Name: Izolacja i hodowla astrocytów korowych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Naucz się izolować i hodować czyste kultury astrocytów korowych myszy. Ta metoda wykorzystuje trypsynizację i orbitalne wytrząsanie do separacji komórek, zapewniając wysoką czystość preparatu do badań neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wspierane przez stypendium Fundacji Fazit dla absolwentów dla S.S., Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań (BMBF 01 EO 0803) dla K.B. oraz Grant Komisji Europejskiej FP7 PIRG08-GA-2010-276989, NEUREX oraz Niemiecka Fundacja Badawcza Grant SCHA 1442/3-1 dla C.S. Autorzy nie mają sprzecznych interesów finansowych.

1. Izolacja i posiewanie mieszanych komórek korowych
Mieszana izolacja komórek korowych dla kultur astrocytów może być przeprowadzona przy użyciu mysich szczeniąt P1 do P4. W celu uzyskania odpowiedniej gęstości astrocytów konieczne jest użycie 4 kory mózgowej młodych myszy na kolbę do hodowli tkankowej T75. Dlatego objętości w poniższym protokole są obliczane dla preparatu komórkowego przy użyciu 4 mysich szczeniąt.
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem procedury preparacji należy ogrzać 30 ml pożywki do hodowli astrocytów (DMEM, wysoka zawartość glukozy + 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej + 1% penicyliny/streptomycyny; patrz tabela) do temperatury 37 °C. Pokryć jedną kolbę T75 20 ml poli-D-lizyny (PDL) o stężeniu 50 μg/ml w wodzie o czystości do hodowli komórkowych przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .</li>
	<li>Do procedury preparacji przygotuj wszystkie niezbędne odczynniki i materiały. Potrzebne będą: nożyczki chirurgiczne, gładkie kleszcze drobnoziarniste, kleszczyki z płaską końcówką, ręczniki papierowe, worek na odpady, 70% etanolu i 2 naczynia preparacyjne (o średnicy 3,5 cm) na lodzie wypełnione po 2 ml HBSS każda.</li>
	<li>Delikatnie przytrzymaj i spryskaj głowę i szyję szczeniaka myszy 70% etanolem. Zwierzę składa się w ofierze przez ścięcie głowy za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w linii środkowej, od tyłu do przodu, wzdłuż skóry głowy, aby odsłonić czaszkę.</li>
	<li>Ostrożnie przeciąć czaszkę od szyi do nosa. Wykonuje się dwa dodatkowe cięcia, aby umożliwić dalszy dostęp do mózgu: pierwsze cięcie wykonuje się przed opuszkami węchowymi, drugie poniżej móżdżku, aby odłączyć czaszkę od podstawy czaszki.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy z płaską końcówką płaty czaszki są delikatnie odchylane na bok, a mózg jest wyjmowany i umieszczany w pierwszym naczyniu preparacyjnym wypełnionym HBSS. Umieść naczynie z powrotem na lodzie i kontynuuj zbieranie wszystkich 4 mózgów.</li>
	<li>Pozostała część procedury preparacji jest wykonywana pod mikroskopem stereoskopowym. Najpierw opuszki węchowe i móżdżek są usuwane za pomocą cienkich kleszczy preparacyjnych (ryc. 1B).</li>
	<li>Aby odzyskać korę, chwyć tylny koniec mózgu cienkimi kleszczami, wykonaj nacięcie w linii środkowej między półkulami, włóż drugi zestaw kleszczy do utworzonego zagajnika i oderwij płytkowatą strukturę kory od mózgu.</li>
	<li>Ostrożnie wypreparuj opony mózgowe z półkul kory, ciągnąc cienkimi kleszczami (ryc. 1D'). Ten etap pozwala uniknąć zanieczyszczenia końcowej hodowli astrocytów komórkami opon mózgowych i fibroblastami. Przenieś przygotowane półkule kory mózgowej do drugiego naczynia wypełnionego HBSS i umieść je z powrotem na lodzie. Kontynuuj odpowiednio ze wszystkimi 4 korami.</li>
