Name: Molekularny odczyt długoterminowej adaptacji węchowej u C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Poznaj molekularny odczyt długoterminowej adaptacji węchowej u C. elegans przy użyciu GFP::EGL-4 w neuronach AWC. Ta metoda umożliwia szybką ocenę stanu adaptacji i badanie plastyczności sensorycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Scottowi Hamiltonowi oraz członkom laboratorium O'Hallorana za uważne przeczytanie niniejszego manuskryptu. Dziękujemy również anonimowemu recenzentowi za doskonałe sugestie i wnikliwe uwagi.

1. Konstrukcja zwierząt wykazujących ekspresję EGL-4 z oznakowaniem GFP
<ol>
	<li>Sklonować fuzję translacyjną GFP::EGL-4 pod promotorem genu odr-3 (użyć 2678 bp bezpośrednio powyżej kodonu start): (p)odr-3::GFP::EGL-4. Promotor odr-3 steruje ekspresją w parach neuronów amfidialnych: AWA, AWB, AWC oraz słabo w ASH.</li>
	<li>Wstrzyknąć plazmid (p)odr-3::GFP::EGL-4 w stężeniu 50 ng/μl do zwierząt typu dzikiego (N2) wraz z markerami ko-iniekcji, stosując standardowe techniki transformacji linii zarodkowej8: (p)ofm-1::GFP9 (25 ng/μl) oraz (p)odr-1::dsRed10 (25 ng/μl). Promotor odr-1 steruje ekspresją w parach neuronów amfidialnych AWC i AWB, a promotor ofm-1 steruje ekspresją w koelomocytach.</li>
	<li>Zwierzęta transgeniczne wykazujące macierze ekstrachromosomalne opisane w kroku 1.2 poddać protokołowi integracji z użyciem promieniowania ultrafioletowego (UV) i trimetylpsoralenu (TMP)11.</li>
	<li>Zsynchronizować zwierzęta metodą wybielania (bleaching)12 i hodować je na płytkach z pożywką NGM zawierającą E. coli OP50 do stadium L4. Zmyć zwierzęta L4 z płytek NGM buforem M9, aby usunąć bakterie E. coli OP50.</li>
	<li>Usunąć bufor M9 i dodać 50-100 μl roztworu roboczego TMP o stężeniu 30 μg/ml do osadu z nicieni w probówce mikrocentryfużowej o pojemności 1.5 ml. Owinąć probówkę folią aluminiową w celu odcięcia światła zewnętrznego i delikatnie mieszać na rotatorze przez 15 min w owiniętej folią probówce. Przenieść nicienie w roztworze TMP do dużej, niezasianej płytki NGM.</li>
	<li>Naświetlić nicienie na płytce NGM promieniowaniem UV dawką 350 μJ(X100) przy użyciu urządzenia Stratalinker 2400. Następnie przenieść nicienie na płytkę NGM z OP50 i inkubować w ciemności przez 5 hr.</li>
	<li>Przenieść 50 nicieni transgenicznych na około 10 zasianych płytek (po 2-5 nicieni na płytkę). Przenosić osobniki P0 na nowe płytki co 24 hr przez 3 dni.</li>
	<li>Wybrać 250 klonalnych zwierząt F1 (1 zwierzę na płytkę). Wyizolować 2-4 zwierzęta F2 z każdej płytki F1. Sprawdzić zwierzęta F3 w celu znalezienia linii o 100% transmisji, analizując wzór ekspresji (p)ofm-1::GFP pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Przeprowadzić krzyżowanie zwrotne (outcross) końcowych linii zintegrowanych ze zwierzętami typu dzikiego N2 pięciokrotnie. Końcową linię zintegrowaną będziemy określać jako pyIs500, a cząsteczkę EGL-4 z tagiem GFP jako GFP::EGL-4.</li>
</ol>
2. Hodowla i utrzymanie zwierząt do testów translokacji jądrowej
<ol>
	<li>Hodować zwierzęta pyIs500 w temperaturze 25 °C na standardowych płytkach NGM o średnicy 10 cm (przepis poniżej) z wysianymi bakteriami OP50 E. coli13 (Rycina 1).</li>
	<li>W dniu 1. przenieść od czterech do pięciu zwierząt pyIs500 w stadium L4 z płytek hodowanych w 25 °C na pięć oddzielnych płytek o średnicy 10 cm z wysianymi bakteriami OP50 E. coli i inkubować w 25 °C (tj. 4-5 zwierząt L4 na płytkę).</li>
	<li>W dniu 4. spłukać dorosłe populacje zwierząt pyIs500 z dużych płytek NGM, używając buforu S-Basal (przepis poniżej). Do przenoszenia zwierząt używać jednorazowych pipet szklanych, ponieważ zwierzęta przywierają do ścianek plastikowych końcówek pipet.</li>
</ol>
3. Testy długoterminowej translokacji jądrowej indukowanej zapachem
<ol>
