Name: Analiza rozwoju mysich komórek Schwanna wzdłuż rosnących aksonów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Poznaj analizę migracji komórek Schwanna wzdłuż aksonów myszy przy użyciu eksplantatów szyjnych węzłów współczulnych. Ta metoda umożliwia obserwację rozwoju komórek w ich naturalnym środowisku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcemy podziękować Urmas Arumae za udostępnienie protokołu kolagenowego oraz Jutcie Fey i Ursuli Hinz za doskonałą pomoc techniczną. Ponadto chcielibyśmy podziękować Christianowi F. Ackermannowi, Ulrike Engel i Centrum Obrazowania Nikon na Uniwersytecie w Heidelbergu, a także Joachimowi Kirschowi za życzliwą pomoc w realizacji filmu. Prace zostały częściowo sfinansowane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 592).

1. Przygotowanie żeli kolagenowych
<ol>
 <li>Przygotować podłoże podstawowe, zawierające 455 μl 10x MEM, 112 μl 7,5% NaHCO3, 50 μl glutaminy i NaOH. Stężenie i ilość NaOH zależy od preparatu kolagenu z ogona szczura (patrz 1.2), przy czym końcowa objętość podłoża podstawowego wynosi 1000 μl.</li>
 <li>Przygotuj kolagen ze szczurzego ogona zgodnie z Ebendal (1). Przechowywać roztwór kolagenu w temperaturze 4 °C. Nie można było zaobserwować degradacji roztworu kolagenu. Po przygotowaniu nowej partii oszacować stężenie NaOH potrzebne dla podłoża podstawowego (patrz ppkt 1.1). Użyć wskaźnika pH pożywki do miareczkowania ilości i stężenia NaOH. 800 μl kwaśnego kolagenu ze szczurzego ogona musi zmienić odcień na czerwony po zmieszaniu z 210 μl podłoża podstawowego. Jeśli stężenie NaOH jest zbyt niskie, roztwór kolagenu zmieni kolor na żółty ze względu na wskaźnik pH pożywki. Dodaj kolagen do podłoża i wymieszaj bez wytwarzania pęcherzyków. Wykonaj te czynności na lodzie. Polimeryzacja zachodzi w ciągu 2 godzin po zmieszaniu roztworu kolagenu i podłoża podstawowego, a nowy roztwór jest inkubowany w temperaturze 37 °C. Sprawdź to przed rozpoczęciem eksperymentu. 1.3) Zmieszać 800 μl roztworu kolagenu z 210 μl podłoża podstawowego (patrz 1.2). Umieścić 100 μl tego roztworu w studzienkach z 8-dołkowym szkiełkiem podstawowym. Szkiełka należy inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotnych warunkach w inkubatorze do hodowli komórkowych. Przygotuj żele kolagenowe pod stołem do hodowli komórkowych i sterylnych warunkach. Kolagen żeluje się w ciągu 2 godzin.</li>
</ol>
2. Sekcja embrionalnych SCG
<ol>
 <li>Zbierz zarodki myszy w ciąży (E16-18) z macicy i przechowuj je w PBS do czasu, gdy będą dalej potrzebne.</li>
 <li>Wypreparuj jeden zarodek z owodni. Odetnij głowę zarodka ogonowego na poziomie obojczyka. Przymocuj głowę do silikonowego dolnego naczynia za pomocą "igieł do owadów". Brzuszna strona głowy musi być skierowana w twoją stronę i musisz zobaczyć obszar podżuchwowy. Mocowanie umożliwia łatwiejsze przygotowanie.</li>
 <li>Usuń skórę okolicy podżuchwowej po lewej i prawej stronie, a wraz z nią podskórną tkankę łączną.</li>
 <li>Usuń gruczoły ślinowe podżuchwowe z ich lokalizacji, aby oczyścić widok na gnykówkę, mięśnie podgnykowe i mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy.</li>
 <li>Usuń te mięśnie ostrożnie, aby oczyścić widok na krtań i tchawicę. Usuń tchawicę i krtań. Tętnice szyjne są wtedy widoczne po obu stronach mięśni przedkręgowych. SCG znajduje się w rozwidleniu tętnic szyjnych i ma owalny kształt. Ostrożnie usuń zwoje nerwowe i umieść je w PBS. Delikatnie usuń zwoje nerwowe z narzędzi do preparowania, jeśli się do nich przyklejają. Do usuwania SCG korzystne jest użycie kleszczy, a także uchwytu na igłę zamontowanego za pomocą "igły do owadów".</li>
 <li>Po umieszczeniu w PBS przechowuj zwoje w temperaturze pokojowej w PBS, dopóki nie wypreparujesz wystarczającej liczby zwojów. Następnie oczyść zwoje z naczyń krwionośnych i tkanki łącznej. Wykonaj sekcję i czyszczenie SCG pod mikroskopem preparacyjnym umieszczonym pod ławką z przepływem laminarnym.</li>
 <li>Na koniec umieść eksplantowane zwoje na żelowych żelach kolagenowych za pomocą igieł strzykawkowych zamontowanych na strzykawce w celu łatwiejszej obsługi.</li>
