Name: Mikroiniekcja insuliny w hipokampie i mikrodializa in vivo podczas badania pamięci przestrzennej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Poznaj mikroiniekcję insuliny i mikrodializę in vivo w hipokampie do badania pamięci przestrzennej. Ta metoda pozwala mierzyć metabolizm mózgu podczas zadań behawioralnych u świadomych zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez NIH/NIDDK (grant DK077106 dla ECM).

<ol><li>McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreases+in+rat+extracellular+hippocampal+glucose+concentration+associated+with+cognitive+demand+during+a+spatial+task%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (6), 2881(2000).</li>
<li>McNay, E. C., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+differences+in+hippocampal+extracellular+fluid+glucose+concentration+during+behavioral+testing+and+following+systemic+glucose+administration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gerontol.+A.+Biol.+Sci.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-related differences in hippocampal extracellular fluid glucose concentration during behavioral testing and following systemic glucose administration.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56 (2), 66(2001).</li>
<li>McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+in+brain+glucose+concentration+during+behavioral+testing%3A+dissociations+between+brain+areas+and+between+brain+and+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 75 (3), 325(2001).</li>
<li>McNay, E. C., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+glucose+concentrations+in+the+rat+hippocampus+measured+by+zero-net-flux%3A+effects+of+microdialysis+flow+rate%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate.</a> 72 (2), 785(1999).</li>
<li>McNay, E. C., Sherwin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+recurrent+hypoglycemia+on+spatial+cognition+and+cognitive+metabolism+in+normal+and+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Effect of recurrent hypoglycemia on spatial cognition and cognitive metabolism in normal and diabetic rats.</a> Diabetes. 53 (2), 418(2004).</li>
<li>McNay, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+memory+processes+are+modulated+by+insulin+and+high-fat-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 93 (4), 546(2010).</li>
<li>McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+in+brain+glucose+concentration+during+behavioral+testing%3A+dissociations+between+brain+areas+and+between+brain+and+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood.</a> Neurobiology of Learning & Memory. 75 (3), 325(2001).</li>
<li>McNay, E. C., Williamson, A., McCrimmon, R. J., Sherwin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+and+neural+hippocampal+effects+of+long-term+moderate+recurrent+hypoglycemia%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Cognitive and neural hippocampal effects of long-term moderate recurrent hypoglycemia.</a> Diabetes. 55 (4), 1088(2006).</li>
<li>McNay, E. C., Sherwin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+artificial+cerebro-spinal+fluid+%28aCSF%29+to+artificial+extracellular+fluid+%28aECF%29%3A+microdialysis+perfusate+composition+effects+on+in+vivo+brain+ECF+glucose+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">From artificial cerebro-spinal fluid (aCSF) to artificial extracellular fluid (aECF): microdialysis perfusate composition effects on in vivo brain ECF glucose measurements.</a> Journal of Neuroscience Methods. 132 (1), 35(2004).</li>
<li>McNay, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+memory+processes+are+modulated+by+insulin+and+high-fat-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 93 (4), 546(2010).</li>
<li>Benveniste, H., Drejer, J., Schousboe, A., Diemer, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cerebral+glucose+phosphorylation+and+blood+flow+after+insertion+of+a+microdialysis+fiber+through+the+dorsal+hippocampus+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Regional cerebral glucose phosphorylation and blood flow after insertion of a microdialysis fiber through the dorsal hippocampus in the rat.</a> Journal of Neurochemistry. 49 (3), 729(1987).</li>
<li>Benveniste, H., Diemer, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+reactions+to+implantation+of+a+microdialysis+tube+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Cellular reactions to implantation of a microdialysis tube in the rat hippocampus.</a> Acta Neuropathologica. 74 (3), 234(1987).</li>
