Name: Badanie punktu kontrolnego uszkodzeń DNA przy użyciu ekstraktów z jaj Xenopus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Poznaj metodę badania punktu kontrolnego uszkodzeń DNA przy użyciu ekstraktów z jaj Xenopus. Technika ta pozwala analizować mechanizmy sygnalizacji kontrolnej i aktywacji kinazy ATR w modelu komórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca jest częściowo finansowana ze środków udostępnionych przez The University of North Carolina at Charlotte, funduszu Wachovia foundation fund for faculty excellence oraz grantu z NIGMS (R15GM101571).

1. Przygotowanie LSE
<ol>
 <li>Samice żab (Xenopus laevis) poddaje się dwóm iniekcjom w celu pobrania jaj. Pierwsza iniekcja (przygotowawcza) to 100 U PMSG (gonadotropiny z surowicy klaczy w ciąży) na jedną żabę. Przygotowanie żab musi nastąpić co najmniej dwa dni przed indukcją składania jaj; tak przygotowane żaby można wykorzystać przez okres do dwóch tygodni. W celu przygotowania żab wstrzyknąć PMSG podskórnie do grzbietowych worków limfatycznych, używając strzykawki 3 ml i igły 27 G.</li>
 <li>Aby indukować składanie jaj, wstrzyknąć 500 U hCG (ludzkiej gonadotropiny kosmórkowej) podskórnie do grzbietowych worków limfatycznych każdej przygotowanej żaby, używając igły 27 G. Inkubować wstrzyknięte żaby w oddzielnych wiadrach zawierających 2 litry 1x zmodyfikowanego roztworu Ringera Marca (MMR). Pozostawić żaby na 14-20 hr w celu złożenia jaj przed ich pobraniem.</li>
 <li>Wyjąć żaby z wiader i odlać roztwór MMR, aż pozostanie około 100 ml. Pobrać jaja z wiader, przenosząc je do zlewki o pojemności 250 ml.</li>
 <li>Usunąć otoczkę galaretowatą z jaj, dodając 100 ml 2% cysteiny (dostosować pH do 7,8 za pomocą 10 M KOH). Delikatnie mieszać jaja odwróconą szklaną pipetą Pasteura (o średnicy 0,7 cm) w odstępach około 30 s. Zlać roztwór i zastąpić go świeżą cysteiną dwukrotnie podczas inkubacji. Proces usuwania otoczki kończy się po około 5-15 min, gdy jaja tworzą bardziej kondensowaną warstwę na dnie zlewki.</li>
 <li>Wylać roztwór cysteiny i trzykrotnie przemyć jaja roztworem 0,25x MMR. Mieszać jaja w roztworze za pomocą szklanej pipety. Jaja „złe” rozpoznaje się poprzez zwykłą inspekcję wizualną; mają one „napuchnięty” biały wygląd. „Złe” jaja gromadzą się w centrum zlewki po wymieszaniu. Usunąć „złe” jaja pipetą Pasteura.</li>
 <li>Przemyć jaja buforem do lizy jaj (ELB) trzykrotnie. Usunąć wszelkie pozostałe „złe” jaja pipetą Pasteura. Przelać jaja do probówki Falcon 14 ml.</li>
 <li>Wirować probówkę Falcon przez 55 sec przy 188 x g (1 100 rpm) w wirówce stołowej CL2 IEC z rotorem z koszyczkami wahadłowymi, aby skondensować jaja. Usunąć nadmiar buforu znad warstwy jaj. Dodać 0,5 μl roztworu zapasowego Aprotininy/Leupeptyny oraz 0,5 μl roztworu zapasowego Cytochalazyny B na każdy 1 ml skondensowanych jaj.</li>
 <li>Centryfugować jaja przy 16 500 x g (10 000 rpm) przez 15 min w temperaturze 4 °C w wirówce superszybką Sorvall RC6 plus z rotorem wahadłowym HB6. Po wirowaniu jaja frakcjonują się w probówce na trzy warstwy (od góry do dołu): lipidową, ekstraktu oraz żółtka/pigmentu. Przebić ściankę probówki Falcon w dolnej części środkowej warstwy ekstraktu igłą 21 G. Ostrożnie wyciągnąć igłę, ponieważ może ona zostać zablokowana przez plastik. W miejsce nakłucia wprowadzić nową igłę 21 G połączoną ze strzykawką 1 ml, aby pobrać ekstrakt. Powoli aspirować ekstrakt do strzykawki, aby uniknąć pęcherzyków powietrza i zanieczyszczenia warstwami lipidową oraz żółtka/pigmentu.</li>
