Name: Kontrolowane uszkodzenie szyjki macicy u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Poznaj metodę precyzyjnego uszkodzenia szyjnego odcinka rdzenia kręgowego u myszy przy użyciu oscylującego ostrza. Technika zapewnia dokładność do 0,01 mm i umożliwia badanie regeneracji aksonów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Rozwój tego urządzenia był wspierany przez LISA Co., Louisville, Kentucky. Doceniamy również ciągłe wsparcie Norton Healthcare, Louisville, KY dla CBS oraz NIH NS050243, NS052290 i NS059622 dla XMX.

1. Przygotowanie i zastosowanie stabilizatora kręgosłupa u zwierząt
Kręgosłup szyjny myszy jest wklęsły brzusznie widziany z boku. Wyrostki kolczyste od C3 do T1 są małe i kruche, a zatem nie nadają się do stabilizacji kręgów, jak powszechnie się określa 3,4. Zalecamy, aby stabilizacja kręgosłupa była wykonywana poprzez boczne zespolenie wyrostka. Urządzenie mocujące składa się z metalowego kanału w kształcie litery U, który podtrzymuje mysz i dwóch regulowanych ramion ze stali nierdzewnej, które zaciskają się bocznie na każdym fasetie. Zapewnia to doskonałe unieruchomienie kręgu docelowego. Po ustabilizowaniu kręgosłupa kręgosłup jest lekko uniesiony, aby spłaszczyć krzywiznę kręgosłupa szyjnego, aby zapewnić lepszą ekspozycję rdzenia kręgowego.
<ol>
	<li>Wysterylizuj następujące narzędzia chirurgiczne: 2-3 pary kleszczy, 2 pary mikronożyczek, igłę 30 G, uchwyt do szwów i igieł, klipsy do skóry i aplikator do klipsów. Zdezynfekuj stabilizator kręgosłupa. Znieczulić mysz za pomocą dootrzewnowego koktajlu ketaminy/ksylazyny (100 mg / 10 mg / kg). Zgol włosy z szyi myszy.</li>
	<li>Po oczyszczeniu skóry roztworem jodu powidonu i 70% alkoholem należy przesunąć mysz na stół operacyjny ogrzany poduszką grzewczą. Zakryj oczy zwierzęcia maścią okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.</li>
	<li>Po indukcji znieczulenia (osiąganej, gdy mysz nie reaguje na uszczypnięcie ogona), wykonaj nacięcie skóry w tylnej linii środkowej szyjki macicy od potylicy do podskórnej poduszeczki tłuszczowej dolnego odcinka szyjnego kręgosłupa. W powiększeniu wykonaj nacięcie w linii środkowej między mięśniami czworobocznymi w C2 i rozdziel mięśnie półrdzeniowe główki. Identyfikacja podmięśniowej poduszeczki tłuszczowej ułatwia rozwarstwienie w odpowiedniej warstwie.</li>
	<li>Rozszerz doogonowo rozwarstwienie mięśni linii środkowej do wyrostka kolczystego T2, który służy jako niezawodny punkt orientacyjny. Przetnij mięśnie przyczepione do kręgu T2 i usuń chrzęstną część wyrostka kolczystego T2.</li>
	<li>Wypreparuj mięśnie przykręgosłupowe od C2 przez blaszki T2 za pomocą mikronożyczek. Rozwarstwienie mięśni rozpoczyna się w sąsiedztwie wyrostków kolczystych i rozciąga się obustronnie do stawów międzywyrostkowych. Oddziel mięśnie bezpośrednio przylegające do wyrostków kolczystych i blaszek (w warstwie okostnej), aby zminimalizować krwawienie. Po odsłonięciu bocznych fasetek umieść mysz na kanale w kształcie litery U stolika LISA.</li>
	<li>Przymocuj ramiona ze stali nierdzewnej pod odsłoniętymi fasetami dwustronnie. Gdy ramiona znajdą się na miejscu, dokręć skrzydełkowe stalowych ramion, aby unieruchomić kręgosłup. Utrzymuje to mocne mocowanie kręgu docelowego i zapewnia doskonałą ekspozycję. Ramiona można regulować, aby zapewnić precyzyjną orientację poziomą kręgosłupa.</li>
	<li>Naciąć więzadło żółte między C5 i C6, aby odsłonić leżącą pod spodem oponę twardą. Pomiędzy przestrzenią międzywarstwową użyj igły 30 G, aby utworzyć małą durotomię, przez którą umieszcza się mikronożyczki w celu przedłużenia durotomii. Rdzeń kręgowy jest teraz przygotowany do poddania się kontrolowanej zmianie szarpanej.</li>
</ol>
2. Uszkodzenie rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym za pomocą urządzenia LISA
<ol>
	<li>Szerokość powiększenia rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym różni się na różnych poziomach. Wykonaj zmianę półwyciętą grzbietu w C5-6 za pomocą płaskiego ostrza 2,3 mm i ustaw amplitudę drgań tak, aby obejmowała całą szerokość rdzenia kręgowego. Ostrza są pozyskiwane od Fine Science Tools Inc. (Foster City, Kalifornia) i modyfikowane pod kątem uszkodzenia rdzenia kręgowego. Utrzymuj amplitudę oscylacji ostrza na poziomie ≥ 0.5 mm, ponieważ niższe poziomy amplitudy zmniejszą łatwość skaleczenia sznurka.</li>
	<li>Ustaw stabilizator kręgosłupa i mysz na stoliku LISA. Ostrze jest przymocowane do LISA, a jego położenie jest kontrolowane przez mikrosterowniki zdolne do trzech zakresów ruchu. Elementy składowe LISA i ich funkcje opisano na rysunku 1.</li>
	<li>Włącz przełącznik wibracyjny ostrza. W powiększeniu przesuń mysz tak, aby odsłonięty rdzeń kręgowy znajdował się bezpośrednio pod wibrującym ostrzem.</li>
	<li>Podnieś stolik podpierający mysz w kierunku ostrza oscylacyjnego. Pozycja "0" jest rejestrowana, gdy ostrze ledwo dotyka żyły grzbietowej rdzenia kręgowego. Zmierz głębokość uszkodzenia rdzenia kręgowego w stosunku do pozycji "0".</li>
	<li>Podnieś pozycję sceny za pomocą sterowania mikrosterownikiem: obrót pokrętła mikroprzetwornika o 360° podnosi scenę o 0,25 mm. W ten sposób zmiana połowicza grzbietowego o średnicy 0,75 mm powstaje poprzez 3-krotne przekręcenie pokrętła mikroprzetwornika. Dokładność zmiany wynosi ± 0,01 mm. Gdy ostrze zacznie ranić rdzeń kręgowy, nasmaruj pole operacyjne irygacją soli fizjologicznej. Głębokość cięcia rdzenia kręgowego jest kontrolowana przez pionowy mikrosterownik i jest niezależna od wskazówek wizualnych.</li>
	<li>Po osiągnięciu ustalonej głębokości wyłącz przełącznik wibracyjny. Idealnie byłoby, gdyby oscylujące ostrze było umieszczone w szczelinie zmiany chorobowej bez oznak deformacji tkanki. Opuść stolik z ostrza tnącego i usuń krew i sól fizjologiczną z pola operacyjnego za pomocą bawełnianych patyczków higienicznych. Hemostaza występuje samoistnie w ciągu < 1 min.</li>
	<li>Zdejmij mysz ze stabilizatora kręgosłupa. Przybliż mięśnie przykręgosłupowe za pomocą jedwabnego szwu 6-0 i zamknij ranę skóry za pomocą klipsów Michela ze stali nierdzewnej.</li>
</ol>
3. Opieka nad zwierzętami
<ol>
	<li>Podskórnie wstrzyknij łącznie 1-2 ml soli fizjologicznej, aby utrzymać odpowiednie nawodnienie i umieść mysz w klatce regeneracyjnej na poduszce grzewczej podczas odzyskiwania przytomności.</li>
	<li>Dostarczaj wodę i miękkie pokarmy ad lib i podawaj leki przeciwbólowe przez 48 godzin po operacji. Nie ma potrzeby pielęgnacji pęcherza moczowego po grzbietowej półsekcji rdzenia kręgowego.</li>
</ol>

