Name: Ilościowa analiza FRET (Förster Resonance Energy Transfer) do oznaczania kinetyki proteazy SENP1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 2 s
Description: Poznaj ilościową analizę kinetyki proteazy SENP1 przy użyciu jednokrokowego testu FRET z substratem pre-SUMO1. Ta metoda umożliwia precyzyjne wyznaczenie parametrów kinetycznych K_M i k_cat w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy bardzo wdzięczni Victorowi G.J. Rodgersowi za cenne rady. Dziękujemy wszystkim członkom grupy Liao za bardzo bliską współpracę i pomoc przy tym badaniu. Badanie to zostało sfinansowane przez National Institutes of Health (Grant AI076504 dla J.L.).

1. Konstrukcje plazmidowe
<ol>
 <li>Należy przeprowadzić amplifikację ramek odczytu genów metodą PCR, a następnie sklonować produkty PCR do wektora PCRII-TOPO.</li>
 <li>Produkty należy potwierdzić poprzez sekwencjonowanie, a następnie sklonować cDNA kodujące CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet oraz domeny katalityczne SENP1 do wektora pET28 (b) z N-terminalnym znacznikiem heksahistydynowym.</li>
</ol>
2. Ekspresja i oczyszczanie białek
<ol>
 <li>Przeprowadzić transformację komórek Escherichia coli szczepu BL21 (DE3) wektorami pET28 (b) kodującymi CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet oraz domeny katalityczne SENP1.</li>
 <li>Hodować transformowane bakterie w pożywce 2xYT przez 3 hr w temperaturze 37 °C (przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm), aż do osiągnięcia gęstości optycznej 0,5 przy 600 nm.</li>
 <li>Dodać izopropyl-β-D-tiogalaktozyd (IPTG) do stężenia końcowego 100 μM w celu indukcji ekspresji białek i inkubować z wytrząsaniem przez 16 hr w temperaturze 25 °C przy 200 rpm.</li>
 <li>Zebrać bakterie poprzez wirowanie przy 10 000 rpm w temperaturze 4 °C przez 5 min i resuspendować je w buforze zawierającym 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl oraz 5 mM imidazolu.</li>
 <li>Sonicować komórki przez 10 min w 5-sekundowych odstępach przy mocy 25 W za pomocą sonikatora MiSonics 4 000 i oddzielić je poprzez wirowanie przy 35 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 min.</li>
 <li>Przygotować kolumnę z 500 ml kulek Ni-NTA dla 1 L hodowli i przenieść nadsącz do kolumny.</li>
 <li>Przemyć żywicę dwukrotnie buforem zawierającym 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl oraz 10 mM imidazolu.</li>
 <li>Eluować białka buforem zawierającym 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl oraz 500 mM imidazolu, a następnie przeprowadzić dializę przeciwko buforowi 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl i 1 mM ditiotreitolu (DTT) w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
 <li>Oznaczyć stężenia oczyszczonych białek za pomocą testu Bradforda. Alternatywną metodą pomiaru stężenia białek będzie elektroforeza w żelu SDS-PAGE, barwienie błękitem Coomassie, a następnie analiza ilościowa obrazu.</li>
</ol>
3. Ilościowa analiza widma FRET
<ol>
 <li>Ogólna strategia analizy opierała się na sygnałach FRET (Rysunek 1). Para FRET, CyPet i YPet, została przyłączona odpowiednio do końca N- i C- terminalnego pre-SUMO1. SENP1 rozcina białko fuzyjne CyPet-(pre-SUMO1)-YPet w obrębie miejsca Gly-Gly na końcu C-terminalnym SUMO1, uwalniając tym samym ogon SUMO wraz z YPet. Sygnał FRET zostaje przerwany, co skutkuje wzrostem emisji CyPet i gwałtownym spadkiem emisji YPet przy długości fali wzbudzenia CyPet.</li>
 <li>Przy wzbudzeniu światłem o długości fali 414 nm, całkowita emisja fluorescencji CyPet-(pre-SUMO1)-YPet przy 530 nm może pochodzić z trzech źródeł: bezwzględnej emisji YPet indukowanej przez FRET, bezpośredniej emisji CyPet oraz bezpośredniej emisji YPet (Rysunek 2).</li>
</ol>
<img alt="Równanie spektroskopii FRET FL530/414 = FLFRET + FLCyPet(cont) + FLYPet(cont) w analizie naukowej." src="/files/ftp_upload/4430/4430eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"> 
gdzie FL530/414 to całkowita emisja fluorescencji przy 530 nm po wzbudzeniu przy 414 nm, FLFRET to absolutny sygnał FRET, FLCyPet(cont) to bezpośrednia emisja CyPet po wzbudzeniu przy 414 nm, a FLYPet (cont) to bezpośrednia emisja YPet po wzbudzeniu przy 414 nm. Indeks (cont) oznacza wkład (contribution).
<ol start="3">
 <li>Bezpośrednia emisja CyPet przy 530 nm była proporcjonalna do emisji przy 475 nm podczas wzbudzenia przy 414 nm ze stałym współczynnikiem α. CyPet-SUMO1 przygotowano w stężeniach 50, 100, 200, 500, 750 nM oraz 1 mM, a następnie zmierzono emisję przy 475 i 530 nm po wzbudzeniu przy 414 nm w celu wyznaczenia α (Rycina 3-1).</li>
