Należy zwrócić uwagę, aby w żadnym momencie nie otworzyć jamy szpiku. W razie potrzeby dno defektów należy zabezpieczyć za pomocą elektrokoagulacji przeciwkrwawiennej.</li>
	<li>Zaimplantuj macierze zasiane hodowlą chondrocytów stroną porowatą do dołu (Rysunek 2). Następnie wprowadź je do otworów wiertniczych metodą press-fit i wyrównaj z powierzchnią otaczającą.</li>
	<li>Uszczelnij zaimplantowane macierze niewielką ilością kleju fibrynowego (Tissucol Duo S), aby zapewnić stabilną fiksację.</li>
	<li>Po skrzepnięciu przywróć rzepkę do bruzdy międzykłykciowej i kilkukrotnie wykonaj pełny zakres ruchu stawu kolanowego.</li>
	<li>Ponownie przemieść rzepkę bocznie i sprawdź, czy nie występuje żadne zdarzenie lub oznaka niestabilnej fiksacji. Macierze muszą pozostać nieruchomo na swoim miejscu.</li>
	<li>Ponownie przywróć rzepkę na miejsce i zakończ operację warstwowym zamknięciem rany oraz nałożeniem opatrunku w sprayu zgodnie z powyższym opisem.</li>
</ol>

