Name: Długotrwałe, konfokalne obrazowanie poklatkowe o wysokiej rozdzielczości naskórka liścienia Arabidopsis podczas kiełkowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Poznaj metodę długotrwałego obrazowania poklatkowego naskórka liścienia Arabidopsis podczas kiełkowania. Technika umożliwia dynamiczną obserwację ruchu białek fluoroforowych podczas podziałów komórkowych i różnicowania się aparatów szparkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Amandzie Rychel za pomoc w opracowaniu protokołu time-lapse oraz Lynn Pillitteri za skonstruowanie POLAR::POLAR-eGFP. Jesteśmy również wdzięczni ABRC za udostępnienie konstruktu pm-rb. Protokół ten został opracowany dzięki wsparciu z grantu PRESTO przyznanego przez Japan Science Technology and Agency. Badania nad POLAR były wspierane również przez University of Washington Royalty Research Fund (RRF-4098) oraz National Science Foundation (MCB-0855659). KMP jest stypendystą badawczym NSF (DGE-0718124), a KUT jest badaczem HHMI-GBMF.

1. Sterylizacja nasion
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do sterylizacji nasion: 33% wybielacz domowy, 0,1% Triton X-100.</li>
	<li>Nasiona posiadające pożądane konstrukty reporterów fluorescencyjnych i genotypy umieścić w probówce 1,7 ml i dodać 1 ml roztworu sterylizującego. Inkubować na nutatorze przez 15 min.</li>
	<li>W sterylnej komorze przepływu laminarnego za pomocą pipety usunąć roztwór sterylizujący z probówki, pozostawiając nasiona. Przepłukać 1 ml sterylnej wody. Powtórzyć czynność cztery razy.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4 °C przez dwa dni lub dłużej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie podłoży do szkiełek z komorkami
<ol>
	<li>W kolbie o pojemności 200 ml wymieszać 20 ml 0,5% roztworu Bacto Agar (nie czystej agarozy) w wodzie i podgrzewać w kuchence mikrofalowej do całkowitego rozpuszczenia. Należy zachować ostrożność podczas wrzenia roztworu.</li>
	<li>Ostudzić roztwór do temperatury około 60 °C.</li>
	<li>Za pomocą pipety pobrać 1 ml roztworu agaru i powoli nanieść na szkiełko podstawowe wewnątrz komory preparatu (Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System). Zbyt gorący roztwór lub zbyt szybkie nanoszenie może doprowadzić do stopienia kleju lub pęknięcia szkła.</li>
	<li>Natychmiast dodać drugi 1 ml roztworu agaru. Pożywka agarowa powinna teraz całkowicie pokrywać dno komory preparatu. Taka minimalna ilość pożywki jest wystarczająca, aby przez cztery do pięciu dni wspierać rozwój w liścieniu rośliny, który zawiera zgromadzone składniki odżywcze, poprzez utrzymanie wilgotności i umożliwienie dyfuzji gazów.</li>
	<li>Ostudzić preparat na blacie laboratoryjnym z przykrytą komorą. Jeśli kolba jest szczelnie zamknięta, roztwór można przechować i ponownie podgrzać do przyszłego użycia.</li>
</ol>
3. Disekcja nasion
<ol>
	<li>Wyjmij probówkę ze sterylnymi nasionami z przechowywania w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umieść chusteczkę papierową na stole mikroskopu stereoskopowego i zwilż ją wodą. Wygładź chusteczkę, aby stworzyć równą powierzchnię. Chusteczka służy do stabilizacji nasion podczas dysekcji.</li>
	<li>Przenieś pipetą 20-30 nasion z probówki na chusteczkę, dbając o to, aby znajdowały się w polu widzenia mikroskopu.</li>
	<li>Używając ostrych pincet (Roboz, końcówka biologiczna nr 5), ostrożnie usuń łupinę nasienną z znajdującego się wewnątrz zawiązka. Należy usunąć zarówno zewnętrzną, jak i wewnętrzną łupinę.</li>
	<li>Podczas obrazowania liści zasiedlinnych korzystne jest usunięcie podliścienia i korzenia zakiełkowego. Liście zasiedlinne zawierają wystarczającą ilość składników odżywczych, aby rozwijać się przez kilka dni zgodnie z tym protokołem. Jeśli pozostanie nienaruszone, podliścień gwałtownie wyprostuje się i wydłuży, przesuwając liść zasiedlinowy poza pole widzenia podczas rejestracji time-lapse. Użyj skalpela, aby oddzielić liście zasiedlinne od podliścienia.</li>
	<li>Przechowuj zdyssekowane liście zasiedlinne zanurzone w wodzie, w mikroprobówce lub podobnym naczyniu.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 3.4-3.6, aż do uzyskania żądanej liczby liści zasiedlinnych. Przed montażem zaleca się wykonanie 15-20 udanych dysekcji.</li>
</ol>
4. Montowanie liści zasiedlonych w szkiełku komorowym
<ol>
	<li>Używając małego szkiełka nakrywkowego (18 mm2), przetnij podłoże agarowe i unieś całą warstwę znad szklanej podstawy preparatu z komorą.</li>
