Name: Lokalne zastosowanie leków do badania funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Poznaj metodę lokalnego aplikowania leków do badania funkcji nikotynowych receptorów acetylocholinowych w neuronach wycinków mózgu myszy. Technika patch clamp umożliwia szybką, precyzyjną aktywację kanałów jonowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) DA030396. Podziękowania dla członków laboratorium Drenan za pomocną dyskusję i krytykę manuskryptu. Specjalne podziękowania dla Mi Ran Kim za pomoc techniczną i Jonathana Thomasa Tinga za porady dotyczące wycinków mózgu dorosłych myszy.

1. Przygotowanie roztworów do przygotowania plastrów mózgu i elektrofizjologii
<ol>
 <li>Roztwory do przygotowania wycinków mózgu zostały wcześniej opisane 3, 4. Przygotować roztwór do cięcia i odzysku na bazie N-metylo-D-glukaminy (NMDG) o następującym składzie (w mM): 93 N-metylo-D-glukamina, 2,5 KCl, 1,2 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glukoza, 5 Na+ askorbinian, 2 tiomocznik, 3 Na+ pirogronian, 10 MgSO4•7H2O, 0,5 CaCl2•2H2O. Dostosuj do 300-310 mOsm za pomocą NMDG. Doprowadzić pH do 7,3-7,4 za pomocą 10 N HCl.
 <ol class="lalpha">
 <li>Rozpuścić MgSO4•7H2Oi CaCl2•2H2Ow wodzie miliporowej, aby uzyskać 2 M roztwory podstawowe każdego z nich.</li>
 <li>Odważyć pozostałe składniki w podanej kolejności i dodać do kolby miarowej częściowo wypełnionej wodą Millipore, mieszając do rozpuszczenia. Gdy wszystko zostanie dodane, napełnij kolbę miarową wodą Millipore.</li>
 <li>Zmierzyć pH i wyregulować za pomocą 10 N HCl.</li>
 <li>Zmierz osmolarność i w razie potrzeby wyreguluj za pomocą NMDG.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przygotować HEPES zawierający sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) o następującym składzie (w mM): 92 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glukozy, 5 Na+ askorbinian, 2 tiomocznik, 3 Na+ pirogronian, 2 MgSO4•7H2O, 2 CaCl2•2H2O. Dostosować do 300-310 mOsm z sacharozą. Dostosuj pH do 7,3-7,4 za pomocą 1 N HCl lub NaOH.
 <ol class="lalpha">
 <li>Odważyć składniki w podanej kolejności i dodać do kolby miarowej częściowo wypełnionej wodą Millipore, mieszając do rozpuszczenia. Gdy wszystko zostanie dodane, napełnij kolbę miarową wodą Millipore.</li>
 <li>Zmierz pH i w razie potrzeby dostosuj za pomocą NaOH lub HCl.</li>
 <li>Zmierz osmolarność i w razie potrzeby dostosuj sacharozą.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przygotować wzorcowy roztwór do zapisu aCSF o następującym składzie (w mM): 124 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH2PO4, 24 NaHCO3, 12,5 glukozy, 2 MgSO4•7H2O, 2 CaCl2•2H2O. Dostosować do 300-310 mOsm z sacharozą. Dostosuj pH do 7,3-7,4 za pomocą 1 N HCl lub NaOH.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ostrych wycinków mózgu
<ol>
