Name: Staphylococcus aureus (gronkowiec złocisty) Wzrost przy użyciu ludzkiej hemoglobiny jako źródła żelaza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Poznaj metodę hodowli Staphylococcus aureus z wykorzystaniem ludzkiej hemoglobiny jako jedynego źródła żelaza. Technika ta pozwala badać mechanizmy pozyskiwania żelaza przez patogeny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty Publicznej Służby Zdrowia Stanów Zjednoczonych AI69233 i AI073843 z Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych. E.P.S. jest stypendystą Burroughs Wellcome Fellow w dziedzinie patogenezy chorób zakaźnych. K.P.H. został sfinansowany z grantu Cellular and Molecular Microbiology Training Program 5 T32 A107611-10.

1. Oczyszczanie hemoglobiny ze świeżej krwi
<ol>
	<li>Zdobądź świeżą ludzką krew uzupełnioną antykoagulantem. Krew powinna być utrzymywana na lodzie lub w temperaturze 4 °C przez cały czas oczyszczania.</li>
	<li>Odwirowywać krew przez 20 minut przy 1 500 x g. Czerwone krwinki (RBC) będą znajdować się na dnie probówki. Ostrożnie odessać supernatant i delikatnie zawiesić osad w lodowatym roztworze NaCl o stężeniu 0,9% (w/v). Powtórz wirowanie i umyj 3 razy.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 objętości lodowatego 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Spowoduje to lizę erytrocytów z powodu ciśnienia osmotycznego. Dodaj toluen do ~ 20% końcowej objętości.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4 °C na rożnie przez noc.</li>
	<li>Odwirować lizat przy 20 000 x g przez 1 godzinę. Zebrać środkową frakcję hemolizatu, pozostawiając toluen (unoszący się na wierzchu) i osad nietknięte. Użyj pipety z długą szyjką, aby zebrać środkową frakcję.</li>
	<li>Przepuścić przez filtr strzykawkowy 0,44 μm. Jeśli roztwór zawiera cząstki stałe i nie może zostać przepuszczony przez filtr, powtórz krok 1.5.</li>
	<li>Oczyść hemoglobinę (Hb) za pomocą kolumny anionowymiennej do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) (Varian, PL-SAX 1,000 Å 8 μm, 150 mm × 4,6 mm). Faza ruchoma A to 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), a faza ruchoma B to 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 0,5 M NaCl. Gradient 0%-100% rozpuszczalnika B jest prowadzony przez 2 minuty przy natężeniu przepływu 2,0 ml/min. Elucja jest monitorowana na podstawie absorpcji (λ: 410 nm i 280 nm). Zbierz tylko frakcję charakteryzującą się jaskrawoczerwonym kolorem i wyraźnym pikiem absorpcji (ryc. 1).</li>
	<li>Odcień należy dializować w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez noc, a następnie ponownie przez kilka godzin. Sterylizować, przepuszczając przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.</li>
	<li>Aby zmierzyć stężenie Hb, należy przygotować wzorcowe roztwory Hb o znanych stężeniach w PBS. Oznaczyć stężenie Hb w próbce, mieszając roztwory wzorcowe (patrz tabela z zastosowanymi odczynnikami) lub roztwór próbki z 2x odczynnikiem Drabkina (przygotowanym z proszku) w stosunku 1:1. Na przykład, zmieszaj 100 μl roztworu Hb ze 100 μl 2x odczynnik Drabkina na 96-dołkowych płytkach. Inkubować przez 15 minut i mierzyć absorbancję przy 540 nm. Wykreślić krzywą wzorcową i oznaczyć stężenie Hb w próbce. Typowe są plony od pięciu do piętnastu mg/ml.</li>
