Staphylococcus aureus (gronkowiec złocisty) Wzrost przy użyciu ludzkiej hemoglobiny jako źródła żelaza

Eksperyment ten testuje zdolność Staphylococcus aureus do wykorzystywania ludzkiej hemoglobiny jako jedynego źródła żelaza. Najpierw wyizoluj czerwone krwinki ze świeżej ludzkiej krwi. Oczyść hemoglobinę za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, aby zapewnić integralność hemoglobiny.

Teraz dodaj hemoglobinę do pożywki zubożonej w żelazo, aby dostarczyć żelazo w postaci hemoglobiny Następna kultura. S reus. W obecności hemoglobiny i zmierz jej zdolność do wykorzystania hemoglobiny jako źródła żelaza.

Wyniki pokazują, że reus rozprzestrzenia się w obecności hemoglobiny jako jedynego źródła żelaza. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii, takie jak to, czy patogen może wykorzystywać białka gospodarza jako źródło żelaza i jakie mechanizmy są wymagane do wykorzystania żelaza w tym procesie. Tak więc ta metoda może dostarczyć wglądu w pozyskiwanie żelaza przez gronkowca z hemoglobiny.

Można go również zastosować do badań nad innymi bakteriami i tym, jak wykorzystują białka zawierające żelazo od gospodarza. Tę technikę zademonstrują GLA Ani i Catherine Haley z mojego laboratorium. Po pierwsze, uzyskaj świeżo wyizolowaną krew ludzką, uzupełnioną antykoagulantem i utrzymuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cały czas oczyszczania Osadzaj czerwone krwinki przez wirowanie przez 20 minut w temperaturze 15 000 Gs. Ostrożnie odessaj snat i delikatnie ponownie zawieś osad w lodowatym, 0,9% roztworze chlorku sodu Po trzech płukaniach, resus, zawiesić osad w jednej objętości lodowatego 10-milimolowego triss, HCL do wychwytywania erytrocytów za pomocą ciśnienia osmotycznego.

Następnie dodaj toluen do 20% końcowej objętości i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze przez noc. Następna wirówka. Lizat w ilości 20 000 g na godzinę.

Zbierz środkową frakcję hemolizatu, pozostawiając górną warstwę toluenu i osad nienaruszony. Przepuścić hemolizat przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,44 mikrometra. Jeśli roztwór zawiera cząstki stałe i nie może zostać przepuszczony przez filtr, powtórzyć wirowanie z dużą prędkością.

Teraz oczyść hemoglobinę za pomocą kolumny wymiany anionów do wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Użyj ruchomej fazy A 10 milimolowych tris, HCL i ruchomej fazy B 10 milimolowych tris, HCL plus 0,5 molowego chlorku sodu. Uruchom gradient rozpuszczalnika B od 0% do 100% w ciągu dwóch minut przy natężeniu przepływu dwóch mililitrów na minutę.

Monitorować elucję w oparciu o absorpcję przy 410 nanometrach i 280 nanometrach. Zbierz frakcję charakteryzującą się jaskrawoczerwonym kolorem i wyraźnym pikiem absorpcji. Elucję należy dializować w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami przez około 16 godzin.

Aby wysterylizować próbkę, przepuść ją przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrometra w celu określenia stężenia hemoglobiny. Przygotuj standardowe rozwiązania HP w PBS. Teraz wymieszać roztwory wzorcowe lub roztwory próbek z dwoma odczynnikami xra kins w stosunku jeden do jednego na 96-dołkowych płytkach po 15-minutowej inkubacji, zmierzyć absorbancję przy 540 nanometrach.

Wykreślić krzywą wzorcową i określić stężenie HP w próbkach od pięciu do 15 miligramów na mililitr. Wydajność to typowe podwielokrotności od 15 do 20 mikrogramów oczyszczonej próbki hemoglobiny na dwóch 15% żelach stronicowych STS. Zabarwić jeden z żeli i przenieść białka z innego żelu na błonę nitrocelulozową do immuno blot w celu zamrożenia hemoglobiny i przechowywać jeden mililitr podwielokrotności izolowanej hemoglobiny w ciekłym azocie z zamrożonej smugi S aureus na tryptyku, agarze sojowym i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 do 24 godzin.

Zaszczepić pojedyncze kolonie w pięciu mililitrach RPMI zawierających E-D-D-H-A i wyhodować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem w temperaturze 180 RP M przez noc. Osadzaj bakterie przez wirowanie przez pięć minut w temperaturze 7 500 Gs. Następnie Resus, zawiesić bakterie w RPMI zawierającym 0,5 milimola E-D-D-H-A i znormalizować do OD 600 około trzech. Następnie przygotuj N-R-P-M-I zawierający 2,5 mikrograma na mililitr, HB i 0,1 do jednego milimola E-D-D-H-A w celu chelatacji wolnego żelaza.

Teraz subkultura 10 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej w jednym mililitrze N-R-P-M-I plus E-D-D-H-A plus HP inkubuje kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza do 48 godzin z wytrząsaniem w temperaturze 180 RRP M co sześć do 12 godzin. Usuń 50 mikrolitrów mieszanki kulturowej ze 150 mikrolitrami PBS na 96-dołkowych płytkach i wykonaj odczyty OD 600. W tym oczyszczaniu hemoglobiny ludzkiej z hemolizatu metodą HPLC mierzy się chłonność eluatu przy długościach fal 280 i 410 nanometrów przy frakcji piątej zawierającej hemoglobinę.

Zazwyczaj uzyskuje się wydajność od pięciu do 15 miligramów hemoglobiny na mililitr na preparat. Oczyszczoną hemoglobinę analizowano za pomocą strony SDS w dwóch egzemplarzach, a żele były albo oznaczane białkami, albo przenoszone na nitrocelulozę i poddawane immunologicznemu osuszeniu. Następnie oczyszczona ludzka hemoglobina została przetestowana pod kątem zdolności do wspierania wzrostu dzikich typów asus i ASUS, które nie mają receptora hemoglobiny wymaganego do pozyskiwania żelaza pochodzącego z hemoglobiny.

Wzrost gęstości optycznej kultur w czasie wskazuje, że w N-R-P-M-I plus E-D-D-H-A plus hb dziki typ ASUS rozprzestrzenia się, ale mutant nie. W przeciwieństwie do tego, zdolność do wykorzystania uzupełnionego wolnego żelaza jest identyczna zarówno w odmianach dzikich, jak i zmutowanych, żaden z nich nie rozmnaża się przy braku źródła. W tym porównaniu pożywek uzupełnionych hemoglobiną oczyszczoną ze świeżej krwi lub liofilizowaną hemoglobiną, hemoglobina oczyszczona z krwi wymaga ISDB do wzrostu.

Podczas gdy hemofilizowana hemoglobina umożliwia proliferację mutanta ISDB Po opanowaniu właściwe oczyszczanie hemoglobiny można zakończyć w ciągu kilku godzin. Pamiętaj, że dawcy są potencjalnymi nosicielami patogenów przenoszonych przez krew, dlatego traktuj ludzką krew jako materiał niebezpieczny biologicznie.