Badanie punktu kontrolnego uszkodzeń DNA z wykorzystaniem ekstraktów z jaj Xenopus

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie punktu kontrolnego uszkodzeń DNA z wykorzystaniem ekstraktów z jajeczek xip jako modelu badawczego. W pierwszej kolejności należy przygotować ekstrakt niskoprędkościowy z jajeczek xip. Następnie należy przygotować uszkodzoną chromatynę plemników, stosując metody uszkadzania DNA, takie jak MMS i światło UV.

Należy również przygotować strukturę imitującą uszkodzenie DNA. W czasie T 70 należy zainicjować punkt kontrolny uszkodzeń DNA w LSE przy użyciu uszkodzonej chromatyny plemników lub w czasie T 70. Ostatecznie wyniki analizy blotów mogą dostarczyć informacji na temat punktu kontrolnego uszkodzeń DNA zapośredniczonego przez a TR check one w ekstrakcie z jaj żaby Xenopus.

Dzień dobry. Jestem CH Y z katedry biologii na UNC Charlotte. Dzisiaj pokażemy Państwu, w jaki sposób ekstrakt z ropy jest wykorzystywany jako modelowy system do badania sygnalizacji uszkodzeń tech point.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie niestabilności dynamicznej, takie jak sposób aktywacji punktu kontrolnego uszkodzeń DNA. Niniejszy protokół opisuje przygotowanie zarówno ekstraktu z jaj opus, jak i odczynników indukujących punkt kontrolny uszkodzeń DNA, a także analizę punktu kontrolnego uszkodzeń DNA oraz xap. Techniki te można dostosować do różnych metod uszkadzania DNA, w tym za pomocą 4-NQO i etoposydu.

Przejdźmy do badania punktu kontrolnego uszkodzeń DNA. Aby przygotować samice żab do składania ikry, wstrzyknij podskórnie do grzbietowych worków chłonnych 100 jednostek PMSG. Po odczekaniu co najmniej dwóch dni od przygotowania, indukuj składanie ikry, wstrzykując każdej przygotowanej żabie 500 jednostek ludzkiej gonadotropiny kosmicznej podskórnie do grzbietowych worków chłonnych; inkubuj wstrzyknięte żaby przez 14 do 20 godzin w osobnych wiadrach zawierających dwa litry zmodyfikowanego roztworu Ringera według Marxa.

Wyjąć żaby z wiader i odlać roztwór MMR, aż pozostanie około 100 mililitrów. Następnie przenieść jaja z wiader do zlewki o pojemności 250 mililitrów; usunąć galaretkę z jaj poprzez dodawanie 100 mililitrów 2% cysteiny o pH 7,8 mniej więcej co 30 sekund. Delikatnie mieszać jaja, używając odwróconej szklanej pipety pasterskiej o średnicy 0,7 centymetra, a następnie dwa razy odlać ciecz i zastąpić ją świeżą cysteiną.

Proces oczyszczania potrwa od około pięciu do 15 minut. Gdy jaja utworzą bardziej zwartą warstwę na dnie zlewki, po odlaniu roztworu cysteiny, przemyj jaja trzy razy roztworem 0,25 XMMR. Zamieszaj jaja za pomocą pipety szklanej i sprawdź, czy nie ma białych, spuchniętych, wadliwych jaj, które mają tendencję do gromadzenia się w centrum zlewki.

Usunąć uszkodzone jaja za pomocą pipety Pasteura. Następnie przemyć jaja trzykrotnie buforem do lizy jaj. Usunąć wszelkie pozostałe uszkodzone jaja, a następnie przelać jaja do 14 mililitrowej probówki typu Falcon.

Skompaktuj jaja poprzez wirowanie przez 55 sekund przy 188 ×g. Używając klinicznej wirówki naketblowniczej z rotorem z koszykami zamykanymi, usuń nadmiar buforu znajdujący się nad warstwą jaj. Następnie na każdy mililitr skompaktowanych jaj dodaj 0,5 µL aprotininy, leptyny lub AL o stężeniu 10 mg/mL oraz 0,5 µL cytokiny B lub cyto B o stężeniu 5 mg/mL. Odwiruj jaja przy 16 500 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Używając wirówki Sarva RC six plus super speed z rotorem z koszykami zamykanymi HB six, po wirowaniu frakcjonuj zawartość na trzy warstwy w probówce: ekstrakt lipidowy i pigment żółtkowy, kolejno od góry do dołu. Przebij bok probówki Falcon w dolnej części środkowej warstwy ekstraktu za pomocą igły o średnicy 21 G.

Ostrożnie wyjmij igłę, ponieważ igła punkcyjna może być zablokowana przez plastik. W miejsce nakłucia wprowadź nową igłę o rozmiarze 21 G, przymocowaną do strzykawki o pojemności 1 ml, aby pobrać ekstrakt.

Powoli odessać ekstrakt, unikając pęcherzyków powietrza oraz zanieczyszczenia warstwami lipidów i pigmentu żółtka. Przenieść ekstrakty do schłodzonej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Na każdy 1 ml ekstraktu z jaj dodać 10 µl roztworu o stężeniu 10 mg/ml.

