Name: Implantacja światłowodu do przewlekłej stymulacji optogenetycznej tkanki mózgowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Poznaj metodę implantacji światłowodu do przewlekłej stymulacji optogenetycznej neuronów u myszy. Technika ta minimalizuje uszkodzenia tkanki mózgowej i umożliwia badanie funkcji obwodów neuronalnych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy potwierdzić, że ta technika została pierwotnie opisana przez Sparta et al., 2012 i została łatwo zaadaptowana do użytku w naszym laboratorium.

*Wszystkie materiały wraz z odpowiednimi producentami i/lub dostawcami są wymienione poniżej protokołu.
1. Montaż implantu
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę utwardzalnej termicznie żywicy epoksydowej do światłowodów, dodając 100 mg utwardzacza do 1 g żywicy.</li>
	<li>Odmierzyć i odciąć około 35 mm światłowodu o średnicy 125 μm i rdzeniu 100 μm, nacinając go węglikowym skryberem z klinowym grotem. Ustawić skryber prostopadle do światłowodu i naciąć go jednym, jednokierunkowym ruchem. Całkowite przecięcie światłowodu uszkodzi jego rdzeń.</li>
	<li>Włożyć ceramiczną ferrulę LC o średnicy otworu 127 μm do imadła, stroną wypukłą skierowaną w dół.</li>
	<li>Wsunąć światłowód do ferruli. Światłowód powinien gładko wejść do środka i nieznacznie wystawać poza wypukły koniec ferruli (Rysunek 1a).</li>
	<li>Nanieść jedną kroplę utwardzalnej termicznie żywicy epoksydowej na płaski koniec i podgrzewać opalarką, aż żywica stanie się czarna. Żywica powinna wypełnić ferrulę podczas podgrzewania i przed utwardzeniem. Utwardzanie żywicy powinno nastąpić w ciągu ~1 min stałego przykładania ciepła.</li>
	<li>Usunąć nadmiar żywicy z boków ferruli, ponieważ będzie ona utrudniać połączenie ze sprzęgaelem.</li>
	<li>Wypolerować wypukły koniec ferruli za pomocą dysku polerskiego do światłowodów LC (FOPD) na arkuszach polerskich z tlenku glinu umieszczonych na podkładce polerskiej (Rysunek 1b). Wykonywać okrężne ruchy obrotowe i polerować na czterech stopniach ziarnistości w następującej kolejności: 5, 3, 1 i 0,3 μm.</li>
	<li>Odciąć światłowód na płaskim końcu do odpowiedniej długości, tak aby celował w obszar zainteresowania. Długość można określić korzystając z atlasu stereotaktycznego.</li>
	<li>Przetestować implant, podłączając go do lasera za pomocą przewodu sprzęgającego opisanego poniżej. Wypolerowany koniec implantu należy wsunąć w tuleję sprzęgała, tak aby stykał się bezpośrednio z przeciwległą ferrulą. Implant powinien być w stanie utrzymać moc wyjściową światła 10 mW, mierzoną na końcówce światłowodu implantu. Wadliwy implant będzie miał słabo zogniskowany punkt w pobliżu końcówki światłowodu.</li>
	<li>Przechowywać gotowe implanty (Rysunek 1c) w piance do momentu użycia.</li>
</ol>
2. Montaż przewodu sprzęgacza światłowodowego
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę utwardzalnej ciepłem żywicy epoksydowej do światłowodów zgodnie z powyższą instrukcją.</li>
	<li>Odmierzyć i odciąć odpowiednią długość światłowodu 220 μm z rdzeniem 200 μm, nacinając go rysikiem z węglika o klinowym grocie. Długość światłowodu powinna umożliwiać myszy swobodne poruszanie się wokół obudowy, ale nie pozwalać jej na przegryzienie światłowodu.</li>
	<li>Wsunąć światłowód do odcinka rurki rozdzielczej o długości nieco większej niż długość światłowodu. Rurka powinna mieć średnicę wewnętrzną nieco większą niż średnica światłowodu.</li>
	<li>Zdjąć izolację z ok. 25 mm jednego końca światłowodu i wsunąć go do metalowej części zespołu ferula FC MM dla światłowodów wielomodowych z otworem 230 μm, aż do oporu. Światłowód powinien wystawać przez koniec ferula (Rysunek 2a).</li>
	<li>Zabezpieczyć połączenie cyjanoakrylanem (super glue) przy metalnym końcu. Przykryć połączenie osłoną złącza (Connector Boot) i wypolerować koniec ferula za pomocą FC FOPD. Wykonywać ruchy obrotowe, polerując na czterech stopniach ziarnistości w następującej kolejności: 5, 3, 1, 0.3 μm (Rysunek 2b).</li>
	<li>Zdjąć izolację z drugiego końca światłowodu i wsunąć go do ceramicznego ferula LC (średnica wewnętrzna otworu 230 μm) końcem wypukłym skierowanym na zewnątrz. Nanieść kroplę żywicy epoksydowej na płaski koniec i podgrzać do utwardzenia.</li>