 <li>Cięcie plastrów mózgu i odzyskiwanie odbywa się zgodnie z wcześniejszym opisem 3, 4. Bąbelkować dwie kryształowe naczynia wypełnione roztworem odzysku NMDG z 95% tlenem/5% gazem CO2 (karbogen), jedno naczynie na lodzie, drugie w temperaturze 33 °C.</li>
 <li>Bąbelkować jedno kryształowe naczynie wypełnione HEPES, trzymając CSF z karbogenem w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Znieczulenie dorosłej myszy (w wieku od 2 do 12 miesięcy) pentobarbitalem Na+ (200 mg/kg, i.p.). Kontynuuj procedurę, gdy zwierzę nie reaguje na uszczypnięcie palca.</li>
 <li>W razie potrzeby należy pobrać próbkę tkanki ogona w celu późniejszego genotypowania zwierzęcia.</li>
 <li>Otwórz klatkę piersiową, odsłoń serce i zaciśnij aortę zstępującą. Zerwij prawe przedsionek.</li>
 <li>Zwierzę poddać perfuzji przezskórnej z 5-10 ml roztworu odzysku NMDG o temperaturze 0-4 °C.</li>
 <li>Odetnij głowę zwierzęcia, usuń mózg i umieść go w roztworze NMDG o temperaturze 4 °C na 1 minutę.</li>
 <li>Na chłodzonej lodem metalowej płytce przytnij mózg w pożądanej orientacji (czołowej, przystrzałkowej, poziomej itp.), Aby objąć obszar zainteresowania.</li>
 <li>Przymocuj blok mózgu za pomocą superglue do suchej powierzchni wibrującej krajalnicy (DSK-Zero 1; Dosaka), zanurz blok mózgowy w roztworze odzyskującym NMDG o temperaturze 4 °C i ciągle bąbelkuj roztwór karbogenem.</li>
 <li>Wytnij plasterki obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania. Grubość plastra wynosi 200-400 μm, w zależności od konkretnego obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania, wieku zwierzęcia i eksperymentu, który ma zostać przeprowadzony.</li>
 <li>Natychmiast po pokrojeniu inkubować wybrane plastry w karbogenicznym roztworze odzysku NMDG o temperaturze 33 °C przez dokładnie 12 minut, a następnie przenieść do karbogenicznego roztworu HEPES o temperaturze pokojowej na początkowy okres 60 minut. Po tej 60-minutowej inkubacji można użyć plasterków do nagrywania. Plastry są przechowywane w roztworze HEPES przez cały dzień, aż zostaną wykorzystane do nagrywania.</li>
</ol>
3. Nagrywanie z zacisku krosowego z neuronów w wycinkach mózgu
<ol>
 <li>Wyciągnij standardową mikropipetę z plastrem za pomocą programowalnego ściągacza Flaming-Brown (Sutter P-97 lub równoważnego ściągacza pionowego). Pipety, które są optymalne do tworzenia uszczelnień giga-omowych, mają zazwyczaj rezystancję 4-6 MΩ</li>
 <li>Przenieś jedną cząstkę do komory nagrywającej (RC-27L; Warner Instruments) na stoliku mikroskopu pionowego (Nikon FN-1). Ciągły superbezpiecznik (1,5 - 2,0 ml/min) plasterka z karbogenowym, wzorcowym zapisem aCSF podgrzanym i utrzymywanym w temperaturze 32 °C. Alternatywnie, plastry mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Zlokalizuj i wyśrodkuj obszar zainteresowania mózgu za pomocą obiektywu pneumatycznego 10X (Nikon Plan Fluor 10X; NA 0,3; Szerokość szer.: 16 mm).</li>