	<li>Przenieś pipetą wypreparowane liścienie z minimalną ilością wody z probówki transportowej do preparatu z komorą, pod uniesioną warstwę agaru.</li>
	<li>Ostrożnie opuść agar na liścienie. Jeśli pojawi się nadmiar wody, odsącz go chusteczką, uważając, aby nie przesunąć liścieni. Po zakończeniu montażu preparaty nie powinny się już łatwo przemieszczać.</li>
	<li>Nałóż pokrywkę na preparat z komorą i przenieś go na stolik mikroskopu.</li>
</ol>
5. Obrazowanie poklatkowe
<ol>
	<li>Przygotować odwrócony mikroskop konfokalny do obrazowania wybranych fluoroforów. Parametry LSM700: dla GFP wzbudzenie przy 488 nm i detekcja z filtrem pasmowym 440-530 nm; dla RFP wzbudzenie przy 555 nm i detekcja z filtrem pasmowym 570-610 nm.</li>
	<li>Obejrzeć zamocowane preparaty pod kątem uszkodzeń. Zaprogramować lokalizacje nienaruszonych, prawidłowo zamocowanych liści zaszyłych w oprogramowaniu mikroskopu. W programie Zen 2009: ustawić ostrość na liściu zaszyłym przy użyciu obiektywu 20x i przesunąć obiektyw do centrum szkiełka komory. W sekcji Acquisition Mode zmienić Zoom na 0,5 oraz Frame Size na 48x48 pikseli. Zaznaczyć pole wyboru Positions i kliknąć przycisk Scan overview image... w sekcji Positions, a następnie zwiększyć liczbę kafelków Horizontal oraz Vertical do 30-35. Po zakończeniu skanowania kliknąć przycisk Positions w zakładce Dimensions i umieścić celowniki na każdym liściu zaszyłym przeznaczonym do obserwacji.</li>
	<li>Przygotować serie z obejmujące epidermę liści zaszyłych we wszystkich próbkach. W programie Zen 2009: zaznaczyć pole wyboru Z-Stack. Wybrać każdą pozycję w sekcji Position List i kliknąć przycisk Move to. Ustawić ostrość na najwyższej płaszczyźnie epidermy liścia zaszyłego i kliknąć przycisk Set First w sekcji Z-Stack. Ustawić ostrość na najniższej pozycji, przy której epidermis jest jeszcze użytecznie widoczna, i kliknąć przycisk Set Last. Kliknąć przycisk obok napisu Optimal, który wskazuje optymalną grubość plastra z, aby go ustawić. Sprawdzić każdy liść zaszyły, aby potwierdzić, że ustawienia te obejmują wszystkie próbki; parametry z nie mogą być ustawiane dla poszczególnych pozycji w programie Zen 2009.</li>
	<li>Przygotować serie czasowe o żądanej rozdzielczości i długości. Przedziały 15-30 min przez trzy dni są skuteczne dla dynamiki białek podczas podziału komórek epidermy. Przedział ten można zmieniać w zależności od potrzeb. W programie Zen 2009: zaznaczyć pole wyboru Time Series. W sekcji Time Series ustawić liczbę pożądanych obrazów w polu Cycles, korzystając z suwaka lub wpisując wartość w polu tekstowym. Ustawić Interval na 30 i wybrać z menu rozwijanego jednostkę min.</li>
	<li>Rozpocząć wielopozycyjne skanowanie xyzt. Należy pamiętać, że liczba pozycji musi być ograniczona specyfikacją skanowania; jeśli całkowity czas skanowania przekroczy pożądany interwał, punkty czasowe będą nieprawidłowe. W naszym systemie przy obrazowaniu GFP i RFP dla 59 plastrów z w interwale 30-min można obrazować maksymalnie sześć pozycji jednocześnie. W programie Zen 2009: zmienić Frame Size na pożądaną rozdzielczość i kliknąć Start Experiment.</li>
</ol>
6. Montaż wideo
<ol>
	<li>Z pliku z danymi konfokalnymi wykonaj projekcję maksymalnej intensywności wzdłuż osi z dla każdej kombinacji czasu i pozycji, a następnie wyeksportuj je jako pliki obrazów w formacie bezstratnym, takim jak TIFF. Nazwy plików powinny być sformatowane tak, aby jedna seria przypadała na jedną pozycję (np. POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002 itd., a nie POLAR-GFP_0001_pos1), aby oprogramowanie mogło połączyć je w film. W programie Zen 2009: użyj funkcji Copy:Subset w zakładce Processing, aby rozdzielić pozycje na osobne pliki, a następnie zastosuj Maximum Intensity Projection. Na koniec wyeksportuj obrazy jako TIFF (File:Export, Full resolution image window - series).</li>
	<li>Użyj programu FIJI7,8, aby wyrównać kolejne obrazy, uruchamiając makro bUnwarpJ9 (Plugins:Registration:bUnwarpJ). Zmień Registration Mode na Mono. W przypadku wszystkich Advanced Options można pozostawić wartości domyślne. Dla długich sekwencji time-lapse pobierz i zainstaluj makro „Affine + Consistent Elastic 2D Image Registration”, które automatycznie zastosuje bUnwarpJ do serii obrazów, a następnie otwórz swoje dane za pomocą File:Import:Image Sequence, aby z niego skorzystać. Odznacz opcję MOPS landmarks extraction i uruchom proces.</li>
	<li>Użyj programu FIJI/ImageJ lub Quicktime Pro, aby otworzyć sekwencję wyrównanych obrazów i zapisać ją w żądanym formacie wideo (dobrym wyborem jest AVI).</li>
</ol>