<ol><li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+and+cell+differentiation+in+matrix-associated+chondrocyte+transplantation+grafts%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Gene expression and cell differentiation in matrix-associated chondrocyte transplantation grafts: a comparative study.</a> Osteoarthritis Cartilage. 19, 1219-1227 (2011).</li>
<li>Pridie, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+resurfacing+osteoarthritic+knee+joints%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Br%22%5BJournal%5D)">A method of resurfacing osteoarthritic knee joints.</a> J. Bone Joint Surg. Br. 41, 618-619 (1959).</li>
<li>Johnson, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthroscopic+abrasion+arthroplasty+historical+and+pathologic+perspective%3A+present+status%5BTitle%5D)+AND+%22Arthroscopy%22%5BJournal%5D)">Arthroscopic abrasion arthroplasty historical and pathologic perspective: present status.</a> Arthroscopy. 2, 54-69 (1986).</li>
<li>Steadman, J. R., Rodkey, W. G., Singelton, S. B., Briggs, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfracture+technique+for+full-thickness+chondral+defects%3A+technique+and+clinical+result%5BTitle%5D)+AND+%22Operat.+Tech.+Orthop%22%5BJournal%5D)">Microfracture technique for full-thickness chondral defects: technique and clinical result.</a> Operat. Tech. Orthop. 7, 300-304 (1997).</li>
<li>Brittberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+deep+cartilage+defects+in+the+knee+with+autologous+chondrocyte+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation.</a> N. Engl. J. Med. 331, 889-895 (1994).</li>
<li>Peterson, L., Vasiliadis, H. S., Brittberg, M., Lindahl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chondrocyte+implantation%3A+a+long-term+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Autologous chondrocyte implantation: a long-term follow-up.</a> Am. J. Sports Med. 38, 1117-1124 (2010).</li>
<li>Nehrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocyte-seeded+collagen+matrices+implanted+in+a+chondral+defect+in+a+canine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Chondrocyte-seeded collagen matrices implanted in a chondral defect in a canine model.</a> Biomaterials. 19, 2313-2328 (1998).</li>
<li>Frenkel, S. R., Toolan, B., Menche, D., Pitman, M. I., Pachence, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocyte+transplantation+using+a+collagen+bilayer+matrix+for+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone.+Joint+Surg.+Br%22%5BJournal%5D)">Chondrocyte transplantation using a collagen bilayer matrix for cartilage repair.</a> J. Bone. Joint Surg. Br. 79, 831-836 (1997).</li>
<li>Salzmann, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dependence+of+autologous+chondrocyte+transplantation+on+varying+cellular+passage%2C+yield+and+culture+duration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The dependence of autologous chondrocyte transplantation on varying cellular passage, yield and culture duration.</a> Biomaterials. 32, 5810-5818 (2011).</li>
<li>Frohlich, M., Malicev, E., Gorensek, M., Knezevic, M., Kregar Velikonja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+rabbit+auricular+chondrocyte+isolation+and+growth+parameters+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Evaluation of rabbit auricular chondrocyte isolation and growth parameters in cell culture.</a> Cell Biol. Int. 31, 620-625 (2007).</li>
<li>Willers, C., Chen, J., Wood, D., Xu, J., Zheng, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chondrocyte+implantation+with+collagen+bioscaffold+for+the+treatment+of+osteochondral+defects+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Autologous chondrocyte implantation with collagen bioscaffold for the treatment of osteochondral defects in rabbits.</a> Tissue Eng. 11, 1065-1076 (2005).</li>
<li>Vogt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+the+stable+expression+of+BMP2+in+fibrin+clots+on+the+remodelling+and+repair+of+osteochondral+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of the stable expression of BMP2 in fibrin clots on the remodelling and repair of osteochondral defects.</a> Biomaterials. 30, 2385-2392 (2009).</li>
<li>Ueblacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+retroviral+gene+transfer+to+chondrocytes+within+collagen+scaffolds+for+the+treatment+of+osteochondral+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of retroviral gene transfer to chondrocytes within collagen scaffolds for the treatment of osteochondral defects.</a> Biomaterials. 28, 4480-4487 (2007).</li>
<li>Marlovits, S., Zeller, P., Singer, P., Resinger, C., Vecsei, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+repair%3A+generations+of+autologous+chondrocyte+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Cartilage repair: generations of autologous chondrocyte transplantation.</a> Eur. J. Radiol. 57, 24-31 (2006).</li>
<li>Benya, P. D., Shaffer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiated+chondrocytes+reexpress+the+differentiated+collagen+phenotype+when+cultured+in+agarose+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels.</a> Cell. 30, 215-224 (1982).</li>
<li>Rudert, M., Hirschmann, F., Wirth, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+behavior+of+chondrocytes+on+various+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Orthopade%22%5BJournal%5D)">Growth behavior of chondrocytes on various biomaterials.</a> Orthopade. 28, 68-75 (1999).</li>
<li>Hsu, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+biodegradable+polyesters+modified+by+type+II+collagen+and+Arg-Gly-Asp+as+Tissue+Engineering+scaffolding+materials+for+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Evaluation of biodegradable polyesters modified by type II collagen and Arg-Gly-Asp as Tissue Engineering scaffolding materials for cartilage regeneration.</a> Artificial Organs. 30, 42-55 (2006).</li>