 <li>Wizualizacja pojedynczych neuronów za pomocą 40-krotnego obiektywu zanurzonego w wodzie w bliskiej podczerwieni (IR) (Nikon APO 40XW; NA: 0,80; WD: 3,5 mm) podłączony do optyki DIC (IR) z kontrastem różnicowym zakłóceń (IR) i szybką kamerą wideo CCD (Hamamatsu C-7500). Pod obserwacją IR-DIC zdrowe neurony wykazują gładką, jasnoszarą błonę plazmatyczną.</li>
 <li>Napełnij mikropipetę odpowiednim roztworem do zapisu wewnątrzkomórkowego. Do większości zastosowań używamy następującego roztworu (w mM): 135 glukonian potasu, 5 EGTA, 0,5 CaCl2, 2 MgCl2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP i 0,1 GTP (pH dostosowane do 7,25 z zasadą Tris, osmolarność dostosowana do 290 mOsm z sacharozą). Ustanów zapis całej komórki z wizualizowanego neuronu.</li>
</ol>
4. Lokalne stosowanie leków na neurony w warstwach
<ol>
 <li>Wyciągnąć standardową mikropipetę z zaciskiem krosowym, jak opisano powyżej. Używanie ściągacza do pipet, takiego jak Sutter P-97, który wytwarza dwie identyczne "siostrzane" końcówki z tego samego kawałka szkła, jest korzystne, gdy na tej samej celi ma być używanych wiele roztworów leków. Rozmiary końcówek, które miałyby rezystancję ~5 MΩ, gdyby były wypełnione roztworem wewnątrzkomórkowym opisanym powyżej, są optymalne.</li>
 <li>Napełnić mikropipetę roztworem leku rozcieńczonego w karbogennym, wzorcowym zapisie aCSF. Skieruj końcówkę w dół i potrząśnij mikropipetą wypełnioną lekiem, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w kolumnie roztworu.</li>
 <li>Zamontuj mikropipetę wypełnioną lekiem w uchwycie na pipety połączonym z rurką do odpowiedniego systemu wyrzutu ciśnienia, takiego jak Picospritzer III (General Valve Co.). Uchwyt pipety powinien być zamontowany na mikromanipulatorze o takiej samej rozdzielczości, jak manipulatory powszechnie używane do nagrywania patch clamp (na przykład Sutter MP-285). Dodatkowo manipulator powinien umożliwiać ruch po przekątnej do i na zewnątrz plastra. Ręcznie wysunąć ciśnienie 3 do 4 razy do mikropipety, aby wytworzyć odpowiednie ciśnienie za kolumną płynu.</li>
 <li>Korzystając z elementów sterujących mikromanipulatora, opuść pipetę leku do plastra, jednocześnie wizualizując końcówkę pod optyką IR-DIC. Idealnie byłoby, gdyby wizualnie zidentyfikował i wyśrodkował neuron, z którego ma być nagrywany, a następnie umieścił pipetę leku w pobliżu komórki przed opuszczeniem mikropipety rejestrującej do wycinka. Ustawienie pipety leku może spowodować ruch tkanki w pobliżu nagranej komórki, co może zakłócić zapis, jeśli pipeta leku zostanie przesunięta na miejsce po ustanowieniu gigaomowej uszczelki.</li>
