Name: Analiza obrazowa interakcji neuron-glej w systemie kohodowli neuronów i gleju opartym na platformie hodowli mikroprzepływowej (MCP) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Poznaj metodę kohodowli neuronów i gleju na platformie mikroprzepływowej do analizy interakcji akson-astrocyt. Technika umożliwia wysokorozdzielcze obrazowanie mechanizmów sygnałowych w układzie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować dr. Jeffrey’emu Rothsteinowi za udostępnienie myszy BAC GLT1 eGFP oraz przeciwciała GLT1; Tufts Center for Neuroscience Research (NIH P30 NS047243; PI, Rob Jackson) za udostępnienie cennych zapleczy badawczych; a także za grant na rekrutację nowej kadry naukowców (NIH P30 5P30NS069254-02; PI, Phil Haydon) w Departamencie Neurobiologii na Uniwersytecie Tufts.

1. Montaż mikrofluidycznej komory hodowlanej (MCP)
<ol>
 <li>MCP (Rysunek 1) to otwarte komory zaprojektowane do przedzielonych kultur różnych typów komórek 4. Zazwyczaj posiadają one dwie komory połączone kanałami centralnymi (o średnicy 3 μm). Do przygotowania kultur i późniejszej analizy obrazowej niezbędny jest montaż MCP z szalkami z dna szklanego.</li>
 <li>Najpierw sterylne szalki z dna szklanego powleka się poliornityną (Sigma-Aldrich, 1 mg/ml) rozpuszczoną w tetraboranie sodu (Sigma-Aldrich, 10 mM pH 8.5), a następnie inkubuje przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
 <li>Następnego dnia powleczone szalki z dna szklanego przemywa się trzykrotnie wodą ddH2O i suszy pod sterylną dygestorem. Następnie szalki z dna szklanego powleka się lamininą (Sigma-Aldrich, 1 mg/ml) i suszy pod światłem UV przez 1 godzinę. Powleczone szalki są gotowe do użycia lub mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu wykorzystania. Powłoki te są niezbędne do wysiewania neuronów i astrocytów w ko-kulturze.</li>
 <li>Aby zmontować platformę hodowlaną, mikrofluidyczne platformy hodowlane umieszcza się na wierzchu powleczonych szalek z dna szklanego, tak aby centralne kanały łączące znajdujące się po ich dolnej stronie tworzyły szczelne połączenie. Do zmontowanego MCP dodaje się standardowe pożywki do hodowli neuronów lub astrocytów (przez obszary wysiewu komórek) po obu stronach (Rysunek 1) i inkubuje przez 2-4 godziny w temperaturze 37 °C, aby upewnić się, że nie ma wycieków między MCP a szalką z dna szklanego. Przed wysianiem komórek przeprowadziliśmy test z pożywką, aby wykluczyć nieszczelności. Zmontowany na szalce z dna szklanego układ MCP powinien być przygotowany bezpośrednio przed użyciem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie hodowli neuronalnej i indukcja aksonów neuronalnych w zmontowanym MCP
<ol>
 <li>Kultury neuronalne kory mózgu przygotowano na świeżo z mózgów embrionalnych myszy w wieku 14-16 dni. Pożywka do hodowli neuronów składa się z pożywki Neurobasal, 2% suplementu Neurobasal B27, 2 mM glutaminy (poprzez dodanie 1% 100x GlutaMAX) oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Po wypreparowaniu mózgu myszy, pod mikroskopem stereoskopowym usunięto oponi mózgowe z kory. Następnie tkankę posiekano żyletką na małe fragmenty, aby zwiększyć powierzchnię wystawioną na działanie trypsyny. Fragmenty tkanki poddano trypsynizacji (Sigma-Aldrich, 0,05% trypsyny) przez 10 min w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, a następnie delikatnie rozdzielono poprzez tryturację za pomocą wypalanej pipety Pasteura. Rozdzielone komórki przefiltrowano przez sito 70 μm w celu uzyskania klarownej zawiesiny komórek neuronalnych.</li>
 <li>Neurony (2-3 x 106/ml, 150 μl) wysiano na obszary wysiewu komórek po prawej stronie (Rysunek 1) złożonej platformy MCP, tak aby neurony mogły przytwierdzić się w obszarze retencji komórek (Rysunek 1). Świeżo przygotowane neurony wysiano w pożywce do wysiewu neuronów, która jest regularną pożywką do hodowli neuronów uzupełnioną o 5% płodowej surowicy bydlęcej (Hyclone). Ponieważ tylko neurony przytwierdzone w obszarze retencji komórek są w stanie rozwinąć aksony na drugą stronę złożonej platformy MCP poprzez kanały centralne, ważne jest wysianie neuronów o wysokiej gęstości w obszarze wysiewu, aby zapewnić przytwierdzenie odpowiedniej liczby neuronów do obszaru retencji komórek. Reprezentatywny obraz wysokiej gęstości aksonów neuronalnych przedstawiono na Rysunku 2A.</li>