	<li>Wypolerować wypukły koniec ferula za pomocą FC FOPD na arkuszach polerskich z tlenku glinu, zgodnie z powyższym opisem.</li>
	<li>Nasunąć tulejkę ferula LC na wypukły koniec ferula do połowy długości tulejki.</li>
	<li>Nałożyć rurkę termokurczliwą na rurkę rozdzielczą i tulejkę, a następnie podgrzać w celu zabezpieczenia i ochrony połączenia (Rysunek 2c).</li>
	<li>Przetestować sprzęgacz, podłączając go do źródła laserowego i mierząc wyjście światła przez sprzęgacz za pomocą spektrofotometru. Strata światła między wyjściem lasera a zmierzonym wyjściem sprzęgacza nie powinna przekraczać 30%.</li>
</ol>
3. Implantacja chirurgiczna
*Jest to procedura zawierająca wyłącznie wskazówki. Instrumenty są sterylne, jednak rękawiczki nie muszą takie być ze względu na ciągłe manipulacje między instrumentami a sprzętem.
<ol>
	<li>Zanurz mysz w narkozie poprzez podanie dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszaniny ketaminy i ksylazyny w dawkach odpowiednio 100 i 10 mg/kg za pomocą igły 30G.</li>
	<li> hãy Wygoń skórę głowy za pomocą trymera. Przetrzyj skórę głowy 70% alkoholem izopropylowym, a następnie gazikiem Betasept (4% roztwór chlorheksydyny) przez dwie minuty, powtarzając czynność raz.</li>
	<li> Umieść mysz w aparacie stereotaktycznym i unieruchom głowę, upewniając się, że czaszka jest w poziomie. Nałóż do oczu maść oftalmiczną, aby zapobiec wysychaniu i bólowi pooperacyjnemu. Podtrzymuj narkozę za pomocą odparowanego izofluranu (1-3% rozcieńczonego tlenem, zależnie od stanu fizjologicznego myszy, który należy stale monitorować, sprawdzając reakcję na uszczypnięcie w ogon).</li>
	<li> Wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy, odsłaniając czaszkę od oczodołów do lambda. W razie potrzeby odsuń tkankę łączną.</li>
	<li> Użyj klamer Serafina, aby odsunąć skórę i utrzymać dostęp do czaszki (Rysunek 3a).</li>
	<li> Za pomocą zgłębika stomatologicznego wykonaj rytowanie w kratkę na całej powierzchni czaszki. Wypłucz odpryski sterylną solą fizjologiczną. Dokładnie osusz.</li>
	<li> Nałóż nadtlenek wodoru (3%) na odsłoniętą czaszkę za pomocą patyczka kosmetycznego przez ok. 2-3 s, aby stworzyć mikropory. Wypłucz kilkukrotnie i dokładnie osusz. Alternatywnie, zgodnie z opisem u Sparta et al. (2012), do czaszki można wkręcić kotwice.</li>
	<li> Ponownie wykonaj rytowanie w kratkę na całej powierzchni czaszki zgłębikiem stomatologicznym i wypłucz odpryski solą fizjologiczną. Dokładnie osusz.</li>
	<li> Za pomocą narzędzia rotacyjnego wykonaj małą trepanację otworem wiertniczym (&lt;1 mm średnicy), używając sterylnego wiertła (autoklawowanego), nad obszarem zainteresowania wyznaczonym za pomocą atlasu stereotaktycznego skalibrowanego do bregma i lambda. Należy uważać, aby nie przebić opony twardej ani nie uszkodzić żadnej tkanki. Wypłucz odpryski i dokładnie osusz.</li>
	<li> Włóż ferrulę światłowodową (implant) do uchwytu sondy i podłącz do ramienia stereotaktycznego.</li>
	<li> Za pomocą ramienia stereotaktycznego umieść implant bezpośrednio nad obszarem zainteresowania (Rysunek 3b). W przypadku wprowadzania światłowodu w tkankę mózgową, należy go posuwać powoli z prędkością ok. 2 mm/min. Ferrula powinna opierać się o pozostałą część czaszki.</li>
	<li> Przygotuj mieszankę cementu stomatologicznego. Mieszanka powinna mieć dostatecznie niską lepkość, aby można ją było łatwo nałożyć na czaszkę. Mieszanka będzie zdatna do użycia przez 2-4 min.</li>
	<li> Używając sterylnej wykałaczki, nałóż cienką, równą warstwę cementu stomatologicznego na czaszkę oraz na dolną część implantu. Warstwa bazowa cementu stomatologicznego powinna pokrywać jak największą powierzchnię czaszki. Nie dopuść do kontaktu cementu stomatologicznego ze skórą myszy. Doprowadzi to do zwiększenia trudności przy szyciu oraz do podrażnienia zwierzęcia. Jeśli cement stomatologiczny dostanie się na skórę, odczekaj do jego częściowego wyschnięcia, tak aby całą warstwę cementu można było odkleić przed jego pełnym utwardzeniem.</li>
	<li> Pozostaw do całkowitego wyschnięcia.</li>