 <li>Korzystając z wideo w podczerwieni, umieść mikropipetę leku na górnej powierzchni wycinka tkanki. Wykonaj jeden wyrzut ciśnienia i monitoruj 1) okolice końcówki pod kątem ruchu zanieczyszczeń związanych z wyrzutem oraz 2) końcówkę mikropipety pod kątem oznak zatkania lub zablokowania końcówki. Jeśli końcówka jest zablokowana/zatkana, schować pipetę i wymienić ją na nową.</li>
 <li>Zbliżyć się do zarejestrowanej komórki po przekątnej od góry wycinka w taki sposób, aby w końcowej pozycji końcówka pipety wypełnionej lekiem znajdowała się 1) w tej samej płaszczyźnie ogniskowej (lub nieco poniżej) co zarejestrowana komórka i końcówka elektrody rejestrującej oraz 2) 10 do 40 μm od zarejestrowanej komórki. Jeśli końcówka pipety wypełnionej lekiem znajduje się powyżej zarejestrowanej celi, siła wynikająca z wyrzutu ciśnienia może zakłócić uszczelnienie gigaomowe.</li>
 <li>Zapisz żądaną odpowiedź komórkową, trzymając ogniwo w trybie cęgów napięcia lub w trybie cęgów prądowych. Rutynowo rejestrujemy prądy komórkowe wywołane acetylocholiną i/lub nikotyną, jednocześnie utrzymując neurony w trybie zacisku napięcia. Chociaż wyrzut ciśnienia może być uruchamiany ręcznie w przypadku korzystania z Picospritzera III, w celu uzyskania bardziej powtarzalnych wyników zaleca się wyzwolenie wyrzutu ciśnienia za pomocą systemu akwizycji (Axon Digidata 1440 i pClamp 10.3) za pomocą cyfrowego impulsu TTL.</li>
</ol>
5. Sterowanie mikropipetą wypełnioną lekiem za pomocą tłumacza piezoelektrycznego
<ol>
 <li>Jeśli to możliwe, zamontuj uchwyt pipety wypełnionej lekiem na jednowymiarowym translatorze piezoelektrycznym (np. Piezojena PA-100 lub Burleigh PZM-150), który jest w stanie przyjąć analogowe wejście napięcia (ponownie z systemu akwizycji), który jest następnie montowany na precyzyjnym mikromanipulatorze (Sutter MP-285). Tłumacz piezoelektryczny jest użyteczny, ponieważ ruch pipety wypełnionej lekiem do i z plasterka, w tym czas i prędkość wejścia/wyjścia, może być łatwiej kontrolowany i odtwarzany z eksperymentu na eksperyment. Podczas badania nAChR odczulające skutki wycieku nikotyny z pipety wypełnionej lekiem, jeśli kiedykolwiek wystąpią, są zminimalizowane, gdy pipeta jest przesuwana w pobliżu celi za pomocą tłumacza piezoelektrycznego tylko w momencie wyrzutu ciśnienia.</li>
 <li>Za pomocą ręcznie sterowanego potencjometru na piezoelektrycznym wzmacniaczu sterującym napięciem, ustaw napięcie na maksymalną wartość.</li>
 <li>Za pomocą mikromanipulatora umieść pipetę wypełnioną lekiem w plastrze, w którym pipeta wyrzuci swoją zawartość na zarejestrowaną celę, a następnie wycofaj pipetę, ręcznie zmniejszając napięcie do zera na piezoelektrycznym wzmacniaczu kontrolującym napięcie.</li>
 <li>Korzystając z analogowego sygnału wyjściowego z systemu rejestracji zapisu, należy przesunąć pipetę wypełnioną lekiem do plastra w ciągu 250 ms, rozpoczynając 300 ms przed wystąpieniem impulsu TTL wyrzutu ciśnienia. Wycofaj pipetę na okres 250 ms, rozpoczynając 50 ms po zakończeniu impulsu TTL.</li>
</ol>

