Name: Obrazowanie na żywo białek znakowanych GFP w oocytach Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo białek GFP w oocytach Drosophila przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Protokół umożliwia badanie dynamiki białek w żywych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez GM096076 grantowe z programu NIH AREA.

1. Przygotowanie much do sekcji
<ol>
 <li>Znieczulenie należy znieczulić zdrowe muchy o pożądanym genotypie (na przykład wykazującym ekspresję białka znakowanego GFP), które mają mniej niż tydzień. Wybierz 10-15 dużych samic z zaokrąglonymi kremowymi odwłokami.</li>
 <li>Przenieść wybrane muchy i kilka (3-5) samców do fiolki zawierającej nowy, lekko drożdżowy pokarm i pozwolić muchom tuczyć się przez dwa dni w temperaturze 25 °C. Patrz Weil i wsp.6 w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat preparatu Drosophila. Tuczenie much zapewnia, że do obrazowania dostępne będą różne etapy, zwłaszcza stadia 8-12. Słabo utuczone lub nieutuczone muchy zwykle zawierają tylko bardzo wczesne (1-6) i dojrzałe (stadium 14) oocyty.</li>
</ol>
2. Przygotowanie oocytów do obrazowania za pomocą pionowego mikroskopu złożonego
<ol>
 <li>Przygotować standardowe szkiełko podstawowe, przyklejając do szkiełka nakrywkowego dwa szkiełka nakrywkowe w odległości około 1 cm od siebie, używając smaru silikonowego. Używaj tylko tyle smaru, aby zapewnić dobre uszczelnienie między szkiełkiem nakrywkowym a suwakiem. Mocne dociśnięcie szkiełka nakrywkowego spowoduje cienkie i równomierne rozprowadzenie smaru. Dodaj trochę oleju halowęglowego 27 (Sigma) do połączenia między szkiełkami nakrywkowymi a szkiełkiem. Będą one służyły jako przekładki, aby zapobiec uszkodzeniu izolowanych komórek jajowych w kolejnych etapach. Szkiełka nakrywkowe nr 1,5 działają dobrze, ze średnią grubością (0,16-0,18 mm), która odpowiada grubości oocytów w późnym stadium.</li>
 <li>Umieść 2-3 krople oleju halowęglowego 27 na powierzchni szkiełka nakrywkowego o średnicy 22mm2. Aby uzyskać jak najzdrowsze oocyty, pojedynczą samicę wyjmuje się z fiolki z pokarmem za pomocą pipetowania doustnego i delikatnie umieszcza w oleju halowęglowym bez uprzedniego znieczulenia.</li>
 <li>Za pomocą ostrych kleszczy preparacyjnych (takich jak Dumont #5) przypnij muchę do szkiełka nakrywkowego i oderwij czubek brzucha. Usuń jajniki, przeciągając je po powierzchni szkiełka nakrywkowego, pod olejem. Będzie to sprzyjać przyleganiu oocytów do szkiełka nakrywkowego.</li>
 <li>Delikatnie rozsuń jajniki, szukając oocytów, które są w co najmniej 10 stopniu oogenezy. Oocyty na tym etapie można zidentyfikować, szukając komór jajowych, w których oocyt zajmuje co najmniej 50-60% całkowitej objętości komory jajowej. W tym momencie oogenezy komórki pęcherzykowe leżące nad oocytem stały się kolumnowe i otaczają oocyt ze wszystkich stron, z wyjątkiem małego obszaru, w którym pozostają połączenia z komórkami pielęgniarskimi. Za pomocą kleszczy usuń pojedyncze oocyty z osłonki jajnika.</li>
 <li>Kontynuuj, używając 1-3 samic, aż 5-8 nieuszkodzonych oocytów zostanie wyizolowanych na szkiełku nakrywkowym. Usuń wszelką bezużyteczną tkankę.</li>
 <li>Ostrożnie odwróć szkiełko nakrywkowe zawierające oocyty na wcześniej przygotowane szkiełko podstawowe, tak aby oocyty znalazły się między dwoma przekładkami. Nie należy naciskać na odwrócone szkiełko nakrywkowe, ponieważ spowoduje to uszkodzenie oocytów. W razie potrzeby dodaj niewielką ilość oleju halowęglowego na krawędzie "kanapki", aby upewnić się, że przestrzeń jest wypełniona. (Opcjonalnie: Pozostaw szkiełko na kilka minut, aby umożliwić osadzenie się szkiełka nakrywkowego.) Slajd jest teraz gotowy do obrazowania.</li>