 <li>Inkubować eksplantaty SCG na żelatynizowanym kolagenie w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, z 5 % CO2 i w wilgotnych warunkach.</li>
</ol>
3. Leczenie eksplantatów SCG
<ol>
 <li>Po 1-2 godzinnej inkubacji przykryj eksplant SCG zawierający kolagen 100 μl pożywki do hodowli komórek neurobazalnych zawierającej suplement B27, glutaminę i antybiotyki. Teraz studzienki szkiełek komorowych zawierają objętość 200 μl (100 μl żelu i 100 μl pożywki). Dodaj kolejne 200 μl pożywki, jednak teraz zawierającej NGF (60 ng / ml), aby ułatwić wzrost aksonów. W związku z tym końcowe stężenie NGF wynosi 30 ng/ml.</li>
 <li>
 <ol class="lalpha">
 <li>Aby zbadać początek migracji SC, należy dodać dodatkowe czynniki bezpośrednio w dniu in vitro 0 (DIV0). Rozpuścić czynniki w pożywce zawierającej NGF w wymaganym podwójnym stężeniu (2).</li>
 <li>Aby przeanalizować wpływ na SC, które już zaczęły migrować wzdłuż aksonów, dodaj dodatkowe czynniki w DIV3 aż do DIV4 (potencjalne zatrzymanie eksperymentu). W tym celu ostrożnie usunąć 180 μl roztworu w DIV3 i dodać 200 μl nowej pożywki zawierającej NGF i dodatkowe czynniki będące przedmiotem zainteresowania przy podwójnym stężeniu (2).</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
4. Obrazowanie poklatkowe
Użyj odwróconego mikroskopu do analiz. Można stosować różne obiektywy, określające pole widzenia i powiększenie. Ważnym aspektem jest jednak odległość robocza zastosowanego obiektywu, ponieważ obrazowanie eksplantatów SCG odbywa się przez szkiełko podstawowe i żel kolagenowy. Liczba klatek na sekundę podczas nagrywania 1/10-30 minut wykazała dobre wyniki (2). Aspekt ten musi być jednak dostosowany do kwestii naukowej. Do akwizycji obrazu można użyć zwykłej kamery CCD. W przypadku obrazowania poklatkowego komora inkubacji hodowli komórkowych musi być podłączona do stolika mikroskopu. Inkubować tkankę podczas obrazowania w temperaturze 37 °C, z 5% CO2 i w wilgotnych warunkach. Uruchomić system inkubacji na godzinę przed rozpoczęciem obrazowania. Dzięki temu części mikroskopu (np. obiektyw), w tym szkiełko komory, dostosowują się do temperatury i zapobiegają dryftom wywołanym temperaturą. Definiowanie określonych obszarów analiz (w obrębie eksplantatu i pomiędzy różnymi eksplantatami) za pomocą oprogramowania mikroskopowego i sterowanego programowo zmotoryzowanego stolika (konfiguracja wielopozycyjna) do jednoczesnych analiz różnych warunków zastosowanych do eksplantatów SCG. Do obrazowania poklatkowego można wykorzystać tkanki typu dzikiego, a także tkanki pochodzące od zwierząt transgenicznych, oznaczając SC (s100b:GFP) (3). Do obrazowania fluoroforów należy zastosować fluorescencyjne źródło światła w konfiguracji mikroskopowej. Używaj standardowych filtrów.
5. Kwantyfikacja odległości migracji SC
<ol>
 <li>W punkcie końcowym (na przykład DIV4) utrwal żele kolagenowe z 4% PFA w szkiełku komorowym na 3-4 godziny. Następnie myj żele kolagenowe 5 razy przez 10 minut za pomocą PBS. Zastosuj standardowe protokoły immunocytochemiczne (2). Jeśli jesteś nowy w przygotowywaniu SCG, zweryfikuj tożsamość ganglionu jako zwoju współczulnego za pomocą immunohistochemii przeciwko hydroksylazie tyrozynowej (TH), powszechnemu markerowi komórek katecholaminergicznych. Podczas immunohistochemii (po przeciwciałie pierwotnym) przenieś eksplant zawierający żele kolagenowe do 24-dołkowych płytek, które mają większą objętość, co jest korzystne dla mycia żeli.</li>
 <li>Po immunohistochemii ostrożnie umieść żele kolagenowe na szkiełkach podstawowych. Ostrożnie usuń pozostały roztwór i pozwól kolagenowi wyschnąć/skurczyć się do dwóch wymiarów. Pozwala to na łatwe pomiary odległości (2). Następnie zamontuj próbki.</li>
 <li>Na koniec zmierz odległości migracji za pomocą oprogramowania Fidżi (NIH). W tym celu nie są potrzebne żadne specjalne wtyczki. Aby umożliwić prawidłowe pomiary w μm, sprawdź poprawne metadane obrazowania i ustawienia w obszarze Fidżi, obraz i skala. Użyj Fidżi również do ilościowego oznaczania komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Ebendal, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEbendal%2C+T+%22Use+of+collagen+gels+to+bioassay+nerve+growth+factor+activity%22">Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity</a>. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).</li>