	<li>Uruchom 15-20 μg oczyszczonej hemoglobiny na 15% SDS-PAGE w dwóch egzemplarzach. Plamić jeden z żeli; przenieść białka z innego żelu na błonę nitrocelulozową i immunoblot dla hemoglobiny (ryc. 2).</li>
	<li>Zamrozić i przechowywać 1 ml podwielokrotności hemoglobiny w ciekłym azocie.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pożywki wzrostowej zubożonej w żelazo
<ol>
	<li>Przygotuj bulion Roswell Park Memorial Institute (RPMI), rozpuszczając proszek RPMI w wodzie, dodając wodorowęglan sodu zgodnie z zaleceniami producenta i 1% kassaaminokwasów (CA) (w/v). Sterylizować, przechodząc przez filtr 0,2 μm i przechowywać w lodówce.</li>
	<li>Przygotuj zubożone w metale RPMI (NRPMI), dodając 7% (w/v) Chelex 100 i mieszając przez noc na talerzu mieszającym. Chelex 100 należy usunąć przez filtr 0,2 μm i przechowywać w lodówce. Pożywki uzupełniające niezbędnymi metalami nieżelaznymi: 25 μM ZnCl2, 25 μM MnCl2, 100 mM CaCl2 i 1 mM MgCl2 przygotowane wcześniej jako sterylny roztwór 1,000x. Na tym etapie użyj jednorazowych plastikowych pojemników, aby uniknąć zanieczyszczenia żelazem z materiałów wielokrotnego użytku.</li>
</ol>
3. Wzrost Staphylococcus aureus przy użyciu hemoglobiny jako jedynego źródła żelaza
<ol>
	<li>Smuga S. aureus do izolacji na agarze sojowym tryptycznym (TSA) z zamrożonego bulionu. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20-24 godziny.</li>
	<li>Zawiesić etylenodiamino-N,N'-bis(kwas 2-hydroksyfenylooctowy) (EDDHA) w bezwodnym etanolu do 100 mM. EDDHA nie przechodzi do roztworu, ale jest sterylizowany etanolem.</li>
	<li>Dodaj EDDHA do RPMI do końcowego stężenia 0,5 mM. Pozwól EDDHA rozpuścić się przez co najmniej 30 minut przed przejściem do następnego kroku. Ze względu na różnice między partiami, końcowe stężenie EDDHA może wymagać obniżenia do 0,25 mM, aby umożliwić rozwój bakterii.</li>
	<li>Zaszczepić pojedyncze kolonie S. aureus w 5 ml RPMI zawierającym EDDHA w 15 ml stożkowych probówkach z nakrętką gwintowaną. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem z prędkością 180 obrotów na minutę (obr./min) przez 16-20 godzin.</li>
	<li>Odwirować nocne kultury przez 5 minut przy 7 500 x g i ponownie zawiesić osad w NRPMI zawierającym 0,5 mM EDDHA. Normalizuj OD600 do ~3.</li>
	<li>Przygotować NRPMI zawierający 2,5 μg na ml Hb i 0,1-1,0 mM EDDHA. Ze względu na różnice między partiami, stężenie EDDHA wymagane do chelatowania wolnego żelaza w NRPMI może się różnić.</li>
	<li>Subkultura: 10 μl zawiesiny bakteryjnej z etapu 3,5 do 1 ml NRPMI + EDDHA + Hb w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Inkubować kultury w temperaturze 37 °C przez okres do 48 godzin, wytrząsając przy 180 obr./min lub na bębnie toczącym.</li>
	<li>Co 6-12 godzin wykonuj odczyty OD600, usuwając 50 μl kultury i mieszając ją ze 150 μl PBS w 96-dołkowych płytkach.</li>
</ol>