<ol><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Embryonic+Cell+Lineage+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64(1983).</li>
<li>Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A. Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFoe%2C+V+%22Development+of+Drosophila+melanogaster%22">Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1993).</li>
<li>Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Lineage+Patterns+and+Homeotic+Gene+Activity+During+Antirrhinum+Flower+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development.</a> Current Biology. 5, 1449(1995).</li>
<li>Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inzé, D. Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854(2002).</li>
<li>Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Analysis+of+Cell+Division%2C+Cell+Growth%2C+and+Differentiation+at+the+Shoot+Apical+Meristem+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 16 (1), 74(2004).</li>
<li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Profiling+of+Stomatal+Meristemoids+Reveals+New+Component+of+Asymmetric+Cell+Division+and+Commonalities+among+Stem+Cell+Populations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23 (9), 3260(2011).</li>
<li>Fiji Is Just ImageJ. , Fiji. Available from: 
		
 <a target="_blank" href="http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji">http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji</a> (2008).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36(2004).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. ánchez, Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. rtiz-, C,, Kybic, J. Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArganda-Carreras%2C+I+%22Computer+Vision+Approaches+to+Medical+Image+Analysis%2C+ser.+Lecture+Notes+in+Computer+Science%22">Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science</a>. 4241, Springer. Heidelberg, Berlin. 85-95 (2006).</li>
<li>Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Out+of+the+Mouths+of+Plants%3A+The+Molecular+Basis+of+the+Evolution+and+Diversity+of+Stomatal+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development.</a> Plant Cell. 22 (2), 296(2010).</li>
<li>Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -Y., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Time-lapse+Documentation+Using+Confocal+and+Multi-Photon+Microscopy+Reveals+the+Mechanisms+of+Invasion+into+the+Arabidopsis+Root+Vascular+System+by+Fusarium+oxysporum%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum.</a> Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011(2007).</li>
<li>Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Lapse+Analysis+of+Stem-cell+Divisions+in+the+Arabidopsis+thaliana+Root+Meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem.</a> Plant Journal. 48, 619(2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Ta technika konfokalna typu time-lapse umożliwia badania podłużne ekspresji i lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie w pojedynczych komórkach epidermy liścienia Arabidopsis, co w przypadku białka POLAR i innych białek dynamicznie zmieniających się jest kluczowe dla właściwego zrozumienia ich funkcji. Wcześniej obrazowanie time-lapse o przedłużonym czasie trwania było stosowane do badania infekcji grzybowej korzeni Arabidopsis11 oraz wzrostu merystemu5,12, jednak włączenie ...