	<li>Przemyj zwierzęta pyIs500 3 razy w buforze S-Basal, aby usunąć bakterie. Nie wiruj zwierząt pomiędzy płukaniami; zamiast tego pozwól im osadzić się grawitacyjnie w stacjonarnej probówce do mikrowirówki o pojemności 1.5 ml. Kluczowe jest upewnienie się, że wszystkie bakterie zostały usunięte, a szalki NGM są wolne od zanieczyszczeń, ponieważ resztkowe bakterie negatywnie wpłyną na wynik testu translokacji. Stwierdzono również, że autoklawowanie probówek 1.5 ml nadaje ich ściankom wewnętrznym „lepkie” właściwości, co powoduje przyleganie zwierząt do boków, dlatego należy stosować nieautoklawowane probówki 1.5 ml.</li>
	<li>Podczas osadzania się zwierząt pomiędzy płukaniami, przygotuj roztwór adaptacyjny. Do cylindra miarowego o pojemności 100 ml wlej 100 ml buforu S-Basal. Dodaj substancję zapachową do S-Basal i zabezpiecz cylinder paskiem Parafilmu. W przypadku adaptacji do benzaldehydu dodaj 7.5 μl benzaldehydu do 100 ml S-Basal, a w przypadku adaptacji do butononu dodaj 11 μl 2-butanonu do 100 ml S-Basal. Delikatnie odwróć (nie wstrząsaj) cylinder miarowy zawierający S-Basal i substancję zapachową 30 razy, aby utworzyć jednorodną emulsję.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu w S-Basal pozwól zwierzętom osiąść i usuń cały płyn. Oznacz jedną probówkę jako „+ve” lub „adapt”, a drugą jako „-ve” lub „unadapt”. Następnie dodaj 1 ml mieszaniny adaptacyjnej do probówki do adaptacji (+ve) oraz 1 ml S-Basal do probówki kontrolnej nieadaptowanej (-ve). Staraj się utrzymać liczbę zwierząt w każdej probówce w przedziale od 100 do 200. Przy odrobinie wprawy możliwe jest oszacowanie przybliżonej liczby zwierząt w osadzie na oko.</li>
	<li>Załóż zabezpieczacz zakrętki do każdej probówki 1.5 ml (zapobiega to przypadkowemu otwarciu się wieczek) i umieść probówki na rotatorze na 80 min. Stwierdzono, że ekspozycja na zapach trwająca od 60 min do 80 min daje podobne wyniki (oba warianty prowadzą do długoterminowych odpowiedzi adaptacyjnych). Jednakże 80 min ekspozycji zapewnia w naszej praktyce bardziej spójne wyniki. W związku z tym wszystkie nasze testy długoterminowej adaptacji są standaryzowane poprzez stosowanie 80 min ekspozycji na zapach (Rycina 2).</li>
	<li>Po 80 min przemyj zwierzęta 3 razy w S-Basal. Pozwól zwierzętom osiąść grawitacyjnie pomiędzy każdym płukaniem.</li>
</ol>
4. Krótkookresowe analizy translokacji jądrowej indukowanej zapachami
<ol>
	<li>W przypadku krótkotrwałej adaptacji do zapachu należy zastosować ten sam protokół, co w testach długotrwałej translokacji indukowanej zapachem (kroki 3.1-3.4), jednak zamiast inkubować zwierzęta pyIs500 w adaptującym zapachu przez 80 min, należy zastosować 30 min ekspozycji. Ilościowe określenie wyników testów translokacji jądrowej indukowanej zapachem opisane poniżej (krok 5) jest takie samo dla ekspozycji długotrwałej i krótkotrwałej.</li>
</ol>
5. Ocena zdarzenia translokacji jądrowej indukowanej zapachem
<ol>
	<li>Przygotować 2% podkładki agarozowe zawierające 5 mM azotku sodu (NaN3), rozpuszczając agarozę do elektroforezy w dH20. Nanieść jedną kroplę stopionej agarozy z NaN3 na szklane szkiełko przedmiotowe. Natychmiast położyć drugie szkiełko przedmiotowe na pierwszym, aby spłaszczyć kroplę stopionej agarozy. Pozostawić na 30 s, a następnie delikatnie rozdzielić szkiełka, pozostawiając na jednym z nich płaską podkładkę agarozową o grubości ~1 mm.</li>
	<li>Po ostatnim przemyciu w S-Basal pozwolić nicieniom osiąść w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i usunąć cały płyn. Następnie nanosić zwierzęta kroplami na podkładki agarozowe na kilku szkiełkach przedmiotowych. Ważne jest, aby liczba zwierząt na szkiełku wynosiła od 50 do 100. Zbyt duża liczba zwierząt na szkiełku utrudni ocenę i często spowoduje rozproszoną poświatę po wzbudzeniu światłem niebieskim. Nadmiar płynu można usunąć z podkładki agarozowej za pomocą małej chusteczki Kim-wipe. Na podkładkę położyć szkiełko nakrywkowe o grubości 0,5 mm i pozostawić na 2 min, aby NaN3 unieruchomił zwierzęta. Należy pamiętać, że zwierzęta można odzyskać ze szkiełek po ocenie. Zwierzęta wybudzą się z narkozy wywołanej przez NaN3 po ~1 h, jeśli zostaną przeniesione do kropli buforu M9 na zasiałą płytkę NGM.</li>
