Name: Obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego limfocytów T (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Poznaj metodę obrazowania komórek na żywo w czasie rzeczywistym, która umożliwia badanie dynamiki białek podczas aktywacji limfocytów T. Wykorzystuje ona mikroskopię konfokalną i analizę obrazowania do ilościowego pomiaru tworzenia się kompleksów sygnalizacyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Sophii Fried za pomoc techniczną. MBS dziękuje następującym agencjom za wsparcie badawcze: Izraelskiej Fundacji Naukowej za granty nr 1659/08, 971/08, 1503/08 i 491/10, Ministerstwu Zdrowia i Nauki za granty nr 3-4114 i 3-6540, Izraelskiemu Stowarzyszeniu Walki z Rakiem za pośrednictwem Majątku zmarłego Alexandra Smidody oraz Fundacji Rodziny Taubenblatt za grant na doskonałość w dziedzinie biomedycyny.

1. Transfekcja komórek T
<ol>
	<li>Przygotować aktywowany roztwór Amaxa Nucleofector poprzez zmieszanie roztworu "Suplementu" z zestawu z roztworem Nucleofectora. Aktywowany roztwór może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do trzech miesięcy.</li>
	<li>Hoduj limfocyty T Jurkata w pożywce hodowlanej [10% płodowa surowica cielęca (FCS), 1% roztwór penicyliny-streptomycyny i 2 mM L-glutaminy w RPMI]. Optymalnie komórki należy zużyć 1-2 tygodnie po rozmrożeniu. Wykorzystanie kultur komórkowych we wzroście logarytmicznym ma kluczowe znaczenie dla wysokiej wydajności transfekcji i przeżycia komórek. Alternatywnie, z niewielkimi modyfikacjami, protokół ten może być stosowany z pierwotnymi limfocytami T, jak opisano wcześniej 8. Należy podkreślić, że ponieważ czas trwania procesu aktywacji pierwotnych limfocytów T jest dłuższy niż w przypadku limfocytów T Jurkat (~30 min), należy zastosować system inkubacji zamontowany na stoliku mikroskopowym, aby utrzymać poziomCO2, wilgotności i temperaturę przez cały proces aktywacji.</li>
	<li>Zebrać 5 × 106 limfocytów T z fazą logarytmiczną na transfekcję do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować komórki przez 7 minut w temperaturze 400 × g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Podczas wirowania przygotuj płytkę 6-dołkową. Napełnić jedną studzienkę na każdą transfekcję 5 ml pożywki hodowlanej i przeprowadzić wstępną inkubację w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zebrać probówki z wirówki i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml RPMI.</li>
	<li>Wirować komórki przez 7 minut w temperaturze 400 × g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Podczas wirowania przygotuj roztwór do transfekcji. W jednym dołku 96-dołkowej płytki wymieszać aktywowane 100 μl roztworu Amaxa Nucleofector przygotowanego w kroku 1 z 5 μg DNA interesującego plazmidu kodującego fluorescencyjnie znakowane białko. Optymalnie stężenie DNA powinno być większe niż 1 μg/ml, aby uniknąć rozcieńczania roztworu do transfekcji.</li>
	<li>Dobrze wymieszać delikatnym pipetowaniem.</li>
	<li>Po odwirowaniu komórek ostrożnie usunąć cały supernatant, nie naruszając osadu.</li>
	<li>Dwukrotnie odpipetować roztwór DNA/roztwór do transfekcji.</li>
	<li>Dodać roztwór DNA/transfekcji do osadu.</li>
	<li>Przenieś ogniwa do kuwety Axa.</li>
	<li>Włóż kuwetę do urządzenia Amaxa Nucleofector .</li>
	<li>Użyj ustawienia transfekcji H-10 Amaxa do elektroporacji (dla Jurkat) lub T-23 (dla pierwotnych limfocytów T).</li>
	<li>Wyjąć płytkę 6-dołkową z inkubatora.</li>
	<li>Po elektroporacji ostrożnie przenieść supernatant z zawiesiną komórek na płytkę 6-dołkową za pomocą pipety Pasteura. Może powstać osad składający się z resztek komórek. Unikaj przenoszenia granulki.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przenieść 2,5 ml zawiesiny komórkowej z każdej studzienki do nowej studzienki. Dodać 2,5 ml ciepłej pożywki hodowlanej (opisanej w kroku 2) do każdej studzienki.</li>
	<li>Po 72 godzinach przenieść komórki do sterylnej probówki i wirować przez 7 minut w temperaturze 400 × g w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i zastąpić go pożywką hodowlaną uzupełnioną antybiotykiem selekcyjnym odpowiednim dla zastosowanego plazmidu (zastosować stężenie odpowiednie dla zastosowanych antybiotyków; użyliśmy G418 i/lub higromycyny w stężeniach odpowiednio 1,3 mg/ml i/lub 0,2 mg/ml). Hoduj zawiesinę komórkową w świeżej studzience. Alternatywnie, komórki mogą być transfekowane przejściowo i obrazowane 48 godzin po transfekcji. Aby przygotować przejściowo transfekowane komórki, należy jednocześnie przetransfekować komórki z dwoma plazmidami w kroku 8, normalnie kontynuując do kroku 20, a następnie przejść bezpośrednio do kroku 23. Należy pamiętać, że w tym scenariuszu ogniwa powinny być używane natychmiast, a generalnie ich intensywność fluorescencji jest niejednorodna i niekoniecznie wysoka.</li>