<ol><li>Mazmanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+of+heme-iron+across+the+envelope+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus.</a> Science. 299, 906-909 (2003).</li>
<li>Pishchany, G., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+for+blood%3A+hemoglobin+as+a+nutrient+source+for+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens.</a> PLOS Pathogens. 8, e1002535(2012).</li>
<li>Haley, K. P., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+battle+for+iron%3A+host+sequestration+and+Staphylococcus+aureus+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+infection.+Institut+Pasteur%22%5BJournal%5D)">A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition.</a> Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).</li>
<li>Krishna Kumar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+hemoglobin+capture+by+Staphylococcus+aureus+cell-surface+protein%5BTitle%5D)+AND+%22IsdH.+The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein.</a> IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).</li>
<li>Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-coordinating+tyrosine+is+a+key+determinant+of+NEAT+domain+heme+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer.</a> Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).</li>
<li>Villareal, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+weak+protein-protein+complexes+transfer+heme+across+the+cell+wall+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).</li>
<li>Muryoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+the+iron-regulated+surface+determinant+%28Isd%29+heme+transfer+pathway+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus.</a> J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).</li>
<li>Reniere, M. L., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+haem+oxygenases+are+differentially+regulated+by+iron+and+haem%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem.</a> Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+hemin+transfer+from+IsdA+to+IsdC+in+the+iron-regulated+surface+determinant+%28Isd%29+heme+acquisition+system+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus.</a> J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).</li>
<li>Pishchany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+for+human+hemoglobin+enhances+Staphylococcus+aureus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection.</a> Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).</li>
<li>Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+the+Staphylococcus+aureus+heme+iron+transport+components+IsdA+and+IsdB%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB.</a> Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).</li>
<li>Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+IsdB+is+a+hemoglobin+receptor+required+for+heme+iron+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization.</a> J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).</li>
<li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IsdA+and+IsdB+antibodies+protect+mice+against+Staphylococcus+aureus+abscess+formation+and+lethal+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge.</a> Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).</li>
<li>Cheng, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+requirements+for+Staphylococcus+aureus+abscess+formation+and+persistence+in+host+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues.</a> Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).</li>
<li>Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+ions+in+biological+catalysis%3A+from+enzyme+databases+to+general+principles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Inorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles.</a> J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).</li>
<li>Weinberg, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+availability+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Iron availability and infection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790, 600-605 (2009).</li>
<li>Drabkin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+the+Hemin+Chromoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Metabolism of the Hemin Chromoproteins.</a> Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).</li>
<li>Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD163%3A+a+signal+receptor+scavenging+haptoglobin-hemoglobin+complexes+from+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).</li>
<li>Torres, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+Fur+regulates+the+expression+of+virulence+factors+that+contribute+to+the+pathogenesis+of+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia.</a> Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).</li>
<li>Hammer, N. D., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+of+Staphylococcus+aureus+Iron+Acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition.</a> Annu. Rev. Microbiol. , (2011).</li>
<li>Hurd, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iron-regulated+surface+proteins+IsdA%2C+IsdB%2C+and+IsdH+are+not+required+for+heme+iron+utilization+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Fems.+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus.</a> Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).</li>
<li>Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetric+behavior+of+hemoglobin+alpha-+and+beta-+subunits+during+acid-induced+denaturation+observed+by+electrospray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry.</a> Biochemistry. 46, 10675-10684 (2007).</li>
<li>Williams, R. C. Jr, Tsay, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+convenient+chromatographic+method+for+the+preparation+of+human+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin.</a> Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).</li>
<li>Shen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+unmodified+human+adult+hemoglobin+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).</li>
<li>Manjula, B. N., Acharya, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+molecular+analysis+of+hemoglobin+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography.</a> Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).</li>
<li>Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+envelope+proteins+related+to+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial envelope proteins related to iron.</a> Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).</li>
<li>Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+regulated+outer+membrane+proteins+of+Escherichia+coli%3A+variations+in+expression+due+to+the+chelator+used+to+restrict+the+availability+of+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron.</a> Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).</li>
<li>Rogers, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-Binding+Catechols+and+Virulence+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli.</a> Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Żelazo jest niezbędnym składnikiem odżywczym potrzebnym organizmom ze wszystkich królestw życia15. U kręgowców żelazo jest sekwestrowane, aby uniknąć toksyczności spowodowanej przez ten pierwiastek. Ta sekwestracja ukrywa również żelazo przed atakującymi drobnoustrojami w procesie znanym jako odporność odżywcza16. W odpowiedzi patogeny wyewoluowały strategie, które omijają odporność odżywczą. Jeden z takich mechanizmów opiera się na hemoglobinie, która jest najobfitszym źródłem żelaza w organizmie g...