	<li>Na tym etapie niezbędne jest, aby każdy eksperymentator opracował klucz pozwalający zidentyfikować, które szkiełko jest szkiełkiem eksperymentalnym (+ve), a które kontrolnym (-ve), a następnie przekazał szkiełka innej osobie, która dokona ślepej oceny wzoru lokalizacji GFP:EGL-4. Pozwoli to wyeliminować błąd eksperymentatora.</li>
	<li>Ocenić od 50 do 100 zwierząt na szkiełku, korzystając z pionowego mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywami o powiększeniu 10X, 40X i 63X oraz filtrami GFP/RFP. Po pierwsze, zlokalizować zwierzęta przy powiększeniu 10X, korzystając z oświetlenia w polu jasnym. Po drugie, zlokalizować neuron AWC, wyłączając oświetlenie w polu jasnym i używając filtra RFP. (p)odr-1::dsRed indukuje ekspresję w neuronach AWB i AWC. Neurony AWC mają charakterystyczne owalne ciała komórkowe w porównaniu z ciałami komórkowymi AWB, które są mniejsze i mają kształt kolisty (Rycina 2).</li>
	<li>Po zlokalizowaniu ciała komórkowego AWC przełączyć na filtr GFP i zapisać lokalizację GFP:EGL-4 jako jądrową lub cytoplazmatyczną. Użycie licznika pozwala eksperymentatorowi na stałe patrzenie w okular podczas oceny szkiełka. Uwaga: kroki 5.1-5.5 powtarza się co najmniej 3 razy w różne dni, aby uzyskać statystycznie istotne dane (Ryciny 1-2).</li>
</ol>
6. Monitorowanie EGL-4 znakowanego GFP podczas powrotu do stanu wyjściowego po długotrwałej adaptacji do zapachu
<ol>
	<li>Po kroku 3.5 podziel populacje zwierząt pyIs500 na kilka alikwotów i oceń lokalizację GFP::EGL-4 w neuronach AWC (jądrową w stosunku do cytoplazmatycznej) w punkcie czasowym zero (tj. po 80 min ekspozycji) oraz w kilku kolejnych punktach czasowych (Rycina 3).</li>
	<li>Przenieś zwierzęta kontrolne (-ve) i doświadczalne (+ve) za pomocą jednorazowych pipet szklanych na płytki NGM.</li>
	<li>Pozostaw zwierzęta do regeneracji przez różne okresy czasu i ponownie zbadaj lokalizację GFP::EGL-4 w neuronach AWC w każdym punkcie czasowym, zgodnie z krokami od 5.1 do 5.5.</li>
</ol>
7. Materiały
Płytki NGM: Do 1 L ddH20 dodać: 21 g Bacto-Agar; 3 g chlorku sodu (NaCl); 2,5 g Bacto-Peptone. Pożywkę wysterylizować w autoklawie. Po autoklawowaniu chłodzić agar do temperatury 54 °C. Dodać następujące roztwory: 25 ml 1M buforu fosforanowego potasu; 1 ml 1 M siarczanu magnezu (MgSO4); 1 ml 1 M chlorku wapnia (CaCl2); 1 ml cholesterolu w etanolu (stok 5 mg/ml).
1 M fosforan potasu dwuzasadowy K2HPO4 174,2 g/mol: Dla 500 ml: w 400 ml ddH2O rozpuścić 87,1 g fosforanu potasu dwuzasadowego K2HPO4. Uzupełnić objętość do 500 ml za pomocą ddH2O. Sterylizować poprzez filtrację, używając sterylnej jednostki filtrującej 500 ml.
1 M fosforan potasu jednopodstawny KH2PO4 136,1 g/mol: Aby przygotować 1 L: w 800 ml ddH2O rozpuścić 136,1 g fosforanu potasu jednopodstawnego KH2PO4. Uzupełnić objętość do 1 L za pomocą ddH2O. Sterylizować przez filtrowanie, używając sterylnej jednostki filtrującej o pojemności 500 ml.
Bufor fosforanowy potasu (K3PO4) 1 M o pH 6,0: Na 1 L: Do sterylnej jednostki filtrującej o pojemności 1 L dodać 868 ml 1 M KH2PO4 jednobazowego. Odczekać do przefiltrowania roztworu, a następnie dodać 132 ml 1 M K2HPO4 dwubazowego. Odczekać do przefiltrowania całego płynu. Wyjąć jednostkę filtrującą i dostosować pH do wartości 6,0. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
S-Basal: Na 1 L: dodać 50 ml 1M buforu K3PO4, pH ~6.0 oraz 20 ml 5M NaClaq. Uzupełnić do 1 L wodą ddH2O. Roztwór wysterylizować w autoklawie.
M9: Na 1 L: 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O. Uzupełnić ddH20 do objętości 1 L. Sterylizować w autoklawie.