	<li>Hoduj komórki za pomocą pożywki hodowlanej uzupełnionej odpowiednim antybiotykiem selekcyjnym. Podziel komórki i w razie potrzeby uzupełnij je pożywką hodowlaną uzupełnioną antybiotykiem.</li>
	<li>Po 2 tygodniach sprawdź, czy transfekcja przebiegła pomyślnie za pomocą FACS (sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją) w następujący sposób:</li>
	<li>Zbierz 106 transfekowanych komórek, 106 pozorowanych transfekowanych komórek (kontrola negatywna) i 106 komórek, o których wiadomo, że stabilnie wyrażają fluorescencyjnie znakowane białko. Jeśli komórki są transfekowane więcej niż jednym białkiem fluorescencyjnym (patrz krok 27), użyj wielu, pojedynczo oznakowanych linii komórkowych jako kontroli pozytywnej.</li>
	<li>Wirować komórki przez 7 minut w temperaturze 400 × g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić supernatant. Zawieś komórki w buforze FACS o pojemności 500 μl (PBS bez Ca2+ i Mg2+, 5% FCS, 0,05% azydku sodu).</li>
	<li>Użyj analitycznego FACS, aby zweryfikować fluorescencję komórkową. Porównaj fluorescencję transfekowanych komórek z fluorescencją kontroli negatywnej i pozytywnej.</li>
	<li>Aby transfekować komórki dodatkowym, znakowanym fluorescencyjnie białkiem, powtórz kroki 3-26 przy użyciu transfekowanych komórek.</li>
	<li>Należy stosować ogniwa wykazujące wysoki poziom fluorescencji. Optymalnie co najmniej 50% komórek w hodowli powinno być wysoce fluorescencyjnych. Fluorescencja komórek może być zwiększona przez sortowanie komórek za pomocą FACS.</li>
</ol>
Wszelkie dodatkowe oznaczone białka muszą być połączone z różnymi fluoroforami i zakodowane na plazmidach kodujących różne antybiotyki selekcyjne. Pożywka selekcyjna dla komórek transfekowanych więcej niż jednym plazmidem powinna być uzupełniona wszystkimi odpowiednimi antybiotykami.
2. Przygotowanie testu rozprzestrzeniania limfocytów T
<ol>
	<li>Stosować 4-komorowe szkiełka nakrywkowe Lab-Tek II German coverglass. Należy uważać, aby przypadkowo nie zarysować wewnętrznej powierzchni komór, np. końcówką pipety, podczas przygotowywania lub użytkowania.</li>
	<li>Przygotuj 50 ml roztworu do przygotowania szkiełek: Weź 4,6 ml 12 M (37%) HCl, dodaj 38,5 ml 100% etanolu i 6,9 ml podwójnie destylowanej wody.</li>
	<li>Napełnić każdą komorę szkiełka roztworem do przygotowywania szkiełek o stężeniu 500 μl.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Zassać komory, całkowicie je wysuszając.</li>
	<li>Inkubować odkryte szkiełka przez 1 godzinę w temperaturze 45 °C aż do całkowitego wyschnięcia.</li>
	<li>Przygotować 0,01% roztwór poli-L-lizyny, rozcieńczając 0,1% poli-L-lizyny (Sigma-Aldrich) w podwójnie destylowanej wodzie.</li>
	<li>Nanieść 500 μl na każdą komorę.</li>
	<li>Inkubować szkiełko przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zassać komory, całkowicie je wysuszając.</li>
	<li>Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 45 °C aż do całkowitego wyschnięcia.</li>
	<li>Szkiełka powlekane można przechowywać w suchym stanie przez kilka miesięcy w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować aktywujący roztwór przeciwciała. Użyj przeciwciała anty-CD3: HIT3a (BD Pharmingen, #555337) lub UCHT1 (BD Pharmingen, #555330), 10 μg/ml w 400 μl PBS na komorę. Roztwór ten należy przygotować na krótko przed przygotowaniem preparatu.</li>
	<li>Napełnij każdą komorę 400 μl roztworu przeciwciała aktywującego.</li>
	<li>Inkubować szkiełko przez 2 godziny w temperaturze 37 °C lub, najlepiej, przez noc, w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć aktywujący roztwór przeciwciała i natychmiast przemyć komorę dwukrotnie 300 μl PBS. Od tego momentu upewnij się, że komory pozostają wypełnione buforem.</li>
	<li>Przechowywać szkiełko wypełnione PBS w temperaturze 4 °C. Sugerujemy wykorzystanie przygotowanych komór szkiełkowych w ciągu 1 tygodnia.</li>
</ol>
3. Aktywacja i obrazowanie limfocytów T
<ol>
	<li>Przygotować bufor obrazowania [1,25 ml HEPES (1 M), 10 ml FCS, 38,75 ml RPMI bez czerwieni fenolowej]. Bufor obrazowania może być przechowywany w temperaturze 4 °C po filtracji.</li>
	<li>Aktywuj mikroskop Zeiss LSM 510 Meta. Rozgrzej podgrzewaną ramę montażową mikroskopu do 37 °C. Wybierz "Tryb eksperta".</li>
	<li>Kliknij zakładkę "Nabycie" i otwórz następujące zakładki: Lasery; Mikroskopia; Konfiguracja; Skanować; Szeregi czasowe.</li>
	<li>Aktywuj potrzebne lasery. W celu wzbudzenia mCFP i mYFP należy ustawić laser Argon/2 w trybie "czuwania" na 5 minut, a następnie w trybie "włączonym".</li>
	<li>Jeśli wykonałeś wcześniej ten test obrazowania żywych komórek przy użyciu tych samych fluoroforów, otwórz wynikowy plik LSM, kliknij ikonę "użyj ponownie" i kontynuuj od kroku 9. W przeciwnym razie kontynuuj od kroku 6.</li>