<ol><li>Blackmore, M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+within+maturing+neurons+limit+axonal+regeneration+in+the+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Changes within maturing neurons limit axonal regeneration in the developing spinal cord.</a> J. Neurobiol. 66 (4), 348(2006).</li>
<li>Blackmore, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kruppel-like+Factor+7+engineered+for+transcriptional+activation+promotes+axon+regeneration+in+the+adult+corticospinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Kruppel-like Factor 7 engineered for transcriptional activation promotes axon regeneration in the adult corticospinal tract.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109 (19), 7517(2012).</li>
<li>Carbajal, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+transplantation+of+mouse+neural+stem+cells+into+the+spinal+cords+of+mice+infected+with+neurotropic+mouse+hepatitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus.</a> J. Vis. Exp. (53), e2834(2011).</li>
<li>Duhamel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+lumbar+and+cervical+spinal+cord+blood+flow+measurements+by+arterial+spin+labeling%3A+sensitivity+optimization+and+first+application%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Mouse lumbar and cervical spinal cord blood flow measurements by arterial spin labeling: sensitivity optimization and first application.</a> Magn. Reson. Med. 62 (2), 430(2009).</li>
<li>Hermanns, S., Reiprich, P., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+method+to+reduce+collagen+scar+formation+in+the+lesioned+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A reliable method to reduce collagen scar formation in the lesioned rat spinal cord.</a> J. Neurosci. Methods. 110 (1-2), 141(2001).</li>
<li>Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomic+and+functional+outcomes+following+a+precise%2C+graded%2C+dorsal+laceration+spinal+cord+injury+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Anatomic and functional outcomes following a precise, graded, dorsal laceration spinal cord injury in C57BL/6 mice.</a> J. Neurotrauma. 26 (1), 1(2009).</li>
<li>Iannotti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dural+repair+reduces+connective+tissue+scar+invasion+and+cystic+cavity+formation+after+acute+spinal+cord+laceration+injury+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Dural repair reduces connective tissue scar invasion and cystic cavity formation after acute spinal cord laceration injury in adult rats.</a> J. Neurotrauma. 23 (6), 853(2006).</li>
<li>Inman, D., Guth, L., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+influences+on+secondary+degeneration+and+wound+healing+following+spinal+cord+injury+in+various+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Genetic influences on secondary degeneration and wound healing following spinal cord injury in various strains of mice.</a> J. Comp Neurol. 451 (3), 225(2002).</li>
<li>Onifer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+rat+forelimb+dysfunction+after+dorsal+cervical+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Adult rat forelimb dysfunction after dorsal cervical spinal cord injury.</a> Exp. Neurol. 192 (1), 25(2005).</li>
<li>Ramer, M. S., Harper, G. P., Bradbury, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+spinal+cord+research+-+a+refined+strategy+for+the+International+Spinal+Research+Trust%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">Progress in spinal cord research - a refined strategy for the International Spinal Research Trust.</a> Spinal Cord. 38 (8), 449(2000).</li>
<li>Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+from+spinal+cord+injury%3A+a+new+transection+model+in+the+C57Bl%2F6+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse.</a> J. Neurosci. Res. 67 (3), 337(2002).</li>
<li>Sivasankaran, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC+mediates+inhibitory+effects+of+myelin+and+chondroitin+sulfate+proteoglycans+on+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PKC mediates inhibitory effects of myelin and chondroitin sulfate proteoglycans on axonal regeneration.</a> Nat. Neurosci. 7 (3), 261(2004).</li>
<li>Yu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitor+of+DNA+binding+2+promotes+sensory+axonal+growth+after+SCI%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Inhibitor of DNA binding 2 promotes sensory axonal growth after SCI.</a> Exp. Neurol. 231 (1), 38(2011).</li>
<li>Zhang, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dural+closure%2C+cord+approximation%2C+and+clot+removal%3A+enhancement+of+tissue+sparing+in+a+novel+laceration+spinal+cord+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Dural closure, cord approximation, and clot removal: enhancement of tissue sparing in a novel laceration spinal cord injury model.</a> J. Neurosurg. 100, 343(2004).</li>
</ol>