<ol><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14 (4), 803(1995).</li>
<li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+signals+modulate+olfactory+acuity%2C+discrimination%2C+and+memory+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans.</a> Learning and Memory. 4 (2), 179(1997).</li>
<li>Bargmann, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Neuron. 74 (3), 515(1993).</li>
<li>L'Etoile, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyclic+GMP-dependent+protein+kinase+EGL-4+regulates+olfactory+adaptation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans.</a> Neuron. 36, 1079-10 (2002).</li>
<li>Lee, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+entry+of+a+cGMP-dependent+kinase+converts+transient+into+long-lasting+olfactory+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation.</a> PNAS. 107 (13), 6016(2010).</li>
<li>O'Halloran, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+AWC-mediated+olfactory+plasticity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 5 (12), e1000761(2009).</li>
<li>O'Halloran, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cGMP+levels+affect+the+localization+of+EGL-4+in+AWC+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 7 (2), e31614(2012).</li>
<li>Mello, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).</li>
<li>Miyabayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+members+of+a+divergent+nuclear+receptor+family+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 215, 314(1999).</li>
<li>L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfaction+and+odor+discrimination+are+mediated+by+the+C.+elegans+guanylyl+cyclase+ODR-1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1.</a> Neuron. 25 (3), 575(2000).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451(1995).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Wormbook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> Wormbook. , (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71(1974).</li>
<li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+Positive+Butanone+Learning%2C+Short-term%2C+and+Long-term+Associative+Memory+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490(2011).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+C.+elegans+Dopamine+Neuron+Degeneration+Assay+for+the+Validation+of+Potential+Parkinson%27s+Disease+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes.</a> J. Vis. Exp. (17), e835(2008).</li>
<li>Pittenger, C., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+general+mechanisms+for+long-lasting+plasticity%3A+Aplysia+and+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757(2003).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Opisany tutaj indukowany zapachem transport jądrowy cząsteczki EGL-4 znakowanej GFP stanowi wiarygodny odczyt molekularny adaptacji węchowej u C. elegans. Testy translokacji jądrowej indukowanej zapachem są proste i wymagają jedynie kilku dni czasu przygotowawczego. Linia pyIs500, którą skonstruowaliśmy do tych testów, wykazuje ekspresję markera oświetlającego neuron AWC, a także ekspresję białka EGL-4 znakowanego GFP. W związku z tym uważamy, że badacz z niewielkim lub żadnym doświadczeniem w pracy z t...

