Name: In ovo Ekspresja mikroRNA w brzusznym śródmózgowiu piskląt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T07:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj metodę in ovo elektroporacji do selektywnej transfezji DNA w obszary brzusznego i grzbietowego śródmózgowia piskląt. Technika ta umożliwia badanie roli mikroRNA w rozwoju mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy K. Mikicowi, który przyczynił się do początkowej fazy tego filmu oraz M. Nicolescu za zdjęcie miR. C. Huber był stypendystą IZKF Universtitätsklinikum Tübingen, A. Alwin Prem Anand w ramach programu Fortüne Universtitätsklinikum Tübingen.

1. Wymagania dotyczące elektroporacji in ovo
<ol>
 <li>Przygotowanie konstrukcji wektora: 
 Startery sens i antysens miR zaprojektowano zgodnie z instrukcjami firmy Ambion, następnie poddano hybrydyzacji i ligowano do wektora pSilencer U6.1 trawionego enzymami ApaI/EcoRI. Po udanej transformacji wyhodowano jeden z otrzymanych klonów i wyizolowano plazmid pSilencer metodą lizy alkalicznej przy użyciu zestawu do preparacji midi firmy Quiagen. </li>
 <li>Elektrody: 
 Elektrody można kupić lub łatwo wykonać samodzielnie13. Stosujemy własnoręcznie wykonane elektrody z drutu platynowego (Φ = 0,2, 0,25 lub 0,5 mm średnicy), a w niektórych przypadkach, w zależności od obszaru poddawanego elektroporacji, jeszcze cieńsze elektrody z drutu wolframowego (Φ = 0,1 mm)8. Aby uniknąć przypalenia tkanki, stosujemy zasadę, że im bliżej tkanki, tym cieńsze powinny być elektrody. Do szerokiej elektroporacji śródmózgowia używamy drutów platynowych o średnicy 0,5 mm, przylutowanych do mosiężnego lub stalowego trzpienia rurkowego i zamocowanych w uchwycie elektrod w odległości 3-5 mm (Rysunek 1). Do elektroporacji specyficznych obszarów stosujemy anody z drutu platynowego 0,25 mm oraz katody z drutu platynowego 0,2 mm lub wolframowego 0,1 mm, w przybliżonej odległości 1 mm lub mniejszej. </li>
 <li>Roztwory: Należy przygotować następujące roztwory: 
 <ol>
 <li>Autoklawowany roztwór Ringera dla kurcząt, pH 7,5 (9,0 g NaCl, 0,42 g KCl, 0,24 g CaCl2, rozpuścić w 1 L wody destylowanej).</li>
 <li>PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,24 g KH2PO4, 1,44 g Na2HPO4, rozpuścić w 1 l destylowanej H2O). </li>
 <li>Fast Green: roztwór stokowy 10 mg/ml w destylowanej H2O</li>
 <li>Atrament wolno schnący (zawierający mniej szelaku, a tym samym mniej toksyczny dla embrionu). Uwaga: niebieski filtr dichroiczny zamocowany do lampy światłowodowej, opisany przez Canto-Solera i Adlera14, zwiększa kontrast i może wyeliminować konieczność wstrzykiwania atramentu. </li>
 </ol>
 </li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/50024/50024fig1.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50024/50024fig1highres.jpg" alt="Schemat montażu czujnika światłowodowego; układ eksperymentalny do pomiarów, szczegóły światłowodów." data-altupdatedat="1787630408000"> 
Rycina 1. Schemat elektrod i uchwytu elektrod. (A, B, C) Drut platynowy został przylutowany do jednej strony stalowego wału rurkowego. Po drugiej stronie wału rurkowego nawiercono otwór, w którym mieszczą się wtyki pinowe. (A) Do wtyków pinowych podłączono przewody w kolorze czerwonym i niebieskim. Na przeciwległym końcu przewód został dopasowany do wtyków bananowych, które współpracują z gniazdami elektrycznymi elektroporatora. (A, C) Drut platynowy został zgięty pod kątem 90°. Warstwa lakieru do paznokci odizolowała wał powyżej zgięcia.
2. Przygotowania bezpośrednio przed elektroporacją in ovo
<ol>
 <li>Przygotować następujące materiały:
 <ol>
 <li>Rozcieńczyć Ink w roztworze Ringera dla kurcząt w stosunku 1:6, dodać roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100x od Gibco) w stosunku 1:100.</li>
 <li>Przygotować roztwór wektora: 1-2 μg/μl konkretnego DNA w H2O z dodatkiem Fast Green (1:20).</li>
 <li>Zisterylizować pęsetę, nożyczki, igłę wolframową i elektrody za pomocą 70% etanolu.</li>
 <li>Wytworzyć mikropipety do iniekcji kwasów nukleinowych z kapilar borokrzemianowych (długość do średnicy zewnętrznej: 100 mm x 0.9 mm). Stosujemy prosty wyciągacz PUL-1 (WPI, Berlin) z ustawieniami przedstawionymi w Tabeli 1.</li>
 <li>Ustawić parametry elektroporatora zgodnie z Tabelą 2.</li>
 </ol>
 </li> 
</ol>
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td fo:width="1in">Parametry</td>
 <td fo:width="1in">Wartości</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ciepło </td>
 <td>350</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pociągnij</td>
