Analiza rozwoju mysich komórek Schwanna wzdłuż rosnących aksonów

Celem poniższego eksperymentu jest analiza rozwoju komórek Schwana wzdłuż rosnących aksonów, ich naturalnego środowiska. Osiąga się to poprzez pierwszy ex explan górne zwoje szyjne lub S cg zarodków myszy na matrycach kolagenowych jako drugi krok. CG S są leczone czynnikiem wzrostu nerwów lub NGF, który ułatwia wzrost aksonów z neuronów SCG w sposób koronalny.

Oprócz wzrostu aksonów z X explan, można zaobserwować endogenne komórki Schwana migrujące wzdłuż wydłużonych aksonów w kierunku peryferii. Rozwój komórek Schwana można analizować za pomocą obrazowania poklatkowego, a także za pomocą analizy końcowej utrwalonej tkanki, co umożliwia pomiary odległości. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak test migracji zarysowniczej, jest to, że w tym teście uwzględniono naturalne siedlisko komórek łabędzia.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Ponieważ prawidłowy montaż metryk kolagenu i prawidłowe rozwarstwienie sgs są kluczem do sukcesu. Te kroki nie są szczególnie trudne do nauczenia.

Najpierw potrzebują tylko praktyki. Podczas pracy w hodowli tkankowej kaptur zrozumiał nasze warunki ze wszystkimi rozwiązaniami na lodzie. Przygotuj pożywkę hodowlaną i kolagen z ogona szczura zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnym protokole.

Wymieszaj 800 mikrolitrów kolagenu z ogona szczura z 210 mikrolitrami podłoża podstawowego. Bez wprowadzania bąbelków roztwór powinien pozostać koloru czerwonego. Jeśli roztwór zmieni kolor na żółty, oznacza to, że roztwór kolagenu Ratal jest zbyt kwaśny i należy go przetworzyć z większym stężeniem wodorotlenku sodu, pipetą 100 mikro uwalnianie roztworu do każdej studzienki szkiełka wielodołkowego i upewnić się, że dno każdej studzienki jest całkowicie zakryte.

Umieść naczynia w nawilżonym inkubatorze do hodowli tkankowych ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na dwie godziny. Nasze zarodki E 16 do E 18 po zbiorach umieszcza się na szalce Petriego zawierającej PBS, a następnie wycina z owodni i ścina głowę na poziomie rdzenia obojczyka C. Okolice głowy i szyi są następnie przenoszone do silikonowego naczynia dolnego, a podczas patrzenia przez mikroskop preparacyjny igły owadów są używane do przypinania tkanki w obszarach podżuchwowych i obojczykowych.

Teraz użyj kleszczy, aby usunąć skórę i tkankę podskórną okolicy podżuchwowej. Następnie usuń gruczoły ślinowe podżuchwowe, aby odsłonić mięśnie nadgnykowe, podkolanowe i mostkowo-obojczykowo-sutkowe. Następnie za pomocą kleszczy ostrożnie usuń mięśnie podkolanowe i mostkowo-obojczykowo-sutkowe, aby odsłonić krtań i tchawicę.

Chwyć tchawicę kleszczami i wyjmij tchawicę i krtań. Po usunięciu krtani i tchawicy widoczne są tętnice szyjne, które znajdują się po obu stronach mięśni przedkręgowych. Górne zwoje szyjne znajdują się w rozwidleniu tętnic szyjnych i można je zidentyfikować jako owalny kształt.

Użyj kleszczy i uchwytu na igłę zamontowanego za pomocą igły do owadów, aby usunąć górne zwoje szyjne i umieścić w świeżym naczyniu zawierającym PBS, a następnie wypreparować wszelkie naczynia krwionośne lub połączone tkanki ze zwojów. Za pomocą igieł strzykawkowych wyjmij żelowane żele kolagenowe z inkubatora i użyj igieł strzykawkowych zamontowanych na strzykawkach, aby przenieść zwoje na żele. Umieść eksplantaty w inkubatorze do hodowli tkankowych ustawionym na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i wilgotnymi warunkami na jedną do dwóch godzin.