<table><tbody><tr><td>Agar Bacto</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko jednokomorowe</td><td>Nunc (Thermo Scientific)</td><td>155360</td><td>Lub dwukomorowe (155379)</td></tr><tr><td>Skanujący konfokalny mikroskop laserowy</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td>Oprogramowanie Zen 2009</td></tr><tr><td>Obiektyw 20x</td><td>Zeiss</td><td>420650-9901</td><td>NA 0.8, Plan-APOCHROMAT</td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny</td><td>Benz (National)</td><td>431TBL</td><td>Oświetlenie dolne</td></tr><tr><td>Pinceta #5, końcówka biologiczna</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-4978</td><td>Kluczowe są bardzo cienkie końcówki</td></tr></tbody></table>

długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych arabidopsis podczas kiełkowania

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Obrazowanie dynamiki zachowania komórek in vivo w ciągu sekwencji rozwojowej może być potężną techniką pozwalającą zrozumieć mechanizmy wzorowania tkanek. Podczas rozwoju zwierząt kluczowe zdarzenia proliferacji i wzorowania komórek zachodzą bardzo szybko. Na przykład u Caenorhabditis elegans wszystkie podziały komórkowe niezbędne do ukształtowania planu budowy ciała larwy kończą się w ciągu sześciu godzin po zapłodnieniu, obejmując siedem cykli mitotycznych1; szesnaście lub więcej mitoz podczas embriogenezy Drosophila zachodzi w czasie krótszym niż 24 hr2. W przeciwieństwie do tego, podziały komórkowe podczas rozwoju roślin są powolne, zazwyczaj w skali jednego dnia 3,4,5. Stwarza to wyjątkowe wyzwanie i rodzi potrzebę długoterminowego obrazowania żywych tkanek w celu dokumentowania dynamicznych procesów podziału komórek oraz zdarzeń różnicowania podczas organogenezy roślin. Epidermis Arabidopsis jest doskonałym systemem modelowym do badania sygnalizacji, losu komórek i rozwoju roślin. W kotyledonie tkanka ta składa się z odpornych na działanie powietrza i wody komórek bruzdowych, pomiędzy którymi rozmieszczone są równomiernie aparaty szparkowe – zawory otwierające się i zamykające w celu kontroli wymiany gazowej i utraty wody. Odpowiednie rozmieszczenie tych aparatów szparkowych jest krytyczne dla ich funkcji, a ich rozwój przebiega zgodnie z sekwencją asymetrycznych podziałów i etapów różnicowania komórkowego, co prowadzi do powstania zorganizowanej epidermy (Rys. 1).
Niniejszy protokół umożliwia obserwację komórek i białek w epidermie podczas kilku dni rozwoju. Taki przedział czasowy pozwala na precyzyjną dokumentację podziałów komórek macierzystych oraz różnicowania komórek epidermy, w tym aparatów szparkowych i komórek epidermy typu pavement. Białka fluorescencyjne mogą być fuzowane z białkami zainteresowania w celu oceny ich dynamiki podczas procesów podziału i różnicowania komórek. Technika ta pozwala zrozumieć lokalizację nowego białka, POLAR6, podczas etapu proliferacji komórek linii szparkowej w epidermie liści zakrotniowych Arabidopsis, gdzie jest ono ekspresowane w komórkach poprzedzających zdarzenia podziałów asymetrycznych i przemieszcza się do charakterystycznego obszaru kory komórkowej krótko przed wystąpieniem podziału. Obrazy mogą być rejestrowane, a z nich łatwo tworzone płynne filmy przy użyciu oprogramowania z domeny publicznej, co pozwala na wizualizację dynamicznej lokalizacji białek oraz typów komórek zmieniających się w czasie.