 <li>Bezpośrednia emisja YPet przy 530 nm podczas wzbudzenia przy 414 nm była proporcjonalna do emisji przy 530 nm podczas wzbudzenia przy 475 nm ze stałym współczynnikiem β. YPet przygotowano w stężeniach 50, 100, 200, 500, 750 i 1 000 nM, a następnie zmierzono emisję przy 530 nm podczas wzbudzenia próbek długościami fali 414 i 475 nm w celu wyznaczenia β (Rycina 3-2).</li>
 <li>Po strawieniu CyPet-(pre-SUMO1)-YPet przez SENP1, cięcie uwolniło CyPet-SUMO1 oraz ogon SUMO1 z YPet. Po wzbudzeniu związku przy 414 nm emisja fluorescencji przy 530 nm (FL'530/414) uległa zmniejszeniu, lecz nadal można ją podzielić na trzy części w następujący sposób:</li>
</ol>
<img alt="Wzór analizy fluorescencji; schemat z parametrami FRET, CyPet, YPet; badania optyczne." src="/files/ftp_upload/4430/4430eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 2"> 
gdzie FL'530/414 to całkowita emisja fluorescencji przy 530 nm po trawieniu podczas wzbudzenia przy 414 nm, FL'FRET to pozostały bezwzględny sygnał FRET, FL'CyPet(475/414) to emisja CyPet przy 475 nm po trawieniu podczas wzbudzenia przy 414 nm (tutaj emisja CyPet pochodzi z dwóch części: nietrawionego CyPet-(pre-SUMO1)-YPet oraz trawionego CyPet-SUMO1), a FLYPet (530/475) to emisja YPet podczas wzbudzenia przy 475 nm, która jest stała niezależnie od tego, czy CyPet-(pre-SUMO1)-YPet został strawiony, czy nie.
<ol start="6">
 <li>Po trawieniu przez SENP1 pozostała emisja FRET (FL'FRET) wynosi:</li>
</ol>
<img alt="Równanie transferu energii fluorescencji, wzór analizy FRET, badanie fluorescencyjne." src="/files/ftp_upload/4430/4430eq3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 3"> 
gdzie C to całkowite stężenie CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, a x to stężenie strawionego CyPet-(pre-SUMO1)-YPet.
<ol start="7">
 <li>Po połączeniu wszystkich składników wykryta emisja fluorescencji przy 530 nm podczas wzbudzenia przy 414 nm (FL'530/414) wynosi:</li>
</ol>
<img alt="Równanie obliczania fluorescencji, analiza danych spektroskopowych, wzór badawczy." src="/files/ftp_upload/4430/4430eq4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 4">
4. Test proteazy oparty na FRET do badania kinetyki enzymatycznej
<ol>
 <li>CyPet-(pre-SUMO1)-YPet inkubowano z domeną katalityczną SENP1 w temperaturze 37 °C w buforze zawierającym 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 50 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween-20 i 1 mM DTT do całkowitej objętości 80 ml, a następnie przeniesiono do płytki 384-dołkowej.</li>
 <li>Pomiary przeprowadzano, mierząc emisję fluorescencji przy 475 i 530 nm po wzbudzeniu przy 414 nm w wielodołkowym czytniku fluorescencyjnym przez 5 min w odstępach 15 s.</li>
 <li>Szybkość reakcji (v) skorelowano ze zmianą ilości substratu (S) według zależności:</li>
</ol>
<img alt="Wzór na szybkość reakcji; równanie kinetyki enzymatycznej; v = -d[S]/dt = d[P]/dt; proces chemiczny." src="/files/ftp_upload/4430/4430eq5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 5">
<ol start="4">
 <li>Stężenie produktu wzrastało wykładniczo od 0 przy [S]0 (początkowym stężeniu substratu), gdy t=0:</li>
</ol>
<img alt="Wzór kinetyki chemicznej, [P]=[S]₀(1-e⁻ᵏᵗ), wyrażenie na szybkość reakcji, równanie." src="/files/ftp_upload/4430/4430eq6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 6">
<ol start="5">
 <li>Dla t=0 prędkość początkowa (V0) wynosi:</li>
</ol>
<img alt="Równanie kinetyki enzymatycznej V0=d[P]/dt=k[S]0, przedstawiające szybkość reakcji w analizie biochemicznej." src="/files/ftp_upload/4430/4430eq7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 7">
<ol start="6">
 <li>Stężenie SENP1 pozostawiono stałe, natomiast stężenie CyPet-(pre-SUMO1)-YPet zwiększano od poziomu 100-krotnie przekraczającego stężenie enzymu, zgodnie z wymogami równania Michaelisa-Menten.</li>
 <li>Wszystkie odczyty fluorescencji przeanalizowano za pomocą ilościowej metody analizy FRET, a następnie naniesiono na wykresy w oprogramowaniu GraphPad Prism V w celu dopasowania do równania Michaelisa-Menten. Regresję nieliniową można przeprowadzić również przy użyciu bardziej powszechnych pakietów oprogramowania, takich jak arkusze kalkulacyjne (np. Microsoft Excel).</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Dojrzewanie pre-SUMO1 przez SENP1 można określić poprzez monitorowanie zmian sygnału fluorescencji przy 475 i 530 nm w trakcie procesu. Wynik wykazał, że szybkość trawienia pre-SUMO1 przez SENP1 była zależna od dawki substratu (Rysunek 4). Sugeruje to, że domena katalityczna SENP1 wykazuje doskonałą aktywność w procesie dojrzewania pre-SUMO1. Początkowe szybkości reakcji obliczono na podstawie powyższej analizy z zastosowaniem różnych stężeń substratu (Tabela 1).