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>DF0140-07-4</td><td>płytki NGM</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Chemical</td><td>S671-10</td><td>płytki NGM</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Difco</td><td>DF0118-07-2</td><td>płytki NGM</td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Fisher Chemical</td><td>S375-500</td><td>bufor S-Basal i płytki NGM</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Fisher Chemical</td><td>P285-500</td><td>bufor S-Basal i płytki NGM</td></tr><tr><td>Kimwipes - małe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>LS2770</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100%</td><td>Gold Shield Chemical Co.</td><td>43196-115</td><td>rozcieńczanie substancji zapachowych do testów chemotaksji</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106-500G</td><td>płytki NGM</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>MP Biomedicals</td><td>150136-500G</td><td>płytki NGM</td></tr><tr><td>Azydek sodu 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10289180</td><td>środek znieczulający</td></tr><tr><td>Agaroza - UltraPure</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>podkładki agarozowe</td></tr><tr><td>Benzaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1334-100G</td><td>substancja zapachowa AWC</td></tr><tr><td>Butanon, stopień ACS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>360473-500ML</td><td>substancja zapachowa AWC</td></tr><tr><td>Probówki do mikrocentryfugi - 1.5 ml kolorowe</td><td>Denville</td><td>LS8147</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa szklana pipeta Pasteura 5-3/4&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker</td><td>Stratagene</td><td>Stratalinker 2400</td><td>integracja UV</td></tr><tr><td>Butelka filtracyjna próżniowa - 500 ml</td><td>Nalgene</td><td>09-740-25B</td><td></td></tr></tbody></table>