Zestaw informacyjnych punktów czasowych zebranych za pomocą tej metody przedstawiono na Ryc. 3. Membrany komórkowe są znakowane RFP (pm-rb), a GFP jest połączone z białkiem POLAR pod jego natywnym promotorem (POLAR::POLAR-GFP)6 W skali czasowej 30 min obserwujemy podziały komórek wraz ze zmianami w lokalizacji białek im poprzedzającymi. Asymetryczne podziały komórek w linii stomatycznej tworzą przypominające komórki macierzyste prekursory szparek zwane merystemoidami, które zachowują ...

Opisujemy protokół z wykorzystaniem szkiełek z komorami oraz pośrodków do unieruchamiania liści zasadniczych roślin w celu obrazowania konfokalnego epidermy przez kilka dni rozwoju, co pozwala na dokumentowanie różnicowania szparek. Białka znakowane fluoroforami mogą być śledzone dynamicznie poprzez analizę ich ekspresji i lokalizacji subkomórkowej, co zwiększa zrozumienie ich potencjalnych ról podczas podziału komórek i różnicowania typów komórek.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych Arabidopsis podczas kiełkowania

Obrazowanie dynamiki zachowania komórek in vivo w trakcie sekwencji rozwojowej może być potężną techniką pozwalającą zrozumieć mechanizmy tkankowe...