</ol>
3. Przygotowanie oocytów do obrazowania za pomocą odwróconego mikroskopu złożonego
<ol>
 <li>Oocyty są preparowane zasadniczo w sposób opisany w sekcji 2, z wyjątkiem małych szalek Petriego ze szklaną wkładką dolną (MatTek, 35 mm) zamiast szkiełek nakrywkowych. Nie ma potrzeby przykrywania próbki, a po rozbiorzeniu tkankę można obrazować bezpośrednio w szalkach, ale należy zadbać o to, aby oocyty pozostały pokryte olejem i nie mogły wyschnąć.</li>
</ol>
4. Obrazowanie na żywo
<ol>
 <li>Ustaw ostrość oocytu za pomocą DIC lub optyki z kontrastem fazowym i zbadaj oocyt pod kątem oznak uszkodzenia, takich jak wyciek cytoplazmy lub wybrzuszenie komórek pęcherzykowych. Obraz tylko oocytów, które wydają się zdrowe i nieuszkodzone.</li>
 <li>Przesyłanie strumieniowe może być monitorowane bezpośrednio, bez konieczności znakowania GFP, ponieważ pęcherzyki żółtkowe w cytoplazmie są autofluorescencyjne7. Sygnał ten może być przechwycony w zakresie FITC zakresu, ale prawdopodobnie będzie wymagał wyższych ustawień wzmocnienia niż te stosowane w przypadku białek znakowanych GFP.</li>
 <li>Najlepsze obrazy strumieniowania uzyskuje się z przekrojów optycznych, które znajdują się tuż pod powierzchnią oocytu, który opiera się o szklane szkiełko nakrywkowe/szkło Petriego. Tutaj oocyt jest lekko spłaszczony, co zapewnia lepszą płaszczyznę ostrości. Obrazy można rejestrować z szybkością od 200 do 1 000 razy. Korzystając z opisanego tutaj układu, należy stosować obiektywy powietrzne, ponieważ szkiełko nakrywkowe tworzy barierę między oocytem a obiektywem. Jest to optymalne, ponieważ znacznie minimalizuje dryft i ruch próbki.</li>
 <li>Gdy obszar zainteresowania jest ostry, wyłącz optykę jasnego pola i przełącz się na obrazowanie konfokalne. Korzystając z funkcji szybkiego skanowania/podglądu w oprogramowaniu, dostosuj ostrość i wzmocnienie zgodnie z potrzebami.</li>
 <li>Ustawienia przechwytywania będą się różnić w zależności od mikroskopu, ale ogólne parametry są następujące: Użyj długości fali wzbudzenia ~ 488 nm i długości fali emisji ~ 515 nm. Skonfiguruj przechwytywanie osi Z w taki sposób, aby oś Z pozostawała stała, z opóźnieniem 10 sekund między klatkami. Uchwyć sekwencję testową składającą się z 5-10 klatek, aby upewnić się, że oocyt jest nieruchomy, a płaszczyzna ostrości jest odpowiednia.</li>
 <li>Typowa sekwencja poklatkowa obejmuje od 20 do 50 klatek i można ją przejrzeć natychmiast po zakończeniu w celu oceny jakości wideo. Proces można powtórzyć dla innych komórek na szkiełku lub w razie potrzeby wypreparować dodatkowe samice.</li>
</ol>
5. Rozwiązywanie problemów i częste problemy
<ol>
 <li>Dryf - Podczas korzystania z mikroskopu pionowego komórki mogą czasami dryfować z powodu rozprzestrzeniania się oleju. Można to zminimalizować, używając tylko takiej ilości oleju, aby pokryć obszar pod szkiełkiem nakrywkowym. Jeśli problemy będą się powtarzać, użyj mniejszej ilości smaru silikonowego, aby przymocować przekładki do prowadnicy.</li>
</ol>
Uwaga: Niektóre pakiety oprogramowania konfokalnego pozwalają na śledzenie komórek, ale generalnie lepiej jest zrezygnować z obrazowania dryfujących oocytów i zamiast tego użyć innego preparatu.
<ol start="2">
 <li>Brak oznak przesyłania strumieniowego - Jeśli przesyłanie strumieniowe nie jest widoczne, prawdopodobnie jest to spowodowane jedną z dwóch przyczyn: albo płaszczyzna ogniskowa do przechwytywania obrazu nie jest prawidłowa (zwykle zbyt głęboko we wnętrzu oocytu), albo oocyt jest uszkodzony. Czas i praktyka mogą zminimalizować oba błędy.</li>
</ol>