 <li>Następnego dnia pożywkę do wysiewu neuronów zastąpiono regularną pożywką do hodowli neuronów. Wymianę pożywki przeprowadzono poprzez ostrożne odessanie pożywki z obszaru wysiewu komórek w komorze, z pominięciem obszaru retencji komórek złożonej platformy MCP, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza w obszarze retencji oraz w centralnych kanałach łączących. Pęcherzyki powietrza mogą silnie hamować wzrost aksonów i ich późniejsze wnikanie do kanałów centralnych w MCP. Tego samego dnia po drugiej (lewej) stronie komory dodano również czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego (GDNF, 10-20 ng/ml), aby ułatwić indukcję wzrostu aksonów5 ze strony neuronalnej i ich przejście przez kanały centralne złożonej platformy MCP (Rysunek 2A). Obserwuje się również znaczną ilość spontanicznego wzrostu neurytów bez dodatku GDNF ze strony neuronalnej i ich przejście przez kanały centralne złożonej platformy MCP. Aksony wnikające do kanału centralnego obserwuje się często 2-3 dni po wysianiu. Po wniknięciu do kanału centralnego, aksony zazwyczaj docierają na drugą stronę w ciągu jednego dnia. Aksony pozostają zazwyczaj nienaruszone przez co najmniej tydzień po dotarciu na drugą stronę.</li>
</ol>
3. Dodanie hodowanych astrocytów do MCP w celu ustanowienia przedzielonego systemu kokultury
Pierwotne kultury astrocytów przygotowano z mózgu myszy w wieku P1-3. Procedura dysocjacji mózgu jest podobna do opisanej powyżej procedury izolacji komórek neuronalnych. Astrocyty wysiano początkowo do szalek 10 cm, które uprzednio pokryto poliornityną (Sigma-Aldrich, 1 mg/ml). Pożywkę do hodowli astrocytów (DMEM, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny-streptomycyny) zmieniano codziennie przez kolejne dwa dni w celu usunięcia zanieczyszczeń. Następnie pożywkę zmieniano co trzy dni.
<ol>
 <li>Astrocyty osiągają 90% konfluencji i tworzą monowarstwę po 7 dniach. Konfluentne astrocyty poddano trypsynizacji, a następnie 150 μl resuspenderowanych astrocytów (1x106 /ml) wysiano ponownie do obszaru wysiewu komórek po lewej stronie zmontowanego MCP, w momencie gdy aksony miały wejść lub właśnie weszły do lewej strony zmontowanego MCP. Astrocyty wysiewano zazwyczaj 4-5 dni po wysianiu neuronów. Przed ponownym wysianiem astrocytów do lewej strony MCP usunięto GDNF. Ponownie wysiane astrocyty przytwierdziły się w obszarze retencji komórek, co wykazano za pomocą immunobarwienia GFAP (Rycina 1). W MCP stwierdzono jedynie minimalny przepływ medium między obiema stronami komór (wyznaczony za pomocą barwników fluorescencyjnych), co wykazano wcześniej4,6.</li>
 <li>Astrocyty osiągają 90% konfluencji i tworzą monowarstwę po 7 dniach. Konfluentne astrocyty poddano trypsynizacji, a następnie 150 μl resuspenderowanych astrocytów (1 x 106 / ml) wysiano ponownie do obszaru wysiewu komórek po lewej stronie zmontowanego MCP, w momencie gdy aksony miały wejść lub właśnie weszły do lewej strony zmontowanego MCP. Astrocyty wysiewano zazwyczaj 4-5 dni po wysianiu neuronów. Przed ponownym wysianiem astrocytów do lewej strony MCP usunięto GDNF. Ponownie wysiane astrocyty przytwierdziły się w obszarze retencji komórek, co wykazano za pomocą immunobarwienia GFAP (Rycina 1). W MCP stwierdzono jedynie minimalny przepływ medium między obiema stronami komór (wyznaczony za pomocą barwników fluorescencyjnych), co wykazano wcześniej4,6.</li>
 <li>Po ponownym wysianiu astrocytów aksony, które weszły do lewej strony zmontowanego MCP, wchodzą w bezpośrednią interakcję z astrocytami poprzez bezpośredni kontakt aksonalny lub uwalnianie czynników rozpuszczalnych. Aby zwizualizować interakcję między aksonami a astrocytami, przeprowadzono immunobarwienie astroglialnego transportera glutaminianu błony plazmatycznej GLT1 oraz neuronalnej βIII-tubuliny, jak pokazano na Rycini 2D-F.</li>
</ol>