<ol>
		<li>Kilku autorów (YPZ, XMX, CBS) ma finansowe udziały w Louisville Impactor System, Inc.</li>
	 <li>Autorzy, Yi Ping Zhang, Lisa B. E. Shields i Christopher B. Shields, są pracownikami Norton Healthcare, Louisville, KY. Inni autorzy są zatrudnieni przez Indiana University, Indianapolis, IN.</li>
	 <li>Autorzy nie otrzymali dofinansowania od żadnej firmy produkującej odczynniki lub instrumenty wykorzystane w tym artykule.</li>
	</ol>

Stabilizację kręgów przed urazami rdzenia kręgowego uzyskuje się poprzez unieruchomienie wyrostków kolczystych. Zarówno krzywa lordotyczna kręgosłupa szyjnego, jak i przymocowanie klamer do kruchych krótkich wyrostków kolczystych szyjnych od C3 do T1 u myszy uniemożliwiają skuteczną stabilizację kręgosłupa. Ponadto użycie żyletki lub mikronożyczek używanych pod kontrolą ręczną powoduje znaczną deformację tkanki, która powoduje zmienność głębokości zmiany 6. Może to prowadzić do błędnej interpretacji danych, szczególnie gdy badana jest regeneracja aksonów określonych szlaków. Na przykład oszczędzone aksony grzbietowo-rdzeniowe mogą być błędnie interpretowane jako zregenerowane aksony, jeśli grzbietowy odcinek korowo-rdzeniowy nie był całkowicie przecięty w momencie uszkodzenia. Wyzwania te można przezwyciężyć poprzez zastosowanie urządzenia do stabilizacji kręgosłupa z mocowaniem do fasetek na jednym poziomie i precyzyjnym uszkodzeniem rdzenia kręgowego. Dodatkowo, użycie ostrza oscylacyjnego o wysokiej częstotliwości powoduje ostre skaleczenie bez miażdżenia lub kontuzjowania sąsiedniego rdzenia kręgowego. Metoda ta została wykorzystana do wywołania uszkodzeń rdzenia kręgowego u szczurów 9,12,14, z późniejszymi modyfikacjami w celu wytworzenia uszkodzeń rdzenia kręgowego w klatce piersiowej u myszy 6. W niniejszym komunikacie opisujemy metodę tworzenia wiarygodnych zmian szarpanych szyjki macicy u myszy.
O ile przednio-tylna średnica rdzenia kręgowego wynosi <2 mm u myszy, dokładne głębokości uszkodzenia szarpanego mają kluczowe znaczenie dla stworzenia wiarygodnego modelu eksperymentalnego. Minimalna zmienność głębokości zmiany znacząco wpłynie na wyniki eksperymentów oceniających regenerację aksonów, a także badań wolumetrycznych i behawioralnych. Dokładność głębokości zmiany przy użyciu tej metody wynosi ± 0,01 mm, ponieważ użyliśmy bardzo precyzyjnych mikroprzetworników do kontrolowania położenia ostrza tnącego. Metoda ta zmniejszyła niespójność nieodłącznie związaną z innymi modelami tworzenia SCI rany szarpanej. Metoda ta jest szczególnie przydatna w badaniu regeneracji aksonów długich ścieżek rdzenia kręgowego znajdujących się w grzbietowej połowie rdzenia kręgowego, takich jak droga korowo-rdzeniowa, droga rubrordzeniowa i grzbietowa droga wstępująca. Dzięki tej metodzie te szlaki światłowodowe mogą być całkowicie i niezawodnie transektowane. W związku z tym błędy interpretacji danych są zminimalizowane, co poprawia wiarygodność raportowania badań eksperymentalnych dotyczących SCI.
Podsumowując, opisaliśmy nowatorską technikę tworzenia powtarzalnego modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym u myszy in vivo . Technika ta opiera się na stabilizacji kręgosłupa poprzez unieruchomienie fasetek szyjnych i uszkodzenie rdzenia kręgowego za pomocą oscylującego ostrza. Stosując tę metodę w modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego w klatce piersiowej grzbietowej u myszy 6, wykazaliśmy ścisłą korelację między głębokością rany szarpanej, histologią i odzyskiwaniem zachowania. Taka technika została również uznana za niezawodną przez kilka innych laboratoriów 2,12.