<ol><li>Becalska, A. N., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lighting+up+mRNA+localization+in+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Lighting up mRNA localization in Drosophila oogenesis.</a> Dev. 136, 2493-2503 (2009).</li>
<li>He, L., Wang, X., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shining+light+on+Drosophila+oogenesis%3A+Live+imaging+of+egg+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Gen.+Dev%22%5BJournal%5D)">Shining light on Drosophila oogenesis: Live imaging of egg development.</a> Curr. Opin. Gen. Dev. 21, 612-619 (2011).</li>
<li>King, R. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+RC+%22Ovarian+development+Drosophila+melanogaster%22">Ovarian development Drosophila melanogaster</a>. , Academic Press. New York. (1970).</li>
<li>Spradling, A. C. Developmental genetics of oogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor. 1-70 (1993).</li>
<li>Serbus, L. R., Cha, B. -J., Theurkauf, W. E., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+and+the+actin+cytoskeleton+control+kinesin-driven+cytoplasmic+streaming+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Dynein and the actin cytoskeleton control kinesin-driven cytoplasmic streaming in Drosophila oocytes.</a> Dev. 132, 3743-3752 (2005).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+Individual+Drosophila+Egg+Chambers+for+Live+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (60), e3679(2012).</li>
<li>Theurkauf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+microtubule-dependent+cytoplasmic+streaming+in+cappuccino+and+spire+mutant+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Premature microtubule-dependent cytoplasmic streaming in cappuccino and spire mutant oocytes.</a> Science. 265, 2093-2096 (1998).</li>
<li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> PNAS. 98, 15050-15055 (2001).</li>
<li>Röper, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rtnl1+is+enriched+in+a+specialized+germline+ER+that+associates+with+ribonucleoprotein+granule+components%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rtnl1 is enriched in a specialized germline ER that associates with ribonucleoprotein granule components.</a> J. Cell Sci. 120, 1081-1092 (2007).</li>
<li>Pokrywka, N. J., Payne-Tobin, A., Raley-Susman, K. M., Swartzman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules%2C+the+ER+and+Exu%3A+New+associations+revealed+by+analysis+of+mini+spindles+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Microtubules, the ER and Exu: New associations revealed by analysis of mini spindles mutations.</a> Mech. Dev. 126, 289-300 (2009).</li>
<li>Petri, W. H., Mindrinos, M. N., Lombard, M. F., Margaritis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+development+of+the+Drosophila+chorion.ih+a+chemically+defined+organ+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Wilhelm+Roux%27s+Arch.%2C+Devl.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro development of the Drosophila chorion.ih a chemically defined organ culture medium.</a> Wilhelm Roux's Arch., Devl. Biol. 186, 351-362 (1979).</li>
<li>ImageJ [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html</a> (2013).</li>
</ol>

Nie mam nic do ujawnienia.