<li>Brun, P., Cortivo, R., Zavan, B., Vecchiato, N., Abatangelo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro++reconstructed+tissues+on+hyaluronan-based+temporary+scaffolding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstructed tissues on hyaluronan-based temporary scaffolding.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 10, 683-688 (1999).</li>
<li>Domm, C., Fay, J., Schunke, M., Kurz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redifferentiation+of+dedifferentiated+joint+cartilage+cells+in+alginate+culture.+Effect+of+intermittent+hydrostatic+pressure+and+low+oxygen+partial+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Orthopade%22%5BJournal%5D)">Redifferentiation of dedifferentiated joint cartilage cells in alginate culture. Effect of intermittent hydrostatic pressure and low oxygen partial pressure.</a> Orthopade. 29, 91-99 (2000).</li>
<li>Kimura, T., Yasui, N., Ohsawa, S., Ono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocytes+embedded+in+collagen+gels+maintain+cartilage+phenotype+during+long-term+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Chondrocytes embedded in collagen gels maintain cartilage phenotype during long-term cultures.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. , 231-239 (1984).</li>
<li>Kon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-generation+autologous+chondrocyte+implantation%3A+results+in+patients+older+than+40+years%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Second-generation autologous chondrocyte implantation: results in patients older than 40 years.</a> Am. J. Sports Med. 39, 1668-1675 (2011).</li>
<li>Gavenis, K., Schmidt-Rohlfing, B., Mueller-Rath, R., Andereya, S., Schneider, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+comparison+of+six+different+matrix+systems+for+the+cultivation+of+human+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">In vitro comparison of six different matrix systems for the cultivation of human chondrocytes.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 159-167 (2006).</li>
<li>Niemeyer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+complications+after+autologous+chondrocyte+implantation+for+cartilage+defects+of+the+knee+joint%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Characteristic complications after autologous chondrocyte implantation for cartilage defects of the knee joint.</a> Am. J. Sports Med. 36, 2091-2099 (2008).</li>
<li>Tay, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+outcomes+of+alginate-embedded+allogenic+mesenchymal+stem+cells+versus+autologous+chondrocytes+for+the+repair+of+focal+articular+cartilage+defects+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Treatment outcomes of alginate-embedded allogenic mesenchymal stem cells versus autologous chondrocytes for the repair of focal articular cartilage defects in a rabbit model.</a> The American Journal of Sports Medicine. 40, 83-90 (2012).</li>
<li>Brittberg, M., Nilsson, A., Lindahl, A., Ohlsson, C., Peterson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+articular+cartilage+defects+treated+with+autologous+cultured+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Rabbit articular cartilage defects treated with autologous cultured chondrocytes.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. , 270-283 (1996).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony protokół opisuje uznaną 9,12,13 i łatwo powtarzalną technikę izolacji autologicznych chondrocytów w celu ich późniejszej proliferacji i reimplantacji do sztucznie wywołanych ubytków chrząstki w kolanach królików. Wykorzystanie autologicznych chondrocytów do remodelingu i naprawy uszkodzeń chrząstki stawowej znajduje już zastosowanie w praktyce klinicznej, zapewniając satysfakcjonujące wyniki długoterminowe 6.
Poważne problemy, takie jak np. przerost okostnej...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Nazwa odczynnika/sprzętu&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Firma&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Numer katalogowy&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Uwagi&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom AG</td><td>F 0415</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza A</td><td>Roche</td><td>10 103 586 001</td><td>0.21 U/mg</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FCS)</td><td>PAN Biotech GmbH</td><td>3702-P103009</td><td></td></tr><tr><td>Propofol</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Biochrom AG</td><td>A 2213</td><td>10,000 U/ml/10,000 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>PBS Dulbecco (1X)</td><td>Biochrom AG</td><td>L1815</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70%)</td><td>Merck KgaA</td><td>410230</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 0.25 %/0.02 %</td><td>Biochrom AG</td><td>L2163</td><td>w PBS bez Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Delta Select GmBH</td><td>1819340</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór NaCl (0.9%)</td><td>Bbraun</td><td>8333A193</td><td></td></tr><tr><td>Szalki do hodowli tkankowych 100 mm/150 mm</td><td>TPP AG</td><td>93100/93150</td><td>Powierzchnia wzrostu 60.1 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;/147.8 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych 25/75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>TPP AG</td><td>90025/90075</td><td>25 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, 75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Probówki do wirówki (50 ml)</td><td>TPP AG</td><td>91050</td><td>Sterylizowane gamma</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Brand GmbH+Co KG</td><td>717810</td><td>Neubauera</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanu 0.4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8154</td><td></td></tr><tr><td>Opatrunek w sprayu (OpSite)</td><td>Smith&amp;amp;Nephew</td><td>66004978</td><td>Przepuszczalny dla pary wodnej</td></tr><tr><td>Chondro-Gide&amp;Ograve;</td><td>Geistlich Pharma AG</td><td>30915.5</td><td></td></tr><tr><td>Wycinak do biopsji</td><td>pfm medical ag</td><td>48351</td><td></td></tr><tr><td>Tissucol Duo S</td><td>Baxter</td><td>3419627</td><td>0.5 ml</td></tr></tbody></table>

