Analiza obrazowa interakcji neuron-glej w systemie kohodowli neuronów i gleju opartym na platformie hodowli mikroprzepływowej (MCP)

Protokół ten ustanawia nowatorską platformę aksonów neuronalnych i wspólnej hodowli Astrogleju do analizy interakcji między neuronami a ggl przy użyciu obrazowania o wysokiej rozdzielczości. Najpierw zmontuj komorę hodowli mikroprzepływowej, przygotuj kultury neuronalne i spraw, aby aksony neuronów weszły na drugą stronę MCP. Następnie dodaj hodowane astrocyty, aby ustalić podzielony na przedziały system kohodowli, wyniki w tym obrazowanie poklatkowe za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej, które mogą pomóc w zrozumieniu interakcji między aksonami, astroglejami i aksonami neuronalnymi.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy próbowaliśmy oddzielić wpływ procesu neuronalnego i wydzielania neuronalnego na regulację GT one. Zazwyczaj osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, mają trudności z indukcją aksonu w innej części przedziału komórkowego. Wymaga dużej gęstości zdrowych neuronów pokrytych po stronie neuronalnej z neuronem posiewanym w pobliżu kanałów centralnych.

Otwarte komory MCP są przeznaczone do przedziałowych kultur różnych typów komórek, powłoki poliuretanowe i lamininowe są niezbędne do posiewu neuronów i astrocytów w kokulturze. Najpierw nałóż jeden miligram na mililitr roztworu poliuretanu na sterylne naczynia ze szklanym dnem i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Umyj naczynia z powlekanym szklanym dnem trzykrotnie podwójnie destylowaną wodą, a następnie umieść pod sterylnym wyciągiem do wyschnięcia.

Następnie pokryj naczynie jednym miligramem na mililitr, lamininą i susz w świetle UV przez godzinę. Montaż MCP na naczyniu ze szklanym dnem powinien być świeżo przygotowany przed użyciem. Umieść platformę do hodowli mikroprzepływowej z centralnymi kanałami łączącymi na jej spodzie i uformuj szczelne uszczelnienie z powlekanym szkłem.

Naczynia dolne. Dodaj zwykłe pożywki do hodowli neuronów lub astrocytów po obu stronach zmontowanego MCP. Inkubować komorę przez dwie do czterech godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i sprawdzić, czy nie ma wycieku między MCP a szkłem.

Danie dolne. Hodowle komórek neuronalnych Cortico są świeżo przygotowane z embrionalnych mózgów myszy w wieku od 14 do 16 dni. Po rozbiorze mózgu myszy usuń opony mózgowe z kory pod mikroskopem preparacyjnym

Użyj żyletki, aby zmielić tkankę na małe bloki tkanek i umieść bloki tkanki mielonej w probówce po odwirowaniu. Wyrzuć podłoże nad granulką i dodaj 0,05%Wypróbuj przez 10 minut i kąpiel wodną o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Oddziel komórki przez delikatne towanie za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety do makaronu.

Przepuść próbkę przez sitko o średnicy 70 mikronów, aby zebrać klarowną zawiesinę komórek neuronalnych za pomocą posiewu neuronów. Pożywka uzupełniona 5% nasionami FBS. 150 mikrolitrów neuronów po prawej stronie zmontowanej płytki MCP.

Duża gęstość neuronów, ponieważ tylko neurony, które przyczepiają się w obszarze retencji komórek, są w stanie wyhodować aksony przez kanały centralne po drugiej stronie zmontowanego MCP. Następnego dnia. Ostrożnie odessać pożywkę z obszaru posiewu komórek komory i zastąpić pożywkę pożywki neuronowej zwykłą hodowlą neuronów.

Pożywkę, dodaj 20 nanogramów na mililitr, neurotroficzny czynnik glejowy lub GDNF do astrocytowej strony komory. Tworzy to gradient chemiczny, który pomoże indukować rozrost aksonów od strony neuronalnej przez centralne kanały zmontowanego MCP. Dwa dni później obserwuj aksony, które wchodzą do kanału centralnego.