 <li>Przenieść ekstrakty do schłodzonej probówki do mikrocentryfugi 1,5 ml. Na każdy mililitr ekstraktu z jaj dodać następujące roztwory zapasowe do określonego stężenia końcowego (podanego w nawiasach): (1) 10 μl cykloheksymidu (100 μg/ml); (2) 1 μl Aprotininy/Leupeptyny (po 10 μg/ml każda); (3) 1 μl Cytochalazyny B (5 μg/ml); (4) 1 μl ditiotreitolu (1 mM); oraz (5) 0,33 μl nocodazolu (3 μg/ml). Delikatnie odwrócić ekstrakt z jaj co najmniej 10 razy. Jest to LSE, który musi być przygotowany na świeżo i zużyty w ciągu 4 hr. Jakość LSE ulega pogorszeniu po upływie 4 hr lub po cyklu zamrażania i rozmrażania.</li>
</ol>
2. Poddawanie chromatyny plemników działaniu metod uszkadzających DNA
<ol>
 <li>Przygotować prawidłową chromatynę plemnikową zgodnie z wcześniej opisaną metodą 13.</li>
 <li>Przygotować chromatynę plemnikową traktowaną MMS
 <ol>
 <li>Resuspender prawidłową chromatynę plemnikową w 0,5 ml Buforu X.</li>
 <li>Do 500 μl resuspenderowanej chromatyny dodać ~ 5,5 μl MMS (stok 9,1 M) do uzyskania stężenia końcowego 100 mM.</li>
 <li>Inkubować chromatynę plemnikową w probówce do mikrocentryfugi w temperaturze pokojowej przez 30 min przy stałym obracaniu.</li>
 <li>Wirować probówkę w mikrocentryfudze przy 686 x g (2 100 rpm) przez 10 min w temperaturze pokojowej, używając wirówki klinicznej IEC CL2 z rotorem z koszyczkami i adapterami do probówek.</li>
 <li>Odlać supernatant i resuspender osad w 0,5 ml Buforu X z dodatkiem BSA (3%), DTT (0,1 mM) oraz aprotyniny/leupeptyny (po 10 μg/ml każda).</li>
 <li>Powtórzyć kroki (4) i (5) dwukrotnie w celu przemycia chromatyny plemnikowej.</li>
 <li>Wyznaczyć stężenie chromatyny plemnikowej za pomocą hemocytometru i rozcieńczyć do 100 000 plemników/μl. Alikwoty 5 μl przechowywać w zamrażarce -80 °C do dalszego użycia.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przygotować chromatynę plemnikową traktowaną UV
 <ol>
 <li>Nanieść odpowiednią ilość (np. 10 μl) prawidłowej chromatyny plemnikowej na powierzchnię fragmentu Parafilmu.</li>
 <li>Umieścić Parafilm w urządzeniu do sieciowania UV. Ustawić żądany parametr energii, zależnie od eksperymentu, i rozpocząć naświetlanie chromatyny plemnikowej światłem UV. Przykładowo, osiągnięcie 1 000 J/m2 zajmuje około 21 s.</li>
 <li>Po naświetlaniu UV traktowaną chromatynę plemnikową należy niezwłocznie dodać do ekstraktów jajowych.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
3. Przygotowanie struktury naśladującej uszkodzenie DNA (AT70)
<ol>
 <li>Rozpuścić dwa syntetyczne oligonukleotydy poly-(dA)70 (oznaczony jako A70) oraz poly-(dT)70 (oznaczony jako T70) w wodzie do odpowiedniego stężenia 2 μg/μl.</li>
 <li>Do jednej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml dodać 100 μl A70 oraz 100 μl T70. Gotować zmieszany roztwór syntetycznych oligonukleotydów przez 5 min w temperaturze 95 °C w bloku grzewczym.</li>
 <li>Wyjąć blok grzejny (z probówką zawierającą mieszaninę AT) i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej na blacie laboratoryjnym. Dostosowanie temperatury trwa około 45-60 min.</li>
 <li>Ochłodzona mieszanina to AT70 o końcowym stężeniu 2 μg/μl. Alikwoty AT70 o objętości 10 μl przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C do dalszego wykorzystania.</li>
