Przetwarzanie tkanek ludzkiej mammoplastyki redukcyjnej i mastektomii do hodowli komórkowych
3 stycznia 2013
Opisano metodę przetwarzania materiału chirurgicznego ludzkiego sutka. Przetworzona tkanka, w postaci organoidów, może być przechowywana w stanie zamrożonym w nieskończoność lub umieszczona w kulturze w celu długotrwałego wzrostu. Metoda ta umożliwia eksperymentalne badanie prawidłowej biologii komórek nabłonkowych człowieka oraz skutków zaburzeń egzogennych.
Protokół ten ma na celu wyizolowanie nabłonkowych części gruczołu sutkowego wolnych od powiązanych komórek zrębu sutka. Rozpocznij od narosłego rozwarstwienia materiału odrzutów chirurgicznych, aby wzbogacić struktury nabłonkowe za pomocą trawienia enzymatycznego. Oddziel organoidy nabłonkowe od materiału zrębu na zewnątrz błony podstawnej.
Następnie przetworzyć strawione organoidy przez sitka komórkowe o stałej wielkości porów, aby uzyskać wzbogacone frakcje. Wysiewaj organoidy do natychmiastowej hodowli lub zamroź zapasy do wykorzystania w przyszłości. Ostatecznie organoidy nabłonkowe są wykorzystywane do generowania długoterminowych kultur normalnych ludzkich komórek nabłonka sutka.
Po raz pierwszy opracowałem tę metodę pod koniec lat siedemdziesiątych XX wieku, aby posunąć naprzód dziedzinę biologii ludzkiego nabłonka komórkowego i kancerogenezy. Dostępnych było obfite materiały chirurgiczne z normalnych tkanek ludzkiej pamięci. Potrzebna była metoda przetwarzania tego masowego niejednorodnego materiału, aby nadawał się do hodowli komórek czystego nabłonka i pożywek w celu wspierania długoterminowego wzrostu.
Wizualna demonstracja tej metody jest pomocna, szczególnie w celu zwrócenia uwagi na to, jak przeprowadzić surową sekcję. Jak wyglądają prawidłowo strawione organoidy? Filtrowanie organoidów i posiewanie organoidów w celu uzyskania hodowli.
Zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona czyste frakcje nabłonkowe dla zrębu AS, a komórki nabłonkowe pozostają nienaruszone. Organoidy, które znaleźliśmy, dają najlepszy początkowy wzrost i maksymalizują liczbę komórek, które można uzyskać. Dwaj naukowcy z Lawrence Berkeley National Laboratory, James Garvey i Mark LeBarge, zademonstrują teraz tę procedurę z wyrzuconego materiału po zabiegach chirurgicznych.
Uzyskać ludzką tkankę sutka w sterylnych pojemnikach zawierających bufor lub kompletną pożywkę oraz antybiotyki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wytnij kawałki tkanki i umieść je w dużym szklanym sterylnym naczyniu. Oddziel obszary nabłonka od macierzy zrębu tkanki tłuszczowej, tkanki łącznej i naczyń krwionośnych.
Delikatnie wypreparuj białe pasma obszarów nabłonka osadzonych w bardziej żółtej macierzy zrębu. Przytrzymaj materiał kleszczami i zeskrob grubo tłusty materiał skalpelem. Następnie przeciwległymi skalpelami pokrój tkankę nabłonkową na około cztery milimetrowe kawałki, aby ułatwić trawienie.
Przenieś wypreparowaną tkankę nabłonkową do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 lub 15 mililitrów w mocno włóknistej tkance. Będzie więcej solidnego białego materiału nienabłonkowego. Jeśli trudno jest wypreparować komórki nabłonkowe z takich włóknistych matryc.
Tkankę można pokroić na kawałki o powierzchni od jednego do trzech milimetrów kwadratowych i trawić osobno. Napełnij probówkę pożywką wytrawiającą zawierającą surową kolagenazę i dni o wysokiej zawartości alkoholu, pozostawiając niewielką przestrzeń powietrzną, aby umożliwić mieszanie podczas rotacji. Inkubować próbkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza na rotatorze 360 stopni przy ośmiu obr./min po roztrawieniu.
Próbki osadzać przez odwirowanie 600 G przez pięć minut. Usunąć sklarowany tłuszcz i pożywkę zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi usuwania tkanek ludzkich. Aby monitorować trawienie tkanek, rozcieńczyć małą Eloqua osadu w pożywce i zbadać mikroskopowo w całkowicie strawionych organoidach, które pokażą przyczepiony zrąb.