molekularny odczyt długoterminowej adaptacji węchowej u c. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Podczas długotrwałej stymulacji większość neuronów sensorycznych adaptuje swoją odpowiedź poprzez zmniejszenie wrażliwości na sygnał. Odpowiedź adaptacyjna pomaga kształtować uwagę i chroni komórki przed nadmierną stymulacją. Adaptację w obwodzie węchowym C. elegans po raz pierwszy opisali Colbert i Bargmann1,2. Autorzy zdefiniowali w niej parametry paradygmatu adaptacji węchowej, które wykorzystali do zaprojektowania przesiewu genetycznego w celu wyizolowania mutantów z defektem zdolności adaptacji do lotnych zapachów wykrywanych przez neurony sensoryczne typu C komórek skrzydłowych amfid (AWC). Gdy zwierzęta C. elegans typu dzikiego są eksponowane na atrakcyjny zapach wykrywany przez AWC3 przez 30 min, adaptują one swoją reaktywność na ten zapach i następnie ignorują go w teście behawioralnym chemotaksji przez ok. 1 hr. Gdy zwierzęta C. elegans typu dzikiego są eksponowane na atrakcyjny zapach wykrywany przez AWC przez ok. 1 hr, ignorują go następnie w teście behawioralnym chemotaksji przez ok. 3 hr. Te dwie fazy adaptacji węchowej u C. elegans opisano jako krótko- i długoterminową adaptację węchową (indukowaną odpowiednio po 30 min i 60 min ekspozycji na zapach). Późniejsze prace L'Etoile et al.,4 ujawniły kinazę białkową G (PKG) zwaną EGL-4, która jest niezbędna do krótko- i długoterminowej adaptacji węchowej w neuronach AWC. Białko EGL-4 zawiera sekwencję lokalizacji jądrowej, która jest konieczna do długoterminowych odpowiedzi adaptacji węchowej, ale zbędna do krótkoterminowych odpowiedzi adaptacyjnych w AWC4. Dzięki oznaczeniu EGL-4 zielonym białkiem fluorescencyjnym możliwe stało się zwizualizowanie lokalizacji EGL-4 w AWC podczas przedłużonej ekspozycji na zapach. Wykorzystując tę w pełni funkcjonalną cząsteczkę EGL-4 oznaczoną GFP (GFP::EGL-4), opracowaliśmy molekularny odczyt długoterminowej adaptacji węchowej w AWC5. Używając tego molekularnego odczytu adaptacji węchowej, przeprowadziliśmy zarówno forward, jak i reverse genetic screens w celu zidentyfikowania zwierząt mutantów wykazujących defekty wzorców lokalizacji subkomórkowej GFP::EGL-4 w AWC6,7. Opisujemy tutaj: 1) konstrukcję zwierząt ekspresujących GFP::EGL-4; 2) protokół hodowli zwierząt do testów długoterminowej translokacji jądrowej indukowanej zapachem; oraz 3) ocenę zdarzenia długoterminowej translokacji jądrowej indukowanej zapachem oraz powrotu (ponownej sensytyzacji) ze stanu jądrowego GFP::EGL-4.

Przykład wzorca lokalizacji GFP::EGL-4 w neuronie AWC przed i po długotrwałej ekspozycji na zapach przedstawiono na Rysunku 2. Przed długotrwałą ekspozycją na zapach GFP::EGL-4 znajduje się w cytozolu AWC (Rysunek 2B), a po 80 min ekspozycji na zapach GFP::EGL-4 lokalizuje się w jądrze AWC (Rysunek 2D). Na poziomie behawioralnym zwierzęta z cytoplazmatyczną lokalizacją GFP::EGL-4 w AWC są przyciągane przez punktowe źródło zapachu (Rysunek 2C przedstawia ...

W niniejszym materiale opisujemy molekularny odczyt długotrwałej adaptacji węchowej u Caenorhabditis elegans. Kinaza białkowa G, EGL-4, jest niezbędna do stabilnych odpowiedzi adaptacyjnych w parze pierwotnych neuronów sensorycznych zwanych AWC. Podczas długotrwałej ekspozycji na zapach EGL-4 przemieszcza się z cytozolu do jądra komórkowego neuronu AWC.

Molekularny odczyt długoterminowej adaptacji węchowej u C. elegans

Podczas długotrwałej stymulacji większość neuronów sensorycznych adaptuje swoją odpowiedź poprzez zmniejszenie wrażliwości na sygnał. Odpowiedź adaptacyjna pomaga ...