Po jednej do dwóch godzin inkubacji z inkubatora do hodowli tkankowej pobiera się górne eksplantaty zwoju szyjki macicy i dodaje się 100 mikrolitrów podłoża neuro bazalnego zawierającego suplement B 27 glutaminę i antybiotyki do każdego x explan. Następnie 200 mikrolitrów podłoża neuro podstawowego zawierającego 60 nanogramów na mililitr. NGF jest również dodawany do studzienek, aby ułatwić wzrost aksonów.

Substancje badane mogą być również dodawane w tym czasie, który określa się jako dzień zerowy in vitro w celu zbadania wpływu na komórki łabędzia, które już rozpoczęły migrację. Substancje aksonów można podawać po trzech dniach in vitro, usuwając 180 mikrolitrów z istniejących pożywek i zastępując je 200 mikrolitrami pożywki zawierającej substancję będącą przedmiotem zainteresowania i NGF o podwójnym stężeniu końcowym, obrazowanie poklatkowe wykonuje się przy użyciu zestawu mikroskopu odwróconego, który umożliwi równoległą inkubację hodowli komórkowej i obrazowanie poklatkowe w celu porównania różnych substancji badanych. W jednym eksperymencie w punkcie końcowym eksperymentu zalecane jest ustawienie wielopozycyjne.

Po utrwaleniu eksplantatów w szkiełkach hodowlanych za pomocą 4% PFA przez trzy do czterech godzin i umyciu PBS, wykonaj immunohistochemię, aby zwalidować eksplant X jako SCG blokuj tkankę za pomocą PBS zawierającego 10% normalnej surowicy osła i 2% tritton X 100 przez dwie godziny. Następnie wykonaj inkubację przeciwciał pierwotnych w roztworze blokującym przez noc. Następnego dnia po inkubacji przeciwciał pierwszorzędowych przenieść X explan zawierający żele na płytkę 24-dołkową po umyciu PBS, inkubować z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi przez dwie godziny, chroniąc przed światłem, następnie przemyć PBS i inkubować z roztworem dappy przez 10 minut.

Po kilkukrotnym umyciu umieścić żele kolagenowe zawierające X explan pod mikroskopem, szkiełko, wysuszyć szkiełka, a następnie zamontować cielęciną. Użyj standardowego mikroskopu fluorescencyjnego, aby uzyskać obrazy do późniejszej analizy ilościowej. Jest to pomocne, jeśli oprogramowanie mikroskopu jest w stanie rejestrować metadane.

Analiza ilościowa uzyskanych obrazów może być wykonywana za pomocą oprogramowania Fiji lub ImageJ, które może być wykorzystywane bezpłatnie do zastosowań naukowych. Wzrost aksonów ze schematycznego SCGX EXPLAN w ciągu czterech dni in vitro jest pokazany w tym filmie. Immunohistochemię można wykonać w czwartym dniu in vitro, aby wyraźnie zidentyfikować eksplantowany ganglion.

Jako zwój współczulny można zaobserwować migrację komórek Schwana wzdłuż aksonu, przemieszczając się z górnego zwoju szyjki macicy na obrzeża. Ten film pokazuje ten sam wzorzec migracji, który jest widoczny w większym powiększeniu. Odległości migracji można łatwo zmierzyć na próbkach przeciwbarwiących dla jąder o DPI, mierząc odległość od jąder wiodących komórek Schwana do granicy eksplantowanego SCG w wielu miejscach, jak pokazano na schemacie i obrazie próbki potraktowanej NGF oznaczonej DPI po czterech dniach in vitro, ten film pokazuje migrację komórek Schwana na granicy explanu SCG.

Połączenie jasnego pola i fluorescencji umożliwia wizualizację dodatnich komórek łabędzia S 100 GFP i aksonów. Wreszcie, ten film pokazuje migrację komórek Schwana na granicy górnego zwoju szyjnego ex explan. W tym miejscu pokazany jest tylko kanał fluorescencyjny, co umożliwia łatwiejszą interpretację komórek Schwana S 100 GFP-dodatnich.

Po tej procedurze można przeprowadzić dodatkową analizę ilościową, taką jak kwantyfikacja proliferacji jednej komórki lub kwantyfikacja apoptozy jednej komórki. Oczywiście, odpowiednia immunohistochemia musi być przeprowadzona do analizy punktów końcowych lub określone zwierzęta transgeniczne muszą być użyte do pokazania efektów w żywym kontekście.