Celem następnego eksperymentu jest wizualizacja wczesnych etapów rozwoju epidermy po kiełkowaniu nasion na poziomie komórkowym. Jest to osiągane poprzez usunięcie łupiny nasiennej w celu zapewnienia wyraźnego widoku kosin w drugim kroku. Kosiny są montowane pod warstwą pożywki agarowej, która je unieruchamia i wspiera ich rozwój; następnie przez kilka dni przeprowadzane jest obrazowanie poklatkowe, aby obserwować wzrost i podziały komórek epidermy in vivo.Uzyskano wyniki wykazujące dynamiczną ekspresję genów oraz lokalizację białek na podstawie widocznej fluorescencji. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak statyczne obrazy barwienia Gus lub fuzje GFP, jest obrazowanie dynamicznego ruchu białek podczas podziału i różnicowania komórek. Nasiona Arabidopsis do tego eksperymentu sterylizuje się w roztworze do sterylizacji nasion składającym się z 33% domowego wybielacza i 0,1% Triton X 100; nasiona niosące pożądane konstrukty raportacyjne fluorescencyjne i genotypy umieszcza się w probówce o pojemności 1,7 ml, dodaje jeden mililitr roztworu sterylizującego i inkubuje na shakerze przez 15 minut.W sterylnej komorze laminarnej za pomocą pipety usuń roztwór sterylizujący z probówki, pozostawiając w niej nasiona. Przepłucz je 1 ml sterylnej wody. Powtórz tę czynność czterokrotnie po czwartym płukaniu.Inkubować w temperaturze 4°C przez dwa lub więcej dni. Aby przygotować podłoże do szkiełka komorowego, zmieszać 20 ml 0,5% roztworu agaru bakteryjnego w wodzie w kolbie o pojemności 200 ml i podgrzewać w mikrofalówce do czasu rozpuszczenia. Należy zachować ostrożność podczas wrzenia roztworu.Podgrzej roztwór do około 60 °C. Zbyt gorący roztwór lub jego zbyt szybkie naniesienie może doprowadzić do roztopienia kleju lub pęknięcia szkła szkiełka komorowego. Gdy roztwór agaru wystarczająco ostygnie, pobierz jeden mililitr pipetą i niezwłocznie powoli nanieś go na szkiełko nakrywkę wewnątrz szkiełka komorowego.Dodaj drugi mililitr roztworu agaru. Pożywka agarowa powinna teraz całkowicie pokrywać dno szkiełka komorowego. Ta minimalna ilość pożywki jest wystarczająca, aby wspomóc rozwój w oleinie roślinnej, która zawiera zapas składników odżywczych na cztery do pięciu dni, zapewniając wilgotność i umożliwiając dyfuzję gazów.Połóż preparat z zakrytą komorą na blacie laboratoryjnym. Aby rozpocząć procedurę, wyjmij probówkę ze sterylnymi nasionami z przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsius. Umieść papierowy ręcznik na stoliku mikroskopu dissectingowego, zwilż go wodą i wyrównaj, aby uzyskać gładką powierzchnię.Tkanka służy do stabilizacji nasion podczas preparowania. Przenieś pipetą od 20 do 30 nasion z probówki na tkankę, uważając, aby umieścić je w polu widzenia mikroskopu stereoskopowego. Preparowanie osłonki nasion jest najtrudniejszym etapem tej procedury.Zastosowanie małego powiększenia oraz ostrych pęset oraz zachowanie szczególnej ostrożności pomoże zapewnić sukces sekcji. Używając ostrych pęset, ostrożnie usuń łupinę nasienną z znajdującej się wewnątrz siewki; należy usunąć zarówno okrywę zewnętrzną, jak i wewnętrzną. Następnie, za pomocą skalpela, oddziel od hypocotylu i radikuli liść zasłonowy.Zaleca się usunięcie hipokotylu i radykuli przed obrazowaniem, ponieważ w stanie nienaruszonym hipokotyl ulega znacznemu wyprostowaniu i wydłużeniu. Przesuwając wypreparowany hipokotyl poza pole widzenia filmu poklatkowego, należy utrzymywać go w zanurzeniu w wodzie. Powtarzać sekcję nasion, aż do uzyskania pożądanej liczby siewek.Przed zamocowaniem olean w szkiełku z komorą zaleca się przeprowadzenie od 15 do 20 udanych dyssekcji. Aby przygotować szkiełko z komorą do zamocowania cotan, należy użyć małego szkiełka nakrywkowego do przecięcia podłoża agarowego i uniesienia całej warstwy z szklanej podstawy komory. Za pomocą pipety należy przesunąć zdyssekowany cotan z minimalną ilością wody z probówki przechowawczej do komory.Wsuń pod uniesioną warstwę agaru. Delikatnie opuść agar na osad. Jeśli obecna jest nadmiarowa woda, odsącz ją za pomocą chusteczki.Należy uważać, aby nie poruszyć osadów po zakończeniu montowania. Preparaty nie powinny już łatwo się przemieszczać. Umieść przykrycie na szkiełku komorowym i przenieś szkiełko na stolik mikroskopu.Przed rozpoczęciem obrazowania należy skonfigurować odwrócony mikroskop konfokalny do obrazowania wybranego fluoroforu. Parametry LSM 700 są