Mikroiniekcja insuliny do hipokampa i mikrodializa in vivo podczas testów pamięci przestrzennej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar metabolizmu hipokampa podczas testów behawioralnych. Jest to realizowane poprzez chirurgiczne przygotowanie odpowiednio przygotowanego zwierzęcia z implantowaną kaniulą prowadzącą do mikrodializy. W dniu testów do kaniuli wprowadza się sondę do mikrodializy, a następnie potwierdza przepływ perfuzatu.

Następnie pozwala się sondzie na równowagę, podczas gdy zwierzę przebywa w komorze kontrolnej. Ostatecznie stosuje się odpowiednie metody analityczne, na przykład reakcję z użyciem oksydazy glukozowej, NADP i NADPH oraz analizę fluorometryczną. Jeśli pomiar glukozy jest wykorzystywany do wykazania poziomu metabolizmu i/lub uwalniania neurochemicznego w całym okresie testowania, jednym z najtrudniejszych aspektów tej techniki jest ostrożność wymagana przy obchodzeniu się z rurkami do mikrodializy, ponieważ zwierzęta często przegryzają je lub plączą linie, jeśli nie zachowa się należytej staranności.

Pierwszy raz zastosowałem mikrodializę hipokampa podczas testów behawioralnych w trakcie moich studiów doktoranckich; chcieliśmy sprawdzić, czy istniejące modele podaży glukozy były w rzeczywistości zgodne ze znanymi danymi psychologicznymi dotyczącymi usprawnienia pamięci przez glukozę. Metodologia ta pozwoliła nam wykazać, że istniejące modele podawania glukozy do mózgu były całkowicie błędne.

Zgodnie ze standardowymi procedurami chirurgicznymi, przygotuj zwierzę, odsłoń czaszkę i wywierć otwory pod implantację kaniuli. Wprowadź kaniulę w wcześniej określonych współrzędnych, a następnie powoli opuść ją do docelowej głębokości. Po prawidłowym umiejscowieniu unieruchom kaniulę za pomocą cementu dentystycznego.

W razie potrzeby użyj sterylnego szwu chirurgicznego, aby zamknąć ranę. Na koniec zastosuj stylet w celu utrzymania drożności kaniuli. Następnie przygotuj zestaw PERFUSE 8 do mikrodializy.

Należy zaznaczyć, że dokładny skład płynu jest niezbędny dla uzyskania optymalnych wyników. W dniu przeprowadzenia testu należy dodać i całkowicie rozpuścić albuminę surowicy bydlęcej BSA. Po przygotowaniu PERFUSE eight należy przefiltrować przez filtr 0,2 mikrona.

Następnie, używając alikwoty przygotowanego A ECF, należy sporządzić preparat do podania do mózgu (jeśli jest wymagany). W tym przypadku przygotowano insulinę do podania do hipokampa. Nową sondę i linię do mikrodializy należy przygotować w dniu poprzedzającym testy.

Przygotuj dwie oddzielne linie dla dopływu i odpływu. Użyj rurek PE 50 do połączenia dwóch odcinków rurek FEP o długości jednego metra i upewnij się, że przestrzeń martwa między liniami jest minimalna. Rurki należy przyciąć zgodnie z rysunkiem, aby uzyskać skośne końce, co ułatwi ich włożenie do złączy PE 50.

Podłącz przewód dopływowy do strzykawki Hamiltona o objętości 1 ml wypełnionej sterylną filtrowaną wodą dejonizowaną i przymocuj sondę do drugiego końca, aby zwierzę mogło swobodnie poruszać się podczas wykonywania pomiarów. Podłącz linie dopływową i odpływową do dwukanałowego obrotowego złącza (swivela). Następnie podłącz przewód odpływowy do pompy i uruchom ją z prędkością 1,5 µl/min, aż do momentu pojawienia się wody dejonizowanej w przewodzie odpływowym sondy.

Wyłącz pompę i podłącz drugą linię między rurką odpływową a probówką do zbierania próbek. Przepuść przez rurkę 5 mL cieczy, a następnie pozostaw sondę na noc w fiolce zawierającej sterylną wodę dejonizowaną, dbając o to, aby końcówka sondy była stale mokra. Na 24 godziny przed testem przygotuj badanego osobnika poprzez usunięcie atrapy styletu i wprowadzenie sondy do mikrodializy przeznaczonej wyłącznie do tego celu.

Przez kolejne 10 minut zastąp go atrapy i umieść szczura z powrotem w klatce. Alternatywnie, na tym etapie można zastosować nową sondę i pozostawić ją na miejscu, nie usuwając jej aż do momentu wykonania pomiarów. Następnego dnia.

W dniu przeprowadzenia mikrodializy należy napełnić strzykawkę Hamiltona oraz fiolkę scyntylacyjną przefiltrowanym A ECF i pozwolić pompie na równoważenie przez jedną godzinę. W razie potrzeby należy napełnić drugą strzykawkę Hamiltona przygotowaną substancją leczniczą i umieścić ją w pompie strzykawkowej. Kluczem do sukcesu w tej procedurze jest zachowanie spokoju i bardzo delikatne obchodzenie się ze zwierzęciem.