Dostępność genetycznie modyfikowanych myszy jest potężnym narzędziem do identyfikacji efektów działania określonych genów, które odgrywają rolę w mechanizmach SCI. SCI jest ważnym modelem używanym do badania środków terapeutycznych lub molekuł, które mogą zapewnić skuteczne leczenie po tym urazie 8. Unieruchomienie wyrostków kolczystych podczas tworzenia urazu szarpanego u myszy jest nieprecyzyjne ze względu na trudności w uchwyceniu cienkich i delikatnych wyrostków kolczystych związanych z utrzymaniem stabilizacji kręgosłupa 5,11. Zmienność głębokości rany wynosząca zaledwie 0,2 mm (10% średnicy rdzenia kręgowego myszy) powoduje mylącą interpretację danych. Charakter i rozległość uszkodzenia rdzenia kręgowego muszą być dokładnie określone 10. Aby sprostać temu wyzwaniu, opracowaliśmy nowatorską technikę polegającą na stabilizacji kręgów i użyliśmy spreparowanych ostrzy przymocowanych do Louisville Injury System Apparatus (LISA) w celu wytworzenia rany szarpanej SCI 7,14. Uraz ten powstał przy użyciu ostrego ostrza oscylacyjnego, które pozwoliło uniknąć deformacji tkanki podczas procesu szarpania. Głębokość rany została określona z dokładnością do 0,01 mm dzięki zastosowaniu mikroprzetworników, które kontrolują głębokość skaleczenia. Ostrza tnące są wykonywane na zamówienie pod określone kształty i szerokości, aby stworzyć pożądany kontur rany 9. Pokazujemy: 1) metodę odsłaniania odcinka szyjnego kręgosłupa, 2) technikę stabilizacji kręgów za pomocą obustronnego urządzenia do stabilizacji fasetowej oraz 3) tworzenie uszkodzenia szyjki macicy za pomocą wibrującego ostrza.

<table><tbody><tr><td>Stabilizator kręgów myszy </td> System <td>impektorowy Louisville Ustabilizuj</td><td></td><td>i odsłoń kręg szyjny</td></tr><tr><td>LISA vibraknife </td><td>Louisville Impactor System</td><td></td><td>Spowodowaj uraz szarpany rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools (USA)</td><td>15013-12</td><td>Nacięcie mięśnia czworobocznego i czworobocznego</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools (USA)</td><td>15023-10</td><td>Oddziel mięśnie od blaszek</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools (USA)</td><td>15002-08</td><td>Nacięcie opony twardej</td></tr><tr><td>Kleszcze Graefe </td><td>Fine Science Tools (USA)</td><td>11154-10</td><td>Wycofaj skórę</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #7 </td><td>Fine Science Tools (USA)</td><td>11274-20</td><td>Retrakcja mięśni (zmodyfikowana końcówka)(Rys. A)</td></tr> <tr><td>Kleszcze Dumont SS </td><td>Fine Science Tools (USA)</td><td>11203-25</td><td>Mocowanie kręgu (zmodyfikowana końcówka) (Ryc.B)</td></tr><tr><td>Igła 30G </td><td>Becton Dickenson</td><td>305106</td><td>Stwórz otwór opony twardej </td></tr><tr><td>6-0 szew </td><td>Ethicon</td><td>8806H</td><td>Zamknij warstwy mięśni i powięzi </td></tr><tr><td>klips do ran </td><td>Fine Science Tools (USA)</td><td>12031-07</td><td>Zamknięcie skóry</td></tr><tr><td>Tribrom&#8211; thanol (Avertin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90710-10G</td><td>Środek znieczulający</td></tr><tr><td colspan="4">Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: <a href="mailto:cbshields1@gmail.com">cbshields1@gmail.com</a> Fine Science Tools (Stany Zjednoczone), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: <a href="mailto:info@finescience.com">info@finescience.com</a> Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com</td></tr><tr><td colspan="4">Figure A to zmodyfikowane kleszcze Dumont #7; B to zmodyfikowane kleszcze Dumont SS.</td></tr></tbody></table>