Oocyty Drosophila to wszechstronny system modelowy do rozwiązywania różnych pytań związanych z funkcją i organizacją komórek i składników subkomórkowych. Pełne zrozumienie funkcji białek wymaga monitorowania zarówno przestrzennych, jak i czasowych aspektów zachowania białek. Postępy zarówno w systemach obrazowania, jak i w narzędziach genetycznych dostępnych dla drozofilów umożliwiają nawet małym laboratoriom przeprowadzanie wysokiej jakości eksperymentów obrazowych na żywych oocytach. Poniżej przedstawiam protokół analizy zachowania białek i struktur znakowanych GFP lub autofluorescencyjnych podczas środkowej i późnej oogenezy, który można wykorzystać w połączeniu z różnymi tłami genetycznymi do badania funkcji białek.
W niniejszym protokole opisuję proces, w którym oocyty są przygotowywane do obrazowania oraz podstawowe ustawienia konfokalne, które umożliwią uzyskanie poklatkowego filmu białek i struktur fluorescencyjnych. Dodatkowe informacje na temat przygotowania oocytów opisano przez Weil i wsp.6 Dostępna jest szeroka gama szczepów much wykazujących ekspresję białek, które zostały endogennie znakowane za pomocą wychwytywania egzonów8, a nieskończenie więcej wariantów białek można zmodyfikować i ponownie wprowadzić do muszek.
W pracy z żywą tkanką zdrowie próbek ma ogromne znaczenie. Komory jajowe od etapu 10B mogą zakończyć oogenezę w zasadniczo autonomiczny sposób11, co czyni je idealnymi do krótkoterminowych badań obrazowych. Należy zadbać o kilka kluczowych kroków, aby uzyskać dane wysokiej jakości. Podczas sekcji ważne jest, aby jak najmniej manipulować jajnikami i oocytami oraz zminimalizować czas między sekcją a zakończeniem obrazowania. Idealnie byłoby, gdyby mała stacja sekcyjna znajdowała się w tym samym pomieszczeniu, w którym znajduje się luneta konfokalna, a obrazowanie powinno obejmować tylko kilka komór jajowych na raz. Zalecana tutaj liczba (5-8) zapewnia zminimalizowanie czasu preparacji, jednocześnie maksymalizując prawdopodobieństwo uzyskania dobrej jakości obrazów. Zalecam zrobienie krótkiej serii zdjęć, aby ocenić jakość obrazu i potwierdzić, że ustawienia przechwytywania są zoptymalizowane, przed uchwyceniem dłuższej sekwencji poklatkowej. Większość programów umożliwia zapisywanie pojedynczych klatek, które można następnie analizować na różne sposoby za pomocą ImageJ12 lub innego oprogramowania.

<table><tbody><tr><td>Olej halowęglowy 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773-100ML</td><td></td></tr>#5SF <tr><td>Kleszcze </td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Smar silikonowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo białek znakowanych gfp w oocytach drosophila