Należy zatem zachować spokój, poruszać się powoli i precyzyjnie, a przede wszystkim ćwiczyć. Po zakończeniu równoważenia należy wyjąć atrapy styletu i ostrożnie wprowadzić zrównoważoną sondę do mikrodializy do mózgu szczura za pomocą kaniuli. Następnie umieść szczura w przezroczystym plastikowym pudełku zawierającym część ściółki z jego klatki.

Należy zadbać o przeciwwagę dla cewki. Do cewki na zewnątrz klatki przymocować probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,6 ml wypełnioną wodą w taki sposób, aby siła grawitacji zapobiegała załamaniu się linii mikrodializy, ale nie napinała ich. Pozostawić sondę i szczura do równowagi na dwie godziny.

Na początku tego okresu potwierdź, że przepływ w urządzeniu Perfuse eight nie jest zablokowany. Aby to zrobić, zbierz odpływ z PERFUSE eight przez określony czas i zważ próbkę, aby potwierdzić, że z systemu wypływa oczekiwana objętość przed rozpoczęciem pobierania próbek. Upewnij się, że korelacja między dializą próbki a jej pobraniem została dokładnie obliczona.

W tym układzie objętość między sondą a punktem poboru wynosi 30 µL przy szybkości przepływu 1,5 µL/min. Od momentu opuszczenia przez próbkę obszaru mózgu do jej pobrania upływa 20 minut. Po okresie równoważenia należy pobrać co najmniej trzy próbki, gdy szczur pozostaje w spoczynku w komorze domowej.

Aby ustanowić stabilną linię bazową pomiarów przed testami behawioralnymi, należy dokładnie zaplanować czas dostarczenia preparatu do mózgu. W tej konfiguracji, gdzie objętość między końcówką strzykawki a sondą wprowadzoną do mózgu zwierzęcia wynosi 30 µL, wymieniamy strzykawkę z preparatem na roztwór profuse eight na 20 minut przed planowanym czasem dotarcia preparatu do hipokampa.

Należy po prostu odłączyć linię dopływową od strzykawki kontrolnej systemu PERFUSE 8 i szybko podłączyć ją do strzykawki traktowanej systemu PERFUSE 8. Operacja ta nie powinna trwać dłużej niż pięć sekund, aby uniknąć przerwania przepływu w systemie PERFUSE 8. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza, które mogłyby obniżyć skuteczność w odpowiednim przedziale czasowym.

Po podaniu terapii delikatnie przenieś szczura do wybranego aparatu do testów behawioralnych. W tym przypadku spontaniczna alternacja jest mierzona w labiryncie w kształcie znaku plus. Pozostaw zwierzę do swobodnej eksploracji labiryntu przez 20 minut.

Zapisz sekwencję i czas trwania ramienia Aries, korzystając z nagrania wideo lub notując dane ręcznie w celu pobrania próbek. W tym czasie przenieś rurkę odpływową do nowej probówki zbiorczej. Co pięć minut przytrzymuj rurkę w taki sposób, aby mogła się ona swobodnie poruszać.

Urządzenie nie powinno utrudniać poruszania się szczura ani przemieszczać się przed zwierzęciem; należy pozostać w bezruchu, aby Twoje ruchy nie wpływały na zachowanie szczura. Po zakończeniu testu delikatnie wyjmij szczura z labiryntu i przenieś go z powrotem do komory kontrolnej. Kontynuuj pobieranie próbek z mikrodializy, aż uzyskasz co najmniej cztery próbki, aby objąć okres regeneracji po wykonaniu zadania.

Po pobraniu odpowiednich próbek ostrożnie usuń sondę z głowy zwierzęcia i umieść ją w fiolce do przechowywania. Przenieś zwierzę z powrotem do jego klatki i uważnie obserwuj go pod kątem wszelkich zmian w stanie zdrowia lub zachowaniu po zakończeniu eksperymentu. Na koniec przemyj cewkę, podłączając strzykawkę zawierającą roztwór catho, aby zapobiec wzrostowi drobnoustrojów.

Ten przykład przedstawia związany z zadaniem spadek poziomu glukozy w płynie zewnątrzkomórkowym (ECF) hipokampa. Szary obszar oznacza czas, który zwierzę spędziło w labiryncie. Fioletowa linia pokazuje poziom glukozy w hipokampie u zwierząt, które nie przechodziły testu w labiryncie, natomiast czerwona linia reprezentuje zwierzęta wykonujące zadanie spontanicznej alternacji przedramion.

Pomarańczowa linia przedstawia pomiary u zwierząt wykonujących łatwiejszą, trzyramienną wersję tego zadania. Tutaj widoczne są zmiany w poziomach glukozy i mleczanu w hipokampie po podaniu insuliny. Należy zauważyć, że zmiany te występują bez żadnych testów behawioralnych, a zatem odzwierciedlają wpływ samej insuliny w warunkach bazowych.

Podczas wykonywania tej procedury niezwykle ważne jest zachowanie spokoju. Szczury potrafią wyczuć stres eksperymentatora, co prowadzi do ich pobudzenia, a to może znacznie utrudnić pracę i prawdopodobnie zaburzyć wyniki. Połączenie tych technik umożliwiło dokładne badanie neurochemiczne procesów behawioralnych.

Podobne techniki są obecnie stosowane również u pacjentów. Na przykład pacjenci z epilepsją, u których wszczepiono elektrody w celu zlokalizowania ogniska napadów, mogą mieć również wszczepione kaniule do mikrodializy, aby umożliwić pomiary metaboliczne.