<ol><li>Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-astrocyte+signaling+in+the+development+and+plasticity+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Signals%22%5BJournal%5D)">Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits.</a> Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).</li>
<li>Paixao, S., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-astrocyte+communication+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity.</a> Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).</li>
<li>Fields, R. D., Stevens-Graham, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+neuron-glia+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New insights into neuron-glia communication.</a> Science. 298, 556-562 (2002).</li>
<li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature. 1, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuromuscular+synapse+development+by+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+and+neurturin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).</li>
<li>Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+regulation+of+astroglial+excitatory+neurotransmitter+transporter+GLT1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1.</a> Neuron. 61, 880-894 (2009).</li>
<li>Regan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+promoter+activity+reveal+a+differential+expression+and+physiology+of+glutamate+transporters+by+glia+in+the+developing+and+mature+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS.</a> The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).</li>
<li>Swanson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regulation+of+glutamate+transporter+subtype+expression+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal regulation of glutamate transporter subtype expression in astrocytes.</a> The Journal of neuroscience. 17, 932-940 (1997).</li>
<li>Schlag, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+glial+Na%2B-dependent+glutamate+transporters+by+cyclic+AMP+analogs+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons.</a> Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+culture+system+that+supports+adult+microglial+cell+proliferation+and+maintenance+in+the+resting+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state.</a> Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).</li>
<li>Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+system+for+rodent+and+human+oligodendrocyte+specification%2C+lineage+progression%2C+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+stem+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation.</a> Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60, 430-440 (2008).</li>
<li>Debanne, D., Rama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+shape+axonal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science+signaling%22%5BJournal%5D)">Astrocytes shape axonal signaling.</a> Science signaling. 4, pe11(2011).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

System kokultury neuronów i astrocytów oparty na MCP umożliwia szczegółową analizę szlaków sygnalizacyjnych między neuronami a astroglia, pozwalając na przejście przez kanały centralne wyłącznie aksonom i ich oddziaływanie z komórkami astroglialnymi. Ten system kokultury można łatwo przygotować, stosując konwencjonalne procedury hodowli neuronów i astrocytów. Opisaliśmy również praktyczne zastosowanie tego systemu kokultury poprzez użycie reportera opartego na eGFP do wykazania zależnej od aksonów aktywacji promotora GLT...