przeszczep chrząstki autologicznej wspomagany macierzą w celu przebudowy i naprawy ubytków chrzęstnych w modelu królika

Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Transplantation for Remodeling and Repair of Chondral Defects in a Rabbit Model

Uszkodzenia chrząstki stawowej są uważane za istotny problem zdrowotny, ponieważ chrząstka stawowa ma ograniczoną zdolność do samoregeneracji 1. Nieleczone zmiany chrząstki prowadzą do uporczywego bólu, negatywnie wpływają na jakość życia i predysponują do rozwoju choroby zwyrodnieniowej stawów. W ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowano kilka technik chirurgicznych do leczenia takich zmian. Jednak do tej pory nie udało się osiągnąć pełnej naprawy w zakresie pokrycia ubytku chrząstką stawową szklistą lub zapewnienia satysfakcjonującej długoterminowej regeneracji 2-4. W związku z tym urazy chrząstki stawowej pozostają głównym celem technik regeneracyjnych, takich jak inżynieria tkankowa. W przeciwieństwie do innych technik chirurgicznych, które często prowadzą do powstania tkanki włóknistej lub włóknisto-chrząstkowej, inżynieria tkankowa dąży do pełnego przywrócenia złożonej struktury i właściwości oryginalnej chrząstki stawowej poprzez wykorzystanie potencjału chondrogennego przeszczepionych komórek. Niedawne osiągnięcia otworzyły obiecujące możliwości w zakresie regeneracyjnych terapii chrząstki.
Pierwsze podejście oparte na komórkach w leczeniu pełnowarstwowych uszkodzeń chrząstki lub uszkodzeń osteochondralnych zostało przeprowadzone w 1994 roku przez Larsa Petersona i Matsa Brittberga, którzy zapoczątkowali kliniczną implantację autologicznych chondrocytów (ACI) 5. Obecnie technika ta jest dobrze ugruntowana klinicznie w leczeniu dużych ubytków chrząstki szklistej kolana, zapewniając dobre wyniki kliniczne nawet 10 do 20 lat po implantacji 6. W ostatnich latach implantacja autologicznych chondrocytów przeszła szybki rozwój. Coraz popularniejsze stało się wykorzystanie sztucznej trójwymiarowej macierzy kolagenowej, na której następnie replantowane są komórki 7-9.
MACT składa się z dwóch procedur chirurgicznych: Po pierwsze, w celu pobrania chondrocytów należy wykonać biopsję chrząstki z obszaru stawu kolanowego niepodlegającego obciążeniom. Następnie chondrocyty są ekstrahowane, oczyszczane i namnażane in vitro do uzyskania odpowiedniej liczby komórek. Chondrocyty są następnie wysiewane na macierz trójwymiarową, która może zostać później reimplantowana. Podczas przygotowywania implantu inżynierii tkankowej kluczowe dla skutecznej regeneracji tkanki są tempo proliferacji oraz zdolność do różnicowania 10. Uważa się, że zastosowanie macierzy trójwymiarowej jako nośnika komórek wspiera te charakterystyki komórkowe 11.
Poniższy protokół podsumowuje i demonstruje technikę izolacji chondrocytów z biopsji chrząstki, ich proliferację in vitro oraz ich wysiew na matrycę 3D (Chondro-Gide, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Szwajcaria). Na koniec opisano implantację konstruktów komórka-matryca w sztucznie wytworzonych ubytkach chrzęstnych w stawie kolanowym królika. Technika ta może być wykorzystana jako układ doświadczalny w dalszych badaniach nad regeneracją chrząstki.

Opisana technika chirurgiczna umożliwia skuteczną izolację i implantację autologicznych chondrocytów w sztucznym defekcie chrząstki. Układ doświadczalny doprowadził do pomyślnej integracji implantu z otaczającą chrząstką.
Po 12 tygodniach in vivo ubytek chrzestny został wypełniony tkanką naprawczą o jednorodnej i nienaruszonej powierzchni, co zredukowało naprężenia ścinające i uszkodzenia implantu (Rycina 4). Ponadto nie zaobserwowano hipertrofii ani zwapnienia implan...

Opisano eksperymentalną technikę leczenia uszkodzeń chrzęstnych w stawie kolanowym królika. Implantacja autologicznych chondrocytów osadzonych na macierzy jest powszechnie akceptowaną metodą przebudowy i naprawy uszkodzeń chrząstki stawowej, zapewniającą satysfakcjonujące długoterminowe wyniki. Transplantacja autologicznych chondrocytów wspomagana macierzą (MACT) oferuje zstandaryzowaną i klinicznie uznaną metodę implantacji.

