Implantacja światłowodu do przewlekłej stymulacji optogenetycznej tkanki mózgowej

Celem poniższego eksperymentu jest aktywacja i długoterminowe badanie obwodów neuronalnych u obudzonych, zachowujących się myszy. Metoda ta jest zaadaptowana z koncepcji pierwotnie opisanej w Sparta etal. Osiąga się to poprzez najpierw zmontowanie przewodu światłowodowego, który łączy optyczne złącze obrotowe z implantem światłowodowym.

Następnie światłowód jest wszczepiany w tkankę mózgową będącą przedmiotem zainteresowania, aby stworzyć przejście, przez które światło może przemieszczać się bezpośrednio do kanału neuronów wyrażających redinę. Na koniec źródło światła jest połączone z optycznym przegubem obrotowym w celu stworzenia szeregowo połączonej ścieżki od źródła światła do tkanki mózgowej. Ostatecznie, indukowane światłem wypalanie neuronów eksprymujących kanał redzyny można ocenić na podstawie badań in vivo, elektrofizjologii i badań behawioralnych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak kaniule prowadzące, jest to, że minimalizuje ona uszkodzenia tkanki mózgowej spowodowane wielokrotnym wprowadzaniem i usuwaniem światłowodu. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w funkcję obwodów neuronalnych, można ją również zastosować do innych systemów, aby lepiej zrozumieć mechanizmy zależne od synaps i obwodów, które leżą u podstaw niektórych rodzajów zaburzeń neurologicznych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie.

Ponieważ etapy implantacji są trudne do opanowania, każdy pozornie niewielki krok w znacznym stopniu przyczynia się do ogólnej stabilności i niezawodności metody. Zacznij od wycięcia 35 milimetrów światłowodu o średnicy 125 mikronów z rdzeniem o średnicy 100 mikronów, umieszczając rysik z węglika spiekanego z końcówką klinową prostopadle do światłowodu i nacinając włókno jednym jednokierunkowym ruchem, a następnie wyciągając prosto. Teraz włóż dziki ceramiczny lc o średnicy 127 mikronów wypukłą stroną skierowaną w dół do imadła, a następnie włóż kawałek światłowodu do dzikiego.

Światłowód powinien wsuwać się płynnie i nieznacznie wystawać poza wypukły koniec dzikiego. Następnie nałóż jedną kroplę świeżo przygotowanej, utwardzanej termicznie żywicy epoksydowej światłowodowej na płaski koniec dzikiego, a następnie nałóż opalarkę na żywicę epoksydową. Żywica epoksydowa powinna wypełniać dziki, gdy jest podgrzewana i utwardza się, gdy zmieni kolor na.

Po utwardzeniu oczyść żywicę epoksydową z boków dzikiego, a następnie za pomocą tarczy polerskiej z włókna LC wykonaj okrągłe wzory obrotu, aby wypolerować wypukły koniec dzikiego na tlenku glinu Arkusze polerskie na podkładce polerskiej na czterech malejących stopniach. Następnie przytnij światłowód na płaskim końcu do odpowiedniej długości, aby wycelować w obszar zainteresowania. Aby przetestować polerowany światłowód, włóż polerowany koniec implantu do tulei łącznika.

Dopóki nie poczujesz bezpośredniego kontaktu z przeciwległym dzikim implantem, zły implant będzie miał słaby punkt ogniskowy w pobliżu końcówki światłowodu, podczas gdy dobry implant będzie przesyłał gładki koncentryczny krąg światła bez wyjścia. Moc do 10 miliwatów pozwala przechowywać gotowe implanty w piance do czasu użycia. Rozpocznij ten krok od zmierzenia, a następnie nacięcia światłowodu o średnicy 220 mikronów z rdzeniem o średnicy 200 mikronów, aby umożliwić myszowi swobodne poruszanie się, ale nie pozwolić myszy na żucie włókna.

Następnie włóż światłowód do kawałka rurki furacyjnej o średnicy wewnętrznej nieco większej i długości nieco krótszej niż w przypadku światłowodu. Teraz zdejmij około 25 milimetrów z jednego końca światłowodu i włóż go do metalowego końca wielomodowego zespołu dzików FC MM. Z otworem o średnicy 230 mikronów, aż się zatrzyma, światłowód powinien wystawać przez dziki koniec.

Następnie zabezpiecz połączenie cyjanoakrylanem na metalowym końcu i zakryj połączenie łącznikiem Boot wypoleruj dziki koniec tarczą polerską FC, jak pokazano. Po zdjęciu drugiego końca światłowodu, włóż go do dziękowego lc ceramicznego tylko wypukłym końcem. Następnie nałóż kroplę żywicy epoksydowej na płaski koniec i podgrzewaj, aż utwardzi się, jak pokazano.