<li>McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreases+in+rat+extracellular+hippocampal+glucose+concentration+associated+with+cognitive+demand+during+a+spatial+task%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2881(2000).</li>
<li>McNay, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+memory+processes+are+modulated+by+insulin+and+high-fat-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance.</a> Neurobiol. Learn Mem. 93 (4), 546(2010).</li>
<li>Lonnroth, P., Jansson, P. -A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microdialysis+method+allowing+characterization+of+intercellular+water+space+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A microdialysis method allowing characterization of intercellular water space in humans.</a> American Journal of Physiology. 1987, E228(1987).</li>
<li>McNay, E. C., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+glucose+concentrations+in+the+rat+hippocampus+measured+by+zero-net-flux%3A+effects+of+microdialysis+flow+rate%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate.</a> 72 (2), 785(1999).</li>
<li>Lalonde, R. obert <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurobiological+basis+of+spontaneous+alternation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+%26+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">The neurobiological basis of spontaneous alternation.</a> Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 26 (1), 91(2002).</li>
<li>Richman, C., Dember, W., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+alternation+behavior+in+animals%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Psychology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous alternation behavior in animals: A review.</a> Current Psychology. 5 (4), 358(1986).</li>
<li>McNay, E. C., Canal, C. E., Sherwin, R. S., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+memory+with+septal+injections+of+morphine+and+glucose%3A+effects+on+extracellular+glucose+levels+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Modulation of memory with septal injections of morphine and glucose: effects on extracellular glucose levels in the hippocampus.</a> Physiol. Behav. 87 (2), 298(2006).</li>
<li>McNay, E. C., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+modulation+across+neural+systems%3A+intra-amygdala+glucose+reverses+deficits+caused+by+intraseptal+morphine+on+a+spatial+task+but+not+on+an+aversive+task%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Memory modulation across neural systems: intra-amygdala glucose reverses deficits caused by intraseptal morphine on a spatial task but not on an aversive task.</a> Journal of Neuroscience. 18 (10), 3853(1998).</li>
<li>Rex, A., Bert, B., Fink, H., Voigt, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-dependent+changes+of+extracellular+glucose+in+the+rat+hippocampus+determined+by+in+vivo+microdialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Stimulus-dependent changes of extracellular glucose in the rat hippocampus determined by in vivo microdialysis.</a> Physiol. Behav. 98 (4), 467(2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Wszystkie roztwory stosowane w mikrodializie powinny zostać przefiltrowane bezpośrednio przed użyciem, przy użyciu filtra .2 μm. Po wprowadzeniu sondy do kaniuli prowadzącej należy upewnić się, że przepływ nie jest utrudniony i trwa pobieranie próbek. Jeśli przepływ ustanie po wprowadzeniu, najbardziej prawdopodobną przyczyną jest uszkodzenie membrany sondy wynikające z niewłaściwej ostrożności podczas aplikacji; w takim przypadku należy zastosować nową sondę.
Jak wspomniano powyżej, kluczową...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content">Większość odczynników jest standardowej czystości laboratoryjnej i może być zakupiona u dowolnego dostawcy. Podobnie sprzęt, taki jak pompy strzykawkowe i rurki, może pochodzić od różnych producentów. Specyficzne elementy użyte w tej procedurze, których szczegóły są istotne, obejmują:&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>Sondy do mikrodializy CMA 12</td><td>CMA/ Microdialysis</td><td>CMA-12-XXX</td><td>Są one dostępne w różnych długościach membran i zakresach odcięcia (cut-off), co jest oznaczone konkretnymi kodami w miejscu „XXX”.</td></tr><tr><td>Insulina ludzka (Humulin)</td><td>Eli Lilly</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>Przegub płynowy (liquid swivel)</td><td>Instech</td><td>375/D/22QM</td><td>Ten konkretny przegub charakteryzuje się bardzo niskim momentem obrotowym i objętością wewnętrzną oraz posiada niereaktywną wyściółkę kwarcową.</td></tr></tbody></table>

mikroiniekcja insuliny do hipokampa i mikrodializa in vivo podczas testów pamięci przestrzennej