	<li>Zdefiniuj kanały za pomocą filtrów odpowiednich do wzbudzenia i emisji użytych białek fluorescencyjnych.</li>
	<li>W oknie "Kontrola skanowania" wybierz opcję stosu Z.</li>
	<li>Wprowadź następujące parametry skanowania: Liczba plasterków: 5; Interwał: 0,5 μm; Bieżący wycinek: 3.</li>
	<li>Przygotować cyfrową suchą kąpiel Accublock (Labnet) w temperaturze 37 °C w pobliżu mikroskopu.</li>
	<li>Ogrzać bufor obrazowania do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Przygotować zapisany preparat, zasysając PBS, zastępując go 600 μl ciepłego buforu do obrazowania.</li>
	<li>Inkubować szkiełko w temperaturze 37 °C. Przechowywać szkiełko w inkubatorze do etapu 13, przez co najmniej 15 minut.</li>
	<li>Zbierz 5 × 105 transfekowanych limfocytów T.</li>
	<li>Wirować komórki przez 2 minuty w temperaturze 400 × g.</li>
	<li>Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml ciepłym buforze obrazowania i przenieść je do 1,5 ml probówki Eppendorfa.</li>
	<li>Umieść probówkę w cyfrowej suchej kąpieli Accublock.</li>
	<li>Wyjmij podgrzane szkiełko z inkubatora i zamontuj je na rozgrzanej ramie montażowej mikroskopu.</li>
	<li>Kliknij ikonę "VIS".</li>
	<li>Wymieszać zawiesinę komórkową i usunąć 1-2 μl.</li>
	<li>Włożyć końcówkę pipety do bufora obrazowania znajdującego się nad dolną częścią szkiełka. Unikaj zarysowania zjeżdżalni.</li>
	<li>Zasiej komórki nad otworem obiektywu.</li>
	<li>Natychmiast zacznij wizualnie śledzić komórki fluorescencyjne w miarę ich opadania. Wybierz komórkę, która wyświetla wysoką fluorescencję w obu kanałach.</li>
	<li>Zanim komórka dotrze do powierzchni szkiełka, aktywuj tryb LSM.</li>
	<li>Przełącza tylko jeden laser wzbudzenia. Wybierz laser, dla którego masz kanał DIC.</li>
	<li>Ustaw wartość Zoom na 1. Kliknij ikonę "Szybki XY". Kliknij ikonę "Zatrzymaj". Za pomocą narzędzia Kadrowanie wybierz obszar zwrotu wyśrodkowany na komórce.</li>
	<li>Ustaw wartość Zoom na 3. Kliknij ikonę "Szybki XY", a następnie ręcznie ustaw fokus, aby optymalnie wyświetlić komórkę. Kliknij ikonę "Zatrzymaj".</li>
	<li>Przełącz wszystkie potrzebne lasery wzbudzenia.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie, klikając ikonę "StartT". Zobrazuj komórkę dla całego procesu rozprowadzania (zwykle 5 minut). Po zakończeniu kliknij ikonę "Zatrzymaj".</li>
	<li>Zapisz plik.</li>
	<li>Aby uzyskać dodatkowe komórki, kliknij ikonę "VIS". Jeśli istnieją komórki, które nie zetknęły się jeszcze z dnem szkiełka, przejdź do kroku 23. Unikaj obrazowania komórek, które już rozpoczęły proces rozprzestrzeniania się. W przeciwnym razie przejdź do kroku 32.</li>
	<li>Jeśli obserwowany obszar slajdu jest w większości pozbawiony komórek, dodaj kolejną porcję komórek (kontynuuj od kroku 20). W przeciwnym razie przejdź do kroku 33.</li>
	<li>Aby uzyskać dodatkowe komórki, przesuń suwak tak, aby obszar nad otworem obiektywu był pozbawiony komórek.</li>
	<li>Dodaj kolejną porcję komórek (i kontynuuj od kroku 20).</li>
	<li>Po wykonaniu wszystkich żądanych czynności obrazowania otwórz zapisany plik LSM.</li>
	<li>Kliknij "Galeria", "Czas + Z" i "Podzbiór".</li>
	<li>Wybierz odpowiedni zakres czasu i stos Z.</li>
	<li>Zapisz nowy plik.</li>
	<li>Wykonaj kroki 35-38 dla wszystkich plików obrazowania.</li>
</ol>
4. Analiza danych obrazowania
<ol>
	<li>Otwórz pliki LSM za pomocą oprogramowania Imaris (Bitplane AG, Zurych, Szwajcaria).</li>
	<li>Kliknij "Prześcignij". Kliknij menu "Przetwarzanie obrazu" i wybierz "Czas zamiany i Z". Pomoże to w prawidłowym przycięciu obrazu.</li>
	<li>Kliknij pasek narzędzi "Edytuj" i wybierz opcję "Przytnij 3D" z menu rozwijanego. Przytnij obraz tak, aby obejmował tylko obszar otaczający komórkę. Sugerujemy przycięcie kwadratu o wymiarach 300 × 300 pikseli wyśrodkowanego na komórce. Należy pamiętać, że kształt i położenie komórki mogą się zmieniać w czasie. Obserwując oś t, upewnij się, że komórka znajduje się w przyciętym obszarze we wszystkich punktach czasu.</li>
	<li>Kliknij menu "Przetwarzanie obrazu" i wybierz "Zamień czas i Z", aby przywrócić oryginalną separację czasową obrazu.</li>
	<li>Naciśnij przycisk "Coloc" na głównym pasku narzędzi. Wybierz "Dep. Build Time Dep. Coloc". Imaris automatycznie obliczy progi intensywności dla każdego kanału w każdym punkcie czasowym.</li>
	<li>Zobacz wyniki analizy kolokalizacji, wybierając opcję "Statystyki kanału". Wyeksportuj dane, klikając "Eksportuj".</li>
	<li>Powtórz kroki od 1 do 6 dla każdej obrazowanej komórki. Zalecamy przeanalizowanie w ten sposób co najmniej 50 komórek.</li>
	<li>Oblicz średni współczynnik kolokalizacji Pearsona i jego błąd standardowy lub odchylenie.</li>
</ol>

