Obrazowanie na żywo białek znakowanych GFP w oocytach Drosophila

W tym protokole cyty wykazujące ekspresję białek znakowanych GFP są wycinane z samic muszki i obrazowane w celu zbadania ruchu białka w żywych komórkach. Najpierw przygotuj komorę obserwacyjną, przymocowując dwie szkiełka nakrywkowe do szkiełka za pomocą smaru silikonowego w celu utworzenia kanału. Boki kanału wyłożone są olejem węglowym halo.

Następnie wypreparuj jajniki samicy na kroplę olejku węglowego halo na szkiełku nakrywkowym. Następnie wyizoluj poszczególne cyty i odwróć szkiełko nakrywkowe nad kanałem w przygotowanym szkiełku, aby stworzyć komorę obserwacyjną. Po zlokalizowaniu cytów za pomocą optyki jasnego pola lub DIC, uchwyć obrazy cyfrowe w określonych odstępach czasu za pomocą mikroskopii konfokalnej i powiązanego oprogramowania.

Ostatecznie sekwencja poklatkowa wygenerowanych obrazów może być wykorzystana do monitorowania ruchu białek lub cząstek w żywych komórkach w czasie. Metoda ta może pomóc w badaniu kluczowych obszarów biologii komórkowej i rozwojowej, takich jak transport białek i mRNA oraz ustalanie polaryzacji komórek. Najpierw znieczul zdrowe muchy, które mają mniej niż tydzień i wybierz od 10 do 15 dużych samic z zaokrąglonymi kremowymi odwłokami.

Przenieś wybrane muchy i kilka samców do fiolki zawierającej nowy, lekko drożdżowy pokarm. Następnie wysiaduj muchy przez dwa dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aby się utuczyły. Tucz much zapewnia, że różne etapy, zwłaszcza stadium od ósmego do dwunastego, są dostępne do obrazowania much nieutuczonych lub słabo utuczonych much, które zwykle zawierają tylko bardzo wczesne stadia i dojrzałe cyty Za pomocą smaru silikonowego.

Przymocować dwa szkiełka nakrywkowe w odległości około jednego centymetra od siebie na standardowym szkiełku podstawowym. Używaj tylko tyle smaru, aby zapewnić dobre uszczelnienie między szkiełkiem nakrywkowym a suwakiem. Mocno dociśnij każde szkiełko nakrywkowe, aby cienko i równomiernie rozprowadzić smar.

Następnie dodaj trochę olejku z węgla świętego 27 do połączenia między szkiełkami nakrywkowymi i przesuń, aby zapobiec uszkodzeniu izolowanych cytów w kolejnych krokach. Teraz umieść dwie do trzech kropli oleju węglowego 27 na powierzchni szkiełka nakrywkowego o powierzchni 22 milimetrów kwadratowych. Następnie wypij pipetę do ust pojedynczej samicy z fiolki z jedzeniem i delikatnie zdeponuj w oleju halo Caron.

Za pomocą ostrych kleszczy preparacyjnych przypnij muchę do szkiełka nakrywkowego i oderwij czubek brzucha. Usuń jajniki, przeciągając je wzdłuż powierzchni szkiełka nakrywkowego pod olejem, aby zwiększyć przyleganie cytów do szkiełka nakrywkowego. Teraz delikatnie rozsuń jajniki, szukając cytów, które są co najmniej w stadium 10 B oogenezy.

Zidentyfikuj oocyty na tym etapie, szukając komór jajowych, w których oocyt zajmuje co najmniej 50 do 60% całkowitej objętości komory jajowej. Za pomocą kleszczy. Usuń pojedyncze oocyty z osłonki jajnika za pomocą jednej do trzech samic.

Kontynuuj izolowanie od pięciu do ośmiu nieuszkodzonych oocytów na szkiełku nakrywkowym. Następnie usuń bezużyteczną tkankę. Ostrożnie odwróć szkiełko nakrywkowe zawierające oocyty na wcześniej przygotowany szkiełko tak, aby cyty znalazły się między dwoma przekładkami.

I pamiętaj, nie naciskaj szkiełka nakrywkowego, ponieważ może to uszkodzić cyty, jeśli to konieczne, dodaj niewielką ilość oleju węglowego halo na krawędzie kanapki, aby upewnić się, że przestrzeń jest wypełniona. Zauważ, że w tym momencie oogenezy komórki pęcherzykowe leżące nad oocytem stały się koerowane i otaczają oocyt ze wszystkich stron, z wyjątkiem małego obszaru, w którym pozostają połączenia z komórkami pielęgniarskimi. Ustaw ostrość na oocycie za pomocą DIC lub optyki z kontrastem fazowym.

Zbadaj oocyt pod kątem oznak uszkodzenia, takich jak wyciek cytoplazmy lub wybrzuszenie komórek pęcherzykowych. Obrazuj tylko oocyty, które wydają się zdrowe i nieuszkodzone. Do bezpośredniego monitorowania przesyłania strumieniowego bez etykietowania GFP.

Ustaw obrazy przechwytywania w zakresie ZI zakresu zakresu z wyższymi ustawieniami wzmocnienia niż te używane dla białek znakowanych GFP. Wykorzystanie obiektywów pneumatycznych w celu znacznego zminimalizowania znoszenia i ruchu próbki. Uzyskaj przekroje optyczne tuż pod powierzchnią oocytu.

Gdy obszar zainteresowania jest ostry, wyłącz optykę jasnego pola i przełącz się na obrazowanie konfokalne za pomocą funkcji podglądu szybkiego skanowania w oprogramowaniu, dostosuj ostrość i wzmocnienie w razie potrzeby. Ustaw także parametry wzbudzenia, długości fali i długości fali emisji. W przypadku przechwytywania osi Z wybierz stałą oś Z z opóźnieniem 10 sekund między klatkami.

Po uchwyceniu typowej sekwencji poklatkowej od 20 do 50 klatek natychmiast przejrzyj i oceń jakość wideo. Ten pojedynczy obraz poklatkowy przedstawia oocyt w stadium 11. Ten oocyt wyrażający białko R TNL znakowane GFP może wytwarzać silny sygnał.

R TNL jeden wydaje się współlokalizować z długimi mikrotubulami obecnymi podczas op strumienia plazmowego. Zazwyczaj strumieniowanie plazmy op w komorze jajowej typu dzikiego jest widoczne jako zauważalny ruch autofluorescencyjnych pęcherzyków ylk, jak pokazano w maksymalnej projekcji pięciu klatek komory jajowej etapu 10 B. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować zdrowe żeńskie cyty wykazujące ekspresję białek oznaczonych GFP, jak przygotować próbki do obrazowania na żywo oraz jak nagrywać filmy poklatkowe fluorescencyjnych białek i cząstek.