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Metabolizm glukozy jest użytecznym markerem lokalnej aktywności neuronalnej, stanowiąc podstawę takich metod jak zastosowanie 2-deoksyglukozy oraz funkcjonalny rezonans magnetyczny. Jednakże stosowanie tych metod w modelach zwierzęcych wymaga znieczulenia, co zmienia stan mózgu i uniemożliwia pomiary behawioralne. Alternatywną metodą jest wykorzystanie mikrodializy in vivo do ciągłego pomiaru stężeń glukozy, mleczanu i powiązanych metabolitów w płynie pozakomórkowym mózgu u zwierząt budzących się i nieunieruchomionych. Technika ta jest szczególnie przydatna w połączeniu z zadaniami opierającymi się na konkretnych obszarach mózgu i/lub ostrymi manipulacjami farmakologicznymi; na przykład pomiary w hipokampie podczas zadania z pamięcią operacyjną przestrzenną (spontaniczna alternacja) wykazują spadek poziomu glukozy pozakomórkowej i wzrost poziomu mleczanu, co sugeruje nasilenie glikolizy1-3,4-5, a wewnątrzhipokampowe podanie insuliny zarówno poprawia pamięć, jak i zwiększa glikolizę w hipokampie6. Substancje takie jak insulina mogą być dostarczane do hipokampa za pomocą tej samej sondy do mikrodializy, która służy do pomiaru metabolitów. Wykorzystanie spontanicznej alternacji jako miary funkcji hipokampa ma na celu uniknięcie wszelkich czynników zakłócających wynikających ze stresowych motywatorów (np. wstrząsy stóp), unieruchomienia lub nagród (np. pokarm), z których każdy może zmienić zarówno wyniki zadania, jak i metabolizm; zadanie to zapewnia również pomiar aktywności motorycznej, co pozwala na kontrolę niespecyficznych efektów leczenia. Razem metody te umożliwiają bezpośredni pomiar zmiennych neurochemicznych i metabolicznych regulujących zachowanie.

Szczury powinny szybko dojść do siebie po zabiegu i być czujne, ruchliwe oraz aktywne w ciągu 30 min po zaprzestaniu znieczulenia. Wpływ zakrętki kaniuli powinien być minimalny, jeśli zabieg został przeprowadzony starannie i użyto minimalnej ilości cementu stomatologicznego. W przypadku zauważenia jakichkolwiek oznak infekcji podczas monitorowania pooperacyjnego lub jeśli szczur w jakikolwiek sposób wykazuje oznaki stresu lub dyskomfortu, należy natychmiast przerwać eksperyment; powinno to zdarzać się niezwykle rzadko. P...

Modulacja zależnej od hipokampa przestrzennej pamięci roboczej poprzez bezpośrednią mikroiniekcję wewnątrzhipokampalną, połączoną z następującą po niej mikrodializą in vivo w celu oznaczania metabolitów u świadomych, aktywnych behawioralnie zwierząt.

Mikroiniekcja insuliny do hipokampa i mikrodializa in vivo podczas testów pamięci przestrzennej