 <td>100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Prędkość</td>
 <td>50</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Opóźnienie</td>
 <td>200</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Tabela 1. Ustawienia dla PUL-1 
 <table border="1">
 <tbody >
 <tr >
 <td fo:width="1.5in">Parametry</td>
 <td fo:width="1.5in">Wartości</td>
 </tr>
 <tr >
 <td >Częstotliwość</td>
 <td >50 Hz</td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Opóźnienie</td>
 <td >20 - 50 msec*</td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Szerokość</td>
 <td >20 msec</td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Napięcie</td>
 <td >8-25 V *</td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Impuls</td>
 <td >3 - 5 razy</td >
 </tr>
 <tr >
 <td colspan="2">*W zależności od średnicy i odległości elektrod. Prosimy wziąć to pod uwagę przy zmianie jednego z parametrów.</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Tabela 2. Ustawienia stymulatora impulsowego
<ol start="2">
 <li>Przygotowanie embrionów kurzych do elektroporacji:
 <ol>
 <li>Inkubować zapłodnione jaja kurze ułożone na dłuższym boku w temperaturze 37 °C przy 65% wilgotności przez 39 hr, aby uzyskać embriony w stadium Hamburger &amp; Hamilton (HH)15 9-11. Embrion osiada w najwyższej części jaja, dlatego należy go zaznaczyć linią ołówka.</li>
 <li>Zdezynfekować jaja 70% etanolem.</li>
 <li>Przebić jajko z szerszej strony, w miejscu znajdującej się komory powietrznej.</li>
 <li>Usunąć 1-2 ml białka jaja. Pozwoli to oddzielić embrion od skorupki.</li>
 <li>Okleić skorupkę taśmą klejącą, aby zapobiec wpadaniu odłamków skorupki na embrion. Za pomocą nożyczek wyciąć w skorupce małe okno wzdłuż linii zaznaczonej ołówkiem.</li>
 <li>Wstrzyknąć niewielką ilość tuszu pod area opaca w celu wizualizacji embrionu.</li>
 <li>Naciąć błonę witelinową zaostrzoną igłą wolframową, aby zapewnić lepszy dostęp do embrionu podczas wstrzykiwania kwasów nukleinowych i elektroporacji.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
3. Elektroporacja i inkubacja
<ol>
 <li>Nanieś kilka kropel ciepłego roztworu Ringera na zarodki. Pozwoli to obniżyć pozycję zarodków, zapobiegnie ich przegrzaniu oraz przywieraniu elektrod do tkanek, a także zapewni medium dla prądu między obiema elektrodami. </li>
 <li>Wstrzyknij roztwór wektora do światła rurki neuralnej na poziomie śródmózgowia. Jeśli wektor ekspresyjny DNA nie zawiera genu reporterowego (np. EGFP), dodaj do roztworu DNA wektor genu reporterowego o nieco niższym stężeniu (1 μg/μl wektora ekspresyjnego miR do 0,9 μg/μl wektora genu reporterowego). Dzięki temu możliwe będzie późniejsze rozpoznanie transfekowanych komórek8. Używamy tzw. wektora pCAX, otrzymanego w uprzejmym darze od C. Krull 13. </li>
 <li>Aby przeprowadzić szeroką transfekcję śródmózgowia, umieść elektrody po lewej i prawej stronie zarodka na wysokości śródmózgowia. Odległość między elektrodami powinna wynosić około 3-5 mm. Pozostałe ustawienia dla stadium HH 10 to 15V, impulsy 20 msec i opóźnienie 50 msec. Lekka zmiana położenia obu elektrod wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej (DV) śródmózgowia zapewnia szerszą transfekcję komórek wzdłuż osi DV. </li>
 <li>W celu transfekcji brzusznej dodaj nieco roztworu Ringera, aby unieść głowę z błony żółtkowej, i umieść anodę pod brzuszną częścią śródmózgowia. Jeśli głowa nie uniesie się, wprowadź elektrodę pod błonę oddzielającą żółtko od zarodka, aby uniknąć przypalenia rurki neuralnej. Katodę należy umieścić nad śródmózgowiem, grzbietowo-bocznie przeciwlegle do anody. Nie dotykaj rurki neuralnej. Transfekujemy lewą brzuszną połowę śródmózgowia, aby uniknąć problemów z rozwojem serca. Odległość między elektrodami wynosi około 1-0,5 mm, a pozostałe ustawienia to 10V, szerokość impulsu 20 msec i opóźnienie 50 msec.</li>
 <li>Nanieś kolejną kroplę soli fizjologicznej na wierzch zarodków, aby je ochłodzić i usunąć pęcherzyki powietrza. </li>
 <li>Uszczelnij jaja taśmą i inkubuj przez co najmniej 4 hr; jest to minimalny czas wymagany do ekspresji wektora. </li>
</ol>
 4. Fixacja embrionów kurcz own
 <ol>
 <li>Wyjąć zarodki z jaj.</li>
 <li>Oczyścić zarodki pod stereomikroskopem i ocenić zakres transfekcji za pomocą fluorescencyjnego stereomikroskopu.</li>
 <li>Utrwalić zarodki przez noc w 4% PFA w temperaturze 4°C. Przystąpić do sekcjonowania i/lub barwienia (hybrydyzacja in situ, immunohistochemia), aby przeanalizować zmiany w obszarze poddanym transfekcji.</li>
 </ol>