<li>Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin+1+type+III%2FErbB+signaling+is+crucial+for+Schwann+cell+colonization+of+sympathetic+axons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons.</a> PloS One. 6 (12), e28692(2011).</li>
<li>Zuo, Y., Lubischer, J. L., Kang, H., Tian, L., Mikesh, M., Marks, A., Scofield, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia%2C+neurons%2C+macrophages%2C+and+dendritic+cells+for+vital+examination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience.+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> The Journal of Neuroscience. The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (49), 10999-11009 (2004).</li>
<li>Levi-Montalcini, R., Booker, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EXCESSIVE+GROWTH+OF+THE+SYMPATHETIC+GANGLIA+EVOKED+BY+A+PROTEIN+ISOLATED+FROM+MOUSE+SALIVARY+GLANDS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">EXCESSIVE GROWTH OF THE SYMPATHETIC GANGLIA EVOKED BY A PROTEIN ISOLATED FROM MOUSE SALIVARY GLANDS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 46 (3), 373-384 (1960).</li>
<li>Meintanis, S., Thomaidou, D., Jessen, K. R., Mirsky, R., Matsas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuron-glia+signal+beta-neuregulin+promotes+Schwann+cell+motility+via+the+MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The neuron-glia signal beta-neuregulin promotes Schwann cell motility via the MAPK pathway.</a> Glia. 34 (1), 39-51 (2001).</li>
<li>Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Chan, J. R., Tanoue, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB2+directly+activates+the+exchange+factor+Dock7+to+promote+Schwann+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">ErbB2 directly activates the exchange factor Dock7 to promote Schwann cell migration.</a> The Journal of cell biology. 181 (2), 351-365 (2008).</li>
<li>Anton, E. S., Weskamp, G., Reichardt, L. F., Matthew, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+and+its+low-affinity+receptor+promote+Schwann+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2795-2799 (1994).</li>
<li>Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+growth+factor+2%2C+a+soluble+neuregulin%2C+directly+increases+Schwann+cell+motility+and+indirectly+promotes+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).</li>
<li>Yamauchi, J., Chan, J. R., Shooter, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+regulate+Schwann+cell+migration+by+activating+divergent+signaling+pathways+dependent+on+Rho+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins regulate Schwann cell migration by activating divergent signaling pathways dependent on Rho GTPases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (23), 8774-8779 (2004).</li>
<li>Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycaemia+inhibits+Schwann+cell+proliferation+and+migration+and+restricts+regeneration+of+axons+and+Schwann+cells+from+adult+murine+DRG%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 37 (2), 298-311 (2008).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+cell+death+using+an+Hsp90+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 2832-2835 (2011).</li>
<li>Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+and+reliable+FRET%2FFLIM+pair+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins.</a> BMC Biotechnology. 9, 24(2009).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Rozwój obwodowego układu nerwowego to ekscytujący proces. Po zakończeniu rozwoju aksony są otoczone SC na całej długości, która u ludzi często może przekraczać 100 cm. W tym celu podczas rozwoju należy ustalić prawidłową liczbę wymaganych SC, a SC muszą również przemieszczać się wzdłuż rozciągających się aksonów na obrzeża, aby zapewnić pełne pokrycie aksonów. Dotyczy to zarówno aksonów mielinizowanych, jak i niemeylinowanych. W obu przypadkach wszystkie aksony stykają się z SC i są zależne od ich wsparcia. Aby zbadać ro...