Metabolizm glukozy jest użytecznym markerem lokalnej aktywności neuronalnej, stanowiącym podstawę metod takich jak obrazowanie 2-deoksyglukozy oraz funkcjonalny rezonans magnetyczny ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar metabolizmu hipokampa podczas testów behawioralnych. Jest to realizowane poprzez chirurgiczne przygotowanie odpowiednio przygotowanego zwierzęcia z implantowaną kaniulą prowadzącą do mikrodializy. W dniu testów do kaniuli wprowadza się sondę do mikrodializy, a następnie potwierdza przepływ perfuzatu.Następnie pozwala się sondzie na równowagę, podczas gdy zwierzę przebywa w komorze kontrolnej. Ostatecznie stosuje się odpowiednie metody analityczne, na przykład reakcję z użyciem oksydazy glukozowej, NADP i NADPH oraz analizę fluorometryczną. Jeśli pomiar glukozy jest wykorzystywany do wykazania poziomu metabolizmu i/lub uwalniania neurochemicznego w całym okresie testowania, jednym z najtrudniejszych aspektów tej techniki jest ostrożność wymagana przy obchodzeniu się z rurkami do mikrodializy, ponieważ zwierzęta często przegryzają je lub plączą linie, jeśli nie zachowa się należytej staranności.Pierwszy raz zastosowałem mikrodializę hipokampa podczas testów behawioralnych w trakcie moich studiów doktoranckich; chcieliśmy sprawdzić, czy istniejące modele podaży glukozy były w rzeczywistości zgodne ze znanymi danymi psychologicznymi dotyczącymi usprawnienia pamięci przez glukozę. Metodologia ta pozwoliła nam wykazać, że istniejące modele podawania glukozy do mózgu były całkowicie błędne.Zgodnie ze standardowymi procedurami chirurgicznymi, przygotuj zwierzę, odsłoń czaszkę i wywierć otwory pod implantację kaniuli. Wprowadź kaniulę w wcześniej określonych współrzędnych, a następnie powoli opuść ją do docelowej głębokości. Po prawidłowym umiejscowieniu unieruchom kaniulę za pomocą cementu dentystycznego.W razie potrzeby użyj sterylnego szwu chirurgicznego, aby zamknąć ranę. Na koniec zastosuj stylet w celu utrzymania drożności kaniuli. Następnie przygotuj zestaw PERFUSE 8 do mikrodializy.Należy zaznaczyć, że dokładny skład płynu jest niezbędny dla uzyskania optymalnych wyników. W dniu przeprowadzenia testu należy dodać i całkowicie rozpuścić albuminę surowicy bydlęcej BSA. Po przygotowaniu PERFUSE eight należy przefiltrować przez filtr 0,2 mikrona.Następnie, używając alikwoty przygotowanego A ECF, należy sporządzić preparat do podania do mózgu (jeśli jest wymagany). W tym przypadku przygotowano insulinę do podania do hipokampa. Nową sondę i linię do mikrodializy należy przygotować w dniu poprzedzającym testy.Przygotuj dwie oddzielne linie dla dopływu i odpływu. Użyj rurek PE 50 do połączenia dwóch odcinków rurek FEP o długości jednego metra i upewnij się, że przestrzeń martwa między liniami jest minimalna. Rurki należy przyciąć zgodnie z rysunkiem, aby uzyskać skośne końce, co ułatwi ich włożenie do złączy PE 50.Podłącz przewód dopływowy do strzykawki Hamiltona o objętości 1 ml wypełnionej sterylną filtrowaną wodą dejonizowaną i przymocuj sondę do drugiego końca, aby zwierzę mogło swobodnie poruszać się podczas wykonywania pomiarów. Podłącz linie dopływową i odpływową do dwukanałowego obrotowego złącza (swivela). Następnie podłącz przewód odpływowy do pompy i uruchom ją z prędkością 1,5 µl/min, aż do momentu pojawienia się wody dejonizowanej w przewodzie odpływowym sondy.Wyłącz pompę i podłącz drugą linię między rurką odpływową a probówką do zbierania próbek. Przepuść przez rurkę 5 mL cieczy, a następnie pozostaw sondę na noc w fiolce zawierającej sterylną wodę dejonizowaną, dbając o to, aby końcówka sondy była stale mokra. Na 24 godziny przed testem przygotuj badanego osobnika poprzez usunięcie atrapy styletu i wprowadzenie sondy do mikrodializy przeznaczonej wyłącznie do tego celu.Przez kolejne 10 minut zastąp go atrapy i umieść szczura z powrotem w klatce. Alternatywnie, na tym etapie można zastosować nową sondę i pozostawić ją na miejscu, nie usuwając jej aż do momentu wykonania pomiarów. Następnego dnia.W dniu przeprowadzenia mikrodializy należy napełnić strzykawkę Hamiltona oraz fiolkę scyntylacyjną przefiltrowanym A ECF i pozwolić pompie na równoważenie przez jedną godzinę. W razie potrzeby należy napełnić drugą strzykawkę Hamiltona przygotowaną substancją leczniczą i umieścić ją w pompie strzykawkowej. Kluczem do sukcesu w tej procedurze jest zachowanie spokoju i bardzo delikatne obchodzenie się ze zwierzęciem.Należy zatem zachować spokój, poruszać się powoli i precyzyjnie, a przede wszystkim ćwiczyć. Po zakończeniu równoważenia należy wyjąć atrapy styletu