Powtarzaj trawienie enzymatyczne, aż tkanka zostanie całkowicie strawiona na czyste organoidy. Jeśli potrzebne jest drugie trawienie przez noc, może być konieczne zmniejszenie stężenia enzymów, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu. Prawidłowo strawione organoidy pokażą gładko wyglądające przewodowe struktury pęcherzykowe lub przewodowe pęcherzyki płucne wolne od przyczepionego zrębu.
Po zakończeniu trawienia resus zawiesić ostatnią osadkę w podłożu antybiotykowym. Przełóż strawioną próbkę w kwatach przez sterylne sitko o średnicy 100 mikronów na sterylnej probówce o pojemności 50 mililitrów. Po odsączeniu pożywki do probówki umyć organoidy trzema mililitrami pożywki.
Powtarzać tę czynność, aż cała zawieszona osadka zostanie przeniesiona. Następnie ostrożnie przełóż filtr nad sterylną probówką i umyj organoidy w probówce większą ilością pożywki. To jest pula organoidów o wielkości 100 mikronów.
Teraz przepuść materiał, który spłynął do oryginalnej 50-mililitrowej probówki, przez sitko o średnicy 40 mikronów, aby oddzielić struktury pęcherzykowe od puli filtratu pojedynczych komórek i małych grudek komórek mezenchymalnych i nabłonkowych oraz małych kawałków tkanki naczyniowej. Odwirować baseny o wielkości 100 mikronów i 40 mikronach i przesączać je przy stężeniu 600 G przez pięć minut. Rozpuść każdą próbkę przy użyciu jednego mililitra ccpm.
Dwa roztwory zamrażające na 0,1 mililitra upakowanego podniebienia. Przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie umieść po 0,1 mililitra każdej z dwóch pul organoidów.
Kropla po kropli w równomiernym rozprowadzeniu na jednej lub 2 35-milimetrowych szalkach. Unikaj zarysowania powierzchni naczynia po kilku minutach od przyłączenia się organoidów. Powoli dodawaj pożywki wzrostowe, aby uniknąć przemieszczenia organoidów.
Następnie inkubuj pierwotne kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze CO2. Wysiewaj również 0,1 mililitra puli filtratu bezpośrednio na plastik kultury tkankowej za pomocą pożywki fibroblastowej. Inkubuj pierwotne kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze CO2.
Po 24 do 48 godzinach sprawdź migrację komórek z organoidów, a po dwóch do trzech dniach monitoruj kulturę mitotycznego wzrostu. Komórki zbliżają się do zbiegu, uzupełniając pożywkę co dwa do trzech dni. Małe fragmenty układu krwionośnego mogą przyczepiać się i powodować rozrost komórek fibroblastów.
W przypadku znacznego wzrostu fibroblastów. Wykonaj trippinizację różnicową, aby usunąć fibroblasty z dużych plam nabłonka. Umyj komórki raz w buforze STE.
Następnie dodaj świeże 0,5 mililitra STE, aby po prostu przykryć naczynie ciągłą obserwacją mikroskopową i delikatnymi, ale ostrymi uderzeniami naczynia o twardą powierzchnię. Poszukaj oderwania fibroblastów, gdy komórki nabłonkowe nadal przylegają. Kultury pierwotne, w których plamy wyrostka nabłonka zbliżają się do zbiegu.
Aby zachować kulturę pierwotną i wygenerować wiele kultur wtórnych, użyj częściowej trypsyny. Umyj komórki raz w buforze STE, a następnie dodaj świeże STE do przykrycia naczynia. Monitoruj, czy około 50% komórek odłączyło się.
Następnie dodaj dwa mililitry surowicy zawierającej pożywkę wzrostową i zbierz komórki. Następnie po dwóch praniach przenieś komórki do sterylnej 15-mililitrowej probówki. Połącz zebrane komórki i kulturę Częściową izację można powtórzyć około czterech do ośmiu razy z dobrym odrostem komórek z podstawowych szalek i z równoważnym długoterminowym wzrostem z subkultury lub zamrożonych wtórnych.
Zalecamy zamrożenie komórek z pierwszej częściowej trypsynizacji w celu przechowania i użycie komórek z drugiej PT do subhodowli. Gdy tkanka jest odpowiednio trawiona i filtrowana, można zobaczyć organoidy wykazujące struktury przewodowe i pęcherzykowe z gładkimi krawędziami wolnymi od przyczepionego zrębu. Jeśli nie zostanie strawiony, materiał zostanie przyczepiony i więcej zanieczyszczenia fibroblastami, jeśli zostanie nadmiernie strawiony, krawędzie będą szorstkie, a przyczepianie będzie mniej wydajne po przyczepieniu organoidów.