</ol>
4. Wywoływanie punktu kontrolnego uszkodzeń DNA w LSE za pomocą uszkodzonej chromatyny plemników lub struktury naśladującej uszkodzenie DNA
<ol>
 <li>Indukowanie punktu kontrolnego uszkodzeń DNA w LSE przy użyciu uszkodzonej chromatyny plemników
 <ol>
 <li>Do probówki mikroodwirowej o pojemności 1,5 ml dodać 50 μl LSE, a następnie uzupełnić o 1 μl Energy Mixture oraz 2 μl uszkodzonej chromatyny plemników (stężenie końcowe ~4,000 sperm/μl reakcji).</li>
 <li>Inkubować probówkę z reakcją w temperaturze pokojowej przez 90 min, lekko potrząsając probówką co 10 min.</li>
 <li>Po 30-minutowej inkubacji nanieść 1 μl mieszaniny reakcyjnej na szkiełko przedmiotowe uzupełnione o 1 μl roztworu barwnika jądrowego. Nałożyć szkiełko nakrywkowe na mieszaninę reakcyjną i sprawdzić formowanie się jąder za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Zazwyczaj po 30 min inkubacji tworzą się okrągłe jądra, co wskazuje na rozpoczęcie replikacji DNA.</li>
 <li>Przenieść 10 μl mieszaniny reakcyjnej do 90 μl buforu do próbek. Próbki analizuje się metodą immunoblottingu z użyciem przeciwciał anti-Chk1 P-S344 lub anti-Chk1.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Indukowanie punktu kontrolnego uszkodzeń DNA w LSE przy użyciu AT70
 <ol>
 <li>Do probówki mikroodwirowej o pojemności 1,5 ml dodać 50 μl LSE, uzupełnione o 1 μl Energy Mixture oraz 1,6 μl stoku Tautomycin.</li>
 <li>Do każdej reakcji dodać 1,25 μl przygotowanego wcześniej AT70 (2 μg/μl) lub wody (jako kontrolę negatywną). Inkubować reakcje w temperaturze pokojowej przez 90 min. Lekko potrząsać probówkami z reakcją co 10 min.</li>
 <li>Dodać 10 μl mieszaniny reakcyjnej do 90 μl buforu do próbek. Próbki bada się metodą immunoblottingu z użyciem przeciwciał anti-Chk1 P-S344 lub anti-Chk1.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Uszkodzona chromatyna plemników lub struktura naśladująca uszkodzenie DNA może aktywować punkt kontrolny uszkodzeń DNA zależny od ATR/Chk1 w systemie ekstraktu z komórek jajowych Xenopus. Rysunek 2A pokazuje, że MMS indukuje fosforylację Chk1 w pozycji Ser344 (Chk1 P-S344), co jest wskaźnikiem aktywacji kinazy ATR. Rysunek 2B pokazuje, że AT70, jako struktura naśladująca uszkodzenie DNA, również indukuje fosforylację Chk1. Próbki całkowitego białka Chk1 służą jako kontrole ładowania w obu przykładach.
<img alt="Schemat odpowiedzi na uszkodzenia DNA; szlak ATR i Chk1; zatrzymanie cyklu komórkowego; aktywacja transkrypcji." src="/files/ftp_upload/4449/4449fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat sygnalizacji punktu kontrolnego uszkodzeń DNA.
<img alt="Analiza fosforylacji Chk1, prążki Chk1 P-S344, wyniki Western blot, analiza ekspresji białek." src="/files/ftp_upload/4449/4449fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Fosforylacja Chk1 jest indukowana przez traktowanie MMS lub AT70 w ekstraktach z jaj Xenopus. (A) Chromatyna plemników uszkodzona przez MMS (MMS) lub normalna chromatyna plemników (Con) są inkubowane w ekstraktach z jaj przez 90 min. Fosforylację Chk1 w pozycji Ser344 (Chk1 P-S344) oraz całkowitą ilość Chk1 w ekstraktach z jaj analizowano za pomocą immunoblottingu. (B) Do ekstraktów z jaj dodano odpowiednio AT70 lub wodę (Con). Próbki przeanalizowano za pomocą immunoblottingu analogicznie jak w (A).