	<li>Na koniec pokrój każdą półkulę kory na małe kawałki za pomocą ostrych ostrzy (około 4 do 8 razy).</li>
	<li>W sterylnych warunkach przenieś kawałki kory mózgowej do jednej probówki Falcon o pojemności 50 ml i dodaj HBSS do całkowitej objętości 22,5 ml.</li>
	<li>Dodać 2,5 ml 2,5 % trypsyny, wymieszać i inkubować tkankę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Mieszać od czasu do czasu wstrząsając co 10 minut.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 300 x g, aby otopić kawałki tkanki kory mózgowej.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant przez dekantację. W celu uniknięcia utraty osadu tkankowego, można go mechanicznie zatrzymać za pomocą pipety. Dysocjować tkankę na zawiesinę pojedynczej komórki, dodając 10 ml pożywki do posiewu astrocytów i energicznie pipetując za pomocą plastikowej pipety o pojemności 10 ml, aż fragmenty tkanki zostaną zdysocjowane na pojedyncze komórki (20 do 30 razy). Dostosuj objętość do 20 ml za pomocą pożywki do posiewu astrocytów. Możesz udowodnić dysocjację tkanki kory na pojedyncze komórki, licząc za pomocą hematocytometru. Jedno przygotowanie 4 kory mózgowej mysich szczeniąt powinno dać 10-15 x106 zdysocjowanych pojedynczych komórek.</li>
	<li>Odessać PDL z kolby hodowlanej T75, rozlać na płytkę zdysocjowaną zawiesinę jednokomórkową i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .</li>
</ol>
2. Uzyskanie wzbogaconej kultury astrocytów
<ol>
	<li>Zmienić pożywkę 2 dni po posiewie zmieszanych komórek korowych i wszystkie 3 dni później.</li>
	<li>Po 7 do 8 dniach, gdy astrocyty zlewają się ze sobą, a nakładający się mikroglej jest odsłonięty na warstwie astrocytów lub jest już odłączony od warstwy astrocytów (ryc. 2), potrząsaj kolbą T75 z prędkością 180 obr./min przez 30 minut na wytrząsarce orbitalnej, aby usunąć mikroglej. Odrzucić supernatant zawierający mikroglej lub, jeśli chcesz przeprowadzić hodowlę i zbadać mikroglej, odwirować go i płytkę do posiewu 28,29.</li>
	<li>Dodać 20 ml świeżej pożywki do hodowli astrocytów i kontynuować, potrząsając kolbą z prędkością 240 obr./min przez 6 godzin w celu usunięcia komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC). Ponieważ niektóre OPC nie odłączają się całkowicie od warstwy astrocytów, kontynuuj energiczne potrząsanie ręką przez 1 minutę, aby zapobiec zanieczyszczeniu OPC. Odrzucić supernatant lub odwirować go i pokryć płytką, jeśli chcesz hodować OPC 29.</li>
	<li>Przepłukać pozostałą warstwę zlewających się astrocytów dwukrotnie PBS, odessać PBS, dodać 5 ml trypsyny-EDTA i inkubować w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C. Sprawdzaj oderwanie astrocytów co 5 minut i wymuś oderwanie astrocytów, uderzając kolbą o dłoń (2-3 razy).</li>
	<li>Po odłączeniu astrocytów od kolby hodowlanej dodać 5 ml pożywki do hodowli astrocytów, wirować komórki pod ciśnieniem 180 x g przez 5 minut, aspirować supernatant i dodać 40 ml świeżej pożywki do posiewu astrocytów. Jedna kolba do hodowli tkankowej T75 powinna dać około 1x106 komórek po pierwszym podziale komórek. Umieścić komórki w dwóch kolbach hodowlanych T75 i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 . Zmieniaj podłoże co 2 do 3 dni.</li>
	<li>12-14 dni po pierwszym rozszczepieniu astrocyty są siane w odpowiednim stężeniu komórek 24-48 godzin przed wykonaniem eksperymentu. Jedna kolba do hodowli tkankowej T75 powinna dać około 1,5-2 x106 komórek po podziale drugiej komórki.</li>
</ol>