	<li> Nakładaj równomierne warstwy cementu stomatologicznego, formując niewielki kopczyk nad czaszką i wokół implantu, pozwalając każdej warstwie całkowicie wyschnąć (Rysunek 3c). Pozostaw ok. 3-5 mm wypukłego końca ferruli bez cementu, aby umożliwić gładkie i niezakłócone połączenie.</li>
	<li> Zaszyj skórę głowy nad kopczykiem cementu stomatologicznego i wokół implantu, używając sterylnych, jednorazowych jedwabnych nici plecionych (6-0) z igłą C22. Usuń szwy po 7 dniach. Opcjonalnie: użyj kleju Wet Bond do dodatkowego wiązania po zaszyciu. Należy użyć minimalnej ilości Wet Bond. Nadmiar może prowadzić do poważnych uszkodzeń skóry wskutek drapania.</li>
	<li> Bezpośrednio po operacji należy podać myszy podskórnie ketoprofen (5 mg/kg) w celu zmniejszenia bólu pooperacyjnego. Czynność tę należy powtórzyć po 24 h. Na zaszytą skórę oraz wokół podstawy implantu nałóż miejscowe środki przeciwbólowe (bupiwakaina) i antybiotyki (Neosporin).</li>
	<li> Umieść mysz w klatce na macie grzewczej w celu wybudzenia z narkozy. Umieść mysz w sterylnej klatce do rekonwalescencji pooperacyjnej. Klatka ta nie powinna zawierać ściółki, aby utrzymać temperaturę i uniknąć uduszenia. Po przebudzeniu mysz można przenieść do pierwotnej klatki lub nowej.</li>
</ol>
Prawidłowy montaż implantu światłowodowego i sprzęgacza skutkuje minimalną stratą fotonów pomiędzy źródłem światła a końcem światłowodu w obszarze zainteresowania. Dobrze wypolerowane światłowody powinny transmitować światło w postaci równomiernego, koncentrycznego okręgu (Rysunek 2d). Przy starannym implantowaniu i szyciu implant nie powoduje widocznych podrażnień u myszy i może pozostać na miejscu podczas długoterminowych badań (Rysunek 3d, &gt;1 miesiąc, obserwacje niepublikowane) bez istotnej degradacji światłowodu lub ilości transmitowanego światła. Nieprawidłowa implantacja lub szycie mogą powodować podrażnienia i prowadzić do drapania przez mysz skóry głowy, odsłonięcia cementu dentystycznego lub odłamania tulei od cementu dentystycznego w wyniku ciągłych manipulacji. Schemat zmontowanego systemu przedstawiono na Rysunku 4.
<img alt="Proces przygotowania światłowodu; obejmuje cięcie tulejki, użycie tarczy polerskiej oraz utwardzanie epoksydowe." src="/files/ftp_upload/50004/50004fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Montaż implantowalnych światłowodów. (a) Światłowód jest wkładany do tulejki, wystając nieznacznie poza wypukły koniec wskazany grotem strzałki. (b) Wypukły koniec tulejki jest polerowany za pomocą FOPD na arkuszach polerskich o progresywnie drobniejszej ziarnistości. (c) Gotowy implantowalny światłowód. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50004/50004fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek</a>.
<img alt="Przygotowanie światłowodu z osłoną złącza, polerowanie tulei, tulejka LC i koncentryczne światło." src="/files/ftp_upload/50004/50004fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Montaż sprzęgacza światłowodowego używanego do połączenia obrotowego złącza światłowodowego z implantem. (a) Światłowód wystający przez zespół tulei. (b) Strona tulei zespołu jest wkładana do FOPD i polerowana przy użyciu papieru ściernego o stopniowo drobniejszej ziarnistości. (c) Tulejka światłowodowa jest nakładana na tuleję i mocowana za pomocą rurki termokurczliwej. (d) Gotowy sprzęgacz światłowodowy powinien emitować koncentryczne światło z minimalną stratą fotonów.
<img alt="Przygotowanie do operacji okna czaszkowego u myszy w badaniu obrazowania mózgu in vivo; przedstawiono procedurę krok po kroku." src="/files/ftp_upload/50004/50004fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Chirurgiczna implantacja światłowodów. (a) Cała powierzchnia czaszki zostaje odsłonięta, a tkanka łączna usunięta. (b) Implant światłowodowy jest utrzymywany w pozycji za pomocą ramienia stereotaktycznego. (c) Cement dentystyczny zostaje naniesiony w celu utrwalenia implantu światłowodowego do czaszki. (d) &gt;1 miesiąc po implantacji skóra wokół implantu uległa zagojeniu i nie wykazuje oznak podrażnienia.
<img alt="Układ optogenetyczny z laserem półprzewodnikowym i implantem światłowodowym u gryzonia do stymulacji neuronalnej." src="/files/ftp_upload/50004/50004fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Schemat funkcjonalny systemu