i ostrożnie wprowadzić zrównoważoną sondę do mikrodializy do mózgu szczura za pomocą kaniuli. Następnie umieść szczura w przezroczystym plastikowym pudełku zawierającym część ściółki z jego klatki.Należy zadbać o przeciwwagę dla cewki. Do cewki na zewnątrz klatki przymocować probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,6 ml wypełnioną wodą w taki sposób, aby siła grawitacji zapobiegała załamaniu się linii mikrodializy, ale nie napinała ich. Pozostawić sondę i szczura do równowagi na dwie godziny.Na początku tego okresu potwierdź, że przepływ w urządzeniu Perfuse eight nie jest zablokowany. Aby to zrobić, zbierz odpływ z PERFUSE eight przez określony czas i zważ próbkę, aby potwierdzić, że z systemu wypływa oczekiwana objętość przed rozpoczęciem pobierania próbek. Upewnij się, że korelacja między dializą próbki a jej pobraniem została dokładnie obliczona.W tym układzie objętość między sondą a punktem poboru wynosi 30 µL przy szybkości przepływu 1,5 µL/min. Od momentu opuszczenia przez próbkę obszaru mózgu do jej pobrania upływa 20 minut. Po okresie równoważenia należy pobrać co najmniej trzy próbki, gdy szczur pozostaje w spoczynku w komorze domowej.Aby ustanowić stabilną linię bazową pomiarów przed testami behawioralnymi, należy dokładnie zaplanować czas dostarczenia preparatu do mózgu. W tej konfiguracji, gdzie objętość między końcówką strzykawki a sondą wprowadzoną do mózgu zwierzęcia wynosi 30 µL, wymieniamy strzykawkę z preparatem na roztwór profuse eight na 20 minut przed planowanym czasem dotarcia preparatu do hipokampa.Należy po prostu odłączyć linię dopływową od strzykawki kontrolnej systemu PERFUSE 8 i szybko podłączyć ją do strzykawki traktowanej systemu PERFUSE 8. Operacja ta nie powinna trwać dłużej niż pięć sekund, aby uniknąć przerwania przepływu w systemie PERFUSE 8. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza, które mogłyby obniżyć skuteczność w odpowiednim przedziale czasowym.Po podaniu terapii delikatnie przenieś szczura do wybranego aparatu do testów behawioralnych. W tym przypadku spontaniczna alternacja jest mierzona w labiryncie w kształcie znaku plus. Pozostaw zwierzę do swobodnej eksploracji labiryntu przez 20 minut.Zapisz sekwencję i czas trwania ramienia Aries, korzystając z nagrania wideo lub notując dane ręcznie w celu pobrania próbek. W tym czasie przenieś rurkę odpływową do nowej probówki zbiorczej. Co pięć minut przytrzymuj rurkę w taki sposób, aby mogła się ona swobodnie poruszać.Urządzenie nie powinno utrudniać poruszania się szczura ani przemieszczać się przed zwierzęciem; należy pozostać w bezruchu, aby Twoje ruchy nie wpływały na zachowanie szczura. Po zakończeniu testu delikatnie wyjmij szczura z labiryntu i przenieś go z powrotem do komory kontrolnej. Kontynuuj pobieranie próbek z mikrodializy, aż uzyskasz co najmniej cztery próbki, aby objąć okres regeneracji po wykonaniu zadania.Po pobraniu odpowiednich próbek ostrożnie usuń sondę z głowy zwierzęcia i umieść ją w fiolce do przechowywania. Przenieś zwierzę z powrotem do jego klatki i uważnie obserwuj go pod kątem wszelkich zmian w stanie zdrowia lub zachowaniu po zakończeniu eksperymentu. Na koniec przemyj cewkę, podłączając strzykawkę zawierającą roztwór catho, aby zapobiec wzrostowi drobnoustrojów.Ten przykład przedstawia związany z zadaniem spadek poziomu glukozy w płynie zewnątrzkomórkowym (ECF) hipokampa. Szary obszar oznacza czas, który zwierzę spędziło w labiryncie. Fioletowa linia pokazuje poziom glukozy w hipokampie u zwierząt, które nie przechodziły testu w labiryncie, natomiast czerwona linia reprezentuje zwierzęta wykonujące zadanie spontanicznej alternacji przedramion.Pomarańczowa linia przedstawia pomiary u zwierząt wykonujących łatwiejszą, trzyramienną wersję tego zadania. Tutaj widoczne są zmiany w poziomach glukozy i mleczanu w hipokampie po podaniu insuliny. Należy zauważyć, że zmiany te występują bez żadnych testów behawioralnych, a zatem odzwierciedlają wpływ samej insuliny w warunkach bazowych.Podczas wykonywania tej procedury niezwykle ważne jest zachowanie spokoju. Szczury potrafią wyczuć stres eksperymentatora, co prowadzi do ich pobudzenia, a to może znacznie utrudnić pracę i prawdopodobnie zaburzyć wyniki. Połączenie tych technik umożliwiło dokładne badanie neurochemiczne procesów behawioralnych.Podobne techniki są obecnie stosowane również u pacjentów. Na przykład pacjenci z epilepsją, u których wszczepiono elektrody w celu zlokalizowania ogniska napadów, mogą mieć również wszczepione kaniule do mikrodializy, aby umożliwić pomiary metaboliczne.