<ol><li>Viret, C., Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+and+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Immunogenet%22%5BJournal%5D)">MHC and T cell development.</a> Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).</li>
<li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+antimicrobial+peptides%3A+multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).</li>
<li>Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+cell+effector+and+memory+function+in+viral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).</li>
<li>Jager, D., Jager, E., Knuth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+tumour+antigens%3A+implications+for+antigen+specific+immunotherapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer.</a> J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).</li>
<li>Davis, M. M., Bjorkman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+antigen+receptor+genes+and+T-cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition.</a> Nature. 334, 395-402 (1988).</li>
<li>Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+cytoskeleton+in+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The actin cytoskeleton in T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).</li>
<li>Reicher, B., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+leading+from+the+T-cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton+network%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network.</a> FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).</li>
<li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+interactions+linking+the+T+cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton.</a> Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).</li>
<li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading%3A+a+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li>
<li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+colocalization+by+correlation%3A+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander%27s+overlap+coefficient%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry A. 77, 733-742 (2010).</li>
<li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).</li>
<li>Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosines+113%2C+128%2C+and+145+of+SLP-76+are+required+for+optimal+augmentation+of+NFAT+promoter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity.</a> J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).</li>
<li>Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Nck+with+tyrosine-phosphorylated+SLP-76+in+activated+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes.</a> Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).</li>
<li>Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cooperation+between+the+proteins+Nck+and+ADAP+is+fundamental+for+actin+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization.</a> Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).</li>
<li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+interactions+at+the+SLP-76+complex+are+critical+for+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization.</a> EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).</li>
<li>Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3(2012).</li>
</ol>

