Analiza obrazowa interakcji neuronów z glejem w systemie kokultury aksonów neuronalnych i gleju opartym na mikrofluidycznej platformie hodowlanej (MCP)

Niniejszy protokół wprowadza nową platformę do kokultury aksonów neuronalnych i astroglei, służącą do analizy oddziaływań neuronów z glejem z wykorzystaniem obrazowania o wysokiej rozdzielczości. W pierwszej kolejności należy zmontować mikrofluidyczną komorę hodowlaną, przygotować kultury neuronalne i doprowadzić do wzrostu aksonów neuronalnych do przeciwległej strony MCP. Następnie należy dodać hodowlane astrocyty w celu utworzenia skompartmentalizowanego systemu kokultury; uzyskane wyniki, w tym obrazowanie time-lapse z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej, mogą pomóc w zrozumieniu interakcji między aksonami, astrogleją i aksonami neuronalnymi.

Pomysł na tę metodę pojawił się początkowo podczas próby rozdzielenia wpływu wypustek neuronalnych od wydzielin neuronalnych na regulację GT1. Osoby początkującej w tej metodzie zazwyczaj mają trudności z indukowaniem wzrostu aksonów do innych części przedziału komórkowego. Wymaga to wysokiej gęstości zdrowych neuronów wysianych po stronie neuronalnej, przy czym neurony powinny znajdować się blisko kanałów centralnych.

Otwarte komory MCP zostały zaprojektowane do hodowli przedzielonych różnych typów komórek; powłoki z poliuretanu i lamininy są niezbędne do wysiewu neuronów i astrocytów w ko-kulturze. Najpierw nanieś roztwór poliuretanu w stężeniu 1 mg/mL na sterylne szalki z szklanym dnem i inkubuj w temperaturze 37°C przez noc. Przemyj pokryte szalki z szklanym dnem trzy razy wodą dwukrotnie destylowaną, a następnie umieść pod sterylnym dygestorium w celu wysuszenia.

Następnie pokryj szalkę lamininą w stężeniu 1 mg/mL i wysusz pod światłem UV przez jedną godzinę. Zespół MCP na szalce z szklanym dnem powinien zostać przygotowany bezpośrednio przed użyciem. Ustaw platformę do hodowli mikroprzepływowej tak, aby centralne kanały łączące znajdowały się od strony dolnej, a następnie szczelnie przylegaj ją do pokrytego szkła.

Szalki dna. Dodać standardowe pożywki do hodowli neuronów lub astrocytów po obu stronach zmontowanej MCP. Inkubować komorę przez dwie do czterech godzin w temperaturze 37 °C i sprawdzić, czy nie występują przecieki między MCP a szkłem.

Dolna część naczynia. Kultury neuronów korowych są świeżo przygotowywane z mózgów zarodkowych myszy w wieku od 14 do 16 dni. Po wycięciu mózgu myszy należy usunąć oponu mózgowe z kory pod mikroskopem stereoskopowym.

Za pomocą żyletek posiekaj tkankę na małe fragmenty, a następnie umieść je w probówce po wirowaniu. Odlej pożywkę znajdującą się nad osadem, dodaj 0,05% Trypsyny i inkubuj przez 10 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37°C. Rozdziel komórki poprzez delikatne pipetowanie przy użyciu wypalanej pipety Pasteura.

Przesącz próbkę przez sitko o oczkach 70 µm, aby uzyskać klarowną zawiesinę komórek neuronalnych, wykorzystując pożywkę do wysiewu neuronów uzupełnioną o 5% FBS. Wysiej 150 µl neuronów po prawej stronie zmontowanej płytki MCP.

Wysoka gęstość neuronów jest niezbędna, ponieważ tylko te neurony, które przyкрепią się w obszarze retencji komórek, są w stanie rozwinąć aksony przez kanały centralne na drugą stronę zmontowanego MCP. Następnego dnia ostrożnie odessaj medium z obszaru wysiewu komórek w komorze i zastąp medium do wysiewu neuronów standardową pożywką do hodowli neuronów.

Do strony astrocytycznej komory dodać do pożywki 20 ng/mL czynnika neurotroficznego pochodzenia glejowego (GDNF). Pozwoli to stworzyć gradient chemiczny, który wspomaga wzrost aksonów ze strony neuronalnej przez kanały centralne zmontowanego MCP. Po dwóch dniach należy sprawdzić, czy aksony wniknęły do kanału centralnego.