Przeszczep chrząstki autologicznej wspomagany macierzą w celu przebudowy i naprawy ubytków chrzęstnych w modelu królika

Uszkodzenia chrząstki stawowej są uważane za poważny problem zdrowotny, ponieważ chrząstka stawowa wykazuje ograniczoną zdolność do samoregeneracji 1. Nieleczone...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opis techniki eksperymentalnej służącej do leczenia ubytków chrzęstnych w stawie kolanowym królika. Realizuje się to poprzez wykonanie w pierwszej kolejności biopsji chrząstki ze stawu kolanowego w celu pobrania autologicznych chondrocytów. Drugim krokiem jest wyizolowanie, oczyszczenie i namnożenie pobranych w biopsji chondrocytów in vitro do uzyskania odpowiedniej liczby komórek.Następnie chondrocyty są osadzane na macierzy trójwymiarowej. W ostatnim kroku macierz trójwymiarowa jest implantowana w defekt chrzestny, który został wywiercony w przeciwległym kolanie królika. Ostatecznie, po 12 tygodniach in vivo, implanty można ocenić makroskopowo, a tkanka naprawcza wykazuje jednorodną i nienaruszoną powierzchnię o zwartej strukturze.Niniejsza metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji chrząstki stawowej i może ułatwić analizę eksperymentalną terapii czynnikami wzrostu, indukcji genów oraz zmiany właściwości metrycznych. Po znieczuleniu królika należy ogolić kolano, które ma zostać poddane operacji, za pomocą golarki elektrycznej. Następnie należy odessać sierść odkurzaczem i dokładnie zdezynfekować ogolone kolano, przykrywając resztę ciała zwierzęcia jałowym opatrunkiem.Następnie należy przeprowadzić palpację rzepki. Wykonać nacięcie skóry po stronie przyśrodkowej rzepki, a następnie w warunkach sterylnych otworzyć staw kolanowy poprzez przyśrodkową parapatellarną artrotomię, przemieścić rzepkę bocznie, a następnie użyć sterylnego skalpela, aby ostrożnie oddzielić małe kawałki chrząstki o długości od 2 do 3 mm z trochlea ossis femoris.Bezzwłocznie umieść biopsaty chrząstki w probówce o pojemności 50 ml zawierającej pełną pożywkę, a następnie wypłucz ubytki sterylną solą fizjologiczną. Użyj pęsety, aby usunąć wszelkie pozostałe fragmenty chrząstki. Następnie przywróć rzepkę w rowku trochlealnym i zamknij ranę warstwowo, stosując pojedyncze szwy guzkowe oraz ciągły wchłanialny szew skórny.Na koniec zabezpiecz ranę sprayem opatrunkowym przepuszczalnym dla pary wodnej. Rozpocznij ten krok od dwukrotnego przemycia sterylnej pobranej chrząstki w PBS, a następnie odwirowania przez trzy minuty przy 500 ×g w temperaturze pokojowej. Następnie potnij chrząstkę na kawałki o wymiarach jednego milimetra sześciennego.Przenieś je do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml, a następnie poddaj fragmenty trawieniu z użyciem 10 ml trypsyny, EDTA oraz 10 ml PBS na wytrząsarce. Po 30 minutach przerwij trypsynizację, dodając 10 ml pożywki kompletnej. Po wirowaniu usuń nadsącz i dodaj pożywkę bezzserwatkową z kolagenazą A. Następnie wytrząsaj fragmenty przez kolejne 12 godzin.Następnie odwiruj otrzymany roztwór, a osad komórkowy resuspenduj w pięciu mililitrach pełnej pożywki. Wysiej wyizolowane cyty do kolb tkankowych o powierzchni 25 cm² w pięciu mililitrach pełnej pożywki i hoduj komórki w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po osiągnięciu przez kultury gęstości 80%, przemyj cyty dwukrotnie w PBS. Następnie poddaj je działaniu 0,05% trypsyny EDTA przez trzy minuty.Po odłączeniu komórek należy dodać pięć mililitrów pełnej pożywki, aby zatrzymać proces trypsynizacji. Po odwirowaniu komórek należy resuspender osad w pełnej pożywce, a następnie zasiać komórki w kolbach do hodowli tkankowych o powierzchni 75 cm². Po zebraniu komórek z hodowli in vitro w sposób zaprezentowany powyżej, należy je przeliczyć, a następnie przenieść 5 × 10⁴ komórek do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.Po odwirowaniu zawiesiny komórkowej, resuspender osad w 15 µL pełnej pożywki, aby zapewnić całkowite nasycenie macierzy. Następnie wyciąć dwuwarstwowy rusztowanie kolagenowe do dokładnych wymiarów ubytku bloczkowego i umieścić macierz w płytce 24-dołkowej. Teraz zasiać chondrocyty na porowatą, adhezyjną stronę macierzy, aby zapobiec migracji komórek poza obszar macierzy.Następnie inkubuj matryce z osadzonymi komórkami bez dodatkowej pożywki hodowlanej przez jedną godzinę, aby umożliwić pełną adhezję chondrocytów. Na koniec przenieś konstrukty z matryc komórkowych do nowej płytki 24-dołkowej z nową, kompletną pożywką.Po przeprowadzeniu artrotomii okołorzepałkowej przeciwległego kolana, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, należy rozpocząć transplantację, używając sterylnej pneumatycznej wiertarki chirurgicznej do stworzenia dwóch odizolowanych ubytków chrzęstnych o średnicy 3,6 millimeter w bruździe troklearniej. Następnie ubytki należy przepłukać sterylnym roztworem soli fizjologicznej, uważając, aby nie otworzyć jamy szpiku.Następnie zaimplantuj macierze zasiane chondrocytami stroną porowatą skierowaną w dół, a następnie użyj niewielkiej ilości kleju fibrynowego, aby uszczelnić zaimplantowane macierze i zapewnić ich stabilną fiksację. Przywróć rzepkę do bruzdy międzykłykciowej i kilkukrotnie wykonaj pełny zakres ruchu w stawie kolanowym. Następnie, przytrzymując macierze w miejscu, ponownie przemieść rzepkę bocznie, aby sprawdzić, czy nie występują oznaki poluzowania fiksacji.Po ponownym zamocowaniu rzepki należy zakończyć operację warstwowym zamknięciem rany i nałożeniem opatrunku w sprayu, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Po 12 tygodniach in vivo ubytek chrzestny został wypełniony tkanką naprawczą o jednorodnej i nienaruszonej powierzchni, co zredukowało naprężenia ścinające oraz uszkodzenia implantu. Co więcej, nie zaobserwowano przerostu ani zwapnienia implantu.Tkanka naprawcza wykazywała sztywną i zwartą strukturę, porównywalną ze zdrową otaczającą tkanką chrzęstną. Ponadto nie wystąpiło odwarstwienie przeszczepu. Czerwona strzałka wskazuje wcześniej wykonany defekt chrzęstny 12 tygodni po zasiewie autologicznych chondrocytów.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat izolacji autologicznych chondrocytów w celu ich późniejszej proliferacji in vitro oraz sposobu ich wysiewania na rusztowania 3D do reimplantacji w sztucznie stworzonych ubytkach chrzęstnych w kolanie królika. W celu dalszego zapoznania się z techniką tworzenia ubytku chrzęstnego w innym modelu eksperymentalnym, prosimy o obejrzenie naszego towarzyszącego artykułu JoVE: Treatment of Osteocondral defects in the rabbit's knee joint by implantation of allogeneic mesenchymal stem cells in fibrin clots.