Nie mamy żadnych konfliktów interesów, które moglibyśmy ujawnić.

Regulacja i funkcja wielu procesów komórkowych zależy od tworzenia i kończenia interakcji białko-białko. Obrazowanie mikroskopowe umożliwia śledzenie w czasie rzeczywistym fluorescencyjnie znakowanych białek w żywych komórkach. Kolokalizacja znakowanych białek może sugerować bezpośrednią lub pośrednią interakcję między białkami i może być wykorzystana do wzmocnienia wyników uzyskanych metodami biochemicznymi, takimi jak immunoprecypitacja. W przeciwieństwie do metod biochemicznych, obrazowanie żywych komórek umożliwia ob...

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynnik/Materiał</td></tr><tr><td>Amaxa zestaw nukleofektorów ludzkich limfocytów T</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Anti CD3 (klon UCHT1) </td><td>Rurki BioLegend</td><td>300432</td><td></td></tr><tr><td>Falcon FACS</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Calbiochem</td><td>345810</td><td></td></tr><tr><td>Niemiecki system szkła nakrywkowego 4 komorowe szkiełka </td><td>Lab-Tek II</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Bio Lab</td><td>8410501</td><td></td></tr><tr><td>Hepes </td><td>Biological Industries</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Hygomycyna</td><td>Enzo</td><td>ALX-380-306</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina </td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna </td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna 0,1 % (w/v) w H2O</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R87589</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Sprzęt</silny> </td></tr><tr><td>Cyfrowa sucha kąpiel Accublock</td><td>Labnet</td><td>D1105A</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>Wirówka 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewana rama montażowa - Wkład grzewczy PS </td><td>PeCon</td><td>130-800-031</td><td></td></tr><tr><td>TempModule S (wymagany do podgrzewanej ramy montażowej)</td><td>Zeiss</td><td>411860-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do elektroporacji</td><td>Amaxa</td><td>Nucleofector I</td><td></td></tr><tr><td>Aktywowany fluorescencją sortownik komórek</td><td>Becton Dickinson</td><td>FACSVantage SE</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Bitplane</td><td>7.0.0</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego limfocytów t