<table><tbody><tr><td>10x MEM</td><td>Gibco</td><td>21430</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (7,5%)</td><td>Gibco</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>109137</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>Roche</td><td>1058231</td><td>R& D#556-NG-100</td></tr><tr><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>Gibco</td><td>21103</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplement</td><td>Gibco</td><td>17504</td><td></td></tr><tr><td>antybiotyki</td><td>Gibco</td><td>15640</td><td></td></tr><tr><td>d-PBS</td><td>Gibco</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>igły do owadów</td><td>FST</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>igła strzykawkowa</td><td>Braun</td><td></td><td>BD # 300013</td></tr><tr><td>komora 8-dołkowa slajd</td><td>Lab tek</td><td>177402</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza rozwoju mysich komórek schwanna wzdłuż rosnących aksonów

Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons

Rozwój nerwów obwodowych to intrygujący proces. Neurony wysyłają aksony, aby unerwić określone cele, które u ludzi często znajdują się w odległości większej niż 100 cm od somy neuronu. Przeżycie neuronów podczas rozwoju zależy od docelowych czynników wzrostu, ale także od wsparcia komórek Schwanna (SC). W tym celu SC otacza aksony z obszaru somy neuronalnej (lub przejścia z ośrodkowego do obwodowego układu nerwowego) do synapsy lub połączenia nerwowo-mięśniowego. Komórki Schwanna są pochodnymi grzebienia nerwowego i migrują jako prekursory wzdłuż wyłaniających się aksonów, aż cały akson zostanie pokryty SC. Pokazuje to znaczenie migracji SC dla rozwoju obwodowego układu nerwowego i podkreśla konieczność zbadania tego procesu. Aby przeanalizować rozwój SC, potrzebna jest konfiguracja, która oprócz SC zawiera również ich fizjologiczny substrat do migracji, akson. Ze względu na rozwój wewnątrzmaciczny in vivo, obrazowanie poklatkowe nie jest jednak możliwe u kręgowców łożyskowych, takich jak myszy (mus musculus). Aby obejść ten problem, dostosowaliśmy technikę eksplantatu zwoju szyjnego (SCG). Po leczeniu czynnikiem wzrostu nerwów (NGF) eksplantaty SCG wydłużają aksony, a następnie prekursory SC migrują wzdłuż aksonów ze zwoju na obrzeża. Piękno tego systemu polega na tym, że SC pochodzą z puli endogennych SC i że migrują wzdłuż własnych fizjologicznych aksonów, które rosną w tym samym czasie. System ten jest szczególnie intrygujący, ponieważ rozwój SC wzdłuż aksonów może być analizowany za pomocą obrazowania poklatkowego, co otwiera dalsze możliwości uzyskania wglądu w migrację SC.

Wzrost aksonalny z eksplantów SCG jest wspomagany po zastosowaniu NGF (4) (schemat filmu S1, schemat Rysunek 1). Proces ten jest łatwo widoczny w dowolnym mikroskopie odwróconym i może być monitorowany za pomocą obrazowania time-lapse (film S2). Jeśli badacz po raz pierwszy wykonuje wyizolowanie SCG z embrionów myszy, silnie zalecamy walidację tej techniki za pomocą prostej immunohistochemii przeciwko hydroksylazie tyrozynowej (TH). TH jest powszechnym markerem neuronów katecholaminergic...

Tutaj opisujemy test migracji komórek Schwanna (SC), w którym SC są w stanie rozwijać się wzdłuż rozszerzających się aksonów.

Analiza rozwoju mysich komórek Schwanna wzdłuż rosnących aksonów

The  development of peripheral nerves is an intriguing process. Neurons send out  axons to innervate specific targets, which in humans are often more than ...