Stosunek kcat/KM jest zazwyczaj wykorzystywany do porównywania wydajności różnych enzymów z jednym substratem lub konkretnego enzymu z różnymi substratami. KM oraz Vmax można wyznaczyć z równania Michaelisa-Menten, wykreślając różne prędkości początkowe odpowiadające różnym stężeniom CyPet-(pre-SUMO1)-YPet (Rysunek 5). Wartość kcat wyznaczono jako:
<img alt="Równanie wydajności katalitycznej \(k_{cat}=\frac{V_{max}}{[E]}\); wzór na kinetykę enzymatyczną." src="/files/ftp_upload/4430/4430eq8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 8"> 
Zgodnie z powyższą analizą, obliczona wartość KM wyniosła 0,21 ± 0,04 μM, kcat wyniosła 6,90 ± 0,28 s-1, a stosunek kcat/KM wyniósł (3,2 ± 0,55) x107 M-1s-1.
<img alt="Schemat oddziaływania białek z wykorzystaniem FRET; pokazuje CyPet-YPet, cięcie przez SENP, emisję przy 530 nm i 475 nm." src="/files/ftp_upload/4430/4430fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Wykres testu proteazy opartego na FRET dla dojrzewania pre-SUMO przez SENP.
<img alt="Wykres widma emisji fluorescencji; przedstawia wydajność FRET z emisjami przy określonych długościach fal." src="/files/ftp_upload/4430/4430fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Analiza ilościowa sygnału fluorescencyjnego jako wkładu donora, akceptora i FRET. Analiza widm emisji CyPet-(pre-SUMO1)-YPet przy pobudzeniu 414 nm. FLCyPet(530/414) to emisja CyPet przy 530 nm pod wpływem pobudzenia 414 nm, FLFRET to indukowana FRET emisja YPet przy 530 nm pod wpływem pobudzenia 414 nm, a FLYPet(530/414) to emisja YPet przy 530 nm pod wpływem pobudzenia 414 nm.
<img alt="Widma emisji fluorescencji; diagramy przedstawiają stosunki FL_CyPet i FL_YPet; analiza optyczna." src="/files/ftp_upload/4430/4430fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Obliczanie czynników emisji kierunkowej α i β.
<img alt="Wykres ilościowej analizy FRET; trawiony substrat w funkcji czasu dla stężeń substratu [S1-S8]." src="/files/ftp_upload/4430/4430fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Ilościowa analiza CyPet-(pre-SUMO1)-YPet trawionego różnymi stosunkami domeny katalitycznej SENP1. Reakcje monitorowano w ciągu pierwszych 5 min.
<img alt="Wykres kinetyki Michaelisa-Menten, szybkość reakcji enzymatycznej względem stężenia substratu, dane eksperymentalne." src="/files/ftp_upload/4430/4430fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Graficzna analiza Michaelisa-Menten trawienia CyPet-(pre-SUMO1)-YPet przez SENP1. Dane zostały naniesione na wykres i przeanalizowane za pomocą programu GraphPad Prism V oraz regresji nieliniowej.
<table border="1">
 <tbody >
 <tr>
 <td>[S](μM)</td>
 <td>V0(μM/s)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.115</td>
 <td>0.0023±0.00005</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.214</td>
 <td>0.0028±0.00004</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.407</td>
 <td>0.0033±0.00007</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.594</td>
 <td>0.0037±0.00013</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.725</td>
 <td>0.0043±0.00012</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.471</td>
 <td>0.0051±0.00036</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.899</td>
 <td>0.0050±0.00031</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.300</td>
 <td>0.0050±0.00062</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Wyznaczenie prędkości początkowych dojrzewania pre-SUMO1 przez SENP1. Dla każdego stężenia substratu wykorzystano cztery próbki do pomiaru trawienia. Odchylenie standardowe wynika z wariancji tych czterech próbek.
<table border="1">
 <tbody >
 <tr>
 <td>KM(μM)</td>
 <td>kcat(s-1)</td>
 <td>kcat/kM(M-1•s-1)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.21±0.04</td>
 <td>6.90±0.28</td>
 <td>3.2±0.55×107</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 2. Parametry kinetyczne dojrzewania pre-SUMO1 przez SENP1 wyznaczone za pomocą ilościowej analizy FRET. Odchylenie standardowe obliczono na podstawie czterech próbek dla każdego stężenia substratu.