<ol><li>Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+roles+for+astrocytes%3A+redefining+the+functional+architecture+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain.</a> Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).</li>
<li>Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+energy+metabolism%3A+focus+on+astrocyte-neuron+metabolic+cooperation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation.</a> Cell Metab. 14, 724-738 (2011).</li>
<li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroscience%3A+Glia+-+more+than+just+brain+glue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroscience: Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457, 675-677 (2009).</li>
<li>Ballas, N., Lioy, D. T., Grunseich, C., Mandel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-cell+autonomous+influence+of+MeCP2-deficient+glia+on+neuronal+dendritic+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Non-cell autonomous influence of MeCP2-deficient glia on neuronal dendritic morphology.</a> Nat. Neurosci. 12, 311-317 (2009).</li>
<li>Jacobs, S., Nathwani, M., Doering, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+astrocytes+induce+developmental+delays+in+dendrite+maturation+and+synaptic+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fragile X astrocytes induce developmental delays in dendrite maturation and synaptic protein expression.</a> BMC Neurosci. 11, 132(2010).</li>
<li>Kaneko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+clear+the+path+of+astrocytic+processes+for+their+rapid+migration+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain.</a> Neuron. 67, 213-223 (2010).</li>
<li>Min, R., Nevian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+signaling+controls+spike+timing-dependent+depression+at+neocortical+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte signaling controls spike timing-dependent depression at neocortical synapses.</a> Nat. Neurosci. , (2012).</li>
<li>Eroglu, C., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+synaptic+connectivity+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of synaptic connectivity by glia.</a> Nature. 468, 223-231 (2010).</li>
<li>Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action-potential+modulation+during+axonal+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Action-potential modulation during axonal conduction.</a> Science. 331, 599-601 (2011).</li>
<li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+control+the+development+of+the+migration-promoting+vasculature+scaffold+in+the+postnatal+brain+via+VEGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via VEGF signaling.</a> J. Neurosci. 32, 1687-1704 Forthcoming.</li>
<li>Alvarez, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hedgehog+pathway+promotes+blood-brain+barrier+integrity+and+CNS+immune+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Hedgehog pathway promotes blood-brain barrier integrity and CNS immune quiescence.</a> Science. 334, 1727-1731 (2011).</li>
<li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).</li>
<li>Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctions+of+brain+endothelium+in+vitro+are+enhanced+by+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia.</a> J. Neurosci. 7, 3293-3299 (1987).</li>
<li>Gordon, G. R., Choi, H. B., Rungta, R. L., Ellis-Davies, G. C., MacVicar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+metabolism+dictates+the+polarity+of+astrocyte+control+over+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles.</a> Nature. 456, 745-749 (2008).</li>
<li>Silver, J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+beyond+the+glial+scar%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regeneration beyond the glial scar.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 146-156 (2004).</li>
<li>Schachtrup, C., Moan, N. L. e, Passino, M. A., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells+and+astrocytes%3A+Stars+of+scar+formation+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair.</a> Cell Cycle. 10, 1764-1771 (2011).</li>
<li>Schachtrup, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+triggers+astrocyte+scar+formation+by+promoting+the+availability+of+active+TGF-beta+after+vascular+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen triggers astrocyte scar formation by promoting the availability of active TGF-beta after vascular damage.</a> J. Neurosci. 30, 5843-5854 (2010).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> J. Neurosci. 22, 183-192 (2002).</li>
<li>Ogata, K., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+quantitative+analysis+of+astrocytes+in+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus.</a> Neuroscience. 113, 221-233 (2002).</li>
<li>Dabir, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+glutamate+transport+in+a+mouse+model+of+tau+pathology+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Impaired glutamate transport in a mouse model of tau pathology in astrocytes.</a> J. Neuroscience. 26, 644-654 (2006).</li>