Celem poniższego eksperymentu jest analiza rozwoju komórek Schwana wzdłuż rosnących aksonów, ich naturalnego środowiska. Osiąga się to poprzez pierwszy ex explan górne zwoje szyjne lub S cg zarodków myszy na matrycach kolagenowych jako drugi krok. CG S są leczone czynnikiem wzrostu nerwów lub NGF, który ułatwia wzrost aksonów z neuronów SCG w sposób koronalny.Oprócz wzrostu aksonów z X explan, można zaobserwować endogenne komórki Schwana migrujące wzdłuż wydłużonych aksonów w kierunku peryferii. Rozwój komórek Schwana można analizować za pomocą obrazowania poklatkowego, a także za pomocą analizy końcowej utrwalonej tkanki, co umożliwia pomiary odległości. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak test migracji zarysowniczej, jest to, że w tym teście uwzględniono naturalne siedlisko komórek łabędzia.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Ponieważ prawidłowy montaż metryk kolagenu i prawidłowe rozwarstwienie sgs są kluczem do sukcesu. Te kroki nie są szczególnie trudne do nauczenia.Najpierw potrzebują tylko praktyki. Podczas pracy w hodowli tkankowej kaptur zrozumiał nasze warunki ze wszystkimi rozwiązaniami na lodzie. Przygotuj pożywkę hodowlaną i kolagen z ogona szczura zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnym protokole.Wymieszaj 800 mikrolitrów kolagenu z ogona szczura z 210 mikrolitrami podłoża podstawowego. Bez wprowadzania bąbelków roztwór powinien pozostać koloru czerwonego. Jeśli roztwór zmieni kolor na żółty, oznacza to, że roztwór kolagenu Ratal jest zbyt kwaśny i należy go przetworzyć z większym stężeniem wodorotlenku sodu, pipetą 100 mikro uwalnianie roztworu do każdej studzienki szkiełka wielodołkowego i upewnić się, że dno każdej studzienki jest całkowicie zakryte.Umieść naczynia w nawilżonym inkubatorze do hodowli tkankowych ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na dwie godziny. Nasze zarodki E 16 do E 18 po zbiorach umieszcza się na szalce Petriego zawierającej PBS, a następnie wycina z owodni i ścina głowę na poziomie rdzenia obojczyka C. Okolice głowy i szyi są następnie przenoszone do silikonowego naczynia dolnego, a podczas patrzenia przez mikroskop preparacyjny igły owadów są używane do przypinania tkanki w obszarach podżuchwowych i obojczykowych.Teraz użyj kleszczy, aby usunąć skórę i tkankę podskórną okolicy podżuchwowej. Następnie usuń gruczoły ślinowe podżuchwowe, aby odsłonić mięśnie nadgnykowe, podkolanowe i mostkowo-obojczykowo-sutkowe. Następnie za pomocą kleszczy ostrożnie usuń mięśnie podkolanowe i mostkowo-obojczykowo-sutkowe, aby odsłonić krtań i tchawicę.Chwyć tchawicę kleszczami i wyjmij tchawicę i krtań. Po usunięciu krtani i tchawicy widoczne są tętnice szyjne, które znajdują się po obu stronach mięśni przedkręgowych. Górne zwoje szyjne znajdują się w rozwidleniu tętnic szyjnych i można je zidentyfikować jako owalny kształt.Użyj kleszczy i uchwytu na igłę zamontowanego za pomocą igły do owadów, aby usunąć górne zwoje szyjne i umieścić w świeżym naczyniu zawierającym PBS, a następnie wypreparować wszelkie naczynia krwionośne lub połączone tkanki ze zwojów. Za pomocą igieł strzykawkowych wyjmij żelowane żele kolagenowe z inkubatora i użyj igieł strzykawkowych zamontowanych na strzykawkach, aby przenieść zwoje na żele. Umieść eksplantaty w inkubatorze do hodowli tkankowych ustawionym na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i wilgotnymi warunkami na jedną do dwóch godzin.Po jednej do dwóch godzin inkubacji z inkubatora do hodowli tkankowej pobiera się górne eksplantaty zwoju szyjki macicy i dodaje się 100 mikrolitrów podłoża neuro bazalnego zawierającego