<table><tbody><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>do wysiewania neuronów do pożywki do hodowli neuronów</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>do pożywki do hodowli astrocytów</td></tr><tr><td>czynnik nerwowy pochodzenia glejowego</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>212-GD</td><td>Nanieść 10-20 ng/ml na stronę komory z neuronami</td></tr><tr><td>pożywka Dulbecco modified Eagle medium z wysoką zawartością glukozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>sitko do komórek 70 mm</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna szalka z szklanym dnem</td><td>MatTek Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrofluidyczne platformy hodowlane</td><td>Xona Microfluidics LLC</td><td>SND150</td><td></td></tr><tr><td>6 studzienek płytki hodowlanej</td><td>Cellstar</td><td>657 160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Pożywka do hodowli neuronów&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;ul&gt; &lt;li&gt;pożywka Neurobasal&lt;/li&gt; &lt;li&gt;2% suplement B27 do pożywki Neurobasal&lt;/li&gt; &lt;li&gt;2 mM glutaminianu poprzez dodanie 1% 100x GlutaMAX&lt;/li&gt; &lt;li&gt;1% penicylina-streptomycyna&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt; </td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE, przełożę go na język polski zgodnie z Pana/Pani wytycznymi, zachowując rygor akademicki, precyzję terminologiczną oraz naturalny styl protokołów badawczych.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Pożywka do hodowli neuronów do wysiewu komórek&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;µl&gt; &lt;li&gt;pożywka Neurobasal&lt;/li&gt; &lt;li&gt;2% dodatek B27 do pożywki Neurobasal&lt;/li&gt; &lt;li&gt;2 mM glutaminianu poprzez dodanie 1% 100x GlutaMAX&lt;/li&gt; &lt;li&gt;1% penicylina-streptomycyna&lt;/li&gt; &lt;li&gt;5% płodowa surowica bydlęca SH30070.03&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt; </td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p class=&quot;Proszę przesłać tekst źródłowy do tłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy do przełożenia materiałów na język polski, zachowując akademicki rejestr, precyzję terminologiczną oraz standardy publikacji naukowych.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Pożywka do hodowli astrocytów&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;ul&gt; &lt;li&gt;podłoże Eagle'a modyfikowane przez Dulbecco z wysoką zawartością glukozy&lt;/li&gt; &lt;li&gt;10% płodowa surowica bydlęca F4135&lt;/li&gt; &lt;li&gt;1% penicylina-streptomycyna&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt; </td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p class=&quot;Proszę o przesłanie tekstu źródłowego do przetłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy do przygotowania wiernego, precyzyjnego przekładu na język polski, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi rejestru akademickiego i terminologii specjalistycznej.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Tabela 1. &lt;/strong&gt; Materiały wykorzystane w systemie kokultury aksonów neuronalnych i gleju opartym na mikrofluidycznej platformie hodowlanej.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

analiza obrazowa oddziaływań neuronów z glejem w systemie kokultury aksonów neuronowych i gleju opartym na mikrofluidycznej platformie hodowlanej (mcp)

