Name: Procedura decelularyzacji serca świni przez wsteczną perfuzję wieńcową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Poznaj metodę decelularyzacji serca świni przez wsteczną perfuzję wieńcową w celu uzyskania macierzy pozakomórkowej. Technika ta umożliwia szybkie i kompletne usunięcie komponentów komórkowych z zachowaniem struktury tkanki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Brogan Guest, Michelle Weaver i Kristen Lippert. Finansowanie tego badania zostało zapewnione przez NIH Grant R03EB009237, a także NIH Training Grants T32EB001026-06 z National Institute of Biomedical Imaging And Bioengineering oraz T32HL076124-05.

1. Przygotowanie tkanek i konfiguracja eksperymentu
<ol>
	<li>Natychmiast po eutanazji należy pobrać narządy świń z rzeźni lub placówki badawczej i spłukać nadmiar krwi. Oczyść serce z nadmiaru tłuszczu i tkanki, utrzymując przedsionki i aortę w stanie nienaruszonym. Odetnij tłuszcz, aby oddzielić tętnicę płucną od aorty. Jeśli w tkance są jakiekolwiek skaleczenia, należy je odpowiednio wyrzucić.</li>
	<li>Zawiń każde serce pojedynczo w papier do zamrażania i przechowuj całą chusteczkę w zamrażarce o temperaturze -80 °C przez co najmniej 24 godziny, aby zapewnić całkowite zamrożenie.</li>
	<li>Gdy jest gotowy do użycia (zwykle krócej niż 3 miesiące), rozmrozić jedno nienaruszone zamrożone serce świni w wodzie typu 1 przez noc zanurzone w 4-litrowej zlewce w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po całkowitym rozmrożeniu serca osusz je, zważ serce i zapisz wagę. Serce świni o masie rynkowej powinno ważyć około 375-450 g.</li>
	<li>Podłącz rurkę Masterflex w rozmiarze 18 do końcówki 1/4" reduktora kolczastego. Włóż reduktor kolczasty i rurkę do aorty. Umieść 2 zaciski węża lub zabezpiecz opaski zaciskowe wokół aorty, tuż pod tułowiem ramienno-głowowym. Reduktor i rurka muszą pozostać nad zastawką aortalną, aby tętnice wieńcowe mogły być perfundowane (ryc. 1).</li>
	<li>Użyj strzykawki o pojemności 30 lub 60 ml, aby napełnić rurkę wodą typu I. Włożyć rurkę do wkładu pompy rolkowej Masterflex w jej przybliżonym punkcie środkowym. Zanurz końcówkę dopływową rurki w dnie 4-litrowej zlewki wypełnionej 2,5 l wody i zabezpiecz przewód.</li>
	<li>Umieść serce w zlewce wypełnionej wodą i zalej pompę, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Jeśli zaobserwuje się pęcherzyki wydobywające się z aorty, do której wprowadzana jest rurka, może być konieczna zmiana położenia aorty lub zabezpieczenie jej dodatkowymi opaskami. Hermetyczne uszczelnienie jest ważne dla utrzymania odpowiedniego ciśnienia podczas procesu decelularyzacji (ilustracja 2).</li>
	<li>Umieścić 4-litrową zlewkę zawierającą 3 litry 0,2% roztworu trypsyny/0,05% EDTA/0,05% NaN3 na płytce mieszającej i ogrzać ją do temperatury 37 °C w ramach przygotowań do procesu decelularizacji.</li>
</ol>
2. Płukanki do tkanek
<ol>
	<li>Ustaw pompę na natężenie przepływu 400 ml/min, upewniając się, że wybrano odpowiedni rozmiar rurki. Płucz serce wodą typu I przez 15-25 minut. Po uruchomieniu pompy serce powinno puchnąć i wylewać krew z komór. Świeży roztwór należy podmieniać co 5-10 minut lub w razie potrzeby w zależności od ilości krwi usuniętej z serca. Jeśli krew nie wypływa z serca, wyreguluj rurki i clamps w razie potrzeby.</li>
	<li>Zatrzymaj pompę i przenieś serce do osobnej zlewki wypełnionej 2X solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Po zanurzeniu rurki w roztworze uruchom pompę i zwiększ natężenie przepływu do 700 ml/min. Serce powinno pozostać w roztworze przez 15 minut, zmieniając roztwór co 5 minut. Każda zmiana roztworu wymaga tymczasowego zatrzymania pompy na czas przeniesienia tkanki i rurki do nowej zlewki.</li>
	<li>Przenieś serce do wody typu I na 10 minut i zwiększ natężenie przepływu do 750 ml/min.</li>
</ol>
3. Decelularyzacja i perfuzja roztworu
<ol>