<ol><li>Tapper, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+activation+of+%3F4%2A+receptors%3A+sufficient+for+reward%2C+tolerance%2C+and+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization.</a> Science. 306, 1029-1032 (2004).</li>
<li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+activation+of+midbrain+dopamine+neurons+via+sensitized%2C+high-affinity+%3F6%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity ?6* nicotinic acetylcholine receptors.</a> Neuron. 60, 123-136 (2008).</li>
<li>Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8, 745-7452 (2011).</li>
<li>Peca, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shank3+mutant+mice+display+autistic-like+behaviours+and+striatal+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction.</a> Nature. 472, 437-442 (2011).</li>
<li>Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+interneuron+characteristics+and+nicotinic+properties+in+the+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum.</a> J. Neurobiol. 53, 590-605 (2002).</li>
<li>Pidoplichko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+activates+and+desensitizes+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons.</a> Nature. 390, 401-404 (1997).</li>
<li>Nashmi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+nicotine+cell+specifically+upregulates+functional+%3F4%2A+nicotinic+receptors%3A+basis+for+both+tolerance+in+midbrain+and+enhanced+long-term+potentiation+in+perforant+path%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic nicotine cell specifically upregulates functional ?4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path.</a> J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).</li>
<li>Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+nicotine+selectively+enhances+%3F4%3F2%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+the+nigrostriatal+dopamine+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic nicotine selectively enhances ?4?2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway.</a> J. Neurosci. 29, 12428-12439 (2009).</li>
<li>Cohen, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+cholinergic+mechanisms+causing+elevated+dopamine+release+and+abnormal+locomotor+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nicotinic cholinergic mechanisms causing elevated dopamine release and abnormal locomotor behavior.</a> Neuroscience. 200, 31-41 (2012).</li>
<li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+modulation+of+locomotion+and+striatal+dopamine+release+is+mediated+by+%CE%B16%CE%B24%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cholinergic modulation of locomotion and striatal dopamine release is mediated by α6β4* nicotinic acetylcholine receptors.</a> J. Neurosci. 30, 9877-9889 (2010).</li>
<li>Grady, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+differences+determine+the+relative+selectivity+of+nicotinic+compounds+for+native+%CE%B14%CE%B22%2A-%2C+%CE%B16%CE%B22%2A-%2C+%CE%B13%CE%B24%2A-+and+%CE%B17-nicotine+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Structural differences determine the relative selectivity of nicotinic compounds for native α4β2*-, α6β2*-, α3β4*- and α7-nicotine acetylcholine receptors.</a> Neuropharmacology. 58, 1054-1066 (2010).</li>
<li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+trafficking%2C+pentameric+assembly%2C+and+subunit+stoichiometry+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors+containing+fluorescently+labeled+%CE%B16+and+%CE%B23+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled α6 and β3 subunits.</a> Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).</li>
<li>Keath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modulation+by+nicotine+of+substantia+nigra+versus+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Differential modulation by nicotine of substantia nigra versus ventral tegmental area dopamine neurons.</a> J. Neurophysiol. 98, 3388-3396 (2007).</li>
<li>Mansvelder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bupropion+inhibits+the+cellular+effects+of+nicotine+in+the+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area.</a> Biochem. Pharmacol. 74, 1283-1291 (2007).</li>
<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+largest+group+of+superficial+neocortical+GABAergic+interneurons+expresses+ionotropic+serotonin+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The largest group of superficial neocortical GABAergic interneurons expresses ionotropic serotonin receptors.</a> J. Neurosci. 30, 16796-16808 (2010).</li>
<li>Margolis, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+in+the+identification+of+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliability in the identification of midbrain dopamine neurons.</a> PLoS One. 5, e15222(2010).</li>
<li>Margolis, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ventral+tegmental+area+revisited%3A+is+there+an+electrophysiological+marker+for+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons.</a> J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).</li>
<li>Couey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributed+network+actions+by+nicotine+increase+the+threshold+for+spike-timing-dependent+plasticity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex.</a> Neuron. 54, 73-87 (2007).</li>
<li>Yang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+nicotinic+acetylcholine+receptor+functional+phenotypes+of+rat+ventral+tegmental+area+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons.</a> J. Physiol. 587, 345-361 (2009).</li>
<li>Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+acetylcholine+receptor+subtypes+involved+in+facilitation+of+GABAergic+inhibition+in+mouse+superficial+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 94, 3893-3902 (2005).</li>
<li>Bouzat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+structural+bases+of+activation+of+Cys-loop+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Paris%22%5BJournal%5D)">New insights into the structural bases of activation of Cys-loop receptors.</a> J. Physiol. Paris. , (2011).</li>
</ol>