<ol><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Light-Induced+Activation+of+Neural+Circuitry+in+Trangenic+Mice+Expressing+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 (2007).</li>
<li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 165-16 (2010).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li>
<li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits%3A+technology+for+probing+mammalian+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).</li>
<li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450, 420-424 (2007).</li>
<li>Sparta, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).</li>
<li>Stuber, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+transmission+from+the+amygdala+to+nucleus+accumbens+facilitates+reward+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking.</a> Nature. 475, 377-380 (2011).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+a+hippocampal+engram+activates+fear+memory+recall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall.</a> Nature. 484, 381-385 (2012).</li>
</ol>

Optogenetyka to nowa, potężna technika, która pozwala na bezprecedensową kontrolę nad określonymi podtypami neuronów. Można to wykorzystać do modulowania obwodów neuronalnych z anatomiczną i czasową precyzją, unikając jednocześnie bezkrytycznych i inwazyjnych skutków stymulacji elektrycznej za pomocą elektrody dla typu komórkowego. Implantacja światłowodów pozwala na konsekwentną, przewlekłą stymulację obwodów nerwowych przez wiele sesji u rozbudzonych, zachowujących się myszy przy minimalnym uszkodzeniu tkanek. System t...

LC <table><tbody><tr><td>Ferrule Sleeve</td><td>Precision Fiber Products (PFP)</td><td>SM-CS125S</td><td>1,25 mm ID</td></tr><tr><td>FC MM Wstępnie zmontowane złącze</td><td>PFP</td><td>MM-CON2004-2300</td><td>230 &mu; m Tulejka</td></tr><tr><td>FC MM Złącze wstępnie konfekcjonowane</td><td>PFP</td><td>MM-CON2004-2300</td><td>230 &mu; m Tuleja</td></tr><tr><td>Miller FOPD-LC Tarcza</td><td>PFP</td><td>M1-80754</td><td>Do tulejek LC</td></tr><tr><td>Rurki furkacyjne</td><td>PFP</td><td>FF9-250</td><td>900 &mu; m o.d., 250 &MU; m i.d.</td></tr><tr><td>Okucie sztyftowe MM LC 1,25 mm</td><td>PFP</td><td>MM-FER2007C-1270</td><td>127 &mu; m Średnica wewnętrzna</td></tr><tr><td>MM LC Tuleja sztyftowa 1,25 mm</td><td>PFP</td><td>MM-FER2007C-2300</td><td>230 &mu; m ID Bore</td></tr><tr><td>Heatutwardzalny żywica epoksydowa, utwardzacz i żywica</td><td>PFP</td><td>ET-353ND-16OZ</td><td></td></tr><tr><td>FC / PC i SC / PC Złącze Dysk polerski</td><td>ThorLabs</td><td>D50-FC</td><td>do okuć FC</td></tr><tr><td>Cyfrowy miernik mocy optycznej i energii</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D</td><td>Spektrofotometr</td></tr><tr><td>Podkładka polerska</td><td>ThorLabs</td><td>NRS913</td><td>9 "x 13" 50 Twardość</td></tr><tr><td>Arkusze docierania (polerowania) tlenku glinu: 0,3, 1, 3, 5 i mu; m ziarnistości</td><td>ThorLabs</td><td>LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P</td><td></td></tr><tr><td>Standardowa twarda okładzina Włókno wielomodowe</td><td>ThorLabs</td><td>BFL37-200</td><td>Low OH, 200 &mu; m Rdzeń, 0,37 NA</td></tr><tr><td>Narzędzie do usuwania włókien</td><td>ThorLabs</td><td>T10S13</td><td>Plater/Powłoka: 200 &mu; m / 300 &mu; m</td></tr><tr><td>Światłowód SILICA/SILICA</td><td>Polymicro Technologies</td><td>FVP100110125</td><td>Wysoko-OH, wzmocnione promieniowaniem UV, 0,22 NA</td></tr><tr><td>1x1 światłowodowe soczewki</td><td>doryczne</td> ze złączem obrotowym <td>FRJ_FC-FC</td><td></td></tr><tr><td>Mono Patchcord światłowodowy</td><td>soczewki doryckie</td><td>MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC</td><td></td></tr><tr><td>Rurka termokurczliwa, 1/8 cala</td><td>Allied Electronics</td><td>689-0267</td><td></td></tr><tr><td>Opalarka</td><td>Allied Electronics</td><td>972-6966</td><td>250 W; 750-800 &deg; F</td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Puritan Medical Products Company</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Klej tkankowy VetBond</td><td>Fischer Scientific</td><td>19-027136</td><td></td></tr><tr><td>Podstawa protezy Flash akrylowa</td><td>Yates Motloid</td><td>ColdPourPowder+Liq</td><td></td></tr><tr><td>BONN Miniaturowe nożyczki do irysowania</td><td>Integra Miltex</td><td>18-1392</td><td>3-1/2"(8,9cm), proste, ostrza 15 mm</td></tr><tr><td>Johns Hopkins Bulldog Clamp</td><td>Integra Miltex</td><td>7-290</td><td>1-1/2 "(3,8 cm), zakrzywiony</td></tr><tr><td>MEGA-Torque Elektryczny silnik laboratoryjny</td><td>Vector</td><td>EL-S</td><td></td></tr><tr><td>Panther Burs-Ball #1</td><td>Clarkson Laboratory</td><td>77.1006</td><td></td></tr><tr><td>Fioletowy niebieski system laserowy</td><td>CrystaLaser</td><td>CK473-050-O</td><td>Długość fali: 473 nm</td></tr><tr><td>Zasilacz laserowy</td><td>CrystaLaser</td><td>CL-2005</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #2 Kleszcze do laminektomii</td><td>Narzędzia do nauki o</td> nauce <td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Sonda</td><td>Narzędzia do nauki o naprawach</td><td>10140-02</td><td></td></tr><tr><td>5-calowe</td> proste imadło hemostat <td>Excelta</td><td>35-PH</td><td></td></tr><tr><td>z ważoną podstawą</td><td>Altex Electronics</td><td>PAN381</td><td></td></tr></tbody></table>