	<li>Przenieść serce do zlewki zawierającej 0,2% trypsyny/0,05% EDTA/0,05% NaN3 w temperaturze 37 °C. Zwiększyć prędkość pompy do 1 200 ml/min i uruchomić pompę. Za pomocą mieszadła umieszczonego na dnie zlewki rozprowadzić w niej rozpuścić roztwór. Serce powinno pozostać w roztworze 0,2% trypsyny/0,05% EDTA/0,05% NaN3 w temperaturze 37 °C przez łącznie trzy godziny. Po 1 godzinie zwiększ prędkość pompy do 1 500 ml/min. Po dodatkowej godzinie zwiększyć prędkość pompy do 1 800 ml/min. Tkanka jest powoli poddawana zwiększonym prędkościom perfuzji, aby kondycjonować tkankę i zapobiec pękaniu naczyń. Serce puchnie i prawie podwoi swoją wielkość na tym etapie protokołu. Tkanka straci swój naturalny kolor, postępując od przedsionków do wierzchołka w całym protokole (ryc. 3).</li>
	<li>Po każdej perfuzji roztworu przeprowadza się dwuetapowe płukanie w celu usunięcia zanieczyszczeń komórkowych, pozostałości chemicznych i wspomagania lizy komórek. Każde płukanie składa się z 10-minutowego płukania w wodzie typu I, a następnie 10-minutowego płukania 2X roztworem PBS o temperaturze pokojowej. Każde płukanie polega na usunięciu roztworu z oryginalnej zlewki, dodaniu roztworów płuczących i rozprowadzeniu perfuzatu w zlewce zawierającej zanurzone serce. Po 0,2% roztworze trypsyny/0,05% EDTA/0,05% NaN3, należy przelać wodę z prędkością 1,900 ml / min, a następnie przelać 2X PBS z prędkością 1950 ml / min.</li>
	<li>Przenieść serce do roztworu 3% Triton X-100/0,05% EDTA/0,05% NaN3 w temperaturze pokojowej. Zwiększ prędkość pompy do 2 000 ml/min i uzyskuj roztwór przez godzinę. Wyjmij roztwór ze zlewki i zastąp go świeżym roztworem, zwiększ prędkość pompy do 2100 ml/min i perflejuj świeży roztwór przez dodatkowe półtorej godziny, uzyskując całkowity czas w 3% Triton X-100/0,05% EDTA/0,05% NaN od3 do 2,5 godziny.</li>
	<li>Płukać chusteczkę w wodzie typu I o stężeniu 2150 ml/min i 2X PBS o stężeniu 2180 ml/min przez 10 minut każde.</li>
	<li>Przenieś serce do 4% roztworu deoksycholanu sodu o temperaturze pokojowej. Zwiększ prędkość pompy do 2 200 ml/min i uzyskuj roztwór przez 3 godziny.</li>
	<li>Przepłukać tkankę w wodzie typu I o sile 2 200 ml / min przez 15 minut, zmieniając roztwory po 5-10 minutach dla każdego roztworu. Opisane etapy perfuzji można rozłożyć na kilka dni, wykonując dwukrotnie etap płukania i przechowując serce z dołączonym wężem przez noc w temperaturze 4 °C i zanurzone w wodzie typu I.</li>
	<li>Następnego dnia wykonaj 5-minutowe płukanie wodą typu I o stężeniu 750 ml/min, a następnie 5-minutowe płukanie w 1X PBS o stężeniu 1,500 ml/min. Protokół może być następnie kontynuowany przy opisanym natężeniu przepływu w odpowiednim roztworze.</li>
</ol>
4. Dezynfekcja i obróbka końcowa
<ol>
	<li>Przenieść serce do 0,1% roztworu kwasu nadoctowego/4% etanolu i roztworu perfuzyjnego przez 1,5 godziny przy 2,200 ml/min.</li>
	<li>Końcowe płukanie tkanki wykonuje się z prędkością 2 200 ml / min. Perfuzję tkanki za pomocą 1X PBS przez 15 minut, a następnie dwa 5-minutowe płukanie w wodzie typu I. Tę serię płukań powtarza się jeszcze raz w celu zakończenia procedury perfuzji roztworu.</li>
	<li>Wyłącz pompę i wyjmij serce z roztworu, aby opróżnić serce. Odetnij opaski z aorty, usuń wszystkie rurki i umieść serce w pustej zlewce, aby odsączyć przez 1 godzinę. Nadmiar płynu będzie musiał być okresowo spuszczany. Połóż serce na podkładce chłonnej, aby całkowicie opróżnić serce (ryc. 4).</li>
	<li>Po usunięciu większości wody zapisz masę macierzy zewnątrzkomórkowej serca (C-ECM). Można się spodziewać, że serce straci około 20-25% swojej początkowej masy podczas procesu decelularyzacji.</li>
	<li>Rozwiń prawą i lewą komorę, a także przegrodę komorową w celu ilościowego określenia DNA i przetwarzania histologicznego, aby potwierdzić całkowitą decelularyzację tkanki (ryc. 5).</li>
	<li>Zamrażać C-ECM w temperaturze -80 °C przez co najmniej 2 godziny przed liofilizacją.</li>
</ol>