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

oocyt Drosophila został uznany za wszechstronny system do badania podstawowych pytań, takich jak funkcja cytoszkieletu, organizacja komórek oraz struktura i funkcja organelli. Dostępność różnych białek znakowanych GFP oznacza, że wiele procesów komórkowych można monitorować w żywych komórkach w ciągu kilku minut lub godzin, a przy użyciu tej techniki procesy takie jak transport RNP, morfogeneza nabłonka i przebudowa tkanek zostały opisane bardzo szczegółowo w oocytach Drosophila 1,2.
Możliwość wykonywania obrazowania wideo w połączeniu z bogatym repertuarem mutantów pozwala na niezwykle szczegółowe badanie ogromnej różnorodności genów i procesów. Jednym z takich przykładów jest proces strumieniowania ooplazmy, który rozpoczyna się w połowie oogenezy3,4. Ten energiczny ruch pęcherzyków cytoplazmatycznych jest zależny od mikrotubul i kinezyny5 i stanowi użyteczny system do badania funkcji cytoszkieletu na tych etapach.
Tutaj przedstawiam protokół do obrazowania poklatkowego żywych oocytów przy użyciu praktycznie dowolnego zestawu mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie białek znakowanych GFP będzie różnić się w zależności od siły ekspresji białka z tagiem. Oocyt w stadium średnim wykazujący ekspresję białka reticulon-like 1 (Rtnl-1), z eksonem znakowanym GFP8,9, generuje silny sygnał. Rtnl-1 wydaje się kolokalizować z długimi mikrotubulami obecnymi podczas strumieniowania ooplazmatycznego10 (Rysunek 1A). Rtnl-1 stanowi dobry marker do obserwacji strumieniowania, a także wskaźnik organizacji mikrotubul w oocytach w stadium późnym.
Strumieniowanie ooplazmy w komorze jajowej typu dzikiego jest widoczne jako wyraźny ruch autofluorescencyjnych pęcherzyków żółtka przy zastosowaniu częstotliwości rejestracji jednej klatki co 10 sec (Rycina 1B). W celu zaznaczenia ścieżki poruszających się pęcherzyków można wygenerować projekcję maksymalną z pięciu klatek.
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej pokazują lokalizację białek w strukturach komórkowych; wyniki eksperymentu." src="/files/ftp_upload/50044/50044fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Obrazowanie na żywo struktur autofluorescencyjnych oraz znakowanych GFP. A) Pojedynczy obraz z serii czasowej oocyty w stadium 11 wykazującej ekspresję Rtnl1-GFP przy powiększeniu 400X. Włókna Rtnl1-GFP poruszają się falistym ruchem w strumieniujących oocytach. B) Projekcja maksymalna z pięciu klatek komory jajowej w stadium 10B, w której autofluorescencyjne pęcherzyki żółtkowe były obrazowane co 10 s przez łącznie 50 s, przy powiększeniu 400X. Pasek skali = 30 μm.

Opisano protokół obrazowania na żywo białek lub struktur autofluorescencyjnych oznaczonych GFP w pojedynczych oocytach Drosophila.