<ol><li>Johnson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+modification+By+SUMO%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein modification By SUMO.</a> Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).</li>
<li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus%3A+different+functions%2C+similar+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).</li>
<li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO%3A+a+history+of+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).</li>
<li>Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO%2C+ubiquitin%27s+mysterious+cousin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SUMO, ubiquitin's mysterious cousin.</a> Nature. , 202-210 (2001).</li>
<li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SP-RING+for+SUMO%3A+new+functions+bloom+for+a+ubiquitin-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein.</a> Cell. , 5-8 (2001).</li>
<li>Drag, M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeSUMOylating+enzymes-SENPs%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">DeSUMOylating enzymes-SENPs.</a> IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).</li>
<li>Mukhopadhyay, D., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+in+reverse%3A+the+SUMO+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modification in reverse: the SUMO proteases.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).</li>
<li>Reverter, D., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+SENP2+protease+interactions+with+SUMO+precursors+and+conjugated+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).</li>
<li>Shen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+protease+SENP1+induces+isomerization+of+the+scissile+peptide+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).</li>
<li>Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+substrate+for+deubiquitinating+enzymes+based+on+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer+between+terbium+and+yellow+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein.</a> Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).</li>
<li>Mikolajczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+Ubiquitin-related+Modifier+%28SUMO%29-specific+Proteases%3A+PROFILING+THE+SPECIFICITIES+AND+ACTIVITIES+OF+HUMAN+SENPs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).</li>
<li>Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distrubition+and+paralogue+specificity+of+mammalian+deSUMOylating+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes.</a> Biochem. J. , 335-344 (2010).</li>
<li>Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+profiling+of+human+deSUMOylating+enzymes+%28SENPs%29+with+synthetic+substrates+suggests+an+unexpected+specificity+of+two+newly+characterized+members+of+the+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family.</a> Biochemical Journal. 409, 461(2008).</li>
<li>Engels, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+assay+for+DEN1+peptidase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity.</a> Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).</li>
<li>Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-resonance-energy-transfer-based+protease+activity+assay+and+its+use+to+monitor+paralog-specific+small+ubiquitin-like+modifier+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing.</a> Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).</li>
<li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Technologia FRET została wykorzystana do badania dojrzewania pre-SUMO1 przez SENP19. Jako para FRET zastosowano CFP-YFP, a do charakterystyki właściwości kinetycznych wykorzystano analizę ratiometryczną, polegającą na wyznaczeniu stosunku emisji akceptora do donora. Jednakże w tradycyjnej ratiometrycznej analizie FRET nie bierze się pod uwagę autofluorescencji donora i akceptora. Uzyskany stosunek nie koreluje bezpośrednio z ilością strawionego substratu.
W niniejszej pracy opisujem...