hippocampal-insulin-microinjection-vivo-microdialysis-during-spatial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wstrzyknięcie insuliny do zakrętu hipokampalnego i in vivo mikrodializa w czasie testu pamięci przestrzennej

Źródło: Provenzano, G.,  i wsp. Immunohistochemiczna wizualizacja aktywności neuronów hipokampa po uczeniu przestrzennym w mysim modelu zaburzeń neurorozwojowych. J. Vis. Exp. (2015)Ten film przedstawia obrazowanie immunohistochemiczne w celu wizualizacji aktywacji neuronów hipokampa. Poplamione skrawki mózgu ujawniają ciemniejsze obszary pod mikroskopem jasnego pola, co wskazuje na aktywowane neurony.

Obrazowanie aktywacji neuronów hipokampa w sekcjach mózgu myszy

MikroRNA odgrywają znaczącą rolę w strukturze i funkcjonowaniu mózgu. Tutaj opisujemy metodę wymuszania nadmiernej ekspresji miRNA w hipokampie za pomocą stereotaktycznego wstrzykiwania zmodyfikowanego lentiwirusa wykazującego ekspresję miRNA. Podejście to może służyć jako stosunkowo szybki sposób oceny skutków in vivo nadmiernej ekspresji miRNA w określonych regionach mózgu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusów eksprymujących mikroRNA do regionu CA1 hipokampa myszy i ocena wyniku behawioralnego

Celem tego protokołu jest zbadanie poznania przestrzennego u gryzoni. Wodny labirynt z podwójnym H to nowatorski test, który jest szczególnie przydatny do wyjaśnienia różnych elementów uczenia się, konsolidacji i pamięci, a także wzajemnego oddziaływania systemów pamięci.