<ol><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. , (2008).</li>
<li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329, 538-541 (2010).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. , (2010).</li>
<li>Wainwright, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+from+an+intact+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li>
<li>Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+tissue+and+organ+decellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Strategies for tissue and organ decellularization.</a> Journal of cellular biochemistry. , (2012).</li>
<li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).</li>
<li>Akhyari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quest+for+an+optimized+protocol+for+whole-heart+decellularization%3A+a+comparison+of+three+popular+and+a+novel+decellularization+technique+and+their+diverse+effects+on+crucial+extracellular+matrix+qualities%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).</li>
<li>Weymann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+perfusion+decellularization+porcine+heart+model--generation+of+3-dimensional+myocardial+neoscaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+journal+%3A+official+journal+of+the+Japanese+Circulation+Society%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model--generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds.</a> Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).</li>
<li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+acellular+natural+lung+matrix+on+murine+embryonic+stem+cell+differentiation+and+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).</li>
<li>Remlinger, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrated+xenogeneic+decellularized+tracheal+matrix+as+a+scaffold+for+tracheal+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction.</a> Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).</li>
<li>Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+hepatic+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+in+vitro+using+organ-specific+extracellular+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds.</a> Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).</li>
<li>Wainwright, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Right+ventricular+outflow+tract+repair+with+a+cardiac+biologic+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+tissues%2C+organs%22%5BJournal%5D)">Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold.</a> Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).</li>
</ol>

Dr Gilbert był członkiem Naukowej Rady Doradczej w ACell, Inc. podczas prowadzenia badania, a ostatnio został wiceprezesem ds. badań i rozwoju. ACell, Inc. sprzedaje matrycę pęcherza moczowego i nie ma żadnego komercyjnego interesu w niniejszym badaniu.

W obecnym badaniu opisano metodologię konsekwentnej i skutecznej decelularyzacji serca świni. Protokół był modyfikacją wcześniej opublikowanego raportu 1 i obejmował dłuższą ekspozycję na przepływ i zwiększone ciśnienie, co zapewniło bardziej powtarzalne wyniki. Uzyskana w ten sposób tkanka pozbawiona komórek spełniała wszystkie opublikowane kryteria udanej decelularyzacji tkanki 2. Przeprowadzano częste zmiany roztworu w celu ograniczenia ponownego wprowadzania materiału komórkowego do tkanki, a ...