Po wypolerowaniu wypukłego końca dzikiego, jak właśnie pokazano, nasuń tuleję zdziczałego lc na wypukły koniec dzikiego, aż dzikus osiągnie środek rękawa. Następnie umieść rurkę termokurczliwą na rurce i tulei i podgrzej rurkę termokurczliwą, aby zabezpieczyć i zabezpieczyć połączenie. Na koniec podłącz dzikusa do źródła lasera, a następnie przetestuj go, mierząc strumień świetlny przez łącznik za pomocą spektrofotometru, utrata światła między mocą lasera a zmierzoną mocą sprzęgacza nie powinna przekraczać 30% przed rozpoczęciem operacji.

Zdezynfekować obszar operacyjny alkoholem o profilu ipo, a następnie roztworem chlorheksydyny. Następnie umieść mysz w stereotaktycznym zestawie i zabezpiecz głowę, upewniając się, że czaszka jest wypoziomowana. Nałóż maść okulistyczną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu i bólowi pooperacyjnemu.

Teraz wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry głowy, aby odsłonić czaszkę z oczodołów do szwu lambda. Użyj zacisków serafinowych, aby powstrzymać skórę i utrzymać dostęp do czaszki. Następnie użyj wykałaczki dentystycznej, aby wytrawić wzór w kratkę na całej powierzchni czaszki.

Zmyj powstałe zanieczyszczenia sterylną solą fizjologiczną. Po dokładnym wyschnięciu użyj bawełnianego wacika, aby nałożyć 3% nadtlenek wodoru na odsłoniętą czaszkę przez około dwie do trzech sekund, aby utworzyć mikropory. Następnie kilkakrotnie umyj czaszkę bardziej sterylną solą fizjologiczną i dokładnie ją wysusz.

Po wytrawieniu, umyciu i wysuszeniu wzoru szachownicy w czaszce, ponownie włóż światłowodowy implant zdziczałego do uchwytu sondy, a następnie podłącz go do ramienia stereotaktycznego. Określ położenie otworu wiertła za pomocą atlasu stereotaktycznego skalibrowanego na bgma i lambda. Następnie użyj obrotowej wiertarki dentystycznej, aby wykonać kraniotomię z małym otworem na wiertło o średnicy mniejszej niż jeden milimetr nad obszarem zainteresowania, uważając, aby nie złamać opony twardej ani nie uszkodzić żadnej tkanki.

Za pomocą ramienia stereotaktycznego umieść implant bezpośrednio nad obszarem zainteresowania, dzikus powinien spoczywać na otaczającej tkance czaszki. Teraz za pomocą sterylnej wykałaczki nałóż cienką, równą warstwę świeżo przygotowanego cementu dentystycznego na czaszkę i na dolną część implantu. Uważając, aby nie wejść w kontakt ze skórą zwierzęcia, podstawowa warstwa cementu dentystycznego powinna pokrywać jak największą powierzchnię czaszki.

Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest nałożenie cementu dentystycznego bez dotykania przez niego masowej skóry. Aby zapewnić sukces, nakładaj niewielkie ilości cementu na raz cienkimi warstwami i poczekaj, aż każda warstwa całkowicie wyschnie przed dodaniem kolejnej. Nałóż równe warstwy cementu dentystycznego, aby utworzyć mały wzgórek na wierzchu czaszki i wokół implantu.

Pozostaw trzy do pięciu milimetrów wypukłego końca dzikiego cementu czystego z cementu, aby umożliwić gładkie, niezakłócone połączenie. Następnie zszyj skórę głowy nad wzgórkiem cementu dentystycznego i wokół implantu, klej do wiązania weterynaryjnego może być użyty do dodatkowego wiązania po zszyciu. Na koniec nałóż miejscowe środki przeciwbólowe i antybiotyki na skórę szwu i wokół podstawy implantu, a następnie umieść mysz w klatce w celu rekonwalescencji pooperacyjnej.

Prawidłowy montaż implantu światłowodowego i sprzęgacza skutkuje minimalnymi stratami fotonów pomiędzy źródłem światła a końcem światłowodu w obszarze zainteresowania. Podczas gdy polerowane światłowody powinny przepuszczać światło w jednolitym koncentrycznym okręgu podobnym do pokazanego tutaj okręgu, jak widać na tym obrazie przy starannej implantacji i szyciu, implant nie powoduje widocznego podrażnienia myszy i może pozostać na miejscu przez długotrwałe badania bez znaczącej degradacji światłowodu lub ilości przesyłanego światła Funkcjonalne testy behawioralne u obudzonej myszy wykazują bezpośrednią reakcję na stymulację Za pomocą światłowodu wszczepionego przez korę ruchową, o czym świadczą dane wideo z elektrofizjologii in vivo pokazujące aktywację docelowych neuronów przez implant i reakcję behawioralną zwierzęcia podczas stymulacji mózgu. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak fotostymulacja docelowych obszarów mózgu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jakie są wzorce połączeń obwodów związanych z komórkami docelowymi?

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak montować implanty światłowodowe i przewody sprzęgające oraz jak wszczepiać je na portery optogenetyczne wyrażające tkankę mózgową.