kontrolowane uszkodzenie szyjki macicy u myszy

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Użycie genetycznie modyfikowanych myszy poszerza nasze zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw kilku zaburzeń neurologicznych, takich jak uraz rdzenia kręgowego (SCI). Ręczna kontrola z wolnej ręki stosowana do tworzenia modelu rany szarpanej SCI powoduje niespójne obrażenia, często związane z komponentem zmiażdżenia lub stłuczenia, dlatego opracowano nową technikę. Nasz model uszkodzenia szyjki macicy SCI rozwiązał nieodłączne trudności związane z metodą odręczną, włączając 1) stabilizację kręgów szyjnych poprzez unieruchomienie fasety kręgu, 2) zwiększoną ekspozycję rdzenia kręgowego oraz 3) stworzenie powtarzalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego za pomocą oscylującego ostrza z dokładnością do ±0,01 mm głębokości bez związanego z tym stłuczenia. W porównaniu ze standardowymi metodami tworzenia rany szarpanej po SCI, takimi jak odręczne użycie skalpela lub nożyczek, nasza metoda wytworzyła spójną zmianę. Metoda ta jest przydatna w badaniach nad regeneracją aksonów kory mózgowo-rdzeniowej, rubrordzeniowej i grzbietowej drogi wstępującej.

Unieruchomienie docelowego kręgu ma kluczowe znaczenie dla wygenerowania precyzyjnych uszkodzeń rdzenia kręgowego myszy. Nasze urządzenie do stabilizacji kręgosłupa rozwiązuje problemy anatomiczne związane z krótkimi wyrostkami kolczystymi i lordozą brzuchną szyjnego odcinka kręgosłupa myszy. Kręgi szyjne są dobrze wyeksponowane dzięki zastosowaniu naszego stabilizatora kręgosłupa szyjnego (Rycina 2). Nasze urządzenie do stabilizacji kręgosłupa myszy jest niezawodną techniką przygotowania kręgosłupa do zabiegów w obrębie rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym. Głębokość uszkodzenia przy użyciu LISA jest dokładna do 0,01 mm 6,13. Precyzyjne nacięcie nie powoduje stłuczenia na styku uszkodzenia i tkanki (Rycina 3). Precyzja uszkodzeń w formie grzbietowej hemisekcji została wykazana u myszy C57BL/6 w badaniu nad regeneracją aksonów, w którym nacięcie o głębokości 0,9 mm przechodziło tuż poza kanał centralny w każdym preparacie, co potwierdzono w przekrojach patomorfologicznych rdzenia kręgowego 1. U wszystkich tych zwierząt odzyskano zdolność lokomocyjną po tym urazie nacięcia rdzenia kręgowego.
<img alt="Układ eksperymentu zwierzęcego z zestawem wibracyjnych ostrzy i szczegółem nacięcia; badania chirurgiczne." src="/files/ftp_upload/50030/50030fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. (A) Mysz w stabilizatorze kręgosłupa umieszczona na platformie LISA. Wibracyjne ostrze jest skierowane w stronę rdzenia kręgowego, który ma zostać nacięty. Sterowniki mikropopychacza znajdują się pod platformą i służą do pozycjonowania myszy w odpowiednim miejscu. Pionowy mikropopychacz kontroluje głębokość uszkodzenia, a pokrętło nachylenia kontroluje płaszczyznę poziomą rdzenia kręgowego, aby zapobiec kątowaniu nacięcia. Przełącznik włącz/wyłącz steruje silnikiem wibracyjnym, a kolejne pokrętło reguluje jego amplitudę. (B) Lesja w postaci nacięcia grzbietowej hemisekcji o szerokości 0,75 mm wykonana pod nienaruszonymi łukami blaszkowymi.
<img alt="Układ neuronaukowy z ramionami ze stali nierdzewnej i kanałem w kształcie litery U; chirurgiczne odsłonięcie mózgu obiektu." src="/files/ftp_upload/50030/50030fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. (A) Stabilizator kręgosłupa myszy składający się z kanału w kształcie litery U oraz dwóch ramion i łączników. Mysz jest umieszczana w rynnie C stosowanej przy urazach rdzenia kręgowego (SCI) w odcinku szyjnym oraz w rynnie T przy urazach SCI w odcinku piersiowym. (B) Odcinek szyjny kręgosłupa zostaje unieruchomiony poprzez umieszczenie ramion pod wyrostkami bocznymi, a następnie zablokowanie śrub motylkowych. Opona twarda zostaje odsłonięta pomiędzy blaszkami C5-6, C6-7 i C7-T1 bez usuwania tkanki kostnej.
<img alt="Analiza histologiczna, barwione przekroje tkanek o różnych grubościach: badanie rozkładu komórkowego." src="/files/ftp_upload/50030/50030fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Rycina 3. Cztery nacięcia grzbietowej części rdzenia kręgowego na głębokościach 0,5, 0,8, 1,1 i 1,4 mm obserwowane w widoku strzałkowym (barwienie fioletem krezylem i eozyną), obrazujące wysoki stopień precyzji zastosowania tej techniki.