Metoda przedstawiona w tej pracy jest szeroko przydatna do badania funkcji kanałów jonowych bramkowanych ligandem w preparatach wycinków mózgu. Istnieje jednak szereg czynników, które znacząco wpłyną na jakość i odtwarzalność danych eksperymentalnych, które wynikają z zastosowania tej metody. Na przykład prądy wywołane są bardzo wrażliwe na średnicę końcówki pipety wypełnionej lekiem. Małe końcówki spowodują trudności z wyrzuceniem roztworu leku, a duże końcówki o niskiej rezystancji będą bardziej podatne na zakłócenie g...

<table><tbody><tr><td>N-metylo-D-glukamina</td><td>Sigma</td><td>M2004</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>glukoza</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Na+ askorbinian</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>tiomocznik</td><td>Sigma</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Na+ pirogronian</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&#8729; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#8729; 2H20</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Na+ pentobarbital</td><td>Vortech Pharmaceuticals</td><td>76351315</td><td></td></tr><tr><td>glukonian potasu</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>DSK-Zero 1 Krajalnica wibracyjna</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 Płonący/brązowy ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RC-27 Komora nagraniowa</td><td>Warner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-344B Sterownik grzałki perfuzyjnej</td><td>Warner</td><td>640101</td><td></td></tr><tr><td>SH-27B Podgrzewacz roztworu</td><td>Warner</td><td>640102</td><td></td></tr><tr><td>Nikon FN-1</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-7500 CCD Kamera</td> <td>wideoHamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>General Valve Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MP-285 Mikromanipulator </td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PA-100 Piez&#8211; tłumacz medyczny </td><td>piezosystem jena, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz piezoelektryczny 12V40</td><td>piezosystem jena, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B</td><td>Urządzenia molekularne Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Molecular Devices Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lokalne zastosowanie leków do badania funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Używanie tytoniu prowadzi do licznych problemów zdrowotnych, w tym raka, chorób serca, rozedmy płuc i udaru. Uzależnienie od palenia papierosów jest powszechnym zaburzeniem neuropsychiatrycznym, które wynika z biofizycznego i komórkowego działania nikotyny na nikotynowe receptory acetylocholiny (nAChR) w całym ośrodkowym układzie nerwowym. Zrozumienie różnych podtypów nAChR, które występują w obszarach mózgu istotnych dla uzależnienia od nikotyny, jest głównym priorytetem.
Eksperymenty wykorzystujące techniki elektrofizjologiczne, takie jak zapisy z użyciem patch clamp dla całych komórek lub dwuelektrodowych zacisków napięciowych, są przydatne do farmakologicznej charakterystyki interesujących nas nAChR. Komórki wykazujące ekspresję nAChR, takie jak komórki hodowli tkankowej ssaków lub oocyty Xenopus laevis, są fizycznie izolowane i dlatego można je łatwo badać przy użyciu narzędzi nowoczesnej farmakologii. Dzięki tym technikom poczyniono znaczne postępy, zwłaszcza gdy receptor docelowy był już znany, a ekspresja ektopowa była łatwo osiągana. Często jednak konieczne jest badanie nAChR w ich naturalnym środowisku: w neuronach w wycinkach mózgu pobranych od myszy laboratoryjnych lub szczurów. Na przykład myszy z ekspresją "nadwrażliwych" podjednostek nAChR, takich jak myszy α4 L9′A 1 i myszy α6 L9′S 2, pozwalają na jednoznaczną identyfikację neuronów na podstawie ich funkcjonalnej ekspresji określonej podjednostki nAChR. Chociaż nagrania klamer całokomórkowy z neuronów w wycinkach mózgu są rutynowo wykonywane przez wykwalifikowanego elektrofizjologa, trudno jest miejscowo zastosować leki, takie jak acetylocholina lub nikotyna, do zarejestrowanej komórki w wycinku mózgu. Rozcieńczenie leków do superfusatu (aplikacja do kąpieli) nie jest szybko odwracalne, a systemy rurek w kształcie litery U nie są łatwo przystosowane do pracy z plastrami mózgu.
W tym artykule opisujemy metodę szybkiego stosowania leków aktywujących nAChR do neuronów zarejestrowanych w wycinkach mózgu dorosłej myszy. Standardowe zapisy całych komórek są wykonywane z neuronów w plasterkach, a druga mikropipeta wypełniona interesującym lekiem jest manewrowana w pobliżu zarejestrowanej komórki. Wstrzyknięcie sprężonego powietrza lub obojętnego azotu do pipety wypełnionej lekiem powoduje wyrzucenie niewielkiej ilości roztworu leku z pipety na zarejestrowaną komórkę. Dzięki tej metodzie prądy za pośrednictwem nAChR mogą być rozwiązywane z dokładnością do milisekund. Czas aplikacji leku można łatwo zmieniać, a pipetę wypełnioną lekiem można schować i zastąpić nową pipetą, co pozwala na utworzenie krzywych stężenie-odpowiedź dla pojedynczego neuronu. Chociaż technika ta została opisana w kontekście neurobiologii nAChR, powinna być przydatna do badania wielu typów kanałów jonowych lub receptorów bramkowanych ligandem w neuronach z wycinków mózgu.