Obrazowanie na żywo białek znakowanych GFP w oocytach Drosophila

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

W niniejszym protokole komórki wykazujące ekspresję białek znakowanych GFP są izolowane z samic muszki owocówki i obrazowane w celu zbadania ruchu białka w żywych komórkach. Najpierw należy przygotować komorę obserwacyjną, mocując dwa szkiełka nakrywkowe do szkiełka podstawowego za pomocą smaru silikonowego w celu utworzenia kanału. Ścianki kanału są wyłożone olejem halokarbonowym.Następnie wypreparuj jajniki samicy do kropli oleju halokarbonowego na szkiełku nakrywnym. Potem wyizoluj poszczególne cyty i odwróć szkiełko nakrywne nad kanałem w przygotowanym preparacie, aby utworzyć komorę obserwacyjną. Po zlokalizowaniu cytów za pomocą optyki w jasnym polu lub DIC, wykonaj cyfrowe zdjęcia w określonych odstępach czasu, korzystając z mikroskopii konfokalnej i odpowiedniego oprogramowania.W końcowym etapie sekwencja obrazów z lapse-time może zostać wykorzystana do monitorowania ruchu białek lub cząsteczek w żywych komórkach w czasie. Metoda ta może pomóc w badaniu kluczowych zagadnień z zakresu biologii komórki i biologii rozwoju, takich jak transport białek i mRNA oraz ustalanie polarności komórkowej. Najpierw należy znieczulić zdrowe muchy w wieku poniżej jednego tygodnia i wybrać od 10 do 15 dużych samic z zaokrąglonymi, kremowymi odwłokami.Przenieś wybrane muchy oraz kilka osobników płci męskiej do fiolki zawierającej nową pożywkę z niewielką ilością drożdży. Następnie inkubuj muchy przez dwa dni w temperaturze 25 °C w celu ich dotuczenia. Dotuczenie much zapewnia dostępność różnych stadiów, zwłaszcza od ósmego do dwunastego, do celów obrazowania; muchy niedotuczone lub słabo dotuczone zazwyczaj zawierają jedynie stadia bardzo wczesne oraz dojrzałe cytes. Używając smaru silikonowego.Przytwierdź dwa szkiełka nakrywkowe w odstępach około jednego centymetra do standardniego szkiełka podstawowego. Użyj tylko takiej ilości wazeliny, która zapewni szczelne połączenie między szkiełkiem nakrywkowym a podstawowym. Mocno dociśnij każde szkiełko nakrywkowe, aby wazelina rozprowadziła się cienko i równomiernie.Następnie należy dodać niewielką ilość oleju węglowego 27 do miejsca styku szkiełek nakrywkowych i podstawki, aby zapobiec uszkodzeniu wyizolowanych komórek w kolejnych krokach. Teraz nanieś dwie do trzech kropli oleju węglowego 27 na powierzchnię szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 mm². Następnie za pomocą pipety ustnej pobierz pojedynczą samicę z fiolki z pożywką i delikatnie umieść ją w oleju węglowym.Używając ostrych pęsety sekcyjnej, przypnij muchę do szkiełka nakrywki i odciągnij koniec odwłoka. Usuń jajniki, przesuwając je wzdłuż powierzchni szkiełka nakrywki w oleju, aby wspomóc przyleganie cytów do szkiełka. Następnie delikatnie rozdziel jajniki, szukając cytów, które znajdują się co najmniej w stadium 10 B oogenezy.Oocyty na tym etapie rozpoznaje się poprzez wyszukiwanie komór jajowych, w których oocyt zajmuje co najmniej 50 do 60% całkowitej objętości komory jajowej. Za pomocą pęsety należy wyizolować pojedyncze oocyty z osłonki jajowej, wykorzystując od jednej do trzech samic.Kontynuuj izolowanie od pięciu do ośmiu nieuszkodzonych oocytów na szkiełku nakrywce. Następnie usuń wszelkie nieużyteczne tkanki. Ostrożnie odwróć szkiełko nakrywkowe z oocytami na przygotowany wcześniej preparat, tak aby komórki znalazły się pomiędzy dwoma dystansami.Należy pamiętać, aby nie naciskać szkiełka nakrywkowe, ponieważ może to uszkodzić cyty. Jeśli jest to konieczne, należy dodać niewielką ilość oleju halokarbonowego na krawędzie preparatu, aby upewnić się, że przestrzeń została wypełniona. Zauważmy, że na tym etapie oogenezy komórki pęcherzyka pokrywające oocyt stały się bardziej zwarte i otaczają oocyt z każdej strony, z wyjątkiem niewielkiego obszaru, w którym zachowane pozostają połączenia z komórkami pielęgnacyjnymi. Należy ustawić ostrość na oocyt, korzystając z optyki DIC lub kontrastu fazowego.Zbadaj oocyt pod kątem wszelkich oznak uszkodzenia, takich jak wyciek cytoplazmy lub wybrzuszenie komórek pęcherzyka. Wykonaj obrazowanie tylko tych oocytów, które wyglądają na zdrowe i nieuszkodzone. Aby monitorować strumieniowanie bezpośrednio, bez znakowania GFP.Należy ustawić obrazowanie w zakresie ZI mikroskopu, stosując wyższe wartości wzmocnienia niż w przypadku białek znakowanych GFP. Należy używać obiektywów powietrznych, aby maksymalnie zminimalizować dryft i ruchy próbki. Należy wykonać przekroje optyczne tuż poniżej powierzchni oocytu.Po ustawieniu ostrości na obszarze zainteresowania, wyłącz optykę pola jasnego i przełącz się na obrazowanie konfokalne, korzystając z funkcji szybkiego podglądu skanowania w oprogramowaniu, dostosowując w razie potrzeby ostrość i wzmocnienie. Następnie ustaw parametry wzbudzenia, długość fali wzbudzenia oraz długość fali emisji. Do akwizycji w osi Z wybierz stałą oś Z z opóźnieniem 10 sekund pomiędzy klatkami.Po zarejestrowaniu typowej sekwencji poklatkowej składającej się z 20–50 klatek, należy niezwłocznie przejrzeć i ocenić jakość wideo. Ten pojedynczy obraz poklatkowy przedstawia oocyt w stadium 11. Oocyt ten, wykazujący ekspresję białka R TNL one znakowanego GFP, może generować silny sygnał.R TNL one wydaje się współlokalizować z długimi mikrotubulami obecnymi podczas prądów cytoplazmatycznych w oocytach. Typowo prądy cytoplazmatyczne w komorze jajowej typu dzikiego są widoczne jako wyraźny ruch autofluorescencyjnych pęcherzyków ylk, co przedstawiono na pięcioklatkowej projekcji maksymalnej komory jajowej w stadium 10 B. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak izolować zdrowe oocyty samic wykazujące ekspresję białek znakowanych GFP, jak przygotowywać próbki do obrazowania na żywo oraz jak rejestrować filmy poklatkowe białek i cząsteczek fluorescencyjnych.