<ol><li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li>
<li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATR%3A+an+essential+regulator+of+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li>
<li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li>
<li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li>
<li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li>
<li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li>
<li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li>
<li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li>
<li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li>
<li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claspin%2C+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li>
<li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li>
<li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li>
<li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891(2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Badanie punktu kontrolnego uszkodzeń DNA z wykorzystaniem ekstraktów z jaj Xenopus wiąże się z kilkoma zaletami. Zastosowanie ekstraktów z jaj pozwala na uzyskanie dużej ilości ekstraktów bezkomórkowych zsynchronizowanych w fazie interfazy cyklu komórkowego. Ekstrakty z jaj można przygotować w sposób łatwy i niedrogi. Stosunkowo łatwo jest wywołać uszkodzenia DNA lub chromatyny i wykazać defekt w punkcie kontrolnym uszkodzeń DNA po immunodeplecji docelowego białka z ekstraktu z jaj. Następnie potencjalny defekt ...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Odczynniki&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-Chk1 P-S344</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>2348L</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Chk1</td><td>Santa Cruz</td><td>SC7898</td><td></td></tr><tr><td>Aprotynina</td><td>MP Biomedicals</td><td>0219115880</td><td></td></tr><tr><td>cykloheksymida</td><td>Sigma</td><td>C7698-5G</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalazyna B</td><td>EMD</td><td>250233</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>VWR</td><td>JTF780-2</td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Sigma</td><td>CG10-10VL</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma</td><td>C7352-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptyna</td><td>VWR</td><td>97063-922</td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfonian metylu (MMS)</td><td>Sigma</td><td>129925-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nokodazol</td><td>Sigma</td><td>M1404-2MG</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Calbiochem</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do próbek</td><td>Sigma</td><td>S3401</td><td></td></tr><tr><td>Tautomycyna</td><td>Wako Chemicals USA</td><td>209-12041</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Sprzęt &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kubełek do składania jaj</td><td>produkty komercyjne Rubbermaid</td><td>6308</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka CL2 IEC z rotorem z koszami wahadłowymi</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr><tr><td>wirnik z koszami wahadłowymi HB6</td><td>Thermo Scientific</td><td>11860</td><td></td></tr><tr><td>wirówka superspeed Sorvall RC6 plus </td><td>Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>krzyżownik UV</td><td>UVP</td><td>95-0174-01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Roztwory&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>1x MMR</td><td></td><td></td><td>100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0,5 mM MgSO4&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 2,5 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5 mM HEPES, doprowadzić pH do 7,8 za pomocą 10 M NaOH</td></tr><tr><td>Roztwór zapasowy aprotininy/leupeptyny</td><td></td><td></td><td>po 10 mg/ml w wodzie. Przechowywać w 20 &amp;mu;alikwoty w -80°C &amp;deg;C. </td></tr><tr><td>Bufor X</td><td></td><td></td><td>0,2 M sacharozy, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, pH skorygowane do 7,5 za pomocą HCl</td></tr><tr><td>Roztwór zapasowy cykloheksymidu</td><td></td><td></td><td>10 mg/ml w wodzie. Przechowywać w alikwotach po 1 ml w temperaturze -20°C. &amp;deg;C. </td></tr><tr><td>Roztwór stokowy cytochalazyny B</td><td></td><td></td><td>5 mg/ml w DMSO. Przechowywać w temperaturze 20 &amp;mu;alikwoty w temperaturze -20°C &amp;deg;C. </td></tr><tr><td>Roztwór stokowy ditiotreitolu (DTT)</td><td></td><td></td><td>1 M w wodzie. Przechowywać w aliquotach po 1 ml w temperaturze -20°C. &amp;deg;C. </td></tr><tr><td>ELB</td><td></td><td></td><td>0,25 M sacharozy, 1 mM DTT, 50 &amp;mu;g/ml cykloheksymidu, 2,5 mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,7</td></tr><tr><td>Roztwór stokowy nocodazolu</td><td></td><td></td><td>10 mg/ml w DMSO. Przechowywać w temperaturze 5 &amp;mu;alikwoty w temperaturze -80°C &amp;deg;C. </td></tr><tr><td>Mieszanina energetyczna</td><td></td><td></td><td>375 mM fosforanu kreatyny, 50 mM ATP i 25 mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Aliquoty są przechowywane w temperaturze -80°C. &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Roztwór barwnika jądrowego</td><td></td><td></td><td>0.4 &amp;mu;g/ml H&amp;#8211;chst 33258, 25% glicerolu (v/v), w 1x PBS </td></tr><tr><td>Roztwór zapasowy tautomycyny</td><td></td><td></td><td>100 &amp;mu;M w DMSO. Przechowywać w temperaturze 10 &amp;mu;alikwoty w temp. -80°C &amp;deg;C. </td></tr></tbody></table>