Ogólnym celem tego filmu jest szczegółowe przedstawienie opracowania i wdrożenia molekularnego odczytu długotrwałej adaptacji węchowej u nicieni morskich, który opisuje stan adaptacji zwierzęcia. Zostaje to osiągnięte poprzez oznakowanie kinazy białkowej G zwanej egg L four cząsteczką zielonego białka fluorescencyjnego i ekspresję tej białkowej fuzji w komórkach amphi wing typu C lub neuronach A WC. W drugim kroku zwierzęta wykazujące ekspresję formy egg L four oznakowanej GFP w neuronach A WC są hodowane na płytkach z pożywką wzrostową dla nicieni zawierającej bakteryjne źródło pokarmu OP 50. Następnie, po czterech dniach, populacja zwierząt zostaje zmyta z płytek hodowlanych i poddana działaniu zapachu wykrywanego przez A WC przez 80 minut, aby wywołać długotrwałą adaptację węchową.Wyniki wykazują lokalizację jądrową białka ALE4 znakowanego GFP w neuronach AWC u zwierząt zaadaptowanych, w przeciwieństwie do lokalizacji cytoplazmatycznej białka ALE4 znakowanego GFP u zwierząt kontrolnych niezaadaptowanych. Poprzez stworzenie funkcjonalnej kopii ALE4 połączonej z zielonym białkiem fluorescencyjnym, możemy śledzić subkomórkową lokalizację ALE4 w AWC i opisywać stan behawioralny zwierzęcia na podstawie lokalizacji GFP. To narzędzie molekularne pozwala nam na szybkie badanie roli różnych mutantów lub terapii w kształtowaniu odpowiedzi komórkowej po długotrwałej stymulacji neuronalnej.Niniejszy protokół rozpoczyna się od stworzenia zwierząt w czwartym stadium larwalnym (L4) wykazujących ekspresję białka egg L four znakowanego GFP, zgodnie z opisem w procedurze pisemnej towarzyszącej temu filmowi. Końcowa linia zintegrowana została oznaczona jako IS 500, a cząsteczka egg L four znakowana GFP jako GFP egg L four. Hodować zwierzęta IS 500 w temperaturze 25°C na standardowych 10 cm płytkach NGM wysianych bakteriami E. coli szczep OP 50. W pierwszym dniu, przy użyciu małego drutu platynowego (tzw. picka), pobrać od 4 do 5 zwierząt IS 500 w czwartym stadium larwalnym z płytek hodowanych w 25°C i przenieść je na 10 cm płytki wysiane bakteriami E. coli OP 50.Powtórz tę procedurę dla czterech dodatkowych płytek. Inkubuj płytki w temperaturze 25 °C w czwartym dniu. Zmyj dorosłe populacje zwierząt IS 500 z dużych płytek NGM, dodając do płytki bufor podstawowy i delikatnie nim mieszając.Powoduje to odczepienie się zwierząt od powierzchni płytki i ich przedostanie się do roztworu buforowego. Za pomocą jednorazowych pipet szklanych odessij zwierzęta z płytki i przenieś je do probówki typu eppendorf o pojemności 1,5 ml. Rozpocznij testy translokacji, przemywając te 500 zwierząt w s basil w celu usunięcia bakterii; nie wiruj próbki.Zwierzęta pomiędzy etapami płukania. Należy pozwolić zwierzętom osiąść pod wpływem grawitacji w stacjonarnej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Kluczowe jest upewnienie się, że wszystkie bakterie zostały usunięte i że płytki NGM są wolne od zanieczyszczeń, ponieważ pozostałe bakterie negatywnie wpłyną na wynik testu translokacji.Powtórz płukanie za pomocą S basil dwukrotnie. Przygotuj roztwór adaptacyjny, dodając 100 milliliters buforu S basil do cylindra miarowego o pojemności 100 milliliter. W przypadku przeprowadzania adaptacji aldehydowej, dodaj 7.5 microliters aldehydu do 100 milliliters ESP basil i zamknij cylinder za pomocą paska param.Delikatnie odwróć 30 razy menzurkę zawierającą bazylię i zapach. Aby stworzyć jednorodną emulsję, dodaj zwierzęta do każdej probówki, starając się utrzymać ich liczbę w przedziale od 100 do 200 w każdej probówce. Przy pewnej praktyce możliwe jest oszacowanie wzrokiem przybliżonej liczby zwierząt w palecie po ich osiedleniu się.Po przemyciu S. basil, usuń cały płyn z probówki epi orph; jedną nową probówkę oznacz jako pozytywną, a drugą jako negatywną. Następnie dodaj 1 mL mieszaniny adaptacyjnej do pozytywnej probówki do mikrowirówki adaptacyjnej oraz dodaj 1 mL S. basil do negatywnej probówki do mikrowirówki kontrolnej nieadaptowanej. Na każdą probówkę nałóż zatyczkę ochronną do probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i umieść probówki na rotatorze na 80 minut.Po 80 minutach trzykrotnie przemyj zwierzęta w S basil, pozwalając im osiaść grawitacyjnie pomiędzy każdym płukaniem. Przygotuj podkładki 2%aros zawierające pięciomilimolarowy azotek sodu, rozpuszczając żel do elektroforezy aros. W wodzie destylowanej umieść pojedynczą kroplę mol oraz aros zawierający azotek sodu na szklanym szkiełku mikroskopowym, a następnie natychmiast połóż drugie szkiełko mikroskopowe na pierwszym, aby spłaszczyć kroplę stopionego agros.Odczekać 30 sekund, a następnie delikatnie rozdzielić szkiełka przedmiotowe, pozostawiając na jednym szkiełku płaski pad aros o grubości około 1 mm. Na tym etapie niezbędne jest, aby każdy badacz opracował system oznaczeń pozwalający rozróżnić szkiełka przeznaczone do eksperymentu pozytywnego od tych służących jako kontrola negatywna. Po opadnięciu nicieni po końcowym przemywaniu w buforze, usunąć cały płyn, a następnie nanieść zwierzęta kroplami na pady aros na kilku szkiełkach przedmiotowych.Ważne jest, aby liczba zwierząt na jednym szkiełku mieściła się w przedziale od 50 do 100. Zbyt duża liczba zwierząt na szkiełku utrudni ocenę i często spowoduje powstanie rozproszonego blasku. Po wzbudzeniu światłem niebieskim nadmiar cieczy można usunąć z podkładki aros za pomocą małej chusteczki Kimwipe.Umieść szkiełko nakrywkowe o grubości 0,5 millimeter na podkładce i odstaw na dwie minuty, aby azydek sodu unieruchomił zwierzęta. Następnie przekaż preparaty drugiej osobie, która w sposób zaślepiony oceni wzorzec lokalizacji GFP egg L four. Pozwoli to wyeliminować błędy eksperymentalne lub stronniczość w ocenie. Oceń od 50 do 100 zwierząt na preparacie, używając odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywami o powiększeniach 10 x, 40 x i 63 x oraz filtrami G-F-P-R-F-P.Po pierwsze, zlokalizuj zwierzęta przy 10-krotnym powiększeniu, korzystając z oświetlenia w polu jasnym. Po drugie, zlokalizuj neuron A WC, wyłączając oświetlenie w polu jasnym i używając filtra RFP. Promotor odor.Jeden marker DS red napędza ekspresję w neuronach WB oraz A WC. Neurony A WC mają charakterystyczne owalne ciała komórkowe w porównaniu z ciałami komórkowymi WB, które są mniejsze i mają kształt kolisty. Po zlokalizowaniu ciała komórkowego A WC, należy przełączyć na filtr GFP i odnotować lokalizację GFP egg L four jako jądrową lub cytoplazmatyczną.Użycie licznika pozwala eksperymentatorowi na ciągłą obserwację przez okular podczas oceny preparatu. Proces ten powtarza się co najmniej trzy razy w oddzielnych dniach, aby uzyskać statystycznie istotne dane. Przykład wzorca lokalizacji GFP egg L four w A WC przed i po przedłużonej ekspozycji na zapach przedstawiono przed przedłużoną ekspozycją na zapach.GFP egg L four jest zlokalizowany w cytozolu A WC po 80 minutach ekspozycji na zapach. GFP egg four jest zlokalizowany w jądrze A WC na poziomie behawioralnym. Zwierzęta z cytozolowym GFP egg four w A WC są przyciągane do punktowego źródła zapachu.Wykres ten został wygenerowany na podstawie reprezentatywnych wyników testów chemotaksji u zwierząt niezaadaptowanych. Należy zauważyć, że indeks CHEMOTAXIS jest bliski jedności. Zwierzęta wykazujące GFPEL4 w A WC nie są przyciągane przez punktowe źródło zapachu adaptacyjnego.Wykres ten został wygenerowany na podstawie reprezentatywnych wyników testów CHEMOTAXIS przeprowadzonych na adoptowanych zwierzętach. Należy zauważyć, że indeks CHEMOTAXIS jest bliski zeru. Gdy egg L four wnika do jądra neuronów A WC, powoduje trwałe i długofalowe zmiany w fizjologii A WC, które utrzymują się nawet wtedy, gdy egg L four nie znajduje się już w jądrze.Po 80 minutach ekspozycji na zapach zwierzęta będą ignorować punktowe źródło adaptującego zapachu, a adaptacja ta utrzyma się nawet po 120 minutach regeneracji. Po 80 minutach ekspozycji na zapach w jądrze komórki AWC obserwuje się GFP Egle four. To wniknięcie do jądra jest zarówno konieczne, jak i wystarczające do wywołania długotrwałej adaptacji w komórce AWC. Po 120 minutach regeneracji u tych zwierząt nie obserwuje się już GFP Eagle four w jądrze, jednak na poziomie behawioralnym nadal ignorują one punktowe źródło adaptującego zapachu aldehydu, nie wliczając czasu hodowli.Po opanowaniu tej techniki, przy jej prawidłowym przeprowadzeniu, można ją wykonać w ciągu kilku godzin.