implantacja światłowodu do przewlekłej stymulacji optogenetycznej tkanki mózgowej

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Wyjaśnienie wzorców połączeń neuronalnych było wyzwaniem zarówno dla klinicznej, jak i podstawowej neuronauki. Elektrofizjologia jest złotym standardem w analizie wzorców połączeń synaptycznych, ale sparowane zapisy elektrofizjologiczne mogą być zarówno kłopotliwe, jak i eksperymentalnie ograniczające. Rozwój optogenetyki wprowadził elegancką metodę stymulacji neuronów i obwodów, zarówno in vitro1, jak i in vivo2,3. Wykorzystując aktywność promotora specyficznego dla typu komórki do napędzania ekspresji opsyny w dyskretnych populacjach neuronów, można precyzyjnie stymulować genetycznie zdefiniowane podtypy neuronów w odrębnych obwodach4-6. Dobrze opisane metody stymulacji neuronów, w tym stymulacja elektryczna i/lub manipulacje farmakologiczne, są często bezkrytyczne, inwazyjne i mogą uszkadzać otaczające tkanki. Ograniczenia te mogą zmienić normalną funkcję synaptyczną i/lub zachowanie obwodu. Ponadto, ze względu na charakter manipulacji, obecne metody są często ostre i terminalne. Optogenetyka daje możliwość stymulowania neuronów w stosunkowo nieszkodliwy sposób i w neuronach ukierunkowanych genetycznie. W większości badań z udziałem optogenetyki in vivo wykorzystuje się obecnie światłowód prowadzony przez wszczepioną kaniulę6,7; Jednak ograniczenia tej metody obejmują uszkodzoną tkankę mózgową przy wielokrotnym wprowadzaniu światłowodu oraz potencjalne pęknięcie włókna wewnątrz kaniuli. Biorąc pod uwagę rozwijającą się dziedzinę optogenetyki, konieczna jest bardziej niezawodna metoda przewlekłej stymulacji, aby ułatwić długoterminowe badania przy minimalnym przypadkowym uszkodzeniu tkanek. W tym miejscu udostępniamy nasz zmodyfikowany protokół w formie artykułu wideo, aby skutecznie i elegancko uzupełnić metodę opisaną w Sparta i wsp. 8 do wytworzenia implantu światłowodowego i jego trwałego zamocowania na czaszce znieczulonych myszy, a także montażu łącznika światłowodowego łączącego implant ze źródłem światła. Implant, połączony światłowodami z laserem na ciele stałym, pozwala na skuteczną metodę chronicznej fotostymulacji funkcjonalnych obwodów neuronalnych przy mniejszym uszkodzeniu tkanek9 przy użyciu małych, odłączanych pasów. Trwałe mocowanie implantów światłowodowych zapewnia spójne, długoterminowe badania optogenetyczne in vivo obwodów neuronalnych u obudzonych, zachowujących się myszy10 przy minimalnym uszkodzeniu tkanek.

Rozwój optogenetyki dostarcza teraz środków do precyzyjnej stymulacji genetycznie zdefiniowanych neuronów i obwodów, zarówno in vitro, jak i in vivo. Tutaj opisujemy montaż i wszczepienie światłowodu do przewlekłej fotostymulacji tkanki mózgowej.