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Właściwa interakcja między neuronami a glejem jest kluczowa dla funkcji fizjologicznych ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Ta dwukierunkowa komunikacja jest w złożony sposób mediowana przez specyficzne szlaki sygnalizacyjne między neuronami a glejem1,2. Identyfikacja i charakterystyka tych szlaków sygnalizacyjnych są niezbędne do zrozumienia, w jaki sposób interakcja neuron-glej kształtuje fizjologię OUN. Wcześniej do testowania i charakterystyki szlaków sygnalizacyjnych między neuronami a glejem powszechnie wykorzystywano mieszane hodowle neuronów i gleju. To, czego dowiedzieliśmy się z tych preparatów oraz innych narzędzi in vivo, sugeruje jednak, że wzajemna sygnalizacja między neuronami a glejem często zachodzi w konkretnych przedziałach neuronów (i.e., aksonie, dendrycie lub somie)3. Dlatego ważne jest opracowanie nowego systemu hodowli, który pozwala na oddzielenie przedziałów neuronalnych i umożliwia specyficzne badanie interakcji między glejem a aksonami/dendrytami neuronalnymi. Ponadto konwencjonalny system hodowli mieszanych nie pozwala na rozróżnienie czynników rozpuszczalnych od sygnałów bezpośredniego kontaktu błonowego między neuronem a glejem. Co więcej, duża liczba neuronów i komórek glejowych w konwencjonalnym systemie kokultury nie zapewnia rozdzielczości niezbędnej do obserwacji interakcji między pojedynczym aksonem a komórką glejową.
	W niniejszym badaniu opisujemy nowatorski system kokultury aksonów i gleju z wykorzystaniem mikrofluidycznej platformy hodowlanej (MCP). W tym systemie kokultury neurony i komórki glejowe są hodowane w dwóch oddzielnych komorach połączonych za pomocą wielu kanałów centralnych. W tej mikrofluidycznej platformie hodowlanej tylko wypustki neuronalne (w szczególności aksony) mogą przedostać się na stronę glejową poprzez kanały centralne. W połączeniu z wydajnym znakowaniem białkami fluorescencyjnymi system ten umożliwia bezpośrednie badanie szlaków sygnalizacyjnych w interakcjach aksonalno-dendrytycznych i glejowych, takich jak regulacja transkrypcyjna w gleju pośredniczona przez aksony, transport receptorów w zakończeniach neuronalnych pośredniczony przez glej oraz wzrost aksonów pośredniczony przez glej. Wąska średnica komory znacząco ogranicza również przepływ medium wzbogaconego w neurony do komory glejowej, co ułatwia badanie bezpośrednich oddziaływań białek błonowych między aksonami/dendrytami a powierzchniami glejowymi.

Analiza obrazowania time-lapse aktywacji promotora GLT1 indukowanej przez aksony w astrocytach
Przegrodowy system kokultury neuronów i astrocytów umożliwia selektywną interakcję jedynie wypustek neuronalnych, w szczególności aksonów, z astrocytami. Po pomyślnym ustanowieniu kokultury aksonów i astrocytów (lub innych komórek glejowych) w zmontowanym MCP można badać różne rodzaje oddziaływań aksonowo-glejowych, takie jak: indukowana przez aksony aktywacja promotora genu w astrogleju, indukowane prz...

Niniejsze badanie opisuje procedury tworzenia nowatorskiej platformy do kokultury aksonów neuronalnych i (astro)gleju. W tym systemie kokultury możliwa staje się manipulacja bezpośrednią interakcją między pojedynczym aksonem (i pojedynczą komórką glejową), co pozwala na analizę mechanistyczną wzajemnego sygnalizowania między neuronem a glejem.

Analiza obrazowa oddziaływań neuronów z glejem w systemie kokultury aksonów neuronowych i gleju opartym na mikrofluidycznej platformie hodowlanej (MCP)

Prawidłowe oddziaływania między neuronami a glejem są kluczowe dla fizjologicznego funkcjonowania ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Ta dwukierunkowa komunikacja jest ...