a-molecular-readout-of-long-term-olfactory-adaptation-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Cząsteczkowe odczytywanie długotrwałej adaptacji węchowej u C. elegans

W niniejszym artykule wideo opisujemy nową metodę umożliwiającą tworzenie gradientów substancji zapachowych o stabilnych i kontrolowalnych geometriach. Krótko ilustrujemy, w jaki sposób gradienty te mogą być wykorzystane do wykrywania wad węchu (całkowitej i częściowej anosmii) oraz do badania bardziej subtelnych cech zachowań chemotaktycznych.

Wysokorozdzielczy pomiar zachowań sterowanych węchem u larw Drosophila

W niniejszym opracowaniu opisujemy metody testowania uczenia się warunkowego oraz krótkotrwałej i długotrwałej pamięci asocjacyjnej u C. elegans. Te populacyjne testy wykorzystują zdolność nicieni do chemotaksji w kierunku lotnych substancji zapachowych oraz tworzenie pozytywnych skojarzeń poprzez parowanie pożywienia z chemoatraktantem, jakim jest butanon. Zwiększenie liczby okresów warunkowania indukuje pamięć długotrwałą.

C. elegans: testy uczenia się pozytywnego względem butanonu oraz testy krótkotrwałej i długotrwałej pamięci asocjacyjnej

Opisano metodę ilościowej oceny reakcji chemotaktycznej Caenorhabditis elegans. Zastosowano wskaźnik chemotaksyczny (CI) jako sposób dokładnej oceny reakcji robaków na określone cele oraz jako platformę porównawczą między odmianami i związkami interesującymi.

C. elegans Test chemotaktyksy

Po ekspozycji na specyficzne stresory środowiskowe, nicień Caenorhabditis elegans przechodzi intensywną plastyczność fenotypową, aby wejść w odporne na stres stadium młodociane.  Przedstawiono metody kontrolowanej indukcji i obrazowania neuroplastyczności w okresie dauera.

In vivo (in vivo)Obrazowanie specyficznej dla Dauera przebudowy neuronów u C. elegans

Użycie dostosowanego "chipa węchowego" do efektywnego obrazowania wapnia u samców C. elegans jest opisane tutaj. Pokazano również badania dotyczące narażenia mężczyzn na glicerol i feromon.

Wykorzystanie dostosowanego mikroprzepływowego chipa węchowego do obrazowania aktywności neuronalnej w odpowiedzi na feromony w męskich neuronach głowy C. elegans

Ten protokół analizuje zachowanie nawigacyjne larwy Drosophila w odpowiedzi na jednoczesną optogenetyczną stymulację jej neuronów węchowych. Światło o długości fali 630 nm służy do aktywacji pojedynczych neuronów węchowych wyrażających rodopsynę z przesuniętym ku czerwieni kanałem. Ruch larw jest jednocześnie śledzony, rejestrowany cyfrowo i analizowany za pomocą specjalnie napisanego oprogramowania.

Śledzenie zachowań larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację neuronów węchowych

Wcześniej opracowaliśmy protokoły dla Caenorhabditis elegans do tworzenia krótko- i długoterminowych wspomnień asocjacyjnych odpowiednio poprzez trening masowy i rozłożony w odstępach. Tutaj opisano szczegółowe protokoły warunkowania C. elegans poprzez parowanie 1-propanolu i kwasu solnego jako bodźców uwarunkowanych i bezwarunkowych, odpowiednio, w celu utworzenia awersyjnej pamięci asocjacyjnej.

Awersyjne uczenie się asocjacyjne i tworzenie pamięci poprzez połączenie dwóch substancji chemicznych w Caenorhabditis elegans

Tu przedstawiamy protokół do testowania uczenia się skojarzeniowego poprzez przeprowadzenie klasycznego uwarunkowywania u organizmu modelowego C. elegans. Paradygmat opiera się na łączeniu stężenia soli w środowisku z obecnością lub brakiem pokarmu, co zmienia ich chemotaksję w kierunku soli lub w jej kierunku przeciwnym.

Ocena uczenia się asocjacyjnego w chemotaksji nicienia Caenorhabditis elegans

Ten protokół ustanawia metody ekstrakcji i ilościowego określania reakcji na lotny feromon płciowy w C. elegans, zapewniając narzędzia do badania komunikacji chemicznej i trajektorii nawigacji.

Lotna ekstrakcja feromonów płciowych i test chemoatrakcji w Caenorhabditis elegans

Istotną przeszkodą w badaniu aktywności komórkowej podczas procesów poznawczych, takich jak uczenie się i pamięć, jest stosowanie środków znieczulających do przygotowania obrazowania in vivo. Znieczulenie upośledza pamięć krótkotrwałą i funkcje poznawcze w wielu modelach, w tym u Drosophila. W pracy przedstawiono unikalną metodę przygotowania dorosłej Drosophila do obrazowania in vivo bez znieczulenia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie aktywności neuronalnej u nieznieczulonych dorosłych much Drosophila

Poznaj molekularny odczyt długoterminowej adaptacji węchowej u C. elegans przy użyciu GFP::EGL-4 w neuronach AWC. Ta metoda umożliwia szybką ocenę stanu adaptacji i badanie plastyczności sensorycznej.

Molekularny odczyt długoterminowej adaptacji węchowej u C. elegans

Przeglądaj więcej filmów