Implantacja światłowodu do przewlekłej stymulacji optogenetycznej tkanki mózgowej

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Celem poniższego eksperymentu jest aktywacja i długoterminowe badanie obwodów neuronalnych u obudzonych, zachowujących się myszy. Metoda ta jest zaadaptowana z koncepcji pierwotnie opisanej w Sparta etal. Osiąga się to poprzez najpierw zmontowanie przewodu światłowodowego, który łączy optyczne złącze obrotowe z implantem światłowodowym.Następnie światłowód jest wszczepiany w tkankę mózgową będącą przedmiotem zainteresowania, aby stworzyć przejście, przez które światło może przemieszczać się bezpośrednio do kanału neuronów wyrażających redinę. Na koniec źródło światła jest połączone z optycznym przegubem obrotowym w celu stworzenia szeregowo połączonej ścieżki od źródła światła do tkanki mózgowej. Ostatecznie, indukowane światłem wypalanie neuronów eksprymujących kanał redzyny można ocenić na podstawie badań in vivo, elektrofizjologii i badań behawioralnych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak kaniule prowadzące, jest to, że minimalizuje ona uszkodzenia tkanki mózgowej spowodowane wielokrotnym wprowadzaniem i usuwaniem światłowodu. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w funkcję obwodów neuronalnych, można ją również zastosować do innych systemów, aby lepiej zrozumieć mechanizmy zależne od synaps i obwodów, które leżą u podstaw niektórych rodzajów zaburzeń neurologicznych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie.Ponieważ etapy implantacji są trudne do opanowania, każdy pozornie niewielki krok w znacznym stopniu przyczynia się do ogólnej stabilności i niezawodności metody. Zacznij od wycięcia 35 milimetrów światłowodu o średnicy 125 mikronów z rdzeniem o średnicy 100 mikronów, umieszczając rysik z węglika spiekanego z końcówką klinową prostopadle do światłowodu i nacinając włókno jednym jednokierunkowym ruchem, a następnie wyciągając prosto. Teraz włóż dziki ceramiczny lc o średnicy 127 mikronów wypukłą stroną skierowaną w dół do imadła, a następnie włóż kawałek światłowodu do dzikiego.Światłowód powinien wsuwać się płynnie i nieznacznie wystawać poza wypukły koniec dzikiego. Następnie nałóż jedną kroplę świeżo przygotowanej, utwardzanej termicznie żywicy epoksydowej światłowodowej na płaski koniec dzikiego, a następnie nałóż opalarkę na żywicę epoksydową. Żywica epoksydowa powinna wypełniać dziki, gdy jest podgrzewana i utwardza się, gdy zmieni kolor na.Po utwardzeniu oczyść żywicę epoksydową z boków dzikiego, a następnie za pomocą tarczy polerskiej z włókna LC wykonaj okrągłe wzory obrotu, aby wypolerować wypukły koniec dzikiego na tlenku glinu Arkusze polerskie na podkładce polerskiej na czterech malejących stopniach. Następnie przytnij światłowód na płaskim końcu do odpowiedniej długości, aby wycelować w obszar zainteresowania. Aby przetestować polerowany światłowód, włóż polerowany koniec implantu do tulei łącznika.Dopóki nie poczujesz bezpośredniego kontaktu z przeciwległym dzikim implantem, zły implant będzie miał słaby punkt ogniskowy w pobliżu końcówki światłowodu, podczas gdy dobry implant będzie przesyłał gładki koncentryczny krąg światła bez wyjścia. Moc do 10 miliwatów pozwala przechowywać gotowe implanty w piance do czasu użycia. Rozpocznij ten krok od zmierzenia, a następnie nacięcia światłowodu o średnicy 220 mikronów z rdzeniem o średnicy 200 mikronów, aby umożliwić myszowi swobodne poruszanie się, ale nie pozwolić myszy na żucie włókna.Następnie włóż światłowód do kawałka rurki furacyjnej o średnicy wewnętrznej nieco większej i długości nieco krótszej niż w przypadku światłowodu. Teraz zdejmij około 25 milimetrów z jednego końca światłowodu i włóż go do metalowego końca wielomodowego zespołu dzików FC MM. Z otworem o średnicy 230 mikronów, aż się zatrzyma, światłowód powinien wystawać przez dziki koniec.Następnie zabezpiecz połączenie cyjanoakrylanem na metalowym końcu i zakryj połączenie łącznikiem Boot wypoleruj dziki koniec tarczą polerską FC, jak pokazano. Po zdjęciu drugiego końca światłowodu, włóż go do dziękowego lc ceramicznego tylko wypukłym końcem. Następnie nałóż kroplę żywicy epoksydowej na płaski koniec i podgrzewaj, aż utwardzi się, jak pokazano.Po wypolerowaniu wypukłego końca dzikiego, jak właśnie pokazano, nasuń tuleję zdziczałego lc na wypukły koniec dzikiego, aż dzikus osiągnie środek rękawa. Następnie umieść