<table><tbody><tr><td>zestaw PCR II TOPO Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K466040</td><td></td></tr><tr><td>2xYT</td><td>Research Products Internationa.l Corp.</td><td>X15600</td><td></td></tr><tr><td>agaroza Ni-NTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>88222</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik do testu Coomassie plus (Bradford)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23238</td><td></td></tr><tr><td>płyta 384-dołkowa (szklane dno)</td><td>Greiner</td><td>781892</td><td></td></tr><tr><td>czytnik płytek 384-dołkowych FlexStation II</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowa analiza fret (förster resonance energy transfer) w celu oznaczenia kinetyki proteazy senp1

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Odwracalne modyfikacje potranslacyjne białek za pomocą ubikwityny lub białek podobnych do ubikwityny (Ubls) są powszechnie wykorzystywane do dynamicznej regulacji aktywności białek i pełnią różnorodne role w wielu procesach biologicznych. Na przykład SUMO kowalencyjnie modyfikuje znaczną liczbę białek o istotnych funkcjach w wielu procesach komórkowych, w tym w regulacji cyklu komórkowego, przeżyciu i śmierci komórki, odpowiedzi na uszkodzenia DNA oraz odpowiedzi na stres 1-5. SENP, jako proteaza specyficzna dla SUMO, funkcjonuje jako endopeptydaza w dojrzewaniu prekursorów SUMO lub jako izopeptydaza usuwająca SUMO z białek docelowych, co pozwala na odnowienie cyklu sumoilacji 1,3,6,7.
Wydajność katalityczną lub specyficzność enzymu najlepiej charakteryzuje stosunek stałych kinetycznych, kcat/KM. W kilku badaniach parametry kinetyczne par SUMO-SENP określono za pomocą różnych metod, w tym western-blotu z użyciem żelu poliakrylamidowego, podłoży znakowanych radioaktywnie, związków fluorescencyjnych lub podłoży białkowych znakowanych fluorescencyjnie 8-13. Jednak techniki oparte na żelach poliakrylamidowych, które wykorzystywały białka w formie „natywnej”, są pracochłonne i wymagające technicznie, przez co nie nadają się do szczegółowej analizy ilościowej. Uzyskane wartości kcat/KM z badań z wykorzystaniem tetrapeptydów lub białek z fluoroforem ACC (7-amino-4-karbamoylo-metylowa kumaryna) lub AMC (7-amino-4-metylowa kumaryna) były albo o dwa rzędy wielkości niższe niż w przypadku substratów naturalnych, albo nie pozwalały na wyraźne rozróżnienie aktywności izo- i endopeptydazy SENPs.
Niedawno w badaniach nad enzymami deubikwitynującymi (DUBs) lub SENPs wykorzystano testy proteaz oparte na technice FRET z użyciem pary FRET składającej się z cyjanowej białka fluorescencyjnego (CFP) oraz żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) 9,10,14,15. Stosunek emisji akceptora do emisji donora służył jako parametr ilościowy do monitorowania sygnału FRET w celu określenia aktywności proteazy. Metoda ta nie uwzględniała jednak wzajemnych zanieczyszczeń sygnału przy długościach fal emisji akceptora i donora, wynikających z autofluorescencji akceptora i donora, co wpływało na brak dokładności pomiarów.
Opracowaliśmy nową, wysoce czułą i ilościową metodę analizy proteaz opartą na FRET do wyznaczania parametrów kinetycznych dojrzewania pre-SUMO1 przez SENP1. Do wytworzenia substratu CyPet-(pre-SUMO1)-YPet 16 wykorzystano zmodyfikowaną parę FRET CyPet i YPet o znacznie poprawionej wydajności FRET i wydajności kwantowej fluorescencji. Zróżnicowano i określono ilościowo bezwzględne sygnały fluorescencji pochodzące odpowiednio od donora i akceptora oraz FRET przy długościach fal emisji akceptora i donora. Wartość kcat/KM dla SENP1 względem pre-SUMO1 wyniosła (3,2 ± 0,55) x107 M-1s-1, co jest zgodne z ogólnymi parametrami kinetyki enzymatycznej. Zatem metodologia ta jest poprawna i może być stosowana jako ogólne podejście do charakteryzacji innych proteaz.