<table><tbody><tr><td>Trypsyna</td><td>Gibco</td><td>15090</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002-500G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Fisher</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma</td><td>D6750-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas nadoctowy</td><td>Pfaltz i Bauer</td><td>P05020</td><td>35% CAS # 79-21-0</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Napęd pompy Masterflex</td><td>Cole Parmer</td><td>SI-07524-50</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Masterflex</td><td>Cole Parmer</td><td>96400-18</td><td>Rozmiar 18</td></tr><tr><td>Reduktor kolczasty</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-30612-20</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka 4L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540T</td><td></td></tr></tbody></table>

procedura decelularyzacji serca świni przez wsteczną perfuzję wieńcową

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Decelularyzacja całego narządu oparta na perfuzji zyskała ostatnio zainteresowanie w dziedzinie inżynierii tkankowej jako sposób na tworzenie specyficznych dla miejsca rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej, przy jednoczesnym zachowaniu natywnej architektury rusztowania. Do tej pory podejście to było stosowane w różnych układach narządów, w tym w sercu, płucach i wątrobie 1-5. Poprzednie metody decelularyzacji tkanek bez łatwo dostępnej sieci naczyniowej polegały na długotrwałym narażeniu tkanki na roztwory detergentów, kwasów lub zabiegów enzymatycznych jako sposób na usunięcie składników komórkowych i jądrowych z otaczającego środowiska zewnątrzkomórkowego6-8. Jednak skuteczność tych metod zależała od zdolności roztworów do przenikania do tkanki poprzez dyfuzję. Natomiast perfuzja narządów przez naturalny układ naczyniowy skutecznie zmniejszała odległość dyfuzji i ułatwiała transport środków decelularyzacyjnych do tkanek i składników komórkowych poza tkankę. W niniejszym artykule opisujemy metodę pełnej decelularyzacji nienaruszonego serca świni poprzez wsteczną perfuzję wieńcową. W wyniku protokołu uzyskano w pełni zdekomórkowane rusztowanie macierzy zewnątrzkomórkowej serca (c-ECM) z nienaruszoną trójwymiarową strukturą serca. W naszej metodzie wykorzystano szereg enzymów, detergentów i kwasów w połączeniu z hipertonicznymi i hipotonicznymi płukankami, aby wspomóc lizę i usuwanie komórek. W protokole wykorzystano roztwór trypsyny do odłączenia komórek od macierzy, a następnie roztwory Triton X-100 i deoksycholanu sodu, aby pomóc w usunięciu materiału komórkowego. Opisany protokół wykorzystuje również prędkości perfuzji większe niż 2 l/min przez dłuższy czas. Wysokie natężenie przepływu w połączeniu ze zmianami roztworu umożliwiło transport środków do tkanki bez zanieczyszczenia resztek komórkowych i zapewniło skuteczne płukanie tkanki. Opisana metoda usunęła cały materiał jądrowy z natywnej tkanki serca świni, tworząc specyficzne dla danego miejsca rusztowanie ECM serca, które można wykorzystać do różnych zastosowań.

Wpływ decelularyzacji na całe serca świńskie naturalnie różni się ze względu na różnice w wielkości, ciśnieniu i układzie naczyń. W związku z tym dokładny skład uzyskanych rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej nie będzie taki sam dla każdego serca. Zakończenie opisanego protokołu pozwoli uzyskać serce o białym lub półprzezroczystym wyglądzie, co wskazuje na utratę materiału komórkowego. Powszechnie przyjmuje się jednak, że tkankę można uznać za „zdecelularyzowaną” na podstawie kombinacji kilku dodatkowych parametrów iloś...

Opisano metodę szybkiego i całkowitego usuwania składników komórkowych z nienaruszonego serca świni poprzez wsteczną perfuzję. Metoda ta pozwala uzyskać specyficzne dla miejsca rusztowanie macierzy zewnątrzkomórkowej serca, które może być stosowane w wielu zastosowaniach klinicznych.