<ol><li>Kutter, C., Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA%2C+siRNA%2C+piRNA%3A+Knowns+of+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown.</a> RNA Biol. 5, 181-188 (2008).</li>
<li>Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigmatic+world+of+mRNA-like+ncRNAs%3A+their+role+in+human+evolution+and+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 141-148 (2008).</li>
<li>Li, X., Jin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+small+regulatory+RNAs+in+determining+neuronal+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity.</a> Nature reviews. Neuroscience. 11, 329-338 (2010).</li>
<li>Riedmann, L. T., Schwentner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA%2C+siRNA%2C+piRNA+and+argonautes%3A+news+in+small+matters%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">miRNA, siRNA, piRNA and argonautes: news in small matters.</a> RNA Biol. 7, 133-139 (2010).</li>
<li>Coolen, M., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+brain+development+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in brain development and physiology.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 461-470 (2009).</li>
<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).</li>
<li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shocking%27+developments+in+chick+embryology%3A+electroporation+and+in+ovo+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).</li>
<li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).</li>
<li>Nakamura, H., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misexpression+of+genes+in+brain+vesicles+by+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 42, 199-201 (2000).</li>
<li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nat. Protoc. 3, 419-426 (2008).</li>
<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Gene Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> The EMBO journal. 1, 841-845 (1982).</li>
<li>Potter, H., Weir, L., Leder, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer-dependent+expression+of+human+kappa+immunoglobulin+genes+introduced+into+mouse+pre-B+lymphocytes+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 7161-7165 (1984).</li>
<li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Dev. Dyn. 229, 433-439 (2004).</li>
<li>Canto-Soler, M. V., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+cup+and+lens+development+requires+Pax6+expression+in+the+early+optic+vesicle+during+a+narrow+time+window%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Optic cup and lens development requires Pax6 expression in the early optic vesicle during a narrow time window.</a> Developmental biology. , 294-2119 (2006).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).</li>
<li>Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation%3A+a+powerful+and+convenient+means+of+nonviral+gene+transfer+to+tissues+of+living+animals+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review).</a> Int J Mol Med. 1, 55-62 (1998).</li>
<li>Agoston, Z., Li, N., Haslinger, A., Wizenmann, A., Schulte, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+physical+interaction+of+Meis2%2C+Pax3+and+Pax7+during+dorsal+midbrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic and physical interaction of Meis2, Pax3 and Pax7 during dorsal midbrain development.</a> BMC Dev Biol. 12, 10(2012).</li>
<li>De Pietri Tonelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+detection+of+microRNAs+in+developing+vertebrate+embryos+after+acute+administration+of+a+dual-fluorescence+reporter%2Fsensor+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid.</a> Biotechniques. 41, 727-732 (2006).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Ten film pokazuje skuteczną metodę transfekcji plazmidu do komórek neuroepitelialnych określonych obszarów śródmózgowia pisklęcia. Prostokątne impulsy elektryczne o niskim napięciu mogą wprowadzić DNA do komórek cewy nerwowej pisklęcia w ovo6,16. Jednak dokładność celowania w DNA jest często utrudniona przez szerokie pole elektryczne, które unosi się przez stosunkowo duże elektrody (Φ = 0,5 mm). Próbowaliśmy rozwiązać ten problem, stosując elektrody o mniejszej średnicy, zgodnie z wytycznymi Momose <e...