ustawione na wzbudzenie GFP przy 488 nanometrach oraz detekcję, z zastosowaniem filtra pasmowo-przepustowego od 440 do 530 nanometrów, a dla RFP na wzbudzenie przy 555 nanometrach oraz detekcję.Przy użyciu filtra pasmowo-przepustowego od 570 do 610 nanometrów i obiektywu 20x. Ustaw ostrość na wprowadzenie ACO i przesuń obiektyw na środek komory. W trybie akwizycji zmień powiększenie na 0,5 i rozmiar klatki na 48 na 48 pikseli.Zaznacz pole wyboru positions oraz scan overview image, a następnie zwiększ liczbę kafelków w poziomie i pionie do wartości od 30 do 35. Kliknij przycisk scan, aby rozpocząć skanowanie. Po zakończeniu skanowania kliknij przycisk positions w zakładce dimensions i umieść znaki celownika (Cross hairs) przy każdym obserwowanym prowadniku COT.Obejrzyj zamontowane preparaty pod kątem uszkodzeń. Usuń pozycje odpowiadające uszkodzonym coss leadin, aby pozostawić jedynie odpowiednie preparaty do obrazowania. Następnie ustaw serię Z obejmującą epidermę coss leadin wszystkich próbek.Zaznacz pole wyboru Zack. Wybierz każdą pozycję z listy pozycji i kliknij przycisk move to. Skup się na najwyższej płaszczyźnie wyprowadzenia cos w naskórku i kliknij przycisk set first pod polem Zack.Ustaw ostrość na najniższej pozycji, przy której naskórek jest wyraźnie widoczny. Następnie kliknij przycisk „set last”. Kliknij przycisk obok opcji „optimal”, który wskazuje optymalną grubość warstwy Z do ustawienia.Sprawdź każdy lead-in kos, aby potwierdzić, że ustawienia te obejmują wszystkie próbki. Parametry Z nie mogą być ustawione dla poszczególnych pozycji. W programie Zen 2009 użytym w tej procedurze, serie czasowe z pożądaną rozdzielczością i interwałami długości od 15 do 30 minut przez trzy dni są skuteczne w badaniu dynamiki białek podczas podziału komórek naskórka, jednak interwały można zmieniać według potrzeb.Zaznacz pole wyboru serii czasowych w sekcji cykli zestawu serii czasowych, wpisz w polu tekstowym pożądaną liczbę obrazów, ustaw interwał na 30 i z menu rozwijanego wybierz MIN, aby rozpocząć wielopozycyjny skan XY, ZT. Zmień rozmiar klatki na żądaną rozdzielczość i wybierz „start experiment”, aby rozpocząć pomiar. Należy pamiętać, że liczba pozycji musi być ograniczona specyfikacją skanowania. Jeśli całkowity czas skanowania przekroczy wybrany interwał, punkty czasowe nie będą poprawne.Przy użyciu tego systemu możliwe jest obrazowanie maksymalnie sześciu pozycji jednocześnie podczas rejestracji GFP i RFP w 59 płaszczyznach Z w odstępach 30-minutowych. Poniżej przedstawiono przykład zestawu informatywnych punktów czasowych zebranych tą metodą. Membrany komórkowe są znakowane RFP oraz GFP połączonym z białkiem polarnym pod jego natywnym promotorem.Obrazy w serii A pokazują, że polarne GFP początkowo wydaje się równomiernie rozłożone, a następnie pojawia się około dwie godziny przed podziałami asymetrycznymi wskazanymi grotami strzałek. Polarne GFP oddziela się od miejsca powstającego meister OID w serii B po pierwszym podziale asymetrycznym wskazanym grotem strzałki w 47. godzinie. Polarne GFP znika w obu komórkach.Sugerując szybkie przejście w stan komórki macierzystej szparki pod wpływem merisoidu, komórka macierzysta szparki oznaczona gwiazdką dzieli się symetrycznie i różnicuje, tworząc komórki strażnicze szparki, podczas gdy komórka cystoidalna odzyskuje polarną ekspresję GFP, co prawdopodobnie poprzedza późniejszy podział asymetryczny. Przedstawiono tutaj przyspieszone, zarejestrowane wideo polaryzacji lokalizacji GFP podczas amplifikacji i rozmieszczania jednej komórki prekursorowej szparki. Początkowo polarna ekspresja GFP pojawia się jednorodnie w komórce do 39 godzin po kiełkowaniu.Silnie polaryzuje tuż przed podziałem w 40. godzinie, umieszczając mniejszy merystem w przeciwnym końcu komórki. Większa komórka po prawej stronie odzyskuje również tożsamość linii szparkowej, a do 45. godziny polarna lokalizacja GFP przemieszcza się w sąsiedztwo prekursora szparki. Podział w 47. godzinie wytwarza nowy merystem po prawej stronie, zorientowany w kierunku przeciwnym do istniejącego merystemu po lewej stronie z pierwszego merystemu.Efektem końcowym jest oddzielenie dwóch aparatów szparkowych jedną komórką. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania długotrwałego time-lapse kiełkującego liścia przewodzącego do oceny ekspresji genów i lokalizacji białek w epidermie podczas rozwoju.