live-imaging-of-gfp-labeled-proteins-in-drosophila-oocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie na żywo białek oznaczonych zieloną fluorescencyjną białkiem w komórkach jajowych Drosophila

W niniejszej pracy opisujemy protokół badania migracji komórek glejowych do rozwijającego się oka Drosophila za pomocą analizy mikroskopowej żywych tkanek z wykorzystaniem komórek glejowych znakowanych GFP.

Obrazowanie na żywo migracji komórek glejowych w tarczceImaginal oka Drosophila

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Komora jajowa Drosophila stanowi doskonały model do badania mechanizmów lokalizacji mRNA. Aby uchwycić dynamiczne zdarzenia leżące u podstaw procesów lokalizacji, wymagane jest szybkie obrazowanie tkanek żywych w wysokiej rozdzielczości. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół preparatyki i obrazowania żywych próbek przy minimalnej ingerencji w ich strukturę.

Przygotowanie pojedynczych komór jajeczkowych Drosophila do obrazowania na żywo

Źródło: Hellerman, M. B., et al. Obrazowanie na żywo Drosophila Oko poczwarki. J. Vis. exp. (2015){{TAG_ 28}}Film demonstruje technikę obrazowania na żywo do badania wzorców oczu u poczwarki Drosophila melanogaster. Markery znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) umożliwiają wizualizację organizacji i różnicowania komórek podczas tworzenia rozwijającej się struktury oka.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj opisujemy skuteczną metodę badania dynamiki apoptotycznego oczyszczania komórek in vivo. Metoda ta wykorzystuje żywe zarodki Drosophila jako potężny model do monitorowania fagocytozy komórek apoptotycznych przy użyciu specyficznego znakowania komórek apoptotycznych i fagocytów.

Obrazowanie na żywo apoptotycznego usuwania komórek podczas embriogenezy Drosophila

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Ten artykuł opisuje adaptowalny protokół ex vivo do wizualizacji Ca2+ podczas aktywacji jaj u Drosophila.

Obrazowanie wapnia u Drosophila podczas aktywacji jaj

Tutaj udostępniamy protokół sekcji wymagany do zobrazowania na żywo późnej embrionalnej męskiej gonady Drosophila. Protokół ten pozwoli na obserwację dynamicznych procesów komórkowych w normalnych warunkach lub po manipulacji transgenicznej lub farmakologicznej.

Sekcja i obrazowanie na żywo późnej embrionalnej gonady Drosophila

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do wykonywania na żywo obrazowania asymetrycznego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) w niszy jajnikowej Drosophila. Używamy linii transgenicznej, która wszechobecnie ulega ekspresji fuzji białka zielonej fluorescencji (GFP) białka spektrosomu Par-1.

Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster

Poznaj metodę obrazowania na żywo białek GFP w oocytach Drosophila przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Protokół umożliwia badanie dynamiki białek w żywych komórkach.

Obrazowanie na żywo białek znakowanych GFP w oocytach Drosophila

Przeglądaj więcej filmów