Po wejściu aksonów do kanału centralnego, zazwyczaj przedostają się one na drugą stronę w ciągu jednego dnia. Aksony pozostają zazwyczaj nienaruszone przez co najmniej jeden tydzień po dotarciu na drugą stronę. Po dysocjacji mózgu myszy w wieku od jednego do trzech dni, wysiewamy astrocyty do 10 centymetrowych naczyń powlekanych poliuretanem.

Kultywuj komórki przez noc, codziennie uzupełniając pożywkę do hodowli astrocytów przez kolejne dwa dni, a następnie raz na trzy dni. Po siedmiu dniach, gdy astrocyty utworzą monowarstwę o 90% konfluencji, zbierz komórki za pomocą trypsyny. Około pięciu dni po wysianiu neuronów odessaj GDNF. Następnie zasiać 150 µL resuspenderowanych astrocytów w lewej części zmontowanego MCP. Gdy aksony zaczynają wnikać lub właśnie wniknęły po ponownym wysianiu astrocytów, aksony, które wniknęły w lewą stronę zmontowanego MCP, oddziałują bezpośrednio z astrocytami poprzez bezpośredni kontakt aksonalny lub wydzielanie czynników rozpuszczalnych.

Monitoruj astrocyty pod kątem przylegania do obszaru retencji komórek. Przeprowadź immunobarwienie komórek w przedzielonym systemie kokultury, aby zwizualizować specyficzne białka, takie jak te zaangażowane w interakcję między aksonami a astrocytami. Przedzielony system kokultury neuronów i astrocytów umożliwia selektywną interakcję z astrocytami wyłącznie wypustkom neuronalnym, a w szczególności aksonom.

W niniejszej pracy opisujemy indukowaną przez aksony aktywację transkrypcyjną transportera glutaminianu astroglejowego. Badania te przeprowadzono z wykorzystaniem myszy transgenicznych, wykazujących ekspresję reportera fluorescencyjnego EGF pod kontrolą promotora genomowego GT1. Wysoka gęstość neuronów jest hodowana w obszarze retencji komórek zmontowanego MCPA; powiększony widok pokazuje aksony przecinające kanały centralne i wchodzące na drugą stronę, przy czym barwienie beta-III tubuliną ujawnia stożek wzrostu aksonu.

System MCP umożliwia monitorowanie pęczków aksonów podczas ich wzrostu przez kanał centralny i przechodzenia na drugą stronę. Barwienie immunocytochemiczne na GLT-1 identyfikuje astrocyty w części glejowej systemu MCP. Obraz przedstawia kontakt między aksonami a astrocytami wykazującymi pozytywną ekspresję GLT-1.

Ekspresja reportera EGFP koreluje z endogenną aktywacją promotora GT one, ekspresją białka oraz aktywnością funkcjonalną. Ocena aktywności promotora GT one w pojedynczych astrocytach w C two wykazuje znacząco zwiększoną immunoreaktywność GLT one w przedziałowym systemie współhodowli. Co istotne, system MCP umożliwia obrazowanie poklatkowe w celu monitorowania dynamicznych zmian.

Na przykład dane te wykazują aktywację promotora GT1 indukowaną przez aksony w przypadku astrocytów GT1 EGFP oraz neuronów typu dzikiego jeden dzień po wysianiu astrocytów. Obserwowana jest minimalna fluorescencja EGFP. Intensywność EGFP znacznie wzrasta 48 godzin po rozpoczęciu kokultury, gdy aksony głęboko wnikają w obszar astrocytów i wchodzą z nimi w bezpośredni kontakt.

Leczenie kininą po stronie neuronalnej zmontowanego MCP wywołało śmierć komórek neuronalnych. Co ciekawe, stymulowało ono również retrakcję i degenerację aksonów, a także spadek fluorescencji EGFP w aksonach. Te dynamiczne zmiany intensywności fluorescencji EGFP w aksonach wyraźnie wykazały, że aktywność promotora Astroglia GT 1 jest modulowana przez interakcję z aksonami.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób ustanowienia systemu hodowli rdzenia przy użyciu platformy hodowli mikroprzepływowej; po opanowaniu technika ta może być właściwie wykonywana w ciągu kilku dni.