badanie punktu kontrolnego uszkodzeń dna z wykorzystaniem ekstraktów z jaj xenopus

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Na co dzień komórki są narażone na różnorodne uszkodzenia endogenne i środowiskowe. Aby przeciwdziałać tym czynnikom, komórki wyewoluowały sygnalizację punktów kontrolnych uszkodzeń DNA jako mechanizm nadzoru służący do wykrywania uszkodzeń DNA i kierowania odpowiedziami komórkowymi na te uszkodzenia. W sygnalizacji punktów kontrolnych uszkodzeń DNA biorą udział kilka grup białek zwanych sensorami, transduktorami i efektorami (Rycina 1). W tej złożonej ścieżce sygnałowej ATR (ATM and Rad3-related) jest jedną z głównych kinaz, które mogą reagować na uszkodzenia DNA i stres replikacyjny. Aktywowana kinaza ATR może fosforylować swoje substraty w dół szlaku, takie jak Chk1 (Checkpoint kinase 1). W konsekwencji fosforylowana i aktywowana Chk1 prowadzi do wielu efektów w dół szlaku punktu kontrolnego uszkodzeń DNA, w tym do zatrzymania cyklu komórkowego, aktywacji transkrypcji, naprawy uszkodzeń DNA oraz apoptozy lub starzenia się komórkowego (Rycina 1). W przypadku uszkodzenia DNA brak aktywacji punktu kontrolnego skutkuje nieodwracalnymi uszkodzeniami, a w konsekwencji niestabilnością genomiczną. Badanie punktów kontrolnych uszkodzeń DNA pozwoli wyjaśnić, w jaki sposób komórki utrzymują integralność genomu i zapewni lepsze zrozumienie mechanizmów rozwoju chorób ludzkich, takich jak nowotwory.
Xenopus laevis ekstrakty z jaj komórkowych stają się potężnym, bezkomórkowym systemem modelowym w badaniach nad punktami kontrolnymi uszkodzeń DNA. Ekstrakt niskoprędkościowy (LSE) został pierwotnie opisany przez grupę Masui1. Dodanie do LSE chromatiny plemników pozbawionych błon prowadzi do powstania jąder komórkowych, w których DNA replikuje się w sposób półkonserwatywny raz na cykl komórkowy.
Szlak sygnalizacji punktu kontrolnego zależny od ATR/Chk1 jest aktywowany przez uszkodzenia DNA lub stres replikacyjny 2. Obecnie stosuje się dwie metody indukcji punktu kontrolnego uszkodzeń DNA: podejścia powodujące uszkodzenia DNA oraz struktury naśladujące uszkodzenia DNA 3. Uszkodzenia DNA można indukować za pomocą promieniowania ultrafioletowego (UV), promieniowania γ, metanosulfonianu metylu (MMS), mitomycyny C (MMC), 4-nitrochinolino-1-tlenku (4-NQO) lub afidikoliny3, 4. MMS jest czynnikiem alkilującym, który hamuje replikację DNA i aktywuje zależny od ATR/Chk1 punkt kontrolny uszkodzeń DNA 4-7. Promieniowanie UV również aktywuje zależny od ATR/Chk1 punkt kontrolny uszkodzeń DNA 8. Strukturą naśladującą uszkodzenia DNA jest AT70, który stanowi kompleks dwóch odziedziczonych oligonukleotydów poly-(dA)70 i poly-(dT)70. System AT70 został opracowany w laboratorium Billa Dunphy'ego i jest powszechnie stosowany do indukcji sygnalizacji punktu kontrolnego ATR/Chk1 9-12.
W niniejszej pracy opisujemy protokoły (1) przygotowania ekstraktów z jaj bezkomórkowych (LSE), (2) poddania chromatyny plemników Xenopus dwóm różnym metodom uszkadzania DNA (MMS i UV), (3) przygotowania struktury AT70 naśladującej uszkodzenia DNA oraz (4) aktywacji zależnego od ATR/Chk1 punktu kontrolnego uszkodzeń DNA w LSE przy użyciu uszkodzonej chromatyny plemników lub struktury naśladującej uszkodzenia DNA.

Xenopus ekstrakt z jaj jest przydatnym systemem modelowym do badania punktu kontrolnego uszkodzeń DNA. Niniejszy protokół dotyczy przygotowania ekstraktów z jaj Xenopus oraz odczynników indukujących punkt kontrolny uszkodzeń DNA. Techniki te można zaadaptować do różnych metod wywołania uszkodzeń DNA w badaniach nad sygnałowaniem punktu kontrolnego uszkodzeń DNA.