Opisano nową metodę badania kinetyki enzymatycznej, wykorzystującą ilościową analizę sygnałów FRET (Förster Resonance Energy Transfer). Wyznaczono wartości KM oraz kcat dla hydrolizy domeny katalitycznej SENP1 (proteazy 1 specyficznej dla SUMO/Sentryny) w odniesieniu do pre-SUMO1 (małego modyfikatora podobnego do ubikwityny). Ogólne zasady tego ilościowego badania kinetyki proteaz w oparciu o technikę FRET mogą zostać zastosowane do innych proteaz.

Ilościowa analiza FRET (Förster Resonance Energy Transfer) w celu oznaczenia kinetyki proteazy SENP1

Odwracalne modyfikacje potranslacyjne białek za pomocą ubikwityny lub białek podobnych do ubikwityny (Ubl) są powszechnie wykorzystywane do dynamicznej regulacji białek...

Niniejszy film prezentuje nowatorski, jednostopniowy test FRET do ilościowej analizy kinetyki proteaz. Ogólna strategia poniższego testu opiera się na analizie sygnału FRET. W tym przypadku para FRET, CyPet i YPet, jest przyłączona do końców N i C przedsumo-1 w nienaruszonym substracie, przez co CyPet i YPet znajdują się w bliskiej odległości.Kiedy ta cząsteczka jest wzbudzana przy 414 nanometrach, większość sygnału emisji występuje przy 530 nanometrach. Jednak po dodaniu proteazy SENP1 substrat zostaje rozcięty w obrębie Gly-Gly w C-końcu Sumo1, co oddziela CIPA od wpa. Teraz, po wzbudzeniu przy 414 nanometrach, większość obserwowanego sygnału emisji występuje przy 475 nanometrach.Aby ocenić kinetykę tej reakcji, emisję fluorescencji mierzy się co 15 sekund przez okres pięciu minut. Analiza uzyskanych danych fluorescencyjnych pozwala określić szybkość trawienia substratu cype pre sumo one ype przez proteazę SENP one. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy z użyciem fluorescencyjnych substratów peptydowych, analiza radiometryczna czy western blot, jest możliwość wyznaczenia parametrów kinetycznych w czasie rzeczywistym w ramach pojedynczego etapu analizy.Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię i diagnostykę chorób związanych z białkami, takich jak nowotwory i choroby metaboliczne. Ponieważ technika ta umożliwia prowadzenie precyzyjnych i wysokoprzepustowych analiz dla różnych białek, a także wykrywanie ich inhibitorów i charakterystykę, procedurę demonstracyjną dla danej choroby przeprowadzi student studiów magisterskich z mojego laboratorium, który był pierwszą osobą, która opracowała tę metodę i procedurę. Rozpocznij procedurę od amplifikacji metodą PCR otwartych ramek odczytu dla Cype ype pre sumo one, mature sumo one oraz domeny katalitycznej SENP one.Klonuj otrzymane produkty do wektora PCR 2 topo. Następnie potwierdź poprawność sekwencji genów poprzez sekwencjonowanie. Następnie sklonuj cDNA kodujące CYPE pre sumo 1, ype cype sumo 1, ype oraz domenę katalityczną SENP 1 do wektora PET 28 B z N-końcową etykietą Polyhis.Po sklonowaniu genów do wektora należy przeprowadzić ich transformację do szczepu Escherichia coli BL21(DE3) za pomocą elektroporacji. Po wysianiu przetransformowanych bakterii na podłoże stałe należy wybrać pojedyncze kolonie i inkubować je przez noc. Następnie należy zaszczepić dwulitrowe kolby z pożywką 2x XYT przetransformowanymi bakteriami w stosunku 1:100.Inkubować kultury przez trzy godziny w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 250 RPM, aż do osiągnięcia gęstości optycznej 0,5 przy 600 nm. Aby zindukować ekspresję białka, dodać IPTG do końcowego stężenia 100 µM i inkubować z wstrząsaniem przez 16 godzin w temperaturze 25 °C przy 200 RPM. Następnie przenieść bakterie do butelek wirówkowych o pojemności 250 mL.Następnie zebrać bakterie poprzez wirowanie przy 8,000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Po wirowaniu odlać supernatant i resuspenderowane komórki bakteryjne w buforze lizującym składającym się z tris HCL, chlorku sodu i ole, a następnie przenieść kultury do probówek do wirowania o pojemności 50 mililitrów. Następnie poddać komórki sonikacji przy amplitudzie 70 przez 10 minut w odstępach pięciosekundowych, aby rozbić komórki bakteryjne.Następnie, aby oddzielić białka fuzyjne od szczątków komórkowych, wirować probówki przy 35 000 RCF w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Podczas wirowania przygotować 10 mililitrową kolumnę BioRad z 500 mikrolitrami kulek niklowych NTI na każdy litr hodowlanych komórek. Po wirowaniu pozwolić roztworowi spłynąć z kolumny.Przenieś nadsącz do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Wlej roztwór nadsączu do kolumny. Po tym, jak cały nadsącz przeniknie przez żywicę, przemyj kolumnę dwukrotnie 10 ml buforu tris-HCl/NaCl/EDTA.Aby eluować białko, dodaj 500 µL tego samego buforu, który tym razem zawiera 500 mM ole. Zbierz frakcję przepływową do probówki do wirówki.Następnie przenieś roztwór do membrany dializacyjnej o progu odcięcia 10 kilodaltonów i dializuj próbkę przez noc w jednym litrze buforu zawierającego 20 millimolar tris, HCL 50 millimolar chlorku sodu oraz jeden millimolar DTT w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po dializie przenieś oczyszczone białka do probówki do mikrocentryfugi i wyznacz stężenia oczyszczonych białek za pomocą testu Bradforda. Następnie oczyszczone białka wykorzystuje się do oceny szybkości rozszczepiania pre sumo one przez SENP one przy użyciu ilościowego testu FRET.W probówkach do mikrocentryfugi przygotować 60 mililitrów Spet Sumo one i YA w stężeniach 5100, 200 500, 750 i 1000 nanomolar. Próbki kontrolne te zostaną wykorzystane do określenia stałego stosunku bezpośredniej emisji cype i YA w tym samym buforze. Przygotować cype pre sumo one y PET w 12 stężeniach w zakresie od 0,03 micromolar do 0,9 micromolar oraz rozcieńczenie domeny katalitycznej SENP one o stężeniu 0,3 nanomolar.Skonfiguruj wielodołkowy czytnik fluorescencyjny, aby mierzył emisję fluorescencji przy 475 i 530 nanometrach po wzbudzeniu przy 414 nanometrach oraz emisję przy 530 nanometrach po wzbudzeniu