W naszych eksperymentach rutynowo rejestrujemy sygnały z neuronów produkujących dopaminę (DA) w polu brzusznym nakrywki (VTA) oraz w prążkowiu ciemnym części gęstej (SNc). W trybie clampa napięciowego aplikacja ciśnieniowa acetylocholiny lub nikotyny do tych komórek zazwyczaj powoduje szybki, dośrodkowy prąd kationowy, który osiąga szczyt w ciągu 100-200 msec (Rysunek 1A-B). Zanik prądu jest w dużej mierze determinowany przez dyfuzję leku z miejsca działania oraz przez obecność enzymów w skrawku, które m...

W tym artykule opisujemy użyteczną metodę badania funkcji kanałów jonowych bramkowanych ligandem w neuronach ostro izolowanych wycinków mózgu. Metoda ta polega na użyciu mikropipety wypełnionej lekiem do miejscowego nakładania leków na neurony zarejestrowane przy użyciu standardowych technik patch clamp.

Lokalne zastosowanie leków do badania funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie funkcji kanałów jonowych bramkowanych ligandem w neuronach z ostro przygotowanych wycinków mózgu pochodzących od dorosłych myszy. Osiąga się to poprzez najpierw ekstrakcję nienaruszonego mózgu od dorosłej myszy, która została perfuzjona trans Cardi ze specjalistycznym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Drugim krokiem jest przygotowanie wycinków mózgu z obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania w pożądanej orientacji.Następnie identyfikuje się pojedyncze wycinki mózgu umieszczone w komorze rejestracyjnej pod mikroskopem oraz poszczególne neurony w tym wycinku w celu rejestracji. Ostatnim krokiem jest rejestracja neuronu za pomocą opaski na całą komórkę, a następnie miejscowe zastosowanie leków w celu aktywacji kanałów jonowych bramkowanych ligandem za pomocą drugiej szklanej mikropipety. Ostatecznie ta metoda badania kanałów jonowych bramkowanych ligandem jest wykorzystywana do pokazania właściwości biofizycznych natywnych receptorów na żywych neuronach.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak aplikacja kąpielowa lub dostarczanie leków na YouTube, jest to, że dostarczanie leku do zarejestrowanego neuronu

local-application-drugs-to-study-nicotinic-acetylcholine-receptor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Lokalne stosowanie leków w badaniu funkcji nikotyny receptorów acetylocholiny w kawałkach mózgu myszy

Opracowaliśmy nową technikę kwantyfikacji zmian receptorów nikotynowych acetylocholiny w obrębie regionów podkomórkowych specyficznych podtypów neuronów OUN, aby lepiej zrozumieć mechanizmy uzależnienia od nikotyny, wykorzystując kombinację podejść, w tym znakowanie receptora białkiem fluorescencyjnym metodą knock-in oraz spektralną mikroskopię konfokalną.

Spektralne obrazowanie konfokalne nikotynowych receptorów znakowanych fluorescencyjnie u myszy typu knock-in z przewlekłą podażą nikotyny

Ruch błony neuronalnej dynamicznie kontroluje dostępność białek błony plazmatycznej i znacząco wpływa na neuroprzekaźnictwo. Do tej pory trudno było zmierzyć neuronalny transport endocytarny w dorosłych neuronach. W tym miejscu opisujemy wysoce skuteczną, ilościową metodę pomiaru szybkich zmian ekspresji białek powierzchniowych ex vivo w ostrych wycinkach mózgu.

Biotynylacja wycinków mózgu: podejście ex vivo do pomiaru specyficznego dla regionu transportu białek błony plazmatycznej w dorosłych neuronach

Opracowaliśmy genowo-chimeryczny preparat brzusznego obwodu hipokamp – półleżący in vitro, który umożliwia bezpośrednie obrazowanie na żywo w celu analizy presynaptycznych mechanizmów transmisji synaptycznej za pośrednictwem nikotynowych receptorów acetylocholiny (nAChR). Preparat ten zapewnia również pouczające podejście do badania pre- i postsynaptycznych mechanizmów plastyczności synaptycznej.

Obrazowanie na żywo indukowanej nikotyną sygnalizacji wapnia i uwalniania neuroprzekaźników wzdłuż brzusznych aksonów hipokampa

Ten protokół demonstruje implementację zoptymalizowanej metody ochronnego odzyskiwania N-metylo-D-glukaminy (NMDG) do przygotowania wycinków mózgu. Pojedynczy preparat podłoża jest używany do niezawodnego uzyskiwania zdrowych wycinków mózgu od zwierząt w każdym wieku i do różnych zastosowań eksperymentalnych.

Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy

Zweryfikowana komputerowa bateria testów neuropsychologicznych i neurofizjologicznych jest używana do badania farmakodynamicznego wpływu na ośrodkowy układ nerwowy nowo opracowanych leków we wczesnej fazie rozwoju. Aby zademonstrować baterię testową, opisano ostre działanie mekamylaminy i odwrócenie tego działania przez dwa leki agonistyczne.

Skomputeryzowana bateria testowa do badania wpływu farmakodynamicznego leków cholinergicznych na ośrodkowy układ nerwowy we wczesnej fazie opracowywania leków

Prezentujemy metodę, która może dostarczyć dalszych informacji na temat wczesnych zdarzeń leżących u podstaw neurodegeneracji i opiera się na uznanej technice mózgu ex-vivo, łącząc zalety eksperymentów in vivo i in vitro. Co więcej, jest to wyjątkowa okazja do bezpośredniego porównania grupy leczonej i nieleczonej na tej samej płaszczyźnie anatomicznej.

Alternatywne podejście do badania pierwotnych zdarzeń w neurodegeneracji przy użyciu wycinków mózgu szczurów ex vivo

Mikroglej, komórki odpornościowe rezydujące w mózgu, szybko reagują zmianami morfologicznymi na modyfikacje swojego środowiska. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać mikroskopię dwufotonową do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku serotoniny lub ATP w ostrych wycinkach mózgu myszy.

Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu

Ten artykuł przedstawia metodę badania nikotynowych receptorów acetylocholiny (nAChR) w wycinkach mózgu myszy poprzez uwalnianie nikotyny. W połączeniu z jednoczesnym rejestrowaniem za pomocą klamry krosowej i 2-fotonowej laserowej mikroskopii skaningowej, odblokowanie nikotyny łączy funkcję receptora nikotynowego z morfologią komórki, zapewniając głębsze zrozumienie neurobiologii cholinergicznej.

Badanie funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy za pomocą laserowej fotolizy fotoaktywowanej nikotyny

Przedstawiamy protokół do oceny równowagi między uwalnianiem glutaminianu a klirensem w pojedynczych synapsach glutaminergicznym korowo-prążkowych w ostrych wycinkach od dorosłych myszy. Protokół ten wykorzystuje czujnik fluorescencyjny iGluu do wykrywania glutaminianu, kamerę sCMOS do akwizycji sygnału oraz urządzenie do ogniskowego oświetlenia laserowego.

Wskaźniki uwalniania i wychwytu glutaminianu w pojedynczych synapsach w ostrych wycinkach mózgu od myszy normalnych i myszy z chorobą Huntingtona

Ta metoda wprowadza prostą technikę wykrywania endogennego uwalniania monoamin za pomocą ostrych wycinków mózgu. Zestaw wykorzystuje 48-dołkową płytkę zawierającą uchwyt na tkankę do uwalniania monoamin. Uwolniona monoamina jest analizowana za pomocą HPLC w połączeniu z detekcją elektrochemiczną. Ponadto technika ta zapewnia metodę przesiewową w celu odkrywania leków.

Test na płytce do pomiaru endogennego uwalniania monoamin w ostrych wycinkach mózgu

Protokół ten opisuje ekspresję i ilościową liczbę podjednostek receptorów acetylocholinowych neuronów za pomocą linii komórkowej Neuro-2a ssaków. Znaczniki fluorescencyjne wrażliwe na pH oraz mikroskopia konfokalna umożliwiają precyzyjną ocenę lokalizacji receptorów w błonie plazmatycznej w porównaniu do tych wyrażanych w neutralnych pH-przedziałach wewnątrzkomórkowych, ułatwiając badania transportu nAChR i modulacji farmakologicznej.

Lokalizacja błony plazmatycznej i wewnątrzkomórkowych receptorów nikotynowej acetylocholiny za pomocą obrazowania ilościowego w komórkach ssaków

Poznaj metodę lokalnego aplikowania leków do badania funkcji nikotynowych receptorów acetylocholinowych w neuronach wycinków mózgu myszy. Technika patch clamp umożliwia szybką, precyzyjną aktywację kanałów jonowych.

Lokalne zastosowanie leków do badania funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów