In ovo Ekspresja mikroRNA w brzusznym śródmózgowiu piskląt

Owalna elektroporacja rozpoczyna się od otwarcia aktu w celu odsłonięcia zarodka policzka. W hamburgerze Hamilton DNA w stadium od 9 do 11 jest wstrzykiwane do obszaru śródmózgowia. Następnie elektrody umieszcza się po lewej i prawej stronie śródmózgowia i przykłada się napięcie elektryczne.

Powoduje to, że komórki progenitorowe muralu w strefie komorowej pobierają DNA do transfekcji brzusznej. Jedna elektroda. Anoda jest umieszczona pod membraną zakrywającą A poniżej obszaru śródmózgowia.

Katodę umieszcza się bocznie grzbietowo po przeciwnej stronie śródmózgowia przed przyłożeniem napięcia elektrycznego. Należy uważać, aby elektrody nie stykały się z cewą nerwową. 24 godziny później, w stadium Hamburger Hamilton 16 lub 17, zarodki są usuwane z komórki jajowej i analizowane za pomocą przeciwciał, barwienia lub hybrydyzacji in situ.

Komórki GFP dodatnie wskazują obszar transfekcji genu. Elektroporacja cząsteczek prekursorów mikroRNA lub dupleks mikroRNA zapewnia natychmiastowy, ale krótki efekt, aby zapewnić dłuższą ekspresję mikroRNA. Elektronicznie operujemy wektorem ekspresyjnym, który zawiera sekwencje kodujące z mikro RNA wraz z wektorem wyrażającym GFP.

Aby uwidocznić przecięte komórki, mikroRNA wyrażone z wektora będzie obecne najwcześniej cztery godziny po elektroporacji. Prosimy o zapoznanie się z naszym pisemnym protokołem, aby uzyskać szczegółowe instrukcje dotyczące sterylizacji narzędzi oraz przygotowywania użytych przez nas roztworów i konstruktów. Witam wszystkich.

Jestem studentką medycyny w laboratorium Andrei Manna na Wydziale Embriologii Doświadczalnej w Instytucie Anatomii Uniwersytetu w Tybindze. W poniższym filmie chcę pokazać, jak przeprowadzić transfekcję DNA lub RNA w owalnych obszarach środkowej części mózgu. Ta metoda może być stosowana do różnych obszarów mózgu.

Stosujemy metodę nadekspresji mikro RNA w otworze wentylacyjnym Midbrain Mikropipeta z drobną końcówką powinna być przygotowana przed rozpoczęciem za pomocą ściągacza do mikropipet za pomocą długiej końcówki do ładowania żelu, napełnić mikropipetę około sześcioma mikrolitrami, roztworem DNA zamiast zasypki. DNA może być również wchłonięte za pomocą wstrzykiwacza po złamaniu końcówki mikropipety w celu otrzymania zarodków piskląt w wymaganym stadium embrionalnym. XR inkubował w temperaturze 37 stopni Celsjusza i wilgotności 65% po tym, jak hamburger i instrukcje Hamiltona XR położyły się na boku.

Wierzchołek, w którym osadza się zarodek, jest oznaczony linią długopisu. Po upływie wymaganego czasu inkubacji, XR wyjmuje się z inkubatora w taki sposób, że linia pióra jest nadal skierowana do góry. XR zdezynfekowany 70% etanolem na szerokiej stronie komory powietrznej SSON, do której nakładany jest otwór.

Używamy dostępnego w handlu szczypca do jajek, ale duża igła też się sprawdzi. Strzykawkę o pojemności 10 mililitrów wkłada się do otworu pod dość pionowym kątem, aby uniknąć uszkodzenia Eggo i usuwa się od jednego do dwóch mililitrów białka jaja. Pomaga to odłączyć zarodek od skorupki jaja, aby uniknąć kapania skorupki jaja na zarodek.

Przymocuj mały pasek taśmy siodłowej do górnej części jajka, a następnie wytnij małe okienko w skorupce jajka, aby odsłonić zarodek. Aby uwidocznić zarodek. Niewielka ilość inus wstrzyknięta pod spód.

Następnie potrząśnij trochę jajkiem, aby rozprowadzić atrament. Kolejny, mikroskop stereoskopowy. Zarodek jest łatwy do rozpoznania.

Dodając tarczycę, oderwij nieco zarodek od błony vilin za pomocą ostrego drutu wolframowego. Przebij błonę vilin i owiń szczelinę. Luka. Przebij ścianę nabłonka nerwowego z tyłu lub z przodu śródmózgowia za pomocą mikropipety i wstrzyknij DNA do światła cewy nerwowej.

Na poziomie śródmózgowia Do operacji elektrycznej używamy wewnątrzkomórkowego elektroradaru z podwójnym impulsem z pedałem nożnym do elektro obsługi szerokich obszarów śródmózgowia. Używamy drutów płaskich o średnicy Ø 0,5 milimetra mocowanych w samodzielnie wykonanym uchwycie. Elektrody pokazują odległość około pięciu milimetrów od siebie do elektrolitu wentylacyjnego mózgu.

Jako anodę używamy drutu płytkowego o średnicy oh 0,2 milimetra i oh point 25 milimetrów na miejsce katody. Elektrody są równoległe do poziomu śródmózgowia zarodka, aby uzyskać szeroką inspekcję komórek śródmózgowia. Następnie naciśnij pedał nożny trzy do pięciu razy do wątroby, prąd pulsuje do zarodka.

Bąbelki, które formatują negatywnie ocenianą elektrodę, wykazują udaną elektroporację w celu osiągnięcia transfekcji brzusznej środkowej części mózgu. Anoda jest wpychana poniżej błony obszaru, lucida poniżej brzusznej środkowej części mózgu, aby uniknąć przypalenia cewy nerwowej. Katoda jest umieszczona również bocznie po przeciwnej stronie śródmózgowia i doprowadzane są impulsy prądowe.

XR uszczelnia się taśmą chroniącą je przed odwodnieniem i infekcjami i inkubuje przez kolejne 20 do 24 godzin. Po wymaganej inkubacji X wyjmuje się z inkubatora, a taśmę otwiera się nożyczkami z cienkimi nożyczkami, obficie przecina obszar wokół zarodka i przenosi zarodek do naczynia. W przypadku PBS usuwa się pozostałe błony, amni i dodatkową tkankę zarodkową.

Przecięcie w czterech mózgowiach zapewnia dobry dostęp roztworów do obszaru komorowego cewy nerwowej. Następnie przenieś zarodek do 4% PFA i utrwal przez noc w temperaturze czterech obniżonych stopni Celsjusza. Właśnie pokazałem Ci, jak transfekować mikro RNA do śródmózgowia za pomocą elektroporacji.

Badamy wpływ mikro RNA na różnicowanie i proliferację określonych obszarów śródmózgowia. Jednak metoda ta może być również bardzo pomocna w badaniu ekspresji genów MIS lub knockdownów genów przez S-I-R-N-A w innych specyficznych regionach układu nerwowego zarodka pisklęcia. Mam nadzieję, że to było pomocne i powodzenia w twoich eksperymentach.