Długotrwałe, konfokalne obrazowanie poklatkowe o wysokiej rozdzielczości naskórka liścienia Arabidopsis podczas kiełkowania

Celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja wczesnych zdarzeń rozwoju naskórka po wykiełkowaniu nasion na poziomie komórkowym. Osiąga się to poprzez usunięcie najpierw okrywy nasiennej, aby umożliwić wyraźny widok kosin w drugim kroku. Kosyny są montowane pod warstwą podłoża agarowego, która je unieruchamia i wspomaga ich rozwój Kolejne obrazowanie poklatkowe jest wykonywane przez kilka dni w celu obserwacji wzrostu i podziału komórek naskórka in vivo.

Uzyskano wyniki, które wskazują na dynamiczną ekspresję genów i lokalizację białek w oparciu o widoczną fluorescencję. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak nieruchome obrazy barwienia Gus lub fuzji GFP, jest to, że pokazuje ona dynamiczny ruch białek podczas podziału i różnicowania komórek. Nasiona Arabidopsis do tego eksperymentu są sterylizowane w roztworze do sterylizacji nasion wykonanym z 33% wybielacza domowego i 0,1% Triton X 100, umieść nasiona zawierające pożądane fluorescencyjne konstrukty reporterowe i genotypy w probówce o pojemności 1,7 mililitra i zastosuj jeden mililitr roztworu sterylizacyjnego, inkubuj na mutatorze przez 15 minut.

W sterylnym kapturze użyj pipety, aby usunąć roztwór sterylizacyjny z probówki, pozostawiając nasiona. Spłucz jednym mililitrem sterylnej wody. Powtórz cztery razy po czwartym płukaniu.

Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa lub więcej dni. Aby przygotować podłoże do szkiełek komorowych, wymieszaj 20 mililitrów 0,5% roztworu baktu z agarem w wodzie w kolbie o pojemności 200 mililitrów i kuchence mikrofalowej, aż do rozpuszczenia. Zachowaj ostrożność podczas gotowania roztworu.

Zadzwoń do roztworu na około 60 stopni Celsjusza. Roztwór, który jest zbyt gorący lub nałożony zbyt szybko, może spowodować stopienie kleju lub pęknięcie szyby szkiełka komory. Gdy roztwór agaru jest wystarczająco chłodny, zbierz jeden mililitr pipetą i powoli nałóż go na szkło nakrywkowe wewnątrz szkiełka komory.

Dodaj drugi mililitr roztworu agaru. Podłoże agarowe powinno teraz całkowicie pokrywać dno szkiełka komory. Ta minimalna ilość pożywki jest wystarczająca do wsparcia rozwoju oleiny roślinnej, która zawiera zmagazynowane składniki odżywcze przez cztery do pięciu dni, utrzymując wilgoć i umożliwiając dyfuzję gazu.

Wywołaj zjeżdżalnię z komorą zakrytą na blacie. Aby rozpocząć tę procedurę, wyjmij probówkę ze sterylnymi nasionami z magazynu w czterech stopniach Celsjusza. Umieść papierową chusteczkę na stoliku mikroskopu preparacyjnego, zwilż je wodą i dostosuj, aby uzyskać gładką powierzchnię.

Tkanka służy do stabilizacji nasion podczas sekcji. Odpipetuj od 20 do 30 nasion z probówki na tkankę, uważając, aby umieścić je w polu widzenia lunety sekcyjnej. Analiza koleadyny jest najtrudniejszym aspektem tej procedury.

Używanie małego powiększenia i ostrych kleszczy oraz zachowanie dużej ostrożności pomoże zapewnić udaną sekcję za pomocą ostrych kleszczy. Ostrożnie usuń okrywę nasienną z sadzonki wewnątrz, należy usunąć zarówno zewnętrzne, jak i wewnętrzne powłoki. Następnie użyj skalpela, aby pokroić ołowi łóżeczka z hiper kotleta i radykału.

Korzystne jest usunięcie hiper łóżeczka i radykału do obrazowania, ponieważ jeśli jest nienaruszone, hiper kot znacznie się wyprostuje i wydłuży. Przesuwając Koss Leadin poza pole widzenia poklatkowego, trzymaj wypreparowany cos leadin zanurzony w wodzie. Powtarzaj rozcinanie nasion, aż do osiągnięcia pożądanej liczby oleanów.

Zaleca się wykonanie od 15 do 20 udanych sekcji przed zamontowaniem oleanu w prowadnicy studzienki. Aby przygotować szkiełko komory do montażu kotanu, użyj małego szkiełka nakrywkowego, aby przeciąć podłoże agarowe i podnieść całą warstwę ze szklanej podstawy komory. Wsuń do komory wypreparowany pipeta cotan z minimalną ilością wody z rurki podtrzymującej.

Wsuń pod podniesioną warstwę agaru. Delikatnie opuść agar na sedyny. Jeśli obecny jest nadmiar wody, namocz go chusteczką.

Uważaj, aby nie przeszkadzać sedinom po zakończeniu montażu. Okazy nie powinny się już łatwo poruszać. Umieść pokrywę na szkiełku komory i przenieś szkiełko do stolika mikroskopu.