Labirynt Double-H: solidny test behawioralny do uczenia się i pamięci u gryzoni

Opisujemy protokół immunohistochemiczny do badania profilu aktywacji neuronów hipokampa po ekspozycji na zadanie uczenia przestrzennego w modelu mysim charakteryzującym się deficytami poznawczymi pochodzenia neurorozwojowego. Protokół ten może być stosowany zarówno do genetycznych, jak i farmakologicznych modeli myszy charakteryzujących się deficytami poznawczymi.

Immunohistochemiczna wizualizacja aktywności neuronów hipokampa po uczeniu przestrzennym w mysim modelu zaburzeń neurorozwojowych

Podczas gdy obrazowanie wielofotonowe jest skuteczne tylko na ograniczonych głębokościach od powierzchni tkanki, możliwe jest osiągnięcie obrazowania o rozdzielczości 3 μm na dowolnej głębokości za pomocą pCLE. W tym miejscu przedstawiamy protokół do przeprowadzania obrazowania pCLE w celu pomiaru dynamiki mikronaczyniowej w hipokampie myszy ictal i dzikich myszy.

Przedkliniczna konfokalna endomikroskopia laserowo-skaningowa (pCLE) in vivo sprzężona z włóknami światłowodowymi naczyń włosowatych hipokampa u obudzonych myszy

Ta metoda opisuje chroniczne przygotowanie, które umożliwia optyczny dostęp do hipokampa żywych myszy. Preparat ten może być stosowany do wykonywania podłużnego obrazowania optycznego plastyczności strukturalnej neuronów i plastyczności komórkowej wywołanej aktywnością przez okres kilku tygodni.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy

Ten artykuł przedstawia eksperymentalne procedury oceny zaburzeń pamięci u myszy z padaczką wywołaną pilokarpiną. Protokół ten może być wykorzystany do badania patofizjologicznych mechanizmów spadku funkcji poznawczych związanego z padaczką, który jest jedną z najczęstszych chorób współistniejących w padaczce.

Ocena funkcji pamięci u myszy z padaczką indukowaną pilokarpiną

Przedstawiony tutaj protokół dostarcza informacji na temat jednoczesnej elektroencefalografii (EEG) i oceny behawioralnej w czasie rzeczywistym. Omówiliśmy wszystkie kroki związane z tym protokołem jako atrakcyjnym rozwiązaniem dla badaczy z wielu dziedzin neuronauki, szczególnie w obszarach uczenia się i pamięci.

Jednoczesne monitorowanie bezprzewodowego testu elektrofizjologii i pamięci behawioralnej jako narzędzia do badania neurogenezy hipokampa

Ten artykuł ma na celu opisanie systematycznego protokołu uzyskiwania poziomych wycinków mózgu hipokampa u myszy. Celem tej metodologii jest zachowanie integralności szlaków włókien hipokampa, takich jak ścieżka perforantu i szlak włókien omszałych, w celu oceny procesów neurologicznych związanych z zakrętem zębatym.

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Ten artykuł demonstruje przygotowanie specjalnego okna obrazowania uzupełnionego o kaniulę infuzyjną i jej implantację w regionie CA1 hipokampa u myszy.

Procedura kraniotomii do wizualizacji aktywności neuronalnej w hipokampie zachowujących się myszy

Ten artykuł opisuje metodę przewlekłej obserwacji in vivo spoczynkowego mikrogleju w mysim hipokampie CA1 przy użyciu precyzyjnie kontrolowanej chirurgii i mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Przewlekłe dwufotonowe obrazowanie mikrogleju w hipokampie myszy

Poznaj mikroiniekcję insuliny i mikrodializę in vivo w hipokampie do badania pamięci przestrzennej. Ta metoda pozwala mierzyć metabolizm mózgu podczas zadań behawioralnych u świadomych zwierząt.

Mikroiniekcja insuliny do hipokampa i mikrodializa in vivo podczas testów pamięci przestrzennej

Przeglądaj więcej filmów