<li>Wisniewski, H. M., Wegiel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+relationships+between+astrocytes+and+classical+plaque+components%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Spatial relationships between astrocytes and classical plaque components.</a> Neurobiol. Aging. 12, 593-600 (1991).</li>
<li>Shin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+mutant+huntingtin+in+glial+cells+contributes+to+neuronal+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of mutant huntingtin in glial cells contributes to neuronal excitotoxicity.</a> J. Cell Biol. 171, 1001-1012 (2005).</li>
<li>Wakabayashi, K., Hayashi, S., Yoshimoto, M., Kudo, H., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NACP%2Falpha-synuclein-positive+filamentous+inclusions+in+astrocytes+and+oligodendrocytes+of+Parkinson%27s+disease+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">NACP/alpha-synuclein-positive filamentous inclusions in astrocytes and oligodendrocytes of Parkinson's disease brains.</a> Acta Neuropathol. 99, 14-20 (2000).</li>
<li>Lioy, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+glia+in+the+progression+of+Rett%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A role for glia in the progression of Rett's syndrome.</a> Nature. 475, 497-500 (2011).</li>
<li>Quinlan, R. A., Brenner, M., Goldman, J. E., Messing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFAP+and+its+role+in+Alexander+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">GFAP and its role in Alexander disease.</a> Exp. Cell Res. 313, 2077-2087 (2007).</li>
<li>Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+damage+in+the+central+nervous+system%3A+a+multifaceted+role+for+vascular-derived+TGF-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular damage in the central nervous system: a multifaceted role for vascular-derived TGF-beta.</a> Cell Tissue Res. 347, 187-201 (2012).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Siao, C. J., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+plasminogen+activator+mediates+microglial+activation+via+its+finger+domain+through+annexin+II%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tissue plasminogen activator mediates microglial activation via its finger domain through annexin II.</a> J. Neurosci. 22, 3352-3358 (2002).</li>
<li>Armstrong, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+immature+oligodendrocyte+lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells.</a> Methods. 16, 282-292 (1998).</li>
<li>Cahoy, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J. Neurosci. 28, 264-278 (2008).</li>
<li>Anthony, T. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+folate+metabolic+enzyme+ALDH1L1+is+restricted+to+the+midline+of+the+early+CNS%2C+suggesting+a+role+in+human+neural+tube+defects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The folate metabolic enzyme ALDH1L1 is restricted to the midline of the early CNS, suggesting a role in human neural tube defects.</a> J. Comp. Neurol. 500, 368-383 (2007).</li>
<li>Skoff, R. P., Knapp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+astroblasts+and+oligodendroblasts+in+postnatal+rodent+brain%3A+evidence+for+separate+astrocyte+and+oligodendrocyte+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Division of astroblasts and oligodendroblasts in postnatal rodent brain: evidence for separate astrocyte and oligodendrocyte lineages.</a> Glia. 4, 165-174 (1991).</li>
<li>Molofsky, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+and+disease%3A+a+neurodevelopmental+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Astrocytes and disease: a neurodevelopmental perspective.</a> Genes Dev. 26, 891-907 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+heterogeneity%3A+an+underappreciated+topic+in+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 20, 588-594 (2010).</li>
<li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71, 799-811 (2011).</li>
<li>Jungblut, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+living+primary+astroglial+cells+using+the+new+GLAST-specific+monoclonal+antibody+ACSA-1%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1.</a> Glia. 60, 894-907 (2012).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Opisana tutaj metoda opiera się na przygotowaniu hodowli astrocytów z mózgów noworodków gryzoni, pierwotnie opisanej przez McCarthy'ego i de Vellisa w 1980 roku. Przedstawiona tutaj zmodyfikowana metoda izolacji i hodowli astrocytów korowych z postnatalnej myszy P1 do P4 jest szybka, daje czyste astrocyty pierwotne i jest wysoce odtwarzalna. Technikę tę można łatwo przenieść do izolacji astrocytów od innych gatunków, takich jak szczury lub świnie oraz od innych obszarów mózgu, takich jak rdzeń kręgowy. Podczas...