rurkę termokurczliwą na rurce i tulei i podgrzej rurkę termokurczliwą, aby zabezpieczyć i zabezpieczyć połączenie. Na koniec podłącz dzikusa do źródła lasera, a następnie przetestuj go, mierząc strumień świetlny przez łącznik za pomocą spektrofotometru, utrata światła między mocą lasera a zmierzoną mocą sprzęgacza nie powinna przekraczać 30% przed rozpoczęciem operacji.Zdezynfekować obszar operacyjny alkoholem o profilu ipo, a następnie roztworem chlorheksydyny. Następnie umieść mysz w stereotaktycznym zestawie i zabezpiecz głowę, upewniając się, że czaszka jest wypoziomowana. Nałóż maść okulistyczną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu i bólowi pooperacyjnemu.Teraz wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry głowy, aby odsłonić czaszkę z oczodołów do szwu lambda. Użyj zacisków serafinowych, aby powstrzymać skórę i utrzymać dostęp do czaszki. Następnie użyj wykałaczki dentystycznej, aby wytrawić wzór w kratkę na całej powierzchni czaszki.Zmyj powstałe zanieczyszczenia sterylną solą fizjologiczną. Po dokładnym wyschnięciu użyj bawełnianego wacika, aby nałożyć 3% nadtlenek wodoru na odsłoniętą czaszkę przez około dwie do trzech sekund, aby utworzyć mikropory. Następnie kilkakrotnie umyj czaszkę bardziej sterylną solą fizjologiczną i dokładnie ją wysusz.Po wytrawieniu, umyciu i wysuszeniu wzoru szachownicy w czaszce, ponownie włóż światłowodowy implant zdziczałego do uchwytu sondy, a następnie podłącz go do ramienia stereotaktycznego. Określ położenie otworu wiertła za pomocą atlasu stereotaktycznego skalibrowanego na bgma i lambda. Następnie użyj obrotowej wiertarki dentystycznej, aby wykonać kraniotomię z małym otworem na wiertło o średnicy mniejszej niż jeden milimetr nad obszarem zainteresowania, uważając, aby nie złamać opony twardej ani nie uszkodzić żadnej tkanki.Za pomocą ramienia stereotaktycznego umieść implant bezpośrednio nad obszarem zainteresowania, dzikus powinien spoczywać na otaczającej tkance czaszki. Teraz za pomocą sterylnej wykałaczki nałóż cienką, równą warstwę świeżo przygotowanego cementu dentystycznego na czaszkę i na dolną część implantu. Uważając, aby nie wejść w kontakt ze skórą zwierzęcia, podstawowa warstwa cementu dentystycznego powinna pokrywać jak największą powierzchnię czaszki.Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest nałożenie cementu dentystycznego bez dotykania przez niego masowej skóry. Aby zapewnić sukces, nakładaj niewielkie ilości cementu na raz cienkimi warstwami i poczekaj, aż każda warstwa całkowicie wyschnie przed dodaniem kolejnej. Nałóż równe warstwy cementu dentystycznego, aby utworzyć mały wzgórek na wierzchu czaszki i wokół implantu.Pozostaw trzy do pięciu milimetrów wypukłego końca dzikiego cementu czystego z cementu, aby umożliwić gładkie, niezakłócone połączenie. Następnie zszyj skórę głowy nad wzgórkiem cementu dentystycznego i wokół implantu, klej do wiązania weterynaryjnego może być użyty do dodatkowego wiązania po zszyciu. Na koniec nałóż miejscowe środki przeciwbólowe i antybiotyki na skórę szwu i wokół podstawy implantu, a następnie umieść mysz w klatce w celu rekonwalescencji pooperacyjnej.Prawidłowy montaż implantu światłowodowego i sprzęgacza skutkuje minimalnymi stratami fotonów pomiędzy źródłem światła a końcem światłowodu w obszarze zainteresowania. Podczas gdy polerowane światłowody powinny przepuszczać światło w jednolitym koncentrycznym okręgu podobnym do pokazanego tutaj okręgu, jak widać na tym obrazie przy starannej implantacji i szyciu, implant nie powoduje widocznego podrażnienia myszy i może pozostać na miejscu przez długotrwałe badania bez znaczącej degradacji światłowodu lub ilości przesyłanego światła Funkcjonalne testy behawioralne u obudzonej myszy wykazują bezpośrednią reakcję na stymulację Za pomocą światłowodu wszczepionego przez korę ruchową, o czym świadczą dane wideo z elektrofizjologii in vivo pokazujące aktywację docelowych neuronów przez implant i reakcję behawioralną zwierzęcia podczas stymulacji mózgu. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak fotostymulacja docelowych obszarów mózgu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jakie są wzorce połączeń obwodów związanych z komórkami docelowymi?Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak montować implanty światłowodowe i przewody sprzęgające oraz jak wszczepiać je na portery optogenetyczne wyrażające tkankę mózgową.