Gdy aksony wejdą do kanału centralnego, zwykle dostają się na drugą stronę w ciągu jednego dnia. Aksony są zwykle nienaruszone przez co najmniej tydzień po przedostaniu się na drugą stronę. I po dysocjacji mózgu od P jeden do trzech mysich zaciągnięć nasion astrocytów do pokrytych poliuretanem 10-centymetrowych szalek.

Hodowla, komórki przez noc uzupełniają pożywkę hodowlaną astrocytów codziennie przez następne dwa dni, a następnie raz na trzy dni po siedmiu dniach, kiedy astrocyty utworzyły 90% zlewane jednowarstwowe komórki zbierające za pomocą trypsyny Około pięć dni po posianiu neuronów odessać z GDNF. Następnie zasiaj 150 mikrolitrów zawieszonych astrocytów po lewej stronie zmontowanego MCP. Kiedy aksony mają wejść lub właśnie weszły po ponownym poszyciu astrocytów, aksony, które weszły po lewej stronie zmontowanego MCP, bezpośrednio oddziałują z astrocytami poprzez bezpośredni kontakt aksonalny lub uwolnienie rozpuszczalnych czynników.

Monitoruj astrocyty pod kątem przyczepienia się do obszaru retencji komórek. Barwienie immunologiczne komórek w przedziałowym systemie kohodowli w celu wizualizacji określonych białek, takich jak te biorące udział w interakcji między aksonami a astrocytami. Przedziałowy system kohodowli neuronów i astrocytów pozwala tylko procesom neuronalnym, zwłaszcza aksonom, na selektywną interakcję z astrocytami.

Tutaj opisujemy indukowaną aksonami aktywację transkrypcyjną transportera glutaminianu astrogleju. W badaniach tych wykorzystuje się myszy transgeniczne, które mają ekspresję reportera fluorescencji EGF pod kontrolą promotora genomu GT one. Duża gęstość neuronów jest hodowana w obszarze retencji komórek zmontowanego MCPA w powiększeniu, pokazującym, że aksony przechodzą przez kanały centralne i wchodzą na drugą stronę z barwieniem tubuliny beta trzy, odsłaniając stożek wzrostu aksonu.

System MCP umożliwia monitorowanie wiązek aksonów, gdy przechodzą one przez kanał centralny i przechodzą na drugą stronę. Pojawiło się barwienie immunologiczne dla GT one identyfikuje astrocyty po stronie glejowej systemu MCP. Obraz pokazuje tutaj kontakt między aksonami a astrocytami GLT one dodatnimi.

Ekspresja reportera EGFP koreluje z endogenną aktywacją promotora GT one, ekspresją białka i aktywnością funkcjonalną. Ocena aktywności promotora GT one w pojedynczych astrocytach w C 2 wykazuje znacznie zwiększoną immunoreaktywność GLT one w przedziałowym systemie kohodowli. Co ważne, system MCP pozwala na monitorowanie dynamicznych zmian na obrazach poklatkowych.

Na przykład dane te pokazują indukowaną aksonem aktywację promotora GT one z powrotem GT jeden astrocytów EGFP i neuronów typu dzikiego dzień po posiewie astrocytów. Obserwuje się minimalną fluorescencję EGFP. Intensywność EGFP znacznie wzrasta 48 godzin po wspólnej hodowli, gdy aksony znajdują się w pobliżu astrocytów i oddziałują w bezpośrednim kontakcie z astrocytami.

Leczenie kininami po stronie neuronalnej zmontowanego MCP indukowało śmierć komórek neuronalnych. Co ciekawe, stymulował również retrakcję i degenerację aksonów, a także spadek fluorescencji aksonalnej EGFP. Te dynamiczne zmiany intensywności fluorescencji EGFP w odpowiedzi na aksony wyraźnie pokazały, że aktywność jednego promotora Astroglia GT jest modulowana przez oddziaływanie aksonów.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustanowić podstawowy system hodowli za pomocą platformy hodowli mikroprzepływowej po opanowaniu, technika ta może być wykonana poprawnie w ciągu kilku dni.