Procedura decelularyzacji serca świni przez wsteczną perfuzję wieńcową

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Ogólnym celem tej procedury jest szybkie i całkowite usunięcie składników komórkowych z nienaruszonego serca świni poprzez wsteczną obfitość, aby uzyskać specyficzne dla miejsca rusztowanie macierzy zewnątrzkomórkowej serca. Osiąga się to poprzez pierwszą kaniulację aorty nienaruszonego serca świni. Następnie rurkę podłącza się do pompy perystaltycznej, a tkankę przemywa się roztworami wody i soli o niskich natężeniach przepływu.Serce jest następnie perfundowane serią detergentów i roztworów enzymatycznych o stopniowo rosnącym natężeniu przepływu w celu usunięcia składników komórkowych. Ostatnim krokiem jest perfuzja roztworu dezynfekującego. Usuń rurkę i odetnij ścianki komór do obróbki.Ostatecznie serce jest analizowane w celu potwierdzenia całkowitego usunięcia materiału komórkowego i jądrowego z tkanki. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy kaniulacji i początkowej obfitości są trudne do nauczenia, ponieważ dokładna pozycja rurki jest kluczem do sukcesu eksperymentu. Narząd świni jest pozyskiwany z rzeźni lub placówki badawczej natychmiast po eutanazji.Zacznij od spłukania nadmiaru krwi. Następnie przytnij serce z nadmiaru tłuszczu i tkanki, pozostawiając przedsionki i aortę w stanie nienaruszonym. Oddziel tętnicę płucną od aorty, odcinając dodatkowy tłuszcz.Po przycięciu zawiń każde serce pojedynczo w papier do zamrażania i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej 24 godziny, aby zapewnić całkowite zamrożenie. Gdy będzie gotowe do użycia, rozmrozić serce, zanurzając je w czterolitrowej zlewce wypełnionej wodą typu pierwszego i pozostawić na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po całkowitym rozmrożeniu serca osusz je i zapisz jego wagę.Serce świni o masie rynkowej powinno ważyć około 375 do 450 gramów. Gdy serce będzie gotowe, podłącz elastyczną rurkę Master w rozmiarze 18 do ćwierćcalowego końca reduktora kolczastego. Następnie włóż reduktor kolczasty i rurkę do aorty.Umieść dwa węże clamps lub zabezpiecz opaski zaciskowe wokół aorty tuż pod tułowiem ramienno-głowowym. Reduktor i rurka muszą pozostać nad zastawką aortalną, aby tętnice wieńcowe mogły być perfundowane. Następnie za pomocą strzykawki napełnij rurkę wodą typu pierwszego i włóż ją do wkładu głównej pompy rolkowej flex w przybliżonym punkcie środkowym.Następnie zanurz końcówkę dopływową rurki wraz z sercem na dnie zlewki wypełnionej 2,5 litra wody i zabezpiecz. Najtrudniejszymi aspektami tej procedury są prawidłowa kaniulacja serca i utrzymanie odpowiednich prędkości pompowania przez cały czas trwania zabiegu. Sukces w naszym eksperymencie zapewniamy poprzez wizualną kontrolę tkanki pod kątem pęcherzyków powietrza przez cały czas trwania zabiegu, a także utrzymanie prawidłowego wysięku z komór przez cały czas trwania zabiegu.Zalać pompę, aby usunąć pęcherzyki powietrza z rurki, zmienić położenie lub zabezpieczyć dodatkowe opaski wokół aorty i rurki, jeśli zaobserwuje się pęcherzyki powietrza. Hermetyczne uszczelnienie jest ważne dla utrzymania odpowiedniego ciśnienia podczas procesu decelularyzacji. W tym momencie ogrzej czterolitrową zlewkę zawierającą trzy litry roztworu trypsyny o zrównoważonym roztworze soli w ramach przygotowań do procesu decelularyzacji.Najpierw ustaw pompę na natężenie przepływu 400 mililitrów na minutę i upewnij się, że wybrano odpowiedni rozmiar rurki. Uruchom pompę i przepłucz serce wodą typu pierwszego przez 15 do 25 minut, serce powinno puchnąć i rozproszyć krew z komór, świeży roztwór należy zastępować co pięć do 10 minut lub w razie potrzeby. Po usunięciu krwi należy