Uznanie małych niekodujących RNA za dodatkowe elementy wpływające na ekspresję genów wprowadziło nową warstwę złożoności do programowania genomowego i regulacji genów. Różne rodzaje niekodujących RNA mają istotne znaczenie funkcjonalne w komórkach nerwowych, w tym małe niekodujące RNA1-4. MikroRNA (miR lub miRNA) wykazują na przykład wyraźne i zmienne profile ekspresji w rozwijających się mózgach5. Celowana elektroporacja in ovo embrionów kurzych stwarza wyjątkową możliwość czasowej i przestrzennej kontroli ekspresji i wyciszania genów podczas rozwoju.
W niniejszym materiale wideo przedstawiono poszczególne etapy przeprowadzania ekspresji ektopowej miRs w określonych obszarach śródmózgowia kurczaka przy użyciu in ovo elektroporacja6-10Aby zapewnić długotrwały efekt działania tych małych niekodujących RNA w komórkach, sekwencje DNA miRs sklonowano do wektorów mono- lub bicistronowych. Dla in ovo elektroporacja, wektor zawierający miR jest wstrzykiwany do neuralnej rurki śródmózgowia poprzez odsłonięcie zarodka po wykonaniu małego otworu w skorupce jaja. Aby przeprowadzić transfekcję konkretnych obszarów śródmózgowia, małe elektrody platynowe dodatnie (anoda) i ujemne (katoda) umieszcza się w określonych pozycjach. W przypadku transfekcji brzusznej części śródmózgowia, przed przyłożeniem prądu, anodę umieszcza się pod lewą brzuszną częścią śródmózgowia, a katodę nad prawą połową śródmózgowia. Otwór w skorupce jaja zamyka się taśmą, a zarodki inkubuje się przez czas niezbędny do przeprowadzenia analizy. Metoda ta została pierwotnie opisana przez Muramatsuu. i wsp..6 i udoskonalone przez Momose i wsp..8 do transfekcji obszarowej.
<img src="/files/ftp_upload/50024/50024schematic1.jpg" fo:content-width-="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50024/50024schematic1highres.jpg" alt="Schemat procesu edycji genów; DNA→RNA; układ elektroforezy; metoda biologii molekularnej." data-altupdatedat="1787630408000"> 
Przegląd schematu.
<ol>
 <li>Zarodek w jajku zostaje odsłonięty poprzez wycięcie małego okna w skorupce.</li>
 <li>Rozpuszczony wektor (lub wektory) jest wstrzykiwany do śródmózgowia przy użyciu mikrokapilary.</li>
 <li>Dwie elektrody – umieszczone równolegle lub pod zarodkiem i nad nim – generują impulsowe pole elektryczne.</li>
 <li>Pole elektryczne tymczasowo tworzy pory w błonie komórkowej, co ułatwia wniknięcie do komórki ujemnie naładowanego DNA (lub RNA) przyciąganego do anody11,12.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego </td><td>Hartenstein</td><td></td><td>Model: 0,9 mm</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikrokapilar</td><td>WPI, Berlin</td><td></td><td>Model: Pul1-E</td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Intracel</td><td></td><td>Model: TSSIC</td></tr><tr><td>Stereomikroskop - fluorescencyjny </td><td>LEICA</td><td></td><td>Model: MZFLIII</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Model: Stemi</td></tr><tr><td>Kamera i oprogramowanie</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8</td></tr></tbody></table>

in ovo ekspresja mikrorna w brzusznym śródmózgowiu piskląt

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Niekodujące RNA są dodatkowymi graczami w regulacji ekspresji genów. Ukierunkowana elektroporacja in ovo określonych obszarów stanowi unikalne narzędzie do przestrzennej i czasowej kontroli ektopowej ekspresji mikroRNA. Jednak brzuszne struktury mózgu, takie jak brzuszne śródmózgowie, są raczej trudne do osiągnięcia w celu jakichkolwiek manipulacji. Tutaj pokazujemy skuteczny sposób elektroportowania miRNA do brzusznego śródmózgowia za pomocą cienkich elektrod platynowych. Metoda ta oferuje niezawodny sposób transfekcji określonych obszarów śródmózgowia i jest użytecznym narzędziem do badań in vivo.