<table><tbody><tr><td>Kolumna wymiany anionów HPLC</td><td>Varian</td><td>PL1551-3802</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Drabkina</td><td>Sigma</td><td>D5941-6VL</td><td></td></tr><tr><td>Wzorzec hemoglobiny</td><td>Pointe Scientific</td><td>H7506-STD</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>HyClone</td><td>SH30011.02</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100 forma sodu</td><td>Sigma</td><td>C7901</td><td></td></tr><tr><td>EDDHA</td><td>LGC Standards GmbH</td><td>ANC 001</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko hemoglobinie A</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc</td><td>SC-21005</td><td></td></tr><tr><td>Tryptyczny agar sojowy</td><td>BD</td><td>236920</td><td></td></tr></tbody></table>

staphylococcus aureus (gronkowiec złocisty) wzrost przy użyciu ludzkiej hemoglobiny jako źródła żelaza

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus to bakteria chorobotwórczy, która potrzebuje żelaza do wykonywania ważnych funkcji metabolicznych i wywoływania chorób. Najobfitszym rezerwuarem żelaza wewnątrz ludzkiego gospodarza jest hem, który jest kofaktorem hemoglobiny. Aby pozyskać żelazo z hemoglobiny, S. aureus wykorzystuje skomplikowany system znany jako system determinantów powierzchni regulowanych żelazem (Isd)1. Składniki układu Isd najpierw wiążą hemoglobinę gospodarza, następnie ekstrahują i importują hem, a na końcu uwalniają żelazo z hemu w cytoplazmie bakteryjnej2,3. Szlak ten został przeanalizowany w licznych badaniach in vitro 4-9. Co więcej, udział systemu Isd w infekcji został wielokrotnie wykazany w modelachmysich 8,10-14. Ustalenie udziału systemu Isd w pozyskiwaniu i wzroście żelaza pochodzącego z hemoglobiny okazało się większym wyzwaniem. Testy wzrostu wykorzystujące hemoglobinę jako jedyne źródło żelaza są skomplikowane ze względu na niestabilność dostępnej na rynku hemoglobiny, zanieczyszczenie wolnego żelaza w pożywce wzrostowej oraz toksyczność związaną z chelatorami żelaza. Poniżej przedstawiamy metodę, która pozwala przezwyciężyć te ograniczenia. Wysokiej jakości hemoglobina jest przygotowywana ze świeżej krwi i jest przechowywana w ciekłym azocie. Oczyszczona hemoglobina jest uzupełniana do pożywki zubożonej w żelazo, naśladującej środowisko ubogie w żelazo, z którym spotykają się patogeny wewnątrz gospodarza kręgowców. Pozbawiając S. aureus wolnego żelaza i uzupełniając go minimalnie zmanipulowaną formą hemoglobiny, indukujemy wzrost w sposób, który jest całkowicie zależny od zdolności do wiązania hemoglobiny, ekstrakcji hemu, przepuszczania hemu przez otoczkę komórki bakteryjnej i degradacji hemu w cytoplazmie. Test ten będzie przydatny dla naukowców dążących do wyjaśnienia mechanizmów pozyskiwania żelaza pochodzącego z hemoglobiny/hemu w S. aureus i prawdopodobnie innych patogenach bakteryjnych.

Oczyszczono ludzką hemoglobinę z hemolizatu za pomocą techniki HPLC (krok protokołu 1.7). Rycina 1 przedstawia zarejestrowaną absorbancję eluatu przy długościach fal 280 i 410 nm. Zebrano frakcję 5, a pozostałe frakcje odrzucono. Zazwyczaj uzyskuje się wydajność od pięciu do piętnastu miligramów hemoglobiny na mililitr eluatu. Oczyszczoną hemoglobinę analizowano metodą SDS-PAGE w dwóch powtórzeniach, a żele barwiono na obecność białek lub przeniesiono na membranę nitrocelulozową i poddano immunoblotingow...

Tutaj opisujemy test wzrostu Staphylococcus aureus przy użyciu hemoglobiny jako jedynego źródła dostępnego składnika odżywczego żelaza. Test ten określa rolę czynników bakteryjnych zaangażowanych w pozyskiwanie żelaza pochodzącego z hemoglobiny.