suplement B 27 glutaminę i antybiotyki do każdego x explan. Następnie 200 mikrolitrów podłoża neuro podstawowego zawierającego 60 nanogramów na mililitr. NGF jest również dodawany do studzienek, aby ułatwić wzrost aksonów.Substancje badane mogą być również dodawane w tym czasie, który określa się jako dzień zerowy in vitro w celu zbadania wpływu na komórki łabędzia, które już rozpoczęły migrację. Substancje aksonów można podawać po trzech dniach in vitro, usuwając 180 mikrolitrów z istniejących pożywek i zastępując je 200 mikrolitrami pożywki zawierającej substancję będącą przedmiotem zainteresowania i NGF o podwójnym stężeniu końcowym, obrazowanie poklatkowe wykonuje się przy użyciu zestawu mikroskopu odwróconego, który umożliwi równoległą inkubację hodowli komórkowej i obrazowanie poklatkowe w celu porównania różnych substancji badanych. W jednym eksperymencie w punkcie końcowym eksperymentu zalecane jest ustawienie wielopozycyjne.Po utrwaleniu eksplantatów w szkiełkach hodowlanych za pomocą 4% PFA przez trzy do czterech godzin i umyciu PBS, wykonaj immunohistochemię, aby zwalidować eksplant X jako SCG blokuj tkankę za pomocą PBS zawierającego 10% normalnej surowicy osła i 2% tritton X 100 przez dwie godziny. Następnie wykonaj inkubację przeciwciał pierwotnych w roztworze blokującym przez noc. Następnego dnia po inkubacji przeciwciał pierwszorzędowych przenieść X explan zawierający żele na płytkę 24-dołkową po umyciu PBS, inkubować z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi przez dwie godziny, chroniąc przed światłem, następnie przemyć PBS i inkubować z roztworem dappy przez 10 minut.Po kilkukrotnym umyciu umieścić żele kolagenowe zawierające X explan pod mikroskopem, szkiełko, wysuszyć szkiełka, a następnie zamontować cielęciną. Użyj standardowego mikroskopu fluorescencyjnego, aby uzyskać obrazy do późniejszej analizy ilościowej. Jest to pomocne, jeśli oprogramowanie mikroskopu jest w stanie rejestrować metadane.Analiza ilościowa uzyskanych obrazów może być wykonywana za pomocą oprogramowania Fiji lub ImageJ, które może być wykorzystywane bezpłatnie do zastosowań naukowych. Wzrost aksonów ze schematycznego SCGX EXPLAN w ciągu czterech dni in vitro jest pokazany w tym filmie. Immunohistochemię można wykonać w czwartym dniu in vitro, aby wyraźnie zidentyfikować eksplantowany ganglion.Jako zwój współczulny można zaobserwować migrację komórek Schwana wzdłuż aksonu, przemieszczając się z górnego zwoju szyjki macicy na obrzeża. Ten film pokazuje ten sam wzorzec migracji, który jest widoczny w większym powiększeniu. Odległości migracji można łatwo zmierzyć na próbkach przeciwbarwiących dla jąder o DPI, mierząc odległość od jąder wiodących komórek Schwana do granicy eksplantowanego SCG w wielu miejscach, jak pokazano na schemacie i obrazie próbki potraktowanej NGF oznaczonej DPI po czterech dniach in vitro, ten film pokazuje migrację komórek Schwana na granicy explanu SCG.Połączenie jasnego pola i fluorescencji umożliwia wizualizację dodatnich komórek łabędzia S 100 GFP i aksonów. Wreszcie, ten film pokazuje migrację komórek Schwana na granicy górnego zwoju szyjnego ex explan. W tym miejscu pokazany jest tylko kanał fluorescencyjny, co umożliwia łatwiejszą interpretację komórek Schwana S 100 GFP-dodatnich.Po tej procedurze można przeprowadzić dodatkową analizę ilościową, taką jak kwantyfikacja proliferacji jednej komórki lub kwantyfikacja apoptozy jednej komórki. Oczywiście, odpowiednia immunohistochemia musi być przeprowadzona do analizy punktów końcowych lub określone zwierzęta transgeniczne muszą być użyte do pokazania efektów w żywym kontekście.