Zakres obszaru śródmózgowia przetransfekowanego miR jest widoczny dzięki ekspresji GFP z wektora reporterowego, który został wstrzyknięty wraz z wektorem wykazującym ekspresję miR (Rysunek 2). Zastosowanie elektrod platynowych o średnicy 0,5 mm, umieszczonych równolegle do osi AP śródmózgowia, zazwyczaj prowadzi do transfekcji szerokiego obszaru wzdłuż osi DV i AP, obejmującego rdzeń przedłużony, śródmózowie i niekiedy wzgórze (Rysunki 2A i B). Rozmiar elektrod skutkuje przyłożeniem szer...

Ekspresja ektopowa to jedna z technik wyjaśniających rolę mikroRNA w rozwoju mózgu. Jednak celowanie w określone obszary za pomocą elektroporacji in ovo jest trudne. Tutaj pokazujemy skuteczny sposób selektywnego elektroportowania brzusznych i grzbietowych obszarów śródmózgowia.

In ovo Ekspresja mikroRNA w brzusznym śródmózgowiu piskląt

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Elektroporację owalną rozpoczyna się od otwarcia zarodka w celu odsłonięcia policzka. W stadiach 9–11 według skali Hamburgera i Hamiltona DNA jest wstrzykiwane do obszaru śródmózgowia. Następnie elektrody są umieszczane po lewej i prawej stronie śródmózgowia, a następnie przyłożone jest napięcie elektryczne.Powoduje to, że komórki progenitorowe ściany w strefie komorowej pobierają DNA do transfekcji brzusznej. Jedna elektroda. Anoda jest umieszczona pod błoną pokrywającą obszar poniżej części środkowej mózgowia.Katodę umieszcza się bocznie w części grzbietowej po przeciwnej stronie niż śródmózgowie przed przyłożeniem napięcia elektrycznego. Należy zwrócić uwagę, aby elektrody nie dotknęły cewy neuronalnej. Po 24 godzinach, w stadium Hamburgera-Hamiltona 16 lub 17, zarodki są usuwane z jaja, utrwalane i analizowane za pomocą przeciwciał, barwienia lub hybrydyzacji in situ.Komórki wykazujące pozytywny wynik w kierunku GFP wskazują obszar transfekcji genów. Elektroporacja cząsteczek prekursorów microRNA lub dupleksu microRNA zapewnia natychmiastowy, lecz krótkotrwały efekt, aby zapewnić dłuższą ekspresję microRNA. Przeprowadzamy elektroporację wektora ekspresyjnego zawierającego sekwe

in-ovo-expression-of-microrna-in-ventral-chick-midbrain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

In ovo Ekspresja mikroRNA w grzbietowej części śródmózgowia kurcząt

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób wizualizacji szlaków aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w embrionalnym rdzeniu kręgowym kurczaka, z wykorzystaniem elektroporacji in ovo genów reporterowych pod kontrolą specyficznych elementów enhancera.

Rozszyfrowanie dróg aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w cewie nerwowej kurczaka z wykorzystaniem elektroporacji in ovo

Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić celowaną iniekcję do siatkówki oraz elektroporację konstruktów DNA/RNA in ovo do siatkówki zarodka kurczaka w stadium 22-23 według skali Hamburgera i Hamiltona, co odpowiada około 4. dniu inkubacji (E4). Technika ta jest bardzo użyteczna w badaniu ekspresji genów, regulacji genów oraz zmian morfologicznych w rozwijającej się siatkówce kurczaka.

Elektroporacja in ovo siatkówki zarodka kurczaka

Niniejsza praca opisuje opracowanie techniki elektroporacji in vitro, która umożliwia manipulację ekspresją genów w dolnej części wargi rombowej embrionów w połowie okresu gestacji.