Niniejszy protokół wprowadza nowatorską platformę do kokultury aksonów neuronalnych i astroglei w celu analizy oddziaływań neuron-glej z wykorzystaniem obrazowania o wysokiej rozdzielczości. W pierwszej kolejności należy złożyć mikrofluidyczną komorę hodowlaną, przygotować kultury neuronalne i pobudzić aksony neuronalne do przejścia na drugą stronę MCP. Następnie należy dodać hodowlane astrocyty, aby ustanowić skompartmentowany system kokultury; uzyskane wyniki, w tym obrazowanie time-lapse z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej, mogą pomóc w zrozumieniu oddziaływań między aksonami, astrogleją a aksonami neuronalnymi.Pomysł na tę metodę pojawił się podczas próby oddzielenia wpływu wypustek neuronalnych od wydzielin neuronalnych na regulację GT. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą zazwyczaj mają trudności z indukowaniem wzrostu aksonów do innej części komory komórkowej. Wymaga to wysokiej gęstości zdrowych neuronów wysianych po stronie neuronalnej, przy czym neurony powinny znajdować się w pobliżu kanałów centralnych.Otwarte komory MCP są przeznaczone do hodowli przedzielonych różnych typów komórek; powłoki z poliuretanu i lamininy są niezbędne do wysiewu neuronów i astrocytów w kokulturze. Najpierw nanieś roztwór poliuretanu w stężeniu 1 mg/mL na sterylne szalki z szklanym dnem i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc. Przemyj pokryte szalki z szklanym dnem trzy razy wodą dwukrotnie destylowaną, a następnie umieść pod sterylnym dygestorium w celu osuszenia.Następnie pokryj szalkę lamininą w stężeniu 1 mg/ml i pozostaw do wyschnięcia pod światłem UV przez jedną godzinę. Montaż MCP na szalce z szklanym dnem należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Ustaw platformę do hodowli mikroprzepływowej tak, aby centralne kanały łączące znajdowały się na jej spodniej stronie, a następnie szczelnie przylegaj ją do pokrytego szkła.Naczynia denne. Dodaj standardowe pożywki do hodowli neuronów lub astrocytów po obu stronach zmontowanego MCP. Inkubuj komorę przez dwie do czterech godzin w temperaturze 37 °C i sprawdź, czy nie występuje przeciek między MCP a szkłem.Dolna część naczynia. Hodowle komórek neuronów kory są świeżo przygotowywane z mózgów myszy w 14. do 16. dniu embrionalnego rozwoju. Po wycięciu mózgu myszy należy usunąć oponami mózgowymi z kory pod mikroskopem stereoskopowym.Za pomocą żyletki posiekaj tkankę na małe fragmenty, a następnie umieść je w probówce po wirowaniu. Odlej medium znad osadu i dodaj 0,05% trypsyny na 10 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Rozdziel komórki poprzez delikatne potrząsanie przy użyciu wypalanej pipety Pasteura.Przefiltruj próbkę przez sito o oczkach 70 µm, aby uzyskać klarowną zawiesinę komórek neuronalnych, wykorzystując medium do wysiewu neuronów uzupełnione o 5% FBS. Naniesie 150 µL neuronów na prawą stronę zmontowanej płytki MCP.Wysoka gęstość neuronów wynika z faktu, że tylko te komórki, które przytwierdzą się w obszarze retencji komórek, są w stanie rozwinąć aksony przez kanały centralne na drugą stronę zmontowanego MCP. Następnego dnia należy ostrożnie odessać medium z obszaru wysiewu komórek w komorze i zastąpić medium do wysiewu neuronów standardową pożywką do hodowli neuronów.Do pożywki po stronie astrocytów w komorze należy dodać 20 nanogramów na mililitr czynnika neurotroficznego pochodzenia glejowego (GDNF). Tworzy to gradient chemiczny, który pomoże indukować wzrost aksonów z poziomu neuronalnego przez kanały centralne zmontowanego MCP. Po dwóch dniach należy monitorować obecność aksonów wnikających do kanału centralnego.Po