analyzing-murine-schwann-cell-development-along-growing-axons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Analiza rozwoju komórek Schwanna u myszy wzdłuż rosnących aksonów

Niniejszy artykuł ma na celu opisanie w sposób etapowy powszechnie stosowanych testów in vitro wykorzystywanych w badaniu oddziaływań między komórkami Schwanna a astrocytami.

Analiza interakcji między komórkami Schwanna a astrocytami z wykorzystaniem testów in vitro

Opisano model in vitro do badań genetycznych nad regeneracją aksonów z wykorzystaniem hodowli neuronów z zwojów korzeni grzbietowych dorosłych myszy. Metoda obejmuje etap resuspensji i ponownego wysiewu, aby umożliwić ponowny wzrost aksonów z neuronów poddanych manipulacjom genetycznym. Podejście to jest szczególnie przydatne w badaniach nad utratą funkcji w procesie regeneracji aksonów z wykorzystaniem wyciszania ekspresji białek opartego na RNAi.

Genetyczne badanie regeneracji aksonów w hodowlach neuronów z dorosłych zwojów korzeni grzbietowych

Ten film demonstruje model kokulturacyjny eksplantacji zwoju korzenia grzbietowego i komórek Schwanna. W warunkach kokultury kwas askorbinowy sprzyja różnicowaniu komórek Schwanna w formy mielinizujące. Mielinizujące się komórki Schwanna wielokrotnie owijają aksony, aby utworzyć osłonkę mielinową, która jest niezbędna do funkcjonowania nerwów.

Wspólna hodowla eksplantatu zwoju korzenia grzbietowego z komórkami Schwanna do mielinizacji neuronów

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany protokół genotypu, barwienia i przygotowania płodów myszy do obrazowania obwodowych projekcji aksonów nocyceptora u całego zwierzęcia, jako skuteczną metodę oceny fenotypów wzrostu aksonów czuciowych u genetycznie modyfikowanych myszy.

Obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy

Techniki mikroskopii świetlnej w połączeniu z testami biochemicznymi wyjaśniają udział egzocytozy za pośrednictwem SNARE w zależnym od netryny rozgałęzianiu aksonów. Ta kombinacja technik pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych kontrolujących rozgałęzianie się aksonów i zmianę kształtu komórki.

Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów

Ten protokół opisuje izolację neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) izolowanych od szczurów oraz hodowlę neuronów DRG na statycznym, wstępnie rozciągniętym systemie hodowli komórek w celu poprawy wyrównania aksonów, z późniejszą kokulturą komórek Schwanna (SC) w celu promowania mielinizacji.

Podejście do poprawy wyrównania i mielinizacji neuronów zwoju korzenia grzbietowego

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji projekcji neuronów ruchowych i arboryzacji aksonów w transgenicznych zarodkach myszy Hb9::GFP. Po barwieniu immunologicznym neuronów ruchowych użyliśmy mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego do obrazowania zarodków do późniejszej analizy ilościowej. Protokół ten ma zastosowanie do innych procesów nawigacji neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Wizualizacja nawigacji aksonów ruchowych i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Test ex vivo pozwala na obrazowanie przerostu nerwu okoruchowego w czasie rzeczywistym. Plastry są generowane przez osadzenie zarodków E10.5 IslMN:GFP w agarozie, krojenie na wibratomie i wzrost w inkubatorze typu stage-top. Rolę szlaków naprowadzania aksonów ocenia się poprzez dodanie inhibitorów do pożywki hodowlanej.

Hodowla plastrów okulomotorycznych ex vivo od embrionalnych myszy z ekspresją GFP do obrazowania poklatkowego wzrostu nerwu okoruchowego

W systemie kokultury zwojów korzenia grzbietowego i komórek Schwanna, mielinizacja obwodowego układu nerwowego może być badana. Model ten zapewnia eksperymentalne możliwości obserwacji i ilościowego określenia mielinizacji obwodowej oraz zbadania wpływu związków będących przedmiotem zainteresowania na osłonkę mielinową.

Mielinizacja in vitro aksonów obwodowych w kokulturze eksplantatów zwojów korzenia grzbietowego szczura i komórek Schwanna

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj analizę migracji komórek Schwanna wzdłuż aksonów myszy przy użyciu eksplantatów szyjnych węzłów współczulnych. Ta metoda umożliwia obserwację rozwoju komórek w ich naturalnym środowisku.

Analiza rozwoju mysich komórek Schwanna wzdłuż rosnących aksonów

Przeglądaj więcej filmów