Cyklheksymida 1 µL w stężeniu 10 mg/mL. Pronin leptyna 1 µL w stężeniu 5 mg/mL, cytokina B 1 µL 1 M DTT oraz 0,33 µL w stężeniu 10 mg/mL. Całość zmieszano, delikatnie odwracając probówkę z ekstraktem jaj co najmniej 10 razy. Ekstrakt musi zostać użyty w ciągu czterech godzin, ponieważ jakość LSE ulega pogorszeniu.

Po czterech godzinach lub całkowitym rozmrożeniu rozpuścić dwa syntetyczne oligonukleotydy w wodzie do stężenia 2 µg/µL. Dodać 100 µL każdego oligonukleotydu do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i inkubować przez pięć minut w bloku grzejnym w temperaturze 95 °C. Wyjąć blok grzejny wraz z probówką zawierającą mieszaninę oligonukleotydów i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie podzielić na aliquoty po 10 µL i przechowywać w temperaturze -20 °C.

Próbka AL stanowi obecnie dupleks A T 70 o końcowej stężeniu 2 µg/µL. Przygotuj prawidłową chromatynę plemnikową zgodnie z opisem Tudora i Waltera do objętości 0,5 ml chromatyny. Dodaj 5,5 µl 9,1 M MMS.

Umieść probówkę z próbką na rotatorze w temperaturze pokojowej na 30 minut, korzystając z wirówki klinicznej IE CCL two z rotorem z koszykami i adapterami do probówek. Wirować próbkę z przyspieszeniem 686 ×g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzuć nadsącz i przemyj osad w 0,5 milliliters buforu X zawierającego B-S-A-D-T-T-A proin oraz leptynę.

Powtórz ten proces trzy razy, a następnie zawieś osad w 0,5 mililitrach Buforu x. Określ stężenie chromatyny plemników za pomocą hemosytometru.

Następnie rozcieńcz próbkę do stężenia 100 000 plemników na mikrolitr i przechowuj aliquoty o objętości pięciu mikrolitrów w temperaturze -80 °C. Nanieś pożądaną ilość normalnej chromatyny plemników na powierzchnię kawałka parafilmy i umieść próbkę w urządzeniu do sieciowania UV. Ustaw wybrany parametr energii i rozpocznij uszkadzanie chromatyny plemników za pomocą światła UV.

Użyj chromatyny plemników poddanej działaniu promieniowania UV natychmiast, aby wywołać punkt kontrolny uszkodzeń DNA w przygotowanym ekstrakcie niskoprędkościowym (LSE). Połącz 50 µL LSE, 1 µL mieszaniny energetycznej oraz 2 µL uszkodzonej chromatyny plemników. Inkubuj reakcję w temperaturze pokojowej przez 90 minut, pamiętając o delikatnym potrząśnięciu probówką co 10 minut po pierwszych 30 minutach inkubacji.

Podczas inkubacji nanieś jeden µL mieszaniny reakcyjnej na szkiełko przedmiotowe i dodaj jeden µL roztworu nuclear dice. Nałóż szkiełko nakrywowe i sprawdź pod mikroskopem fluorescencyjnym, czy utworzyły się jądra. Zazwyczaj po 30 minutach inkubacji formują się okrągłe jądra, co wskazuje na rozpoczęcie replikacji DNA.

Następnie należy ocenić 10 µL mieszaniny reakcyjnej za pomocą immunoblottingu z użyciem przeciwciał anty check one. W probówce do mikrowirówki należy połączyć 50 µL LSE, 1 µL mieszaniny energy oraz 1,6 µL roztoku toto mycin. Następnie dodaje się 1,25 µL albo duplexu DNA T 70 w stężeniu 2 µg/µL, albo wody w celu uzyskania kontroli negatywnej.

Inkubować reakcje w temperaturze pokojowej przez 90 minut, delikatnie potrząsając probkami reakcyjnymi co 10 minut. Następnie dodać 10 µL mieszaniny reakcyjnej do 90 µL buforu do próbek w celu przeprowadzenia analizy western blot białka check one. Uszkodzona chromatyna plemników lub struktury naśladujące uszkodzenia DNA skutecznie aktywują punkt kontrolny uszkodzeń DNA pośredniczony przez TR check one w systemie ekstraktu z jajeczek xop w porównaniu do indukcji przez kontrolny MMS.

Należy sprawdzić fosforylację białka check one w pozycji Ser344, która jest wskaźnikiem aktywacji kinazy TR. Podobnie, T70, jako struktura naśladująca uszkodzenia DNA, również wywołuje fosforylację białka check one. Po opanowaniu metody przygotowanie LSE może zostać ukończone w około jednej godzinie.

Ponieważ jakość ekstraktu ulega pogorszeniu po około czterech godzinach, kluczowe są szybkość i wydajność. Metody te można łączyć z innymi podejściami w celu udzielenia odpowiedzi na istotne pytania dotyczące sygnalizacji punktów kontrolnych uszkodzeń DNA. Na przykład można przeprowadzić immunodeplecję, aby sprawdzić, czy białko docelowe jest wymagane w punkcie kontrolnym uszkodzeń DNA.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat badania punktu kontrolnego uszkodzeń DNA z wykorzystaniem ekstraktu z drożdży jako modelu badawczego. Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.