wejściu aksonów do kanału centralnego, zazwyczaj docierają one do przeciwległej strony w ciągu jednego dnia. Aksony pozostają zazwyczaj nienaruszone przez co najmniej jeden tydzień po dotarciu na drugą stronę. Po dysocjacji mózgu myszy w wieku od P1 do P3, zasiano astrocyty do 10 centymetrowych naczyń pokrytych poliuretanem.Kulturować komórki przez noc, codziennie uzupełniając pożywkę do hodowli astrocytów przez kolejne dwa dni, a następnie raz na trzy dni. Po siedmiu dniach, gdy astrocyty utworzą warstwę jednowarstwową o 90% konfluencji, zebrać komórki za pomocą trypsyny. Około pięć dni po wysianiu neuronów odessać GDNF. Następnie nanieść 150 µL resuspendowanych astrocytów na lewą stronę zmontowanego MCP. W momencie, gdy aksony zaczynają wnikać lub właśnie wniknęły po ponownym wysianiu astrocytów, aksony, które weszły na lewą stronę zmontowanego MCP, wchodzą w bezpośrednią interakcję z astrocytami, albo poprzez bezpośredni kontakt aksonalny, albo poprzez uwalnianie czynników rozpuszczalnych.Monitoruj astrocyty pod kątem przylegania do obszaru retencji komórek. Przeprowadź immunobarwienie komórek w przedzielonym systemie kokultury, aby zwizualizować specyficzne białka, takie jak te zaangażowane w interakcje między aksonami a astrocytami. Przedzielony system kokultury neuronów i astrocytów pozwala na selektywną interakcję astrocytów wyłącznie z wypustkami neuronalnymi, w szczególności z aksonami.W niniejszym opracowaniu opisujemy indukowaną przez aksony aktywację transkrypcyjną transportera glutaminianu astrogleju. Badania te wykorzystują myszy transgeniczne, u których ekspresja fluorescencyjnego reportera EGF znajduje się pod kontrolą promotora genomowego GT1. Wysoka gęstość neuronów jest hodowana w obszarze retencji komórek zmontowanego MCPA; powiększony widok pokazuje aksony przecinające kanały centralne i wnikające na drugą stronę, przy czym barwienie beta III tubuliną ujawnia stożek wzrostu aksonu.System MCP umożliwia monitorowanie pęczków aksonów podczas ich wzrostu przez kanał centralny i przechodzenia na drugą stronę. Barwienie immunohistochemiczne na GLT-1 identyfikuje astrocyty w części glialnej systemu MCP. Obraz przedstawia kontakt pomiędzy aksonami a astrocytami wykazującymi pozytywną ekspresję GLT-1.Ekspresja reportera EGFP koreluje z aktywacją endogennego promotora GT one, ekspresją białka oraz aktywnością funkcjonalną. Ocena aktywności promotora GT one w pojedynczych astrocytach w C two wykazuje znacząco zwiększoną immunoreaktywność GLT one w przedzielonym systemie kokultury. Co istotne, system MCP umożliwia obrazowanie time-lapse w celu monitorowania zmian dynamicznych.Na przykład dane te wykazują aktywację promotora GT1 indukowaną przez aksony w obecności astrocytów z transgenem GT1 EGFP i neuronów typu dzikiego dzień po wysianiu astrocytów. Obserwowana jest minimalna fluorescencja EGFP. Intensywność EGFP wzrasta znacząco 48 godzin po rozpoczęciu kokultury, gdy aksony głęboko wnikają w obszar astrocytów i wchodzą z nimi w bezpośredni kontakt.Leczenie kininą po neuronalnej stronie zmontowanego MCP wywołało śmierć komórek neuronalnych. Co ciekawe, stymulowało ono również retrakcję i degenerację aksonów, a także spadek fluorescencji EGFP w aksonach. Te dynamiczne zmiany intensywności fluorescencji EGFP w aksonach wyraźnie wykazały, że aktywność promotora Astroglia GT 1 jest modulowana przez interakcję aksonalną.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak ustanowić system hodowli rdzeniowej przy użyciu mikrofluidycznej platformy hodowlanej; po opanowaniu techniki ta może być prawidłowo wykonywana w ciągu kilku dni.