przy 475 nanometrach, w odstępach 32 sekund przez dwie minuty w temperaturze 37 degrees Celsius. Aby uzyskać autofluorescencję płytki, umieść pustą płytkę 384-dołkową we fluorymetrze i wykonaj pomiary. Po określeniu autofluorescencji płytki dostosuj ustawienia fluorymetru tak, aby dla Cype Sumo wzbudzenie wynosiło 414 nanometrów, a pomiary były wykonywane przy 475 nanometrach i 530 nanometrach, natomiast dla ype wzbudzenie wynosiło 414 nanometrów i 475 nanometrów, a pomiary były wykonywane przy 530 nanometrach.Następnie do odpowiednich dołków płytki 384-dołkowej dodaj w trzech powtórzeniach 75 µL cype Sumo one ype lub cype sumo one ype, zgodnie z przedstawionym schematem. Następnie do każdego dołka dodaj 5 µL przygotowanego SENP one, tak aby objętość końcowa wyniosła 80 µL; niezwłocznie umieść płytkę we fluorymetrze i rozpocznij pomiary fluorescencji zgodnie z przebiegiem analizy. Odczyty fluorescencji przeanalizuj, stosując metodę ilościowej analizy FRET omówioną w następnej sekcji.Ogólna idea tej technologii polega na powiązaniu absolutnego sygnału zagrożenia z procesem trawienia. Aby uzyskać absolutny sygnał zagrożenia, musimy wykluczyć bezpośrednie wkłady donora i akceptora z całkowitej emisji fluorescencyjnej przy długościach fal emisji akceptora.Bezpośrednie wkłady donora i akceptora oblicza się na podstawie współczynników korelacji alfa i beta odpowiednio dla donora i akceptora. W tej części filmu szczegółowo omówiono sposób przeprowadzania tych obliczeń. Aby przeanalizować kinetykę trawienia substratu przez SENP1, należy użyć oprogramowania GraphPad Prism 5, zaczynając od otwarcia wyeksportowanego pliku txt w programie Excel po odjęciu fluorescencji tła płytki.Stężenie strawionego substratu w różnych punktach czasowych jest obliczane przez formuły PrepU; podczas wzbudzenia światłem o długości fali 414 nanometrów, całkowita emisja fluorescencji spet pre sumo one ype przy 530 nanometrach może pochodzić z trzech źródeł: absolutnej emisji indukowanej przez fret Y pets, emisji cype oraz bezpośredniej emisji wpe. W tym równaniu FL pięć 30/cztery 14 oznacza całkowitą emisję fluorescencji przy 530 nanometrach podczas wzbudzenia przy 414 nanometrach, natomiast FL fret to absolutny sygnał fret.FL Spet Con to bezpośrednia emisja Spet przy pobudzeniu falą o długości 414 nanometrów, a FL Ype Con to bezpośrednia emisja Ype przy pobudzeniu falą o długości 414 nanometrów. Bezpośrednia emisja spet przy 530 nanometrach jest proporcjonalna do jego emisji przy 475 nanometrach.Przy wzbudzeniu przy 414 nanometrach przy stałym stosunku alfa, bezpośrednia emisja YA przy 530 nanometrach pod wpływem wzbudzenia przy 414 nanometrach jest proporcjonalna do jej emisji przy 530 nanometrach. Przy wzbudzeniu przy 475 nanometrach przy stałym stosunku beta, gdy spet pre sumo one ype zostanie strawiony przez SENP one i wzbudzony przy 414 nanometrach, emisja fluorescencyjna przy 530 nanometrach ulega zmniejszeniu, ale nadal może zostać podzielona na trzy części, jak pokazano tutaj.FL Prime 530/414 to całkowita emisja fluorescencji przy 530 nanometrach po trawieniu. Przy wzbudzeniu przy 414 FL Prime fret to pozostały absolutny sygnał fret, a FL prime SPET 475/414 to emisja spet przy 475 nanometrach po trawieniu przy wzbudzeniu przy 414 nanometrach. Emisja pochodzi z dwóch części: nietrawionego cype, pre sumo, one ype oraz trawionego cype Sumo one.Emisja fluorescencji przy 530/475 nm jest emisją typu, gdy wzbudzenie następuje przy 475 nanometrach, co pozostaje stałe niezależnie od tego, czy cype pre sumo one ype uległ trawieniu, czy nie; po trawieniu przez SENP one pozostała emisja FRET jest przedstawiona w tym równaniu, gdzie C jest całkowitym stężeniem cype pre sumo one ype, a X jest stężeniem strawionego cype pre sumo one YA. Po połączeniu wszystkich elementów, wykrywana emisja fluorescencji przy 530 nanometrach pod wpływem wzbudzenia przy 414 nanometrach jest opisana tym równaniem dla testu proteazy opartego na FRET; w badaniu kinetyki enzymatycznej szybkość reakcji jest skorelowana ze zmianą ilości substratu w miarę wykładniczego wzrostu stężenia produktu od zera.Gdy T równa się zero, tak jak widać tutaj, S subzero oznacza pierwotne stężenie substratu dla T równego zero. Pierwotna prędkość to dojrzewanie pre-sumo 1 przez SENP.Można to określić poprzez monitorowanie zmian sygnału fluorescencji przy 475 i 530 nanometrach podczas procesu. Jak pokazano tutaj, szybkość dojrzewania pre-sumo 1 była zależna od dawki substratu, co sugeruje, że domena katalityczna SENP 1 wykazuje doskonałą aktywność w procesie dojrzewania pre-sumo 1. Początkowe szybkości reakcji obliczono, stosując tę samą analizę dla różnych stężeń substratu.Stosunek KCAT do KM jest zazwyczaj wykorzystywany do porównywania wydajności różnych enzymów względem jednego substratu lub konkretnego enzymu względem różnych substratów. KM i Vmax można wyznaczyć z równania McKayla Cementin, wykreślając poszczególne prędkości początkowe odpowiadające różnym stężeniom cype. Pre sumo one YA kcat uzyskano przy użyciu tego równania.Zgodnie z powyższą analizą, obliczona wartość KM wyniosła 0,21 ± 0,4 µM. Wartość kcat wyniosła 6,90 ± 0,28 s⁻¹, a stosunek kcat/km wyniósł 3,2 ± 0,55 × 10⁷ M⁻¹. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak wyznaczyć parametry kinetyczne proteazy za pomocą nowej ilościowej analizy tłuszczów w pomiarze jednokrokowym w czasie rzeczywistym, postępując zgodnie z tą procedurą.W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak rzeczywiste KM pozorne lub K inhibitora, można zastosować inne metody, na przykład badanie inhibicji produktowej lub charakterystykę inhibitorów. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny białek do dokładnych analiz genetycznych oraz zrozumienia roli białek w procesach fizjologicznych i patologicznych w czujnikach optycznych, co umożliwia szybką diagnostykę i odkrywanie nowych leków.