Staphylococcus aureus (gronkowiec złocisty) Wzrost przy użyciu ludzkiej hemoglobiny jako źródła żelaza

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Eksperyment ten testuje zdolność Staphylococcus aureus do wykorzystywania ludzkiej hemoglobiny jako jedynego źródła żelaza. Najpierw wyizoluj czerwone krwinki ze świeżej ludzkiej krwi. Oczyść hemoglobinę za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, aby zapewnić integralność hemoglobiny.Teraz dodaj hemoglobinę do pożywki zubożonej w żelazo, aby dostarczyć żelazo w postaci hemoglobiny Następna kultura. S reus. W obecności hemoglobiny i zmierz jej zdolność do wykorzystania hemoglobiny jako źródła żelaza.Wyniki pokazują, że reus rozprzestrzenia się w obecności hemoglobiny jako jedynego źródła żelaza. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii, takie jak to, czy patogen może wykorzystywać białka gospodarza jako źródło żelaza i jakie mechanizmy są wymagane do wykorzystania żelaza w tym procesie. Tak więc ta metoda może dostarczyć wglądu w pozyskiwanie żelaza przez gronkowca z hemoglobiny.Można go również zastosować do badań nad innymi bakteriami i tym, jak wykorzystują białka zawierające żelazo od gospodarza. Tę technikę zademonstrują GLA Ani i Catherine Haley z mojego laboratorium. Po pierwsze, uzyskaj świeżo wyizolowaną krew ludzką, uzupełnioną antykoagulantem i utrzymuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cały czas oczyszczania Osadzaj czerwone krwinki przez wirowanie przez 20 minut w temperaturze 15 000 Gs. Ostrożnie odessaj snat i delikatnie ponownie zawieś osad w lodowatym, 0,9% roztworze chlorku sodu Po trzech płukaniach, resus, zawiesić osad w jednej objętości lodowatego 10-milimolowego triss, HCL do wychwytywania erytrocytów za pomocą ciśnienia osmotycznego.Następnie dodaj toluen do 20% końcowej objętości i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze przez noc. Następna wirówka. Lizat w ilości 20 000 g na godzinę.Zbierz środkową frakcję hemolizatu, pozostawiając górną warstwę toluenu i osad nienaruszony. Przepuścić hemolizat przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,44 mikrometra. Jeśli roztwór zawiera cząstki stałe i nie może zostać przepuszczony przez filtr, powtórzyć wirowanie z dużą prędkością.Teraz oczyść hemoglobinę za pomocą kolumny wymiany anionów do wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Użyj ruchomej fazy A 10 milimolowych tris, HCL i ruchomej fazy B 10 milimolowych tris, HCL plus 0,5 molowego chlorku sodu. Uruchom gradient rozpuszczalnika B od 0% do 100% w ciągu dwóch minut przy natężeniu przepływu dwóch mililitrów na minutę.Monitorować elucję w oparciu o absorpcję przy 410 nanometrach i 280 nanometrach. Zbierz frakcję charakteryzującą się jaskrawoczerwonym kolorem i wyraźnym pikiem absorpcji. Elucję należy dializować w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami przez około 16 godzin.Aby wysterylizować próbkę, przepuść ją przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrometra w celu określenia stężenia hemoglobiny. Przygotuj standardowe rozwiązania HP w PBS. Teraz wymieszać roztwory wzorcowe lub roztwory próbek z