Opisano nowatorską technikę tworzenia powtarzalnego modelu in vivo uszkodzenia rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym u myszy. Technika ta opiera się na stabilizacji kręgosłupa poprzez unieruchomienie fasetek szyjnych i uszkodzenie rdzenia kręgowego za pomocą oscylującego ostrza z dokładnością do ±0,01 mm.

Kontrolowane uszkodzenie szyjki macicy u myszy

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

Ogólnym celem eksperymentu jest wywołanie powtarzalnej rany szarpanej rdzenia kręgowego myszy. Osiąga się to poprzez tylne odsłonięcie blaszki łukowej w odcinku szyjnym, gdy zwierzę jest umieszczone w aparacie systemu urazowego Louisville. W drugim kroku specjalnie zaprojektowane urządzenie stabilizujące służy do unieruchomienia docelowego kręgu kręgosłupa myszy.Następnie, po usunięciu więzadła żółtego na końcu, identyfikuje się docelowy rdzeń kręgowy pomiędzy łukami blaszkowymi. Przecięcie połowicze grzbietowe rdzenia szyjnego na głębokości 0,75 mm jest precyzyjnie wykonywane przy użyciu oscylującego ostrza i mikronapędu. Główną zaletą opracowanej przez nas w laboratorium techniki jest stworzenie bardzo dokładnej metody wywoływania urazu rdzenia kręgowego typu przerwanie.Jest to istotne, ponieważ techniki stosowane do tej pory, takie jak użycie nożyczek lub skalpela, powodowały problemy wynikające z niekompletnych i niedokładnych metod modelowania urazu rdzenia kręgowego. Obecnie dysponujemy metodami pozwalającymi uniknąć stłuczenia rdzenia kręgowego, jego przemieszczenia względem narzędzia tnącego oraz nadmiernego krwawienia występującego podczas urazu rdzenia kręgowego. Dzięki zastosowaniu tej techniki jesteśmy w stanie stworzyć bardzo precyzyjną metodę, która eliminuje konieczność wizualnej oceny głębokości urazu rdzenia kręgowego.Wierzymy, że zastosowanie tej techniki pozwoli zrewolucjonizować metody eksperymentalnego uszkadzania rdzenia kręgowego stosowane w modelu przerwania, co może mieć kluczowe znaczenie dla regeneracji aksonów, a także dla opracowania metody leczenia urazów rdzenia kręgowego. Procedurę tę prezentuje eing Jang, neurochirurg i naukowiec zajmujący się badaniami neurochirurgicznymi w naszym laboratorium. Rozpocznij procedurę od wysterylizowania następujących instrumentów chirurgicznych: dwóch do trzech par pęset, trzech par mikronożyczek, igły 30G, mikroszycia URS oraz uchwytu do igieł, klipsów skórnych i aplikatora do klipsów. Następnie zdezynfekuj stabilizator kręgosłupa, a po tym znieczul mysz za pomocą koktajlu ketaminy, ksylazyny lub trietanolu podanego domięśniowo.Następnie należy ogolić sierść z karku myszy. Skórę należy oczyścić roztworem powidonu jodowego oraz 70% alkoholem. Następnie mysz należy przenieść na stół operacyjny z uprzednio rozgrzaną podkładką grzewczą.Nanieś maść okulistyczną do oczu, aby zapobiec wysychaniu rogówki. Po indukcji znieczulenia wykonaj skórne nacięcie w linii środkowej tylnej części szyi, od skóry do tkanki tłuszczowej podskórnej w obrębie dolnego odcinka kręgosłupa szyjnego. Pod mikroskopem wykonaj nacięcie skóry w linii środkowej pomiędzy mięśniami czworobocznymi na poziomie C2 i odsunie bocznie mięśnie semispinalis capitis.Następnie ostrożnie rozszerz sekcję mięśni w linii środkowej do wyrostka kolczystego kręgu T2, który służy jako wiarygodny punkt orientacyjny. Oddziel mięśnie od wyrostka kolczystego T2. Następnie usuń chrząstkową część wyrostka kolczystego T2.Następnie, za pomocą mikronozyciórek, odetnij obustronnie mięśnie przykręgosłupowe od łuków łuków kolczystych w odcinku od C4 do T2. Rozpocznij od okolic wyrostków kolczystych i prowadź cięcie nad oboma łukami aż do stawów międzywyrostkowych. Po odsłonięciu wyrostków bocznych umieść mysz w kanale w kształcie litery U stabilizatora kręgosłupa myszy.Następnie umieść stalowe ramiona stabilizatora myszy pod odsłoniętymi powierzchniami