Astrocyty są bardzo licznym typem komórek w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Stosunek astrocytów do neuronów wynosi 1:3 w korze myszy i szczurów, podczas gdy w ludzkiej korze 1 na neuron przypada 1,4 astrocytów. Zainteresowanie funkcją astrocytów dramatycznie wzrosło w ostatnich latach. Kluczową funkcją astrocytów jest ich rola w zapewnianiu neuronom strukturalnego i metabolicznego wsparcia 2,3. Nowo odkryte role astrocytów obejmują szerokie spektrum funkcji. Obejmują one kierowanie migracją rozwijających się aksonów i niektórych neuroblastów podczas rozwoju4-6, funkcje w przekaźnictwie synaptycznym, siłę synaps i przetwarzanie informacji przez obwody neuronalne 7-9, role w tworzeniu bariery krew-mózg (BBB) 10 i integralności 11-13 oraz regulację napięcia naczyniowo-mózgowego 14 . Inną ważną cechą astrocytów jest ich reakcja na urazy. W warunkach patologicznych astrocyty stają się reaktywne i dalej zwiększają ekspresję pośrednich białek fibrylarnych fibrylarnych glejowych (GFAP) i hamujących białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) 15,16. Reaktywne astrocyty oddzielają miejsce urazu od zdrowej tkanki, tworząc bliznę glejową, która składa się głównie z wydzielanych przez astrocyty białek ECM z rodziny proteoglikanów siarczanu chondroityny (CSPG), głównych czynników hamujących regenerację aksonów po uszkodzeniu OUN 15-17.
Astrocyty pochodzą z promieniowych komórek glejowych (RG) w późnym okresie embriogenezy i wczesnego życia pourodzeniowego. Po określeniu astrocytów prekursory astrocytów migrują do swoich końcowych pozycji, gdzie rozpoczynają proces końcowego różnicowania. In vivo astrocyty wydają się być dojrzałe trzy do czterech tygodni po urodzeniu, na co wskazuje ich typowa morfologia 18,19. Subpopulacja komórek RG przekształca się w astrocyty strefy podkomorowej (komórki typu B). Zarówno komórki RG, jak i komórki typu B funkcjonują jako podobne do astrocytów nerwowe komórki macierzyste (NSC) odpowiednio podczas rozwoju i u osoby dorosłej. Podobnie jak astrocyty, komórki RG i typu B również wyrażają transporter glutaminianu specyficzny dla astrocytów (GLAST), białko wiążące lipidy w mózgu (BLBP) i GFAP, co wskazuje, że markery te nie mogą być używane wyłącznie do specyficznego znakowania dorosłych astrocytów. W przeciwieństwie do dorosłych astrocytów miąższowych, które nie dzielą się w zdrowym mózgu, komórki RG i typu B wykazują potencjał komórek macierzystych, taki jak zdolność do samoodnawiania. Rozregulowanie astrocytów jest związane z wieloma patologiami, w tym z chorobą Alzheimera 20,21, chorobą Huntingtona 22, chorobą Parkinsona 23, zespołem Retta 24 i chorobą Alexandra 25. Co więcej, astrocyty reagują na wszelkie uszkodzenia OUN, co prowadzi do aktywacji astrocytów i tworzenia się astrocytowych blizn glejowych 16,26. Uważa się, że astrocytowa blizna glejowa, która powstaje w wyniku urazu mózgu lub urazu rdzenia kręgowego, jest główną barierą zapobiegającą regeneracji neuronów 15.
Rozwój niezawodnych metod izolowania i utrzymywania oczyszczonych populacji komórek był niezbędny dla naszego zrozumienia układu nerwowego. Pionierskie prace McCarthy'ego i de Vellisa umożliwiły badaczom przygotowanie niemal czystych kultur astrocytów z tkanki noworodków szczurów 27. Wiele dowiedziano się o biologii astrocytów przy użyciu tej metody, która jest tutaj przedstawiona w nieco zmodyfikowanej formie do izolowania astrocytów korowych myszy. Uzupełnieniem badań in vivo, astrocyty, a także kondycjonowana pożywka uzyskana przy użyciu opisanej kultury in vitro, są cennymi narzędziami do dalszego uzyskiwania wglądu w funkcje astrocytów.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Pożywka do hodowli astrocytów</td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>FBS, inaktywowane termicznie</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td>Końcowe stężenie: 10%</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Końcowe stężenie: 1%</td></tr><tr><td colspan="4">Roztwór do trawienia tkanki mózgowej</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>15090-046</td><td>Stężenie końcowe: 0,25%</td></tr><tr><td colspan="4">Inne</td></tr><tr><td>70% (vol/vol) etanol</td><td>Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna </td><td>Milipor</td><td>A-003-E</td><td>50 &mu; g / ml </td></tr><tr><td>Woda</td><td>PAA</td><td>S15-012</td><td>klasa hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td>klasa hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA </td><td>Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>0,45 i mu; m Filtr sterylny </td><td>Sartorius</td><td>16555</td><td></td></tr><tr><td>3,5 cm szalka Petriego</td><td>BD Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówka Falcon</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Rurka Falcon</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Kolba do hodowli tkanek</td><td>BD Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze, drobne </td><td>Dumont</td><td>2-1032; 2-1033</td><td># 3c; # 5</td></tr><tr><td>Kleszcze, płaska końcówka</td><td>KLS Martin</td><td>12-120-11</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne 13 cm</td><td>Aesculap</td><td>BC-140-R</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td></td><td>MZ7.5</td></tr><tr><td>+ aparat</td><td>Leica</td><td></td><td>MZ16F; DFC320</td></tr><tr><td>Mikroskop + kamera</td><td>Zeiss; Canon</td><td></td><td>primo vert; Wirówka PowerShot A650 IS</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5805000.017</td><td>Wirówka5804R</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE 4450-1CE</td><td>MaxQ 4450 </td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Julabo</td><td></td><td>SW20; 37 &deg; Z</td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla astrocytów korowych myszy