quantitative-fret-frster-resonance-energy-transfer-analysis-for-senp1

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ilościowa analiza FRET (Förster Resonance Energy Transfer) do określania kinetyki proteazy SENP1

Ten film opisuje czasowo-rozdzielczy transfer energii rezonansu Förstera lub test TR-FRET w celu określenia endogennej fosforylacji białek za pomocą fluoroforów donorowych i akceptorowych oznaczonych na przeciwciałach specyficznych dla badanego białka. Technika ta ma na celu pomiar fosforylacji badanych białek w lizatach komórkowych.

Czasowo-rozdzielczy transfer energii rezonansu Forstera do monitorowania fosforylacji białek w komórkach

Opisujemy tutaj ulepszoną metodę transferu energii rezonansu luminescencji (LRET), w której wprowadzamy miejsce rozszczepienia proteazy między miejscem fluoroforu dawcy i akceptora. Modyfikacja ta pozwala na uzyskanie specyficznych sygnałów LRET pochodzących z interesujących nas białek błonowych, co pozwala na badanie białek błonowych bez oczyszczania białek.

Transfer energii rezonansu luminescencyjnego w celu zbadania zmian konformacyjnych w białkach błonowych ulegających ekspresji w komórkach ssaków

Ostatnio opracowano wiele biosensorów siły opartych na FRET, które umożliwiają specyficzne dla białek rozwiązywanie siły wewnątrzkomórkowej. W tym protokole pokazujemy, w jaki sposób jeden z tych czujników, zaprojektowany dla łącznika białka kompleksu nukleoszkielet-cytoszkielet (LINC) Nesprin-2G, może być wykorzystany do pomiaru sił aktomiozyny w jądrowym kompleksie LINC.

Protokół wykorzystania biosensorów Förster Resonance Energy Transfer (FRET) do pomiaru sił mechanicznych w jądrowym kompleksie LINC

Protokół dla wysoce precyzyjnych eksperymentów FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki jest przedstawiony tutaj. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych w domenie wiążącej ligand receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA). Wyznaczanie precyzyjnych odległości jest pierwszym krokiem w kierunku budowy modeli konstrukcyjnych w oparciu o eksperymenty FRET.

Wysoka precyzja FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do określania struktury biomolekuły

Interakcje białko-białko są kluczowe dla systemów biologicznych, a badania kinetyki wiązania dostarczają wglądu w dynamikę i funkcję kompleksów białkowych. Opisujemy metodę, która określa ilościowo parametry kinetyczne kompleksu białkowego za pomocą rezonansu fluorescencyjnego, transferu energii i techniki zatrzymanego przepływu.

Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej

Opisane tutaj protokoły dostarczają przewodnika do wizualizacji i ilościowego określenia aktywności proteaz neutrofilowych w ludzkiej plwocinie. Zastosowania takiej analizy obejmują zarówno ocenę leczenia przeciwzapalnego, jak i walidację biomarkerów, badania przesiewowe leków i badania kliniczne na dużych kohortach.

Monitorowanie aktywności elastazy neutrofilowej i katepsyny G w próbkach ludzkiej plwociny

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) pomiędzy dwiema cząsteczkami fluoroforu może być wykorzystany do badania interakcji białek w żywej komórce. W tym miejscu przedstawiono protokół pomiaru FRET w żywych komórkach poprzez wykrywanie uczulonej emisji akceptora i wygaszanie cząsteczki donorowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Ocena interakcji białek w żywych komórkach z emisją uwrażliwioną na FRET

Badanie szczegółowo opisuje metodologię mapowania FRET, w tym wybór miejsc etykietowania, wybór barwników, akwizycję i analizę danych. Metodologia ta jest skuteczna w określaniu miejsc wiązania, zmian konformacyjnych i ruchów dynamicznych w układach białkowych i jest najbardziej użyteczna, jeśli jest wykonywana w połączeniu z istniejącymi informacjami strukturalnymi 3D.

Mapowanie transferu energii rezonansu Förster: nowa metodologia wyjaśniająca globalne cechy strukturalne

Spektroskopia wstecznego rozpraszania neutronów oferuje nieniszczący i wolny od znaczników dostęp do dynamiki ps-ns białek i wody do ich hydratacji. Przebieg pracy przedstawiono w dwóch badaniach nad białkami amyloidowymi: nad czasowo-rozdzielczą dynamiką lizozymu podczas agregacji oraz nad dynamiką wody hydratacyjnej tau po tworzeniu włókien.

Spektroskopia neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki pikosekund-nanosekund białek i wody hydratacyjnej

W pracy przedstawiono prosty, przyjazny dla użytkownika ratiometryczny test FRET do wykrywania i ilościowej oceny aktywności DNazy oraz wykazano jego zastosowanie w analizie słabej nukleazy.

Ocena aktywności DNazy za pomocą ratiometrycznego transferu energii rezonansu fluorescencji

Poznaj ilościową analizę kinetyki proteazy SENP1 przy użyciu jednokrokowego testu FRET z substratem pre-SUMO1. Ta metoda umożliwia precyzyjne wyznaczenie parametrów kinetycznych K_M i k_cat w czasie rzeczywistym.

Ilościowa analiza FRET (Förster Resonance Energy Transfer) w celu oznaczenia kinetyki proteazy SENP1

Przeglądaj więcej filmów