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Ochrona przed chorobami zakaźnymi jest wspierana przez układ odpornościowy 1,2. Limfocyty T są głównymi koordynatorami układu odpornościowego, regulującymi aktywację i odpowiedzi wielu komórek odpornościowych 3,4. Aktywacja limfocytów T zależy od rozpoznania specyficznych antygenów wyświetlanych przez komórki prezentujące antygen (APC). Receptor antygenu limfocytów T (TCR) jest specyficzny dla każdego klonu komórek T i określa swoistość antygenu 5. Wiązanie TCR z antygenem indukuje fosforylację składników kompleksu TCR. Aby promować aktywację limfocytów T, sygnał ten musi zostać przetransdukowany z błony do cytoplazmy i jądra, inicjując różne kluczowe odpowiedzi, takie jak rekrutacja białek sygnałowych do TCR; APC (synapsa immunologiczna), ich aktywacja molekularna, przegrupowanie cytoszkieletu, zwiększenie wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i zmiany w ekspresji genów 6,7. Prawidłowa inicjacja i zakończenie sygnałów aktywujących ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej odpowiedzi limfocytów T. Aktywność białek sygnałowych zależy od tworzenia i kończenia interakcji białko-białko, modyfikacji potranslacyjnych, takich jak fosforylacja białek, tworzenie kompleksów białkowych, ubikwitylacja białek i rekrutacja białek do różnych miejsc komórkowych 8. Zrozumienie wewnętrznego działania procesu aktywacji limfocytów T ma kluczowe znaczenie zarówno dla badań immunologicznych, jak i zastosowań klinicznych.
Opracowano różne testy w celu zbadania interakcji białko-białko; jednak testy biochemiczne, takie jak szeroko stosowana metoda koimmunoprecypitacji, nie pozwalają na rozpoznanie lokalizacji białka, co uniemożliwia obserwację cennych spostrzeżeń na temat dynamiki mechanizmów komórkowych. Dodatkowo, te masowe testy zwykle łączą białka z wielu różnych komórek, które mogą znajdować się na różnych etapach badanego procesu komórkowego. Może to mieć szkodliwy wpływ na rozdzielczość czasową. Wykorzystanie obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym pozwala zarówno na przestrzenne śledzenie białek, jak i na możliwość czasowego rozróżniania zdarzeń sygnalizacyjnych, rzucając w ten sposób światło na dynamikę procesu 9,10. Przedstawiamy metodę obrazowania w czasie rzeczywistym powstawania kompleksu sygnalizacyjnego podczas aktywacji limfocytów T. Pierwotne limfocyty T lub linie komórek T, takie jak Jurkat, są transfekowane plazmidami kodującymi interesujące białka połączone z monomerycznymi białkami fluorescencyjnymi, zapobiegając niefizjologicznej oligomeryzacji 11. Żywe limfocyty T umieszcza się na szkiełku nakrywkowym wstępnie pokrytym przeciwciałem aktywującym limfocyty T 8,9, które wiąże się z kompleksem CD3 / TCR, indukując aktywację limfocytów T, jednocześnie pokonując potrzebę stosowania specyficznych antygenów aktywujących. Aktywowane komórki są stale obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Dane obrazowe są analizowane w celu uzyskania wyników ilościowych, takich jak współczynnik kolokalizacji białek sygnałowych.

Przedstawiamy przykład obrazowania i analizy żywych limfocytów T. Przed eksperymentem obrazowania limfocyty T z niedoborem SLP76 (J14) poddano analizie FACS w celu określenia ekspresji białek fluorescencyjnych (Rysunek 1). Limfocyty T przetransfekowane znakowanymi białkami sygnałowymi mCFP-Nck i SLP76-mYFP naniesiono na płytki aktywujące i obrazowano podczas rozprzestrzeniania się komórek T (Rysunek 2). Zebrane obrazy pokazują dynamikę lokalizacji białek podczas aktywacji i rozprzestrzen...

Opisujemy metodę obrazowania żywych komórek, która dostarcza wglądu w dynamikę białek podczas procesu aktywacji limfocytów T. Demonstrujemy połączone zastosowanie testu rozprzestrzeniania się komórek T, mikroskopii konfokalnej i analizy obrazowania w celu uzyskania wyników ilościowych w celu śledzenia tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego podczas aktywacji komórek T.

Obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego limfocytów T

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

real-time-live-imaging-of-t-cell-signaling-complex-formation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawienie w czasie rzeczywistym tworzenia się kompleksów sygnałowych limfocytów T

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Ten film demonstruje technikę in vitro do badania tworzenia synaps immunologicznych między pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a wspieranymi dwuwarstwami lipidowymi (SLB). Białka powierzchniowe limfocytów T oddziałują z odpowiednimi ligandami unieruchomionymi na SLB, tworząc synapsę immunologiczną, po której następuje ruch granulek litycznych w kierunku synapsy, co jest wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Technika in vitro do badania interakcji limfocytów T z obsługiwanymi płaskimi dwuwarstwami lipidowymi

Ten film demonstruje obrazowanie na żywych komórkach topologii synaps immunologicznych, badając interakcje między limfocytami T a komórkami nabłonkowymi przenoszącymi antygeny fluorescencyjne. Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia przemieszczenie czerwonej cytoplazmy i żółte pierścienie błonowe w komórkach śródbłonka, co wskazuje na tworzenie się synaps immunologicznych.

Ocena topologii synaps immunologicznych za pomocą obrazowania żywych komórek

Odporność adaptacyjna jest kontrolowana przez dynamiczne 'synapsy immunologiczne' utworzone między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Protokół ten opisuje metody badania komórek śródbłonka zarówno jako niedostatecznie zbadane fizjologiczne APC, jak i jako nowy typ "płaskiego komórkowego modelu APC".

Model płaskiej komórki śródbłonka do obrazowania dynamiki synaps immunologicznych

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Aby zbadać prędkości przepływu i kierunkowość aktyny nitkowatej w synapsie immunologicznej limfocytów T, obrazowanie super-rozdzielcze żywych komórek jest połączone z całkowitą fluorescencją wewnętrznego odbicia i określone ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazu.

Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Ten protokół opisuje opartą na obrazowaniu metodę aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego peptydu-MHC, umożliwiając precyzyjną czasoprzestrzenną kontrolę aktywacji limfocytów T.

Przestrzenna i czasowa kontrola aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego agonisty

Protokół opisuje technikę badania zdolności pierwotnych poliklonalnych ludzkich limfocytów T do tworzenia interfejsów synaptycznych za pomocą płaskich dwuwarstw lipidowych. Używamy tej techniki, aby pokazać zróżnicowaną zdolność tworzenia synaps ludzkich pierwotnych limfocytów T pochodzących z węzłów chłonnych i krwi obwodowej.

Ocena interfejsu synaptycznego pierwotnych ludzkich limfocytów T z krwi obwodowej i tkanki limfatycznej

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak używać mikroskopii świetlnej do czterowymiarowej wizualizacji dynamiki receptorów powierzchniowych w żywych komórkach. Tutaj pokazano receptory limfocytów T na pierwotnych limfocytach T CD4 +.

Czterowymiarowa wizualizacja dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej

Ten protokół obrazuje zarówno powstawanie synaps immunologicznych, jak i późniejszy spolaryzowany ruch wydzielniczy w kierunku synapsy immunologicznej. Koniugaty komórkowe utworzono między komórką Raji impulsową superantygenem (działającą jako komórka prezentująca antygen) a klonem Jurkat (działającym jako limfocyt T wspomagający efektor).

Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej

Tutaj udostępniamy kompleksowy protokół do rozwiązywania początkowych lokalnych sygnałów Ca2+, znanych jako mikrodomeny Ca2+, w pierwotnych mysich i ludzkich limfocytach T za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten służy jako cenne źródło informacji dla naukowców badających szlaki sygnałowe Ca2+ w komórkach odpornościowych i do dalszego odkrywania ich funkcji.

Obrazowanie początkowych mikrodomen Ca2+ w pierwotnych limfocytach T

Poznaj metodę obrazowania komórek na żywo w czasie rzeczywistym, która umożliwia badanie dynamiki białek podczas aktywacji limfocytów T. Wykorzystuje ona mikroskopię konfokalną i analizę obrazowania do ilościowego pomiaru tworzenia się kompleksów sygnalizacyjnych.

Obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego limfocytów T

Przeglądaj więcej filmów