Rozrost nabłonka rozpoczyna się w ciągu 48 do 72 godzin po 48 godzinach. Nie ma jeszcze aktywnego podziału komórek z widoczną mitozą do 72 godzin. Mitoza powinna stać się bardziej widoczna.
Małe fragmenty układu krwionośnego mogą być źródłem rozrostu komórek mezenchymalnych po czterech dniach. Wyrostki nabłonkowe wykazują tutaj morfologicznie niejednorodne populacje barwione przeciwciałami przeciwko keratynie 14 i keratynie 19 oznaczają zielone linie mioepitelialne K 19 dodatnie luminalne i czerwone K 14 dodatnie, a także żółte K 14 dodatnie K 19 dodatnie komórki progenitorowe. HMEC może być hodowany w różnych preparatach pożywki.
Pożywki o niskim poziomie stresu, takie jak M 87 a, uzupełnione toksyną i oksytocyną, będą wspierać doskonały długoterminowy wzrost normalnego HMEC przed zastojem, a także wzrost wielu linii HMEC. Wyniki analizy faktów ilustrują różnorodność linii w organoidach niehodowanych, a w czwartym pasażu, HMEC hodowanym w pożywce M 87. W tym przypadku populacje luminalne i mioepitelialne są identyfikowane na podstawie ekspresji markerów luminalnych, EPCA i CD 2 27 oraz markerów mioepitelialnych CD 49 F i CD 10 ponownie platerowanych.
Czwarte przejście, HMEC. Fakty wzbogacone dla poprzednich markerów luminalnych i mioepitelialnych zostały potwierdzone za pomocą analiz immunofluorescencyjnych dla keratyny K 14 i K 19 HMEC. Hodowane na plastiku do przejścia, cztery są zdolne do tworzenia zorganizowanych struktur z podobnymi do in vivo relacjami rodowymi komórek luminalnych i mioepitelialnych, po umieszczeniu w odpowiednich CD 2, 27 i CD 10 są używane do wzbogacania tych dwóch linii.
HMC zachowują swoją zdolność do tworzenia prawidłowej organizacji komórek 3D w mikro wzorach 3D z mikrowzorami 3D z komórkami świetlnymi wewnątrz komórek mioepitelialnych. Wzbogacone o fakty komórki progenitorowe mogą również tworzyć solidne struktury 3D po posianiu w matrigel naśladujący struktury przewodowe i pęcherzykowe zębodołowe. Struktury 3D w Matrigel wykazują również prawidłową samoorganizację 3D.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyścić nabłonkowe części gruczołu sutkowego z powiązanego zrębu sutka. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu dwóch do trzech dni. Technika przetwarzania tkanek jest na ogół prosta.
Ważne jest, aby pamiętać o zatrzymaniu trawienia w odpowiednim momencie.
Przegląd
W niniejszym artykule opisano metodę przetwarzania chirurgicznych odpadów tkanki piersi człowieka w organoidy, które mogą być przechowywane w zamrożeniu lub hodowane w celu długotrwałego wzrostu. Technika ta ułatwia badanie biologii prawidłowych ludzkich komórek nabłonkowych oraz wpływu czynników zewnętrznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania nad ludzkimi komórkami nabłonkowymi
Wprowadzenie
- Ludzkie tkanki gruczołu piersiowego są często utylizowane podczas procedur chirurgicznych.
- Istnieje zapotrzebowanie na metody izolacji komórek nabłonkowych z komponentów zrębu.
- Organoidy stanowią odpowiedni model do badania biologii nabłonka.
- Metoda ta została opracowana w celu usprawnienia badań nad kancerogenezą i biologią komórki.
Cel badania
- W celu izolacji komórek nabłonkowych z tkanek gruczołu piersiowego.
- W celu opracowania niezawodnej metody długoterminowej hodowli ludzkich komórek nabłonkowych gruczołu piersiowego.
- W celu umożliwienia eksperymentalnego badania biologii komórek oraz zaburzeń ich funkcji.
Zastosowane metody
- Disekcja materiału chirurgicznego w celu wzbogacenia w struktury nabłonkowe.
- Trawienie enzymatyczne w celu oddzielenia organoidów nabłonkowych od materiału zrębowego.