matrix-assisted-autologous-chondrocyte-transplantation-for-remodeling

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wszczepianie autologous chondrocytów wspomagane matrycą do remodelacji i naprawy defektów chrząstki w modelu królika

Opisano eksperymentalną technikę leczenia ubytków chrzęstno-kostnych w stawie kolanowym królika. Implantacja allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w ubytki chrzęstno-kostne stanowi obiecujący kierunek rozwoju w dziedzinie inżynierii tkankowej. Przygotowanie skrzepów fibrynowo-komórkowych in vitro oferuje zestandaryzowaną metodę implantacji.

Leczenie ubytków chrzęstno-kostnych w stawie kolanowym królika poprzez implantację allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w skrzepach fibrynowych

Modele zwierzęce są ważnymi narzędziami do oceny przeszczepów wytwarzanych metodą inżynierii tkankowej. W pracy przedstawiono protokół przygotowania elektroprzędzonego biodegradowalnego przeszczepu polimerowego do zastosowania w inżynierii tkankowej więzadła krzyżowego przedniego, a także protokół chirurgiczny implantacji w modelu szczurzym.

Atymiczny model szczura do oceny zmodyfikowanych przeszczepów więzadła krzyżowego przedniego

Celem tego badania jest przedstawienie protokołu artroskopowego leczenia uszkodzeń kostno-chrzęstnych kości skokowej przy użyciu mikrozłamanych i oczyszczonych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej.