Badanie punktu kontrolnego uszkodzeń DNA z wykorzystaniem ekstraktów z jaj Xenopus

Na co dzień komórki są narażone na różnorodne uszkodzenia endogenne i środowiskowe. Aby przeciwdziałać tym uszkodzeniom, komórki wykształciły mechanizmy naprawy uszkodzeń DNA...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie punktu kontrolnego uszkodzeń DNA z wykorzystaniem ekstraktów z jajeczek xip jako modelu badawczego. W pierwszej kolejności należy przygotować ekstrakt niskoprędkościowy z jajeczek xip. Następnie należy przygotować uszkodzoną chromatynę plemników, stosując metody uszkadzania DNA, takie jak MMS i światło UV.Należy również przygotować strukturę imitującą uszkodzenie DNA. W czasie T 70 należy zainicjować punkt kontrolny uszkodzeń DNA w LSE przy użyciu uszkodzonej chromatyny plemników lub w czasie T 70. Ostatecznie wyniki analizy blotów mogą dostarczyć informacji na temat punktu kontrolnego uszkodzeń DNA zapośredniczonego przez a TR check one w ekstrakcie z jaj żaby Xenopus.Dzień dobry. Jestem CH Y z katedry biologii na UNC Charlotte. Dzisiaj pokażemy Państwu, w jaki sposób ekstrakt z ropy jest wykorzystywany jako modelowy system do badania sygnalizacji uszkodzeń tech point.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie niestabilności dynamicznej, takie jak sposób aktywacji punktu kontrolnego uszkodzeń DNA. Niniejszy protokół opisuje przygotowanie zarówno ekstraktu z jaj opus, jak i odczynników indukujących punkt kontrolny uszkodzeń DNA, a także analizę punktu kontrolnego uszkodzeń DNA oraz xap. Techniki te można dostosować do różnych metod uszkadzania DNA, w tym za pomocą 4-NQO i etoposydu.Przejdźmy do badania punktu kontrolnego uszkodzeń DNA. Aby przygotować samice żab do składania ikry, wstrzyknij podskórnie do grzbietowych worków chłonnych 100 jednostek PMSG. Po odczekaniu co najmniej dwóch dni od przygotowania, indukuj składanie ikry, wstrzykując każdej przygotowanej żabie 500 jednostek ludzkiej gonadotropiny kosmicznej podskórnie do grzbietowych worków chłonnych; inkubuj wstrzyknięte żaby przez 14 do 20 godzin w osobnych wiadrach zawierających dwa litry zmodyfikowanego roztworu Ringera według Marxa.Wyjąć żaby z wiader i odlać roztwór MMR, aż pozostanie około 100 mililitrów. Następnie przenieść jaja z wiader do zlewki o pojemności 250 mililitrów; usunąć galaretkę z jaj poprzez dodawanie 100 mililitrów 2% cysteiny o pH 7,8 mniej więcej co 30 sekund. Delikatnie mieszać jaja, używając odwróconej szklanej pipety pasterskiej o średnicy 0,7 centymetra, a następnie dwa razy odlać ciecz i zastąpić ją świeżą cysteiną.Proces oczyszczania potrwa od około pięciu do 15 minut. Gdy jaja utworzą bardziej zwartą warstwę na dnie zlewki, po odlaniu roztworu cysteiny, przemyj jaja trzy razy roztworem 0,25 XMMR. Zamieszaj jaja za pomocą pipety szklanej i sprawdź, czy nie ma białych, spuchniętych, wadliwych jaj, które mają tendencję do gromadzenia się w centrum zlewki.Usunąć uszkodzone jaja za pomocą pipety Pasteura. Następnie przemyć jaja trzykrotnie buforem do lizy jaj. Usunąć wszelkie pozostałe uszkodzone jaja, a następnie przelać jaja do 14 mililitrowej probówki typu Falcon.Skompaktuj jaja poprzez wirowanie przez 55 sekund przy 188 ×g. Używając klinicznej wirówki naketblowniczej z rotorem z koszykami zamykanymi, usuń nadmiar buforu znajdujący się nad warstwą jaj. Następnie na każdy mililitr skompaktowanych jaj dodaj 0,5 µL aprotininy, leptyny lub AL o stężeniu 10 mg/mL oraz 0,5 µL cytokiny B lub cyto B o stężeniu 5 mg/mL. Odwiruj jaja przy 16 500 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Używając wirówki Sarva RC six plus super speed z rotorem z koszykami zamykanymi HB six, po wirowaniu frakcjonuj zawartość na trzy warstwy w probówce: ekstrakt lipidowy i pigment żółtkowy, kolejno od góry do dołu. Przebij bok probówki Falcon w dolnej części środkowej warstwy ekstraktu za pomocą igły o średnicy 21 G.Ostrożnie wyjmij igłę, ponieważ igła punkcyjna może być zablokowana przez plastik. W miejsce nakłucia wprowadź nową igłę o rozmiarze 21 G, przymocowaną do strzykawki o pojemności 1 ml, aby pobrać ekstrakt.Powoli odessać ekstrakt, unikając pęcherzyków powietrza oraz zanieczyszczenia warstwami lipidów i pigmentu żółtka. Przenieść ekstrakty do schłodzonej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Na każdy 1 ml ekstraktu z jaj dodać 10 µl roztworu o stężeniu 10 