Przed obrazowaniem ustaw odwrócony mikroskop konfokalny, aby zobrazować żądany fluor. Parametry LSM 700 służą do wzbudzenia GFP o długości 488 nanometrów i zbierania. Z filtrem pasmowo-przepustowym o długości fali od 440 do 530 nanometrów oraz do wzbudzenia zapytania ofertowego przy 555 nanometrach i zbieraniu.

Z filtrem pasmowo-przepustowym o długości fali od 570 do 610 nanometrów z obiektywem 20-krotnym. Skoncentruj się na wejściu ACO i przesuń cel na środek komory. Przesuń w trybie akwizycji, zmień powiększenie na 0,5 i rozmiar klatki na 48 na 48 pikseli.

Zaznacz pole wyboru pozycji i zeskanuj obraz przeglądowy, a następnie zwiększ liczbę kafelków poziomych i pionowych do 30 do 35. Kliknij przycisk skanowania, aby rozpocząć skanowanie. Po zakończeniu skanowania kliknij przycisk pozycji pod zakładką wymiarów i umieść krzyżyk na każdym wejściu łóżeczka, aby je obserwować.

Sprawdź zamontowane próbki pod kątem uszkodzeń. Usunąć pozycje odpowiadające uszkodzonemu ołowiowi coss, aby pozostawić tylko odpowiednie próbki do obrazowania. Następnie ustaw serię Z obejmującą naskórek ołowiu coss wszystkich próbek.

Kliknij pole wyboru Zack. Wybierz każdą pozycję w obszarze Lista pozycji i kliknij przycisk przenieś do. Skoncentruj się na najwyższej płaszczyźnie ołowiu w naskórku i kliknij przycisk ustaw pierwszy pod Zack.

Skoncentruj się na najniższej pozycji, w której naskórek jest dobrze widoczny. I kliknij ostatni przycisk ustawiania. Kliknij przycisk obok opcji optymalny, który pokazuje najlepszą grubość plasterka Z do ustawienia.

Sprawdź każde wejście kos, aby upewnić się, że te ustawienia obejmują wszystkie próbki. Parametrów Z nie można ustawiać dla poszczególnych pozycji. W zastosowanym tutaj oprogramowaniu Zen 2009 ustaw szeregi czasowe z żądaną rozdzielczością i odstępami długości od 15 do 30 minut przez trzy dni, które są skuteczne dla dynamiki białek w podziale komórek naskórka, ale interwały można zmieniać w razie potrzeby.

Kliknij pole wyboru szeregów czasowych w obszarze cykli szeregów czasowych dla żądanej liczby obrazów, wpisując w polu tekstowym interwał ustawiony na 30 i użyj menu rozwijanego, aby wybrać MIN, aby rozpocząć skanowanie wielopozycyjne XY, ZT, zmień rozmiar klatki na żądaną rozdzielczość i zbierz rozpocznij eksperyment. Należy pamiętać, że liczba pozycji musi być ograniczona specyfikacją skanowania. Jeśli całkowity czas skanowania jest dłuższy niż żądany interwał, punkty czasu nie będą poprawne.

Korzystając z tego systemu, możliwe jest maksymalnie sześć jednoczesnych pozycji podczas obrazowania GFP i RFP przy 59 warstwach Z w odstępie 30 minut. Przykład zestawu informacyjnych punktów czasowych zebranych tą metodą pokazano tutaj. Błony komórkowe są znakowane RFP i GFP łączą białko polarne z jego natywnym promotorem.

Zdjęcia z serii A pokazują, że biegunowy GFP początkowo wydaje się być równomiernie rozłożony, a następnie około dwie godziny przed asymetrycznymi podziałami wskazanymi przez groty strzałek. Polar GFP oddziela się od miejsca początkowego meister OID w serii B po początkowym asymetrycznym podziale wskazanym przez grot strzałki po 47 godzinach. Polar GFP znika w obu komórkach.

Sugeruje to szybkie przejście do stanu ochronnej komórki macierzystej przez meris oid, ochronna komórka macierzysta oznaczona gwiazdką dzieli się symetrycznie i różnicuje się, tworząc komórki ochronne aparatów szparkowych, podczas gdy komórka cysto odzyskuje polarną ekspresję GFP, prawdopodobnie poprzedzając późniejszy asymetryczny podział. Pokazano tutaj uproszczony, zarejestrowany film przedstawiający polarną lokalizację GFP podczas amplifikacji i odstępów między jedną komórką prekursorową aparatów szparkowych. Początkowo polarny GFP pojawia się równomiernie w komórce po 39 godzinach od wykiełkowania.

Polaryzuje się silnie tuż przed podziałem po 40 godzinach, umieszczając mniejszą pokojówkę na przeciwległym końcu komórki. Większa komórka po prawej stronie również odzyskuje tożsamość linii szparkowej i po 45 godzinach lokalizacja Polar GFP przesuwa się w sąsiedztwie prekursora aparatów szparkowych. Podział w ciągu 47 godzin wytwarza nowy steryd po prawej stronie, zorientowany od istniejącego stamoidalnego ja, po lewej stronie od pierwszego stamoidu.

Efektem końcowym jest to, że dwie stomie są oddzielone jedną komórką. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać długoterminowy upływ czasu kiełkującej kooleadyny do oceny ekspresji genów i lokalizacji białka w naskórku podczas rozwoju.