In vitro elektroporacja dolnej wargi rombowej zarodków myszy w połowie okresu gestacji

W celu oceny funkcji i regulacji genów podczas rozwoju dopaminergicznych neuronów śródmózgowia opisujemy metodę obejmującą elektroporację in ovo konstruktów plazmidowego DNA do embrionalnych progenitorów dopaminergicznych neuronów brzusznej części śródmózgowia kurczaka. Technika ta może być wykorzystana do uzyskania wydajnej ekspresji genów zainteresowania w celu zbadania różnych aspektów rozwoju śródmózgowia i różnicowania neuronów dopaminergicznych.

In ovo elektroporacja śródmózgowia kurczaka w celu badania funkcji genów w rozwoju neuronów dopaminergicznych

Opisano metodę, która pozwala na specyficzne dla typu komórek i możliwe do śledzenia obniżenie ekspresji genów w rurce nerwowej. Wykazujemy, w jaki sposób elektroporacja in ovo plazmidów opartych na mikroRNA, które wywołują kontrolowaną przestrzennie i czasowo interferencję RNA, może być wykorzystana do badania prowadzenia aksonów komisuralnych w rozwijającej się rurce nerwowej.

In ovo elektroporacja plazmidów opartych na miRNA w rozwijającej się rurze neuronalnej i ocena fenotypów poprzez wstrzykiwanie DiI w preparatach typu open-book

Jak sieci neuronowe są tworzone w embrionalnym mózgu, jest fundamentalnym pytaniem w neurobiologii rozwojowej. Połączyliśmy technikę elektroporacji z nowatorskimi narzędziami genetycznymi, takimi jak plazmidy Cre/Lox i system transpozycji DNA za pośrednictwem PiggyBac w tyłomózgowiu ptaków, aby oznaczyć interneurony grzbietowe i śledzić ich projekcje aksonalne i cele synaptyczne na różnych etapach rozwoju.

Elektroporacja tyłomózgowia w celu śledzenia trajektorii aksonów i celów synaptycznych w zarodku pisklęcia

Kultury Slice ułatwiają manipulowanie rozwojem zarodka za pomocą zaburzeń genowych i farmakologicznych. Jednakże warunki hodowli muszą zapewniać, że normalny rozwój może przebiegać w ograniczonym środowisku wycinka. Ilustrujemy protokół, który ułatwia prawidłowy rozwój rdzenia kręgowego, aby przebiegał przez co najmniej 24 godziny.

Protokół hodowli plastrów rdzenia kręgowego zarodków kurczaka

Neurony słuchowe pnia mózgu ptaków i ssaków są wyspecjalizowane w szybkim kodowaniu neuronalnym, podstawowym procesie dla normalnych funkcji słuchowych. Neurony te powstają z odrębnych prekursorów embrionalnego tyłomózgowia. Przedstawiamy techniki wykorzystujące elektroporację do ekspresji genów w tyłomózgowiu zarodków kurczaków w celu zbadania funkcji genów podczas rozwoju słuchowego.

In Ovo Elektroporacja w słuchowym pniu mózgu kurczaka

Opracowaliśmy nowatorskie podejście do utraty funkcji, które polega na wprowadzeniu i genomowej integracji sztucznych sekwencji mikro-RNA w zarodkach piskląt za pomocą elektroporacji in ovo i systemu transpozonów Tol2. Technika ta zapewnia solidną i stabilną metodologię knockdownu genów do badań funkcji genów podczas rozwoju.

Podejście do utraty funkcji w embrionalnej siatkówce pisklęcia przy użyciu transgenicznej ekspresji sztucznych mikroRNA za pośrednictwem transpozonu Tol2

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Korzystając z elektroporacji in ovo, opracowaliśmy metodę selektywnego transfekowania wewnętrznego ucha słuchowego i jądra ślimakowego w zarodkach kurczaków, aby osiągnąć specyficzne dla danej grupy komórek eliminację delikatnego białka X w upośledzeniu umysłowym podczas dyskretnych okresów składania obwodów.

Analiza autonomicznej funkcji białka upośledzenia umysłowego Fragile X w obwodzie słuchowym za pomocą elektroporacji in ovo

Poznaj metodę in ovo elektroporacji do selektywnej transfezji DNA w obszary brzusznego i grzbietowego śródmózgowia piskląt. Technika ta umożliwia badanie roli mikroRNA w rozwoju mózgu.

In ovo Ekspresja mikroRNA w brzusznym śródmózgowiu piskląt

Przeglądaj więcej filmów