mg/ml.Cyklheksymida 1 µL w stężeniu 10 mg/mL. Pronin leptyna 1 µL w stężeniu 5 mg/mL, cytokina B 1 µL 1 M DTT oraz 0,33 µL w stężeniu 10 mg/mL. Całość zmieszano, delikatnie odwracając probówkę z ekstraktem jaj co najmniej 10 razy. Ekstrakt musi zostać użyty w ciągu czterech godzin, ponieważ jakość LSE ulega pogorszeniu.Po czterech godzinach lub całkowitym rozmrożeniu rozpuścić dwa syntetyczne oligonukleotydy w wodzie do stężenia 2 µg/µL. Dodać 100 µL każdego oligonukleotydu do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i inkubować przez pięć minut w bloku grzejnym w temperaturze 95 °C. Wyjąć blok grzejny wraz z probówką zawierającą mieszaninę oligonukleotydów i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie podzielić na aliquoty po 10 µL i przechowywać w temperaturze -20 °C.Próbka AL stanowi obecnie dupleks A T 70 o końcowej stężeniu 2 µg/µL. Przygotuj prawidłową chromatynę plemnikową zgodnie z opisem Tudora i Waltera do objętości 0,5 ml chromatyny. Dodaj 5,5 µl 9,1 M MMS.Umieść probówkę z próbką na rotatorze w temperaturze pokojowej na 30 minut, korzystając z wirówki klinicznej IE CCL two z rotorem z koszykami i adapterami do probówek. Wirować próbkę z przyspieszeniem 686 ×g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzuć nadsącz i przemyj osad w 0,5 milliliters buforu X zawierającego B-S-A-D-T-T-A proin oraz leptynę.Powtórz ten proces trzy razy, a następnie zawieś osad w 0,5 mililitrach Buforu x. Określ stężenie chromatyny plemników za pomocą hemosytometru.Następnie rozcieńcz próbkę do stężenia 100 000 plemników na mikrolitr i przechowuj aliquoty o objętości pięciu mikrolitrów w temperaturze -80 °C. Nanieś pożądaną ilość normalnej chromatyny plemników na powierzchnię kawałka parafilmy i umieść próbkę w urządzeniu do sieciowania UV. Ustaw wybrany parametr energii i rozpocznij uszkadzanie chromatyny plemników za pomocą światła UV.Użyj chromatyny plemników poddanej działaniu promieniowania UV natychmiast, aby wywołać punkt kontrolny uszkodzeń DNA w przygotowanym ekstrakcie niskoprędkościowym (LSE). Połącz 50 µL LSE, 1 µL mieszaniny energetycznej oraz 2 µL uszkodzonej chromatyny plemników. Inkubuj reakcję w temperaturze pokojowej przez 90 minut, pamiętając o delikatnym potrząśnięciu probówką co 10 minut po pierwszych 30 minutach inkubacji.Podczas inkubacji nanieś jeden µL mieszaniny reakcyjnej na szkiełko przedmiotowe i dodaj jeden µL roztworu nuclear dice. Nałóż szkiełko nakrywowe i sprawdź pod mikroskopem fluorescencyjnym, czy utworzyły się jądra. Zazwyczaj po 30 minutach inkubacji formują się okrągłe jądra, co wskazuje na rozpoczęcie replikacji DNA.Następnie należy ocenić 10 µL mieszaniny reakcyjnej za pomocą immunoblottingu z użyciem przeciwciał anty check one. W probówce do mikrowirówki należy połączyć 50 µL LSE, 1 µL mieszaniny energy oraz 1,6 µL roztoku toto mycin. Następnie dodaje się 1,25 µL albo duplexu DNA T 70 w stężeniu 2 µg/µL, albo wody w celu uzyskania kontroli negatywnej.Inkubować reakcje w temperaturze pokojowej przez 90 minut, delikatnie potrząsając probkami reakcyjnymi co 10 minut. Następnie dodać 10 µL mieszaniny reakcyjnej do 90 µL buforu do próbek w celu przeprowadzenia analizy western blot białka check one. Uszkodzona chromatyna plemników lub struktury naśladujące uszkodzenia DNA skutecznie aktywują punkt kontrolny uszkodzeń DNA pośredniczony przez TR check one w systemie ekstraktu z jajeczek xop w porównaniu do indukcji przez kontrolny MMS.Należy sprawdzić fosforylację białka check one w pozycji Ser344, która jest wskaźnikiem aktywacji kinazy TR. Podobnie, T70, jako struktura naśladująca uszkodzenia DNA, również wywołuje fosforylację białka check one. Po opanowaniu metody przygotowanie LSE może zostać ukończone w około jednej godzinie.Ponieważ jakość ekstraktu ulega pogorszeniu po około czterech godzinach, kluczowe są szybkość i wydajność. Metody te można łączyć z innymi podejściami w celu udzielenia odpowiedzi na istotne pytania dotyczące sygnalizacji punktów kontrolnych uszkodzeń DNA. Na przykład można przeprowadzić immunodeplecję, aby sprawdzić, czy białko docelowe jest wymagane w punkcie kontrolnym uszkodzeń DNA.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat badania punktu kontrolnego uszkodzeń DNA z wykorzystaniem ekstraktu z drożdży jako modelu badawczego. Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