zatrzymać pompę i przenieść serce do osobnej zlewki wypełnionej dwoma XPB.Zanurz rurkę. Zwiększ natężenie przepływu do 700 mililitrów na minutę i uruchom pompę. Pozostaw serce w roztworze na 15 minut, zmieniając roztwór co pięć minut.Gdy będziesz gotowy, przenieś serce do typu jednej wody na 10 minut i zwiększ natężenie przepływu do 750 mililitrów na minutę. Aby rozpocząć proces decelularyzacji, przenieś serce do zlewki zawierającej ciepły roztwór próbny równoważący sól. Zwiększ prędkość do 1200 mililitrów na minutę i uruchom pompę.Umieść mieszadło na dnie zlewki do cyrkulacji i pozostaw serce w tym roztworze na trzy godziny. Prędkości perfuzji są powoli zwiększane, aby kondycjonować tkankę i zapobiegać pękaniu naczyń. Po godzinie zwiększ prędkość pompy do 1500 mililitrów na minutę.Po dodatkowej godzinie prędkość pompy zwiększa się do 1800 mililitrów na minutę. Serce powinno spuchnąć i prawie podwoić swoją wielkość. Tkanka powinna stracić swój naturalny kolor, przechodząc od przedsionków do wierzchołka.Po każdej perfuzji roztworu przeprowadza się dwuetapowe płukanie w celu usunięcia zanieczyszczeń komórkowych, pozostałości chemicznych i wspomagania lizy komórek Po zrównoważonych wyzwoleniach soli i roztworze należy przelać wodę z prędkością 1900 mililitrów na minutę, a następnie dwa XPBS z prędkością 1950 mililitrów na minutę przez 10 minut każdy. Następnie przenieś serce do roztworu soli Triton X 100 o temperaturze pokojowej. Zwiększ prędkość pompy do 2000 mililitrów na minutę i wykonuj przez godzinę.Po napełnieniu świeżym roztworem zwiększ prędkość pompy do 2100 mililitrów na minutę i wytapiaj przez dodatkowe półtorej godziny. Następnie spłucz chusteczkę, jak pokazano wcześniej, ale ze zwiększoną prędkością pompy. Następna perfuzja odbywa się w temperaturze pokojowej 4% deoksycoate sodu.Zwiększ prędkość pompy do 2200 mililitrów na minutę i perfuzuj przez trzy godziny. Po trzech godzinach powtórz etapy płukania, zmieniając roztwory po pięciu do 10 minutach dla każdego roztworu. Po końcowej perfuzji przenieś serce do 0,1% kwasu paracetynowego, 4% roztworu etanolu i wykonuj przez 1,5 godziny z prędkością 2200 mililitrów na minutę przy tej samej prędkości pompy, perfunduj tkankę jednym XPBS przez 15 minut, a następnie wykonaj dwa pięciominutowe płukania w wodzie typu pierwszego.Powtórz jeszcze raz, aby zakończyć procedurę perfuzji roztworu, wyłącz pompę i wyjmij serce z roztworu. Odetnij krawaty od aorty. Usuń wszystkie rurki i umieść serce w pustej zlewce, aby odsączyć je na godzinę.Okresowo usuwaj nadmiar płynu po godzinie. Połóż serce na chłonnym podkładzie, aby dalej odsączyć. Po usunięciu większości wody zapisz ostateczną wagę serca.Serce może stracić około 20 do 25% swojej początkowej wagi podczas procesu decelularyzacji. Pod koniec tego procesu serce powinno wydawać się białe lub półprzezroczyste, co wskazuje na utratę materiału komórkowego. Następnie przegroda komorowa oraz prawa i lewa komora są oddzielane i rezerwowane dla DNA.Kwantyfikacja i przetwarzanie histologiczne zamrażają próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na co najmniej dwie godziny przed liofilizacją. O udanej decelularyzacji świadczy tutaj znaczny spadek zawartości DNA w porównaniu z komorami natywnymi. Żel ten pokazuje, że w bezkomórkowych komorach pozostało niewiele resztkowego DNA w porównaniu z macierzą pęcherza moczowego lub UBM.W tym przykładzie barwienie hemat toiną i eozyną pokazuje całkowite usunięcie materiału jądrowego z komór. Barwienie Massona dodatkowo potwierdza utratę wiązek mięśnia sercowego i zachowanie sieci kolagenowych podczas próby tej procedury. Ważne jest, aby często sprawdzać wzrokowo tkankę i naczynia wieńcowe.