dwoma odczynnikami xra kins w stosunku jeden do jednego na 96-dołkowych płytkach po 15-minutowej inkubacji, zmierzyć absorbancję przy 540 nanometrach.Wykreślić krzywą wzorcową i określić stężenie HP w próbkach od pięciu do 15 miligramów na mililitr. Wydajność to typowe podwielokrotności od 15 do 20 mikrogramów oczyszczonej próbki hemoglobiny na dwóch 15% żelach stronicowych STS. Zabarwić jeden z żeli i przenieść białka z innego żelu na błonę nitrocelulozową do immuno blot w celu zamrożenia hemoglobiny i przechowywać jeden mililitr podwielokrotności izolowanej hemoglobiny w ciekłym azocie z zamrożonej smugi S aureus na tryptyku, agarze sojowym i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 do 24 godzin.Zaszczepić pojedyncze kolonie w pięciu mililitrach RPMI zawierających E-D-D-H-A i wyhodować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem w temperaturze 180 RP M przez noc. Osadzaj bakterie przez wirowanie przez pięć minut w temperaturze 7 500 Gs. Następnie Resus, zawiesić bakterie w RPMI zawierającym 0,5 milimola E-D-D-H-A i znormalizować do OD 600 około trzech. Następnie przygotuj N-R-P-M-I zawierający 2,5 mikrograma na mililitr, HB i 0,1 do jednego milimola E-D-D-H-A w celu chelatacji wolnego żelaza.Teraz subkultura 10 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej w jednym mililitrze N-R-P-M-I plus E-D-D-H-A plus HP inkubuje kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza do 48 godzin z wytrząsaniem w temperaturze 180 RRP M co sześć do 12 godzin. Usuń 50 mikrolitrów mieszanki kulturowej ze 150 mikrolitrami PBS na 96-dołkowych płytkach i wykonaj odczyty OD 600. W tym oczyszczaniu hemoglobiny ludzkiej z hemolizatu metodą HPLC mierzy się chłonność eluatu przy długościach fal 280 i 410 nanometrów przy frakcji piątej zawierającej hemoglobinę.Zazwyczaj uzyskuje się wydajność od pięciu do 15 miligramów hemoglobiny na mililitr na preparat. Oczyszczoną hemoglobinę analizowano za pomocą strony SDS w dwóch egzemplarzach, a żele były albo oznaczane białkami, albo przenoszone na nitrocelulozę i poddawane immunologicznemu osuszeniu. Następnie oczyszczona ludzka hemoglobina została przetestowana pod kątem zdolności do wspierania wzrostu dzikich typów asus i ASUS, które nie mają receptora hemoglobiny wymaganego do pozyskiwania żelaza pochodzącego z hemoglobiny.Wzrost gęstości optycznej kultur w czasie wskazuje, że w N-R-P-M-I plus E-D-D-H-A plus hb dziki typ ASUS rozprzestrzenia się, ale mutant nie. W przeciwieństwie do tego, zdolność do wykorzystania uzupełnionego wolnego żelaza jest identyczna zarówno w odmianach dzikich, jak i zmutowanych, żaden z nich nie rozmnaża się przy braku źródła. W tym porównaniu pożywek uzupełnionych hemoglobiną oczyszczoną ze świeżej krwi lub liofilizowaną hemoglobiną, hemoglobina oczyszczona z krwi wymaga ISDB do wzrostu.Podczas gdy hemofilizowana hemoglobina umożliwia proliferację mutanta ISDB Po opanowaniu właściwe oczyszczanie hemoglobiny można zakończyć w ciągu kilku godzin. Pamiętaj, że dawcy są potencjalnymi nosicielami patogenów przenoszonych przez krew, dlatego traktuj ludzką krew jako materiał niebezpieczny biologicznie.