imaging-analysis-neuron-to-glia-interaction-microfluidic-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Analiza obrazów interakcji neuron-glia w układzie współkultury aksonów neuronów i glia na platformie kultur mikrofluidycznych (MCP)

Niniejszy film opisuje wytwarzanie i zastosowanie urządzenia mikroprzepływowego do hodowli neuronów ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Urządzenie to jest kompatybilne z...

BioMEMS: nawiązywanie nowych współprac pomiędzy biologami a inżynierami

Niniejszy artykuł opisuje nowy protokół oraz zestaw odczynników opracowanych do czułego pomiaru efektów neurotoksyczności związków i metod leczenia w kokulturach neuronów i astrocytów z wykorzystaniem analizy wysokotreściowej (high content analysis). Wyniki wskazują, że analiza wysokotreściowa stanowi obiecującą, nową technologię w ocenie neurotoksyczności.

Test kokultury neuronów i astrocytów do wysokoprzepustowej analizy treści (high content analysis) w badaniach neurotoksyczności

Opracowaliśmy nowatorską wielokomorową platformę mikrosystemową do kokultury neuronów, przeznaczoną do badań nad oddziaływaniami aksonów i gleju w OUN in vitro. Platforma ta umożliwia prowadzenie do sześciu niezależnych eksperymentów równolegle i została wykonana przy użyciu nowo opracowanej hybrydowej metody fabrykacji makro/mikro.

Wielokomorowa mikrofluidyczna platforma do kokultury neuronów i gleju ośrodkowego układu nerwowego

Ten film demonstruje ocenę aktywności elektrycznej neuronów w kokulturze pochodzących z hiPSC korowych neuronów glutaminergicznego i komórek glejaka przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego z układami wieloelektrodowymi.

Ocena interakcji neuronów glutaminergicznego i komórek glejaka w kokulturze

Ten protokół opisuje pośrednią kokulturę neuron-astrocyt do analizy interakcji neuron-glej.

Test pośredniej kokultury neuron-astrocyty: zestaw in vitro do szczegółowego badania interakcji neuron-glej

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak połączyć układy mikroelektrod in vitro z urządzeniami mikroprzepływowymi do badania transmisji potencjału czynnościowego w kulturach neuronalnych. Analiza danych, a mianowicie wykrywanie i charakteryzacja rozchodzących się potencjałów czynnościowych, odbywa się za pomocą nowego, zaawansowanego, a jednocześnie przyjaznego dla użytkownika i ogólnodostępnego narzędzia obliczeniowego.

Łączenie mikrofluidyki z układami mikroelektrod do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnałów aksonalnych

Tutaj prezentujemy proste podejście wykorzystujące specyficzne podłoża hodowlane, które pozwala na tworzenie kultur wzbogaconych o neurony i astrocyty, lub kultur gleju neuronów z kory embrionalnej, o wysokiej wydajności i odtwarzalności.

Model hodowli komórkowej do badania roli interakcji neuron-glej w niedokrwieniu

Ostatnie prace odkrywają wpływ neuronów na komórki glejaka dziecięcego (pHGG) wysokiego stopnia i ich wzajemne interakcje. Niniejsza praca pokazuje rozwój modelu in vitro kokulturującego komórki pHGG i neurony glutaminergiczne oraz rejestrującego ich interakcje elektrofizjologiczne w celu naśladowania tych interakcji.

Wspólna hodowla neuronów glutaminergicznego i pediatrycznych komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości w urządzeniach mikroprzepływowych w celu oceny interakcji elektrycznych

Ten protokół opisuje kokulturę mikrogleju i neuronów utworzoną z pierwotnych komórek nerwowych wyizolowanych z embrionalnych zarodków myszy w 15-16 dniach embrionalnych oraz pierwotnego mikrogleju generowanego z mózgów nowonarodzonych myszy w 1-2 dniach po urodzeniu.

Generowanie i kokultura mysich pierwotnych mikrogleju i neuronów korowych

Protokół ten opisuje system mikroprzepływowy modelujący dynamikę metaboliczną neuronów po uszkodzeniu aksonalnym, umożliwiając obrazowanie, analizę multiomiczną i mechanistyczne badania wewnętrznej przebudowy metabolicznej.

Chip mikroprzepływowy do budowy modeli uszkodzeń aksonalnych i umożliwiający analizę multiomiczną

Poznaj metodę kohodowli neuronów i gleju na platformie mikroprzepływowej do analizy interakcji akson-astrocyt. Technika umożliwia wysokorozdzielcze obrazowanie mechanizmów sygnałowych w układzie nerwowym.

Analiza obrazowa interakcji neuron-glej w systemie kohodowli neuronów i gleju opartym na platformie hodowli mikroprzepływowej (MCP) (Wideo) | JoVE Journal

Analiza obrazowa oddziaływań neuronów z glejem w systemie kokultury aksonów neuronowych i gleju opartym na mikrofluidycznej platformie hodowlanej (MCP)

Przeglądaj więcej filmów