fiber-optic-implantation-for-chronic-optogenetic-stimulation-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Implantacja światłowodowa do przewlekłej optogenetycznej stymulacji tkanki mózgowej

Neurony powstałe w wieku dorosłym w opalfaktorycznej cebulce mogą być kontrolowane optogenetycznie poprzez wstrzyknięcie lentiwirusa wykazującego ekspresję Channelrhodopsin2 do przedniego strumienia migracyjnego oraz przewlekłą fotostymulację za pomocą wszczepionej miniaturowej diody LED.

Selektywna transdukcja wirusowa neuronów węchowych pochodzenia dorosłego w celu chronicznej optogenetycznej stymulacji in vivo

Niedawny rozwój narzędzi neuronauki, które łączą genetykę i optykę, określany jako "optogenetyka", umożliwia kontrolę nad aktywnością obwodów neuronowych z niespotykanym dotąd poziomem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół integracji zapisu in vivo z manipulacją optogenetyczną genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów przedczołowych korowych i podkostnych neuronów piramidowych.

Metoda wysokiej wierności optogenetycznej kontroli pojedynczych neuronów piramidowych in vivo

Optogenetyka stała się potężnym narzędziem do wykorzystania w eksperymentach neuronauki behawioralnej. Protokół ten oferuje przewodnik krok po kroku po projektowaniu i konfiguracji systemów laserowych oraz zapewnia pełny protokół przeprowadzania wielokrotnych i jednoczesnych stymulacji optogenetycznych in vivo zgodnych z większością paradygmatów testów behawioralnych gryzoni.

In vivo (in vivo) Stymulacja optogenetyczna ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Ten protokół opisuje kroki i analizę danych wymaganych do pomyślnego przeprowadzenia optogenetycznego funkcjonalnego rezonansu magnetycznego (ofMRI). ofMRI to nowatorska technika, która łączy odczyt fMRI w wysokim polu ze stymulacją optogenetyczną, pozwalając na specyficzne dla typu komórki mapowanie funkcjonalnych obwodów nerwowych i ich dynamiki w całym żywym mózgu.

Optogenetyczny funkcjonalny rezonans magnetyczny

Tutaj prezentujemy metodę dostarczania wektorów ekspresji wirusa do mózgu za pomocą jedwabnych folii fibroinowych. Ta metoda pozwala na ukierunkowane dostarczanie wektorów ekspresyjnych za pomocą światłowodów pokrytych jedwabiem/AAV, światłowodów stożkowych i okien czaszkowych.

In vivo (in vivo) Ukierunkowana ekspresja białek optogenetycznych za pomocą folii jedwabiu/AAV

Dzięki optogenetycznej manipulacji określonych populacji neuronów lub obszarów mózgu, zachowanie może być modyfikowane z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u swobodnie poruszających się zwierząt. Stosując różne narzędzia optogenetyczne w połączeniu z przewlekle wszczepionymi światłowodami, można przeprowadzić różnorodne modulacje neuronalne i testy behawioralne.

Optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy

Tutaj prezentujemy metodę wytwarzania systemu optycznego ze światłowodami do dostarczania światła i matrycą elektrod do rejestracji neuronowej. Eksperymenty in vivo na transgenicznych myszach z ekspresją rodopsyny-2 pokazują wykonalność systemu do jednoczesnej stymulacji optogenetycznej i zapisu elektrofizjologicznego.

Matryca optrodowa do jednoczesnej modulacji optogenetycznej i elektrycznego zapisu neuronowego

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę chirurgiczną przeprowadzania operacji rdzenia kręgowego oraz wszczepiania i zabezpieczania trzonu optycznego nad rdzeniem kręgowym u gryzoni.

Implantacja urządzeń optoelektronicznych w rdzeniu kręgowym gryzoni

Opracowaliśmy uproszczone i opłacalne podejście do produkcji elektrod i przeprowadziliśmy zapisy sygnałów w wielu regionach u swobodnie poruszających się myszy. Wykorzystanie optogenetyki, wraz z elektrofizjologią wieloregionalną i rejestracją sygnału wapnia, umożliwiło ujawnienie aktywności neuronalnej w różnych regionach w modelu rozpalania napadów.

Zintegrowana metoda tworzenia elastycznych i wygodnych optymór elektrofizjologicznych do wieloregionalnego zapisu in vivo

Ten protokół zapewnia zintegrowaną metodę, która obejmuje dostarczenie wirusowe, implantację optrodu, indukcję fototrombotyczną, jednoczesne rejestrowanie aktywności astrocytów i neuronów oraz optogenetyczną stymulację astrocytów. Ta zintegrowana metoda ma na celu zapewnienie jednoczesnego badania relacji astrocyt-neuron na wszystkich etapach przewlekłych udaru niedokrwiennego.

Zintegrowana metoda modelowania udaru fototrombotycego i in vivo rejestracji optrodem aktywności neuronowej i astrocytów u myszy wykonujących zachowania

Poznaj metodę implantacji światłowodu do przewlekłej stymulacji optogenetycznej neuronów u myszy. Technika ta minimalizuje uszkodzenia tkanki mózgowej i umożliwia badanie funkcji obwodów neuronalnych w czasie rzeczywistym.

Implantacja światłowodu do przewlekłej stymulacji optogenetycznej tkanki mózgowej

Przeglądaj więcej filmów