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocyty są licznym typem komórek w mózgu ssaków, jednak wiele pozostaje do nauczenia się o ich cechach molekularnych i funkcjonalnych. Systemy hodowli komórek astrocytów in vitro mogą być wykorzystywane do szczegółowego badania funkcji biologicznych tych komórek glejowych. Ten protokół wideo pokazuje, jak uzyskać czyste astrocyty poprzez izolację i hodowlę mieszanych komórek korowych młodych myszy. Metoda opiera się na braku żywotnych neuronów i oddzieleniu astrocytów, oligodendrocytów i mikrogleju, trzech głównych populacji komórek glejowych ośrodkowego układu nerwowego, w hodowli. Reprezentatywne obrazy z pierwszych dni hodowli wykazują obecność mieszanej populacji komórek i wskazują punkt czasowy, w którym astrocyty stają się zlewające i powinny być oddzielone od mikrogleju i oligodendrocytów. Ponadto wykazujemy czystość i morfologię astrocytów hodowanych astrocytów za pomocą barwień immunocytochemicznych dla dobrze znanych i nowo opisanych markerów astrocytów. Ten system hodowli może być łatwo wykorzystany do uzyskania czystych astrocytów myszy i pożywki kondycjonowanej przez astrocyty do badania różnych aspektów biologii astrocytów.