- Filtracja przez sita komórkowe w celu uzyskania wzbogaconych frakcji organoidów.
- Hodowla lub mrożenie organoidów do późniejszego wykorzystania.
Główne wyniki
- Pomyślnie wyizolowano czyste organoidy nabłonkowe z tkanek gruczołu mlekowego.
- Wykazano możliwość hodowania tych organoidów przez dłuższy czas.
- Przedstawiono wskazówki wizualne dotyczące etapów sekcji i przetwarzania.
- Wykazano, że organoidy zapewniają optymalny wzrost i wydajność komórkową.
Wnioski
- Metoda ta umożliwia skuteczne badanie ludzkich komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego.
- Zapewnia ona czystą separację komórek nabłonkowych od zrębu.
- Technika ta może przyczynić się do postępów w badaniach nad biologią nabłonka i nowotworami.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Niezawodne przetwarzanie chirurgicznych tkanek piersi człowieka w celu uzyskania czystych organoidów nabłonkowych umożliwia tworzenie standaryzowanych, istotnych dla przebiegu chorób systemów komórkowych do wczesnego wykrywania i mechanistycznej oceny ryzyka w badaniach nad onkologią i starzeniem się. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz badaniach funkcjonalnych poprzez dostarczenie skalowalnych, zweryfikowanych pod kątem linii komórkowych ludzkich modeli komórkowych. Metoda ta rozwiązuje krytyczny problem ciągłości translacyjnej i selekcji projektów w przedklinicznych badaniach i rozwoju (R&D).
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie specyficznych dla ludzi szlaków różnicowania, starzenia się i transformacji komórek nabłonkowych.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez zapewnienie weryfikowanych pod kątem pochodzenia linii komórkowych, fizjologicznie istotnych populacji komórek.
- Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów dzięki ustandaryzowanym, powtarzalnym partiom komórek.
- Umożliwia wysokoprzepustowe badania eksperymentalne z wykorzystaniem pierwotnego materiału ludzkiego.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane, czyste frakcje nabłonkowe, niezbędne do opracowania wiarygodnych testów i przesiewania związków.
- Wspiera powtarzalność i skalowalność poprzez umożliwienie standaryzacji partii oraz kriokonserwacji organoidów.
- Poprawia gotowość do przeprowadzania testów dzięki zachowaniu wielu markerów linii komórkowych i różnorodności funkcjonalnej.
- Umożliwia niezawodną ocenę wpływu związków w istotnych dla danej choroby ludzkich systemach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z biologią istotną dla danej choroby w celu odkrywania i walidacji biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od wczesnej fazy odkrywania po walidację przedkliniczną z wykorzystaniem modeli pochodzenia ludzkiego.
- Zmniejsza ryzyko wystąpienia artefaktów specyficznych dla gatunku poprzez wykorzystanie tkanek ludzkich zamiast modeli gryzoni.
- Wspiera decyzje dotyczące dalszego rozwoju projektu, skorygowane o ryzyko, w oparciu o dane istotne fizjologicznie.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda przetwarzania tkanek integruje etap wczesnego odkrywania z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając przejście od testowania hipotez do identyfikacji wiodących związków i badań translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych w ludzkich układach nabłonkowych.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki do opracowywania testów i profilowania związków.
- Analityka: Zapewnia odczyty oparte na linii komórkowej i markerach do analizy porównawczej w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Zachowuje cechy istotne dla danej choroby w celu dopasowania biomarkerów i modelowania przedklinicznego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku, skalowalną platformę dla różnorodnych potrzeb eksperymentalnych zespołów badawczo-rozwojowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad ludzkimi komórkami.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy, zwiększa powtarzalność i wspiera skalowalną produkcję komórek.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów dotyczących onkologii i starzenia się organizmu.
Kwestie implementacyjne
- Wymagana jest biegłość w zakresie sekcji tkanek, trawienia enzymatycznego oraz technik hodowli komórkowej.
- Niezbędny jest dostęp do sterylnych pomieszczeń procesowych oraz infrastruktury analitycznej służącej do weryfikacji linii komórkowych.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie przetwarzania partii oraz kontroli jakości.
- Możliwe jest zastosowanie adaptacji dla różnych typów tkanek lub kontekstów chorobowych.
- Krytyczne jest uważne monitorowanie etapów trawienia i filtracji w celu zminimalizowania zanieczyszczeń i maksymalizacji wydajności.