Autologiczna mikropęknięta i oczyszczona tkanka tłuszczowa do artroskopowego leczenia zmian kostno-chrzęstnych kości skokowej

Przedstawiamy metodę oceny przestrzennego zasięgu uszkodzenia/śmierci komórek na powierzchni stawowej nienaruszonych stawów mysich po zastosowaniu kontrolowanych obciążeń mechanicznych lub uderzeń. Metoda ta może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób choroba zwyrodnieniowa stawów, czynniki genetyczne i/lub różne schematy obciążenia wpływają na podatność chondrocytów in situ.

Wizualizacja i analiza w czasie rzeczywistym uszkodzeń chondrocytów spowodowanych obciążeniem mechanicznym w całkowicie nienaruszonych eksplantatach chrząstki myszy

Tutaj prezentujemy protokół opisujący izolację i hodowlę eksplantatów chrząstek z kolan bydlęcych. Metoda ta stanowi łatwe i przystępne narzędzie do opisywania zmian w tkankach w odpowiedzi na bodźce biologiczne lub nowatorskie terapie ukierunkowane na staw.

Model hodowli tkankowej ex vivo przebudowy chrząstki w eksplantatach bydlęcego kolana

Tutaj prezentujemy model uszkodzenia chrząstki śródstawowej w kolanie szczura wywołany cyklicznym obciążeniem, generowany przez 60 cyklicznych uciśnięć powyżej 20 N, skutkujących uszkodzeniem chrząstki kłykciowej kości udowej u szczurów.

Nieinwazyjna metoda generowania modelu uszkodzenia chrząstki stawowej w kolanie szczura wywołanego cyklicznym obciążeniem

Model otwartego wpływu kłykcia kości udowej przyśrodkowej u królików jest wiarygodny do badania pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów (PTOA) i nowych strategii terapeutycznych mających na celu złagodzenie progresji PTOA. Protokół ten generuje izolowany ubytek chrząstki tylnego przyśrodkowego kłykcia kości udowej u królików za pomocą wieży zrzutowej opartej na wózku z głowicą impaktora.

Powtarzalny model wpływu chrząstki w celu wygenerowania pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów u królika

Ten protokół ustanawia model pełnogrubych wad chrząstki (FTCD) poprzez wiercenie otworów w rowku bloczkowym kości udowej szczurów i mierzenie późniejszego zachowania bólowego i zmian histopatologicznych.

Opracowanie i ocena szczurzego modelu ubytków chrząstki pełnej grubości

W tym protokole, model choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego został przygotowany przy użyciu zmodyfikowanej metody Videmana, a procedury operacyjne i środki ostrożności związane z akupotomią są szczegółowo opisane. Skuteczność akukotomii wykazano poprzez badanie właściwości mechanicznych mięśnia czworogłowego uda i ścięgna oraz właściwości mechanicznych i morfologicznych chrząstki.

Zastosowanie akupotomii w modelu choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego u królika

Protokół opisuje metodę interwencji Tuina w króliczym modelu choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego.

Interwencja Tuina w króliczym modelu choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego

Przedstawiamy tutaj zintegrowany protokół generowania kontrolowanych zmian kostnych-chondralnych u kolan owiec, aby ustanowić eksperymentalny model odpowiedni do badań regeneracji tkanek kości i chrząstki. Protokół określa metodę wywołania pełnogrubego ubytku kości kostnodzielnej w kłykciu udowym, wykorzystując techniki minimalizujące wpływ na dobrostan zwierząt oraz zmienność wyników.

Ustanowienie i ocena modelu owiec o pełnej grubości ubytku kości kościowego

Poznaj metodę autologicznego przeszczepu chondrocytów wspomaganego matrycą do naprawy ubytków chrzęstnych w stawie kolanowym królika. Technika MACT pozwala uzyskać jednorodną i trwałą tkankę naprawczą po 12 tygodniach.

Przeszczep chrząstki autologicznej wspomagany macierzą w celu przebudowy i naprawy ubytków chrzęstnych w modelu królika

Przeglądaj więcej filmów