long-term-high-resolution-confocal-time-lapse-imaging-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Długoterminowa, wysokorozdzielczościowa konfokalna zdjęciowa wizualna epidermy Arabidopsis Cotyledon podczas kiełkowania

Opisujemy zastosowanie perfluorodekaliny jako infiltracyjnego medium montażowego. Jest to prosta metoda poprawiająca głębokość obrazowania w tkance liścia Arabidopsis thaliana przy minimalnym wpływie fizjologicznym.

Prosta metoda obrazowania liści Arabidopsis z wykorzystaniem perfluorodekaliny jako infiltrującego medium obrazującego

Niniejszy artykuł przedstawia protokół hodowli siewek Arabidopsis w RootChip, mikrofluidycznej platformie obrazowania, która łączy zautomatyzowaną kontrolę warunków wzrostu z mikroskopijnym monitorowaniem korzeni oraz pomiarem wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w oparciu o technikę FRET.

Obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym wzrostu korzeni Arabidopsis z szybką manipulacją środowiskiem korzenia przy użyciu urządzenia RootChip

Ca2+ reguluje różnorodne procesy biologiczne w roślinach. W tym miejscu przedstawiamy podejścia do monitorowania przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2 + wywołanych stresem abiotycznym w komórkach i tkankach rzodkiewnika przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 + Aequorin lub Case12.

Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2+ u rzodkiewnika

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak monitorować dynamikę białek znakowanych fluorescencyjnie na powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie, pokazując kropki PATROL1 oznaczonej GFP, białka transportującego błonę, w korze komórkowej kompleksu szparkowego u Arabidopsis thaliana.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie

Obrazowanie konfokalne na żywo dostarcza biologom potężnego narzędzia do badania rozwoju. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół obrazowania konfokalnego na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika.

Obrazowanie konfokalne na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika

Przedstawiona tutaj jest prosta technika konfokalnego obrazowania poklatkowego o wysokiej rozdzielczości rozwoju korzeni i hipokotylu przez okres do 3 dni przy użyciu obiektywów o dużej aperturze numerycznej i perfluorodekaliny jako medium immersyjnego.

Prosta komora do długoterminowego obrazowania konfokalnego rozwoju korzeni i hipokotylu

Przedstawiamy prostą i wszechstronną metodę wykonywania fluorescencyjnego obrazowania na żywo liści Arabidopsis thaliana przez dłuższy okres czasu. Używamy transgenicznej rośliny Arabidopsis wykazującej ekspresję fluorescencyjnego genu reporterowego pod kontrolą promotora związanego z odpornością jako przykładu uzyskania czasoprzestrzennego zrozumienia odpowiedzi immunologicznych roślin.

Uniwersalna metoda montażu liści Arabidopsis do przyżyciowego obrazowania poklatkowego

Udostępniamy metodę identyfikacji modulatorów transpiracji dolistnej poprzez zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe biblioteki złożonej.

Identyfikacja nowych regulatorów transpiracji roślin za pomocą wielkoskalowych badań termowizyjnych u Helianthus annuus

Ten artykuł opisuje dwie metody fenotypowania bez użycia peelingów naskórka do scharakteryzowania genów kontrolujących rozwój aparatów szparkowych. Pierwsza metoda pokazuje, jak analizować fenotyp aparatów szparkowych przy użyciu naskórka roślinnego barwionego błękitem O-toluidyny. Druga metoda opisuje, w jaki sposób identyfikować ligandy szparkowe i monitorować ich aktywność biologiczną.

Identyfikacja genów zaangażowanych w rozwój aparatów szparkowych poprzez ocenę fenotypu naskórka

Tutaj opisujemy zaawansowane narzędzie przeznaczone do monitorowania biosyntezy chlorofilu podczas wczesnych etapów deetiolacji siewek rzodkiewnika. Nowatorska metodologia umożliwia nieinwazyjne obrazowanie fluorescencji chlorofilu w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Nieinwazyjny test do oznaczania kinetyki biosyntezy chlorofilu we wczesnych stadiach deetiolacji rzodkiewnika

Ten protokół opisuje przygotowanie nienaruszonych próbek warstwy komórek bielma w nasionach Arabidopsis thaliana. Metoda wymaga jedynie powszechnego sprzętu laboratoryjnego, takiego jak igła do wstrzykiwań i precyzyjne kleszcze, i umożliwia obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek bielma w wysokiej rozdzielczości zarówno w rozwijających się, jak i dojrzałych nasionach.

Przygotowanie nienaruszonej tkanki do analizy mikroskopowej warstwy komórek bielma w rozwijających się i dojrzałych nasionach Arabidopsis

Poznaj metodę długotrwałego obrazowania poklatkowego naskórka liścienia Arabidopsis podczas kiełkowania. Technika umożliwia dynamiczną obserwację ruchu białek fluoroforowych podczas podziałów komórkowych i różnicowania się aparatów szparkowych.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych Arabidopsis podczas kiełkowania

Przeglądaj więcej filmów