study-of-the-dna-damage-checkpoint-using-xenopus-egg-extracts

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie kontrolnego punktu uszkodzenia DNA za pomocą ekstraktów z jaj Xenopus

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Opisano metodę analizy degradacji białek za pomocą radioaktywnego i lucyferazy-fuzyjnego białka w ekstrakcie z jaj Xenopus oraz jej adaptację do wysokoprzepustowych badań przesiewowych dla małocząsteczkowych modulatorów degradacji białek.

Rekonstytucja degradacji β-kateniny w ekstrakcie z jaj Xenopus

Pytanie o to, jak regulatory chromatyny i stany chromatyny wpływają na genom in vivo, jest kluczowe dla naszego zrozumienia, jak wcześnie podejmowane są decyzje dotyczące losu komórki w rozwijającym się zarodku. ChIP-Seq – najpopularniejsze podejście do badania cech chromatyny na poziomie globalnym – zostało przedstawione tutaj dla zarodków Xenopus.

Migawka całego genomu regulatorów i stanów chromatyny w zarodkach Xenopus za pomocą ChIP-Seq

Molekularne mechanizmy dekondensacji wysoce zagęszczonej chromatyny mitotycznej są źle zdefiniowane. Przedstawiamy bezkomórkowy test oparty na mitotycznych klastrach chromatyny wyizolowanych z komórek HeLa i ekstraktu z jaj Xenopus laevis, który wiernie odtwarza proces dekondensacji in vitro.

Test bezkomórkowy do badania dekondensacji chromatyny pod koniec mitozy

Prezentujemy metodę generowania in vitro samopodtrzymujących się oscylacji mitotycznych na poziomie pojedynczej komórki poprzez kapsułkowanie ekstraktów jajecznych Xenopus laevis w mikroemulsjach typu woda w oleju.

Rekonstrukcja oscylacji cyklu komórkowego w mikroemulsjach bezkomórkowych ekstraktów jajowych Xenopus

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Opisujemy metodę przygotowania i obrazowania na żywo nierozcieńczonych ekstraktów cytoplazmatycznych z jaj Xenopus laevis.

Xenopus laevis (Xenopus laevis) Przygotowanie ekstraktu z jaj i metody obrazowania na żywo do wizualizacji dynamicznej organizacji cytoplazmy

Celem tego protokołu jest wykorzystanie obrazowania na żywo do wizualizacji wpływu uszkodzeń oksydacyjnych na lokalizację i dynamikę struktur subkomórkowych w jajnikach Drosophila.

Wizualizacja wpływu uszkodzeń oksydacyjnych na komory jajowe Drosophila za pomocą obrazowania na żywo

Ten artykuł przedstawia podstawowe etapy immunobarwienia i immunoprecypitacji chromatyny. Protokoły te są powszechnie stosowane do badania procesów komórkowych związanych z uszkodzeniem DNA oraz do wizualizacji i ilościowego określenia rekrutacji białek zaangażowanych w naprawę DNA.

Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

Utrzymanie integralności genomu oocytu jest niezbędne do zapewnienia genetycznej wierności powstałego zarodka. W tym miejscu przedstawiamy dokładny protokół wykrywania pęknięć dwuniciowych DNA w żeńskich komórkach rozrodczych ssaków.

Wykrywanie dwuniciowych pęknięć DNA w oocytach myszy

Poznaj metodę badania punktu kontrolnego uszkodzeń DNA przy użyciu ekstraktów z jaj Xenopus. Technika ta pozwala analizować mechanizmy sygnalizacji kontrolnej i aktywacji kinazy ATR w modelu komórkowym.

Badanie punktu kontrolnego uszkodzeń DNA z wykorzystaniem ekstraktów z jaj Xenopus

Przeglądaj więcej filmów