obustronnie. Po ustawieniu ramion dokręć śruby motylkowe stalowych ramion, aby unieruchomić kręgosłup pod mikroskopem. Usuń więzadło żółte pomiędzy łukami blaszkowatymi C5 i C6, aby odsłonić leżącą pod nimi oponę twardą w przestrzeni międzyblaszkowej.Użyj igły o rozmiarze 30 G, aby wykonać niewielką duralotomię, a następnie mikro nożyczek, aby ją poszerzyć. Rdzeń kręgowy jest teraz gotowy do kontrolowanego uszkodzenia poprzez nacięcie. W tej procedurze umieść stabilizator kręgosłupa oraz mysz na stole urządzenia systemu urazów Louisville, do którego przymocowane jest ostrze, którego pozycja jest sterowana za pomocą mikropędników.Urządzenie umożliwia ruch w trzech płaszczyznach, co pozwala na wykonanie grzbietowej hemisekcji rdzenia kręgowego między blaszkami łuków C5 i C6 przy użyciu płaskiego ostrza o szerokości 2,3 mm zamocowanego do oscylatora. Amplitudę oscylującego ostrza należy ustawić na 0,5 mm, ponieważ mniejsze amplitudy mogą utrudnić całkowite przecięcie rdzenia. Następnie należy włączyć przełącznik wibratora ostrza i pod mikroskopem umieścić rdzeń kręgowy myszy bezpośrednio pod wibrującym ostrzem.Następnie, za pomocą sterownika mikropresu, podnieś stolik w kierunku oscylującego ostrza. Pozycją zerową jest moment, w którym ostrze ledwie dotyka żyły grzbietowej rdzenia kręgowego; głębokość nacięcia rdzenia kręgowego jest mierzona względem tej pozycji zerowej. Następnie podnieś stolik za pomocą sterownika mikropresu.Pełny obrót pokrętła mikrodrajwera o 360 stopni podnosi platformę o 0,25 milimetra. W związku z tym, aby stworzyć uszkodzenie w postaci półprzecięcia grzbietowego o głębokości 0,75 milimetra, należy obrócić pokrętło mikrodrajwera trzy razy; w momencie gdy ostrze zaczyna nacinać rdzeń kręgowy, należy nawilżać pole operacyjne za pomocą irygacji solą fizjologiczną. Po osiągnięciu wcześniej określonej głębokości należy wyłączyć przełącznik wibratora, a następnie opuścić platformę z myszą i zaciskiem, oddalając je od ostrza tnącego.Usuń krew, płucząc miejsce operacyjne solą fizjologiczną. Następnie osusz ten obszar za pomocą patyczków bawełnianych, ponieważ hemostaza zazwyczaj następuje w ciągu jednej minuty. Na koniec wyjmij mysz ze stabilizatora kręgosłupa i zamknij skórę za pomocą zszywek ze stali nierdzewnej.Klipy Michelle. Odcinek szyjny kręgosłupa zostaje unieruchomiony poprzez umieszczenie ramion pod wyrostkami stawowymi bocznymi, a następnie zablokowanie śrub kciukowych, jak pokazano na tej rycinie; opona twarda zostaje odsłonięta między blaszkami łukowatymi C5–C6, C6–C7 oraz C7–T1 bez usuwania tkanki kostnej. Tutaj przedstawiono widoki strzałkowe czterech grzbietowych nacięć rdzenia kręgowego na głębokościach 0,5, 0,8, 1,1 i 1,4 mm.Wskazują one na wysoki stopień precyzji zastosowania tej techniki. Jednym z problemów nieodłącznie związanych z tworzeniem urazów rdzenia kręgowego był brak stabilizacji kręgosłupa szyjnego. Dzięki zastosowaniu stabilizatora kręgosłupa opracowanego przez naszą grupę, jesteśmy teraz w stanie zapewnić całkowity brak ruchomości kręgosłupa szyjnego.Pozwoli to na ulepszenie modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego poprzez zastosowanie kontuzji rdzenia kręgowego, iniekcji do rdzenia kręgowego, a także transplantacji komórek do rdzenia kręgowego we wszystkich metodach badań nad rdzeniem kręgowym.

controlled-cervical-laceration-injury-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Kontrolowane urazowanie przez rozcięcie szyi macicy u myszy

Procedura chirurgiczna stosowana w celu wywołania eksperymentalnego zawału mięśnia sercowego u myszy rozpoczyna się od lewej torakotomii między trzecim a czwartym żebrem, aby umożliwić wizualizację przedniej powierzchni serca i lewego płuca. Następnie podwiązuje się lewą tętnicę wieńcową, zamyka klatkę piersiową i pozostawia mysz do samoistnego powrotu do sprawności.