staphylococcus-aureus-growth-using-human-hemoglobin-as-an-iron-source

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Rozrost Staphylococcus aureus z wykorzystaniem ludzkiego hemoglobiny jako źródła żelaza

Ogólny protokół badania inwazji komórek gospodarza przez patogen bakteryjny, skupiający się na Staphylococcus aureus oraz ludzkich komórkach śródbłonka.

Inwazja komórek ludzkich przez patogen bakteryjny

Źródło: Gupta, S., et al. Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki o ograniczonej zawartości żelaza. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje procedurę hodowli Mycobacterium tuberculosis w warunkach ograniczonych żelazem w celu wywołania stresu żelazowego i promowania wydzielania sideroforów, które wspierają przeżycie bakterii.

Hodowla prątków gruźlicy w warunkach ograniczonych żelazem

Źródło: Maurakis, S., et al. Ograniczony metalem wzrost Neisseria gonorrhoeae w celu scharakteryzowania genów reagujących na metale i pozyskiwania metali z ligandów gospodarza. J. Vis. Exp. (2020).Ten film przedstawia test wzrostu bakterii z ograniczoną ilością metalu w celu zbadania roli genów reagujących na metale. Dzikie i zmutowane bakterie hodowane w pożywce zubożonej w metale są inkubowane z metalem-ligandem, a ich wzrost jest monitorowany za pomocą czytnika płytek. W warunkach zubożenia...

Test wzrostu bakterii z ograniczoną ilością metali w celu zbadania roli genów reagujących na metale

Źródło: Behera, R.K. i in., Metoda oparta na fluorescencji na badaniu regulacji genów bakteryjnych w tkankach zakażonych. J. Vis. Exp. (2019)Ten film prezentuje przygotowanie hemolitycznych hodowli gronkowca aureus , aby standaryzować wzrost bakterii i osiągnąć synchronizację metaboliczną w badaniach interakcji gospodarz-patogen.

Przygotowanie hodowli gronkowca aureusa hemolitycznego do badań interakcji gospodarz z patogenem

W tym filmie demonstrujemy test do wykrywania cytotoksyczności zjadliwych i mniej zjadliwych szczepów Staphylococcus aureus przeciwko ludzkim neutrofilom po fagocytozie za pomocą cytometrii przepływowej.

Test cytotoksyczności szczepów Staphylococcus aureus na neutrofilach po fagocytozie

Tutaj opisujemy protokół ekstrakcji metabolitów ze Staphylococcus aureus i ich późniejszej analizy za pomocą chromatografii cieczowej i spektrometrii mas.

Podejście oparte na tandemowej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas do analizy metabolitów Staphylococcus aureus

Opisana tutaj jest metoda analizy ekspresji genów bakteryjnych w tkankach zwierzęcych na poziomie komórkowym. Metoda ta stanowi źródło do badania różnorodności fenotypowej występującej w populacji bakterii w odpowiedzi na środowisko tkankowe podczas infekcji.

Oparta na fluorescencji metoda badania regulacji genów bakteryjnych w zakażonych tkankach

Opisujemy tutaj metodę hodowli Neisseria gonorrhoeae w płynnym pożywce z ograniczoną zawartością metali, aby ułatwić ekspresję genów do pobierania metali. Przedstawiamy również dalsze eksperymenty mające na celu scharakteryzowanie fenotypu gonokoków hodowanych w tych warunkach. Metody te mogą być dostosowane tak, aby nadawały się do charakterystyki genów reagujących na metale u innych bakterii.

Ograniczony metalem wzrost Neisseria gonorrhoeae w celu scharakteryzowania genów reagujących na metale i pozyskiwania metali z ligandów gospodarza

Ten protokół ma na celu opisanie sposobu badania zakresu internalizacji Staphylococcus aureus i jego zdolności do przetrwania wewnątrz ludzkiej komórki gospodarza, a także wewnątrzkomórkowej skuteczności związków przeciwdrobnoustrojowych.

Ulepszony test ochrony enzymatycznej do badania internalizacji Staphylococcus aureus i wewnątrzkomórkowej skuteczności związków przeciwdrobnoustrojowych

W tym manuskrypcie udostępniamy kompleksowy protokół oceny przeżywalności antybiotyków dla Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus, przekształcając plazmidy w P. aeruginosa i S. aureus w celu stworzenia szczepów reporterowych i wizualizacji wariantów fenotypowych, takich jak uporczywe, za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej.

Obrazowanie heterogenicznych fenotypów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej

Poznaj metodę hodowli Staphylococcus aureus z wykorzystaniem ludzkiej hemoglobiny jako jedynego źródła żelaza. Technika ta pozwala badać mechanizmy pozyskiwania żelaza przez patogeny.

Staphylococcus aureus (gronkowiec złocisty) Wzrost przy użyciu ludzkiej hemoglobiny jako źródła żelaza

Przeglądaj więcej filmów