procedure-for-decellularization-porcine-heart-retrograde-coronary

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Procedura decelularyzacji świńskiego serca przez retrogradową perfuzyję wieńcową

W tym filmie wykonujemy retrogradacyjną perfuzję Langendorffa izolowanego serca myszy. Podczas zabiegu czynność serca jest utrzymywana poprzez jego wsteczne perfuzję roztworem perfuzyjnym przez tętnice wieńcowe za pomocą kaniuli wprowadzanej do aorty wstępującej. Model służy do badania patofizjologii serca serca.

Wsteczna perfuzja serca Langendorffa: technika ex vivo perfuzji izolowanego serca myszy

W tym filmie opisujemy krok po kroku protokół pobierania serca z modelu świni do przeszczepu serca.

Wycięcie serca świni: protokół ekstrakcji serca świni do przeszczepu serca

Ten film opisuje technikę ex situ do konserwacji izolowanego serca świni poprzez perfuzję za pomocą natlenionego, bogatego w składniki odżywcze roztworu perfuzatu. Technika ta pozwala na kompleksową ocenę wydolności serca w warunkach fizjologicznych.

Perfuzja serca ex situ: technika zachowania izolowanej funkcji serca świni

Ta metoda umożliwia decelularyzację złożonego stałego organu przy użyciu prostego protokołu opartego na szoku osmotycznym i perfuzji jonowego detergentu przy minimalnym naruszeniu macierzy narządu. Obejmuje on nowatorską technikę decelularyzacji ludzkich serc w woreczku ciśnieniowym z monitorowaniem w czasie rzeczywistym dynamiki przepływu i odpływu zanieczyszczeń komórkowych.

Decellularyzacja całego ludzkiego serca w woreczku ciśnieniowym w orientacji odwróconej

Normothermic ex situ heart perfusion (ESHP), utrzymuje serce w bijącym, półfizjologicznym stanie. W przypadku wykonywania w trybie roboczym ESHP daje możliwość przeprowadzenia zaawansowanych ocen funkcji serca dawcy i żywotności narządów. W tym miejscu opisujemy naszą metodę oceny wydolności mięśnia sercowego podczas ESHP.

Normothermiczna perfuzja serca ex situ w trybie pracy: ocena czynności serca i metabolizmu

Tutaj opisujemy przedkliniczny model ortotopowego przeszczepu serca na dużych zwierzętach (świniach), który został mocno ugruntowany i wykorzystany do zbadania nowych strategii kardioprotekcyjnych.

Przedkliniczny model ortotopowego przeszczepiania serca od świń

Opracowaliśmy prostąmetodę izolowania wysokiej jakości pojedynczych komórek serca myszy za pomocą techniki perfuzji antegrade. Metoda ta nie zawiera metody Langendorffa i jest przydatna do izolowania miocytów komorowych i przedsionkowych lub komórek śródmiąższowych, takich jak fibroblasty serca lub komórki progenitorowe.

Metoda perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy

Przedstawiamy protokół wykorzystania normotermicznego systemu perfuzji krwi ex vivo do dostarczania środków terapeutycznych do całego alloprzeszczepu serca w heterotopowym modelu przeszczepu serca u świń.

Protokół heterotopowego przeszczepu serca u świń w celu dostarczenia leków do alloprzeszczepu serca

Protokół opisuje chirurgiczne pobieranie i późniejszą decelularyzację unaczynionych płatów świńskich poprzez perfuzję detergentu z dodecylosiarczanu sodu przez unaczynienie płata w dostosowanym bioreaktorze perfuzyjnym.

Pobieranie i perfuzja-decelularyzacja unaczynionych płatów świń w niestandardowym bioreaktorze perfuzyjnym

Badania przesiewowe w kierunku choroby wieńcowej mogłyby zwiększyć liczbę dawców serc z rozszerzonymi kryteriami. Protokół wykonywania powtarzalnej koronarografii podczas perfuzji serca ex-situ opisano w niniejszym dokumencie na modelu świniowym.

Koronarografia podczas perfuzji serca ex situ w modelu świni

Protokół tutaj opisuje model przeszczepu serca o wysokiej jakości wieprzowinki po oddaniu serca po śmierci krążeniowej, wykorzystujący perfuzję przeszczepu ex vivo .

Model o wysokiej wierności wieprzi ortotopowej transplantacji serca po oddaniu po śmierci krążenia

Poznaj metodę decelularyzacji serca świni przez wsteczną perfuzję wieńcową w celu uzyskania macierzy pozakomórkowej. Technika ta umożliwia szybkie i kompletne usunięcie komponentów komórkowych z zachowaniem struktury tkanki.

Procedura decelularyzacji serca świni przez wsteczną perfuzję wieńcową

Przeglądaj więcej filmów