Zmodyfikowana technika ligacji tętnicy wieńcowej u myszy

Źródło: Gao, Z., et al. Mysi model bezpośredniego zespolenia drogą przedrdzeniową do chirurgii krzyżowania się nerwów. J. Vis. Exp. (2021).Ten film pokazuje przywracanie ruchu kończyn przednich u myszy poprzez bezpośrednie ponowne połączenie nerwu szyjnego. Zaczyna się od myszy ze sparaliżowaną prawą kończyną przednią z powodu przeciętego prawego nerwu C7 w korzeniu nerwowym. Lewy nerw C7 jest przecięty, skierowany w prawo drogą przedrdzeniową i zszyty prawym nerwem C7. Miejsce operacji jest...

Bezpośrednie ponowne połączenie nerwów szyjnych w celu przywrócenia ruchomości kończyn przednich u myszy

Wprowadzamy metodę chirurgiczną do wywoływania eksperymentalnego uszkodzenia niedokrwienia/reperfuzji (I/R) symulującego zawał mięśnia sercowego (MI) w modelach mysich, co pozwala na większą przejrzystość w umiejscowieniu podwiązania na lewej tętnicy zstępującej przedniej (LAD) w celu zwiększenia powtarzalności eksperymentów MI u myszy.

Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego poprzez podwiązanie lewej tętnicy zstępującej przedniej

Fotozakrzepica jest minimalnie inwazyjną i wysoce powtarzalną procedurą wywoływania ogniskowego niedokrwienia rdzenia kręgowego i służy jako model uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy.

Ogniskowe niedokrwienie wywołane fotozakrzepicą jako model uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy

Wprowadzamy model uszkodzenia rdzenia kręgowego oparty na przemieszczeniu tkanki, który może powodować stałe uszkodzenie rdzenia kręgowego u dorosłych myszy.

Model kontuzyjnego uszkodzenia rdzenia kręgowego oparty na przemieszczeniu tkanek u myszy

Ten protokół opisuje, jak stworzyć precyzyjną laminektomię do indukcji stabilnego uszkodzenia rdzenia kręgowego typu transsection w modelu mysim, z minimalnymi szkodami ubocznymi dla badań nad uszkodzeniem rdzenia kręgowego.

Indukcja całkowitego uszkodzenia rdzenia kręgowego typu transsection u myszy

Krwotok śródmiąższowy i zapalenie nerwów, któremu towarzyszy stłuczenie mózgu, mogą spowodować poważne wtórne uszkodzenie mózgu. Protokół ten szczegółowo opisuje model kontrolowanego wpływu kory mózgowej (CCI) na myszy, umożliwiając naukowcom badanie kontuzji krwotoku i pourazowych odpowiedzi immunologicznych oraz badanie potencjalnych terapii.

Przedkliniczny, kontrolowany model oddziaływania kory mózgowej w przypadku krwotoku pourazowego, stłuczenia i zapalenia nerwów

Tutaj opisujemy mysi model niedokrwienia siatkówki poprzez przejściowe obustronne zamknięcie tętnicy szyjnej za pomocą prostych szwów i zacisku. Model ten może być przydatny do zrozumienia patologicznych mechanizmów niedokrwienia siatkówki spowodowanego nieprawidłowościami sercowo-naczyniowymi.

Mysi model niedokrwiennego uszkodzenia siatkówki wywołanego przejściowym obustronnym zamknięciem tętnicy szyjnej wspólnej

Minimalnie inwazyjne techniki i proste urządzenie laboratoryjne poprawiają odtwarzalność modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego, zmniejszając uszkodzenia operacyjne u zwierząt doświadczalnych i umożliwiając utrzymanie anatomicznej morfologii. Metoda ta jest opłacalna, ponieważ wiarygodne wyniki i powtarzalna procedura ułatwiają badanie mechanizmów naprawy choroby.

Ustalenie modelu urazu rdzenia kręgowego stłuczenia u myszy w oparciu o technikę minimalnie inwazyjną

Obecny protokół symulujący zespół centralnego rdzenia kręgowego (CCS) u myszy poprawił powtarzalność i zminimalizował uszkodzenia operacyjne zwierząt doświadczalnych, unikając nadmiernego naruszania struktury anatomicznej. Strategia zawarta w tym badaniu jest korzystna, ponieważ pozwala na badanie mechanizmów urazów poprzez uzyskanie spójnych wyników.

Opracowanie modelu zespołu rdzenia kręgowego u myszy C57BL/6J

Protokół ten opisuje procedurę wywoływania uszkodzenia macicy w modelu mysim, po której następują dalsze analizy podczas kolejnej ciąży.

Mysi model chirurgicznego uszkodzenia macicy i późniejszych wyników ciąży

Poznaj metodę precyzyjnego uszkodzenia szyjnego odcinka rdzenia kręgowego u myszy przy użyciu oscylującego ostrza. Technika zapewnia dokładność do 0,01 mm i umożliwia badanie regeneracji aksonów.

Kontrolowane uszkodzenie szyjki macicy u myszy

Przeglądaj więcej filmów