Po wyizolowaniu całego mózgu myszy (Rysunek 1A), należy usunąć móżdżek oraz opuszki węchowe (Rysunek 1B). Korę odseparowuje się od pnia mózgu myszy (Rysunek 1C), a następnie ostrożnie usuwa opony pojedynczej półkuli (Rysunek 1D') (Rysunek 1E). Opony są łatwo rozpoznawalne dzięki układowi tętnic oponowych, a ich niepełne usunięcie prowadzi do zanieczyszczenia końcowej kultury astrocytów komórkami oponowymi i fibroblastami.
<p class="j...

Astrocyty zostały uznane za wszechstronne komórki uczestniczące w podstawowych procesach biologicznych, które są niezbędne do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania mózgu oraz naprawy ośrodkowego układu nerwowego. Tutaj przedstawiamy szybką procedurę uzyskiwania czystych hodowli astrocytów myszy w celu zbadania biologii tej głównej klasy komórek ośrodkowego układu nerwowego.

Izolacja i hodowla astrocytów korowych myszy

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie czystych kultur astrocytów poprzez wyizolowanie i hodowlę mieszanych komórek korowych od kilku do czterech młodych myszy P. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie kory mózgowej szczeniąt myszy i usunięcie opon mózgowych. Drugim krokiem jest pocięcie kory na małe kawałki, dysocjacja kawałków kory za pomocą trypsyny i tacji w celu uzyskania pojedynczych komórek i umieszczenia pojedynczych komórek w kolbach do hodowli tkankowych pokrytych polipoli lycyną.Następnie, po siedmiu do ośmiu dniach, astrocyty, mikroglej i oligodendrocyty utworzą różne warstwy, a oddzielenie astrocytów od mikrogleju i oligodendrocytów uzyskuje się poprzez potrząśnięcie kolbą kultur tkankowych na wytrząsarce orbitalnej. Ostatnim etapem jest jonizacja i zebranie pozostałych astrocytów, które są następnie ponownie platerowane w kolbie do hodowli tkankowej. Ostatecznie 12 do 14 dni po pierwszym podziale komórki astrocyty są siane w odpowiednim stężeniu do eksperymentów, a czystość komórek można zbadać za pomocą chemii immunocytologicznej przy użyciu markerów specyficznych dla astrocytów.Opisana tutaj metoda opiera się na przygotowaniu hodowli astrocytów z mózgów noworod

isolation-and-culture-of-mouse-cortical-astrocytes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Izolacja i hodowlania astrocytów kory mózgowej myszy

W tym filmie opisujemy metodę uzyskiwania czystej preparacji astrocytów od nowo narodzonych myszy.

Izolacja astrocytów: metoda uzyskiwania czystego przygotowania astrocytów korowych myszy

Film demonstruje technikę izolowania mikrogleju z kory mózgowej dorosłej myszy. Po pierwsze, kora przechodzi segmentację i homogenizację w celu usunięcia neuronów i innych komórek glejowych, zachowując mikroglej. Następnie zawiesina komórkowa jest poddawana działaniu mikrokulek magnetycznych antymieliny i pola magnetycznego, skutecznie oddzielając komórki mikrogleju i szpiku od resztek mieliny i komórek zawierających mielinę.

Izolacja mikrogleju z kory mózgowej dorosłej myszy

Film pokazuje prostą metodę hodowli mysich astrocytów w izolacji od innych komórek mózgowych. Podczas hodowli, przy użyciu pożywek specyficznych dla astrocytów i hamowaniu przylegania komórek nieastrocytowych, metoda selektywnie hoduje astrocyty. Te hodowane astrocyty wykazują gwiaździstą morfologię z drobnymi wyrostkami.

Prosta technika izolacji i hodowli mysich astrocytów

Ten film demonstruje metodę izolowania perycytów mózgowych od mózgu myszy. Wyizolowane komórki są hodowane w pożywkach specyficznych dla perycytów w celu promowania proliferacji perycytów.

Izolowanie i hodowla perycytów mózgowych myszy

Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Astrocyty są jednymi z najważniejszych kluczowych graczy w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). W tym miejscu przedstawiamy praktyczną metodę protokołu hodowli astrocytów w hipokampie płciowym w celu zbadania mechanizmów leżących u podstaw funkcji astrocytów u młodych noworodków płci męskiej i żeńskiej po niedokrwieniu in vitro.

Różnice płci w astrocytach hipokampa myszy po niedokrwieniu in vitro

Ten protokół opisuje pośrednią kokulturę neuron-astrocyt do analizy interakcji neuron-glej.

Test pośredniej kokultury neuron-astrocyty: zestaw in vitro do szczegółowego badania interakcji neuron-glej

Tutaj opisujemy metodę obrazowania na żywo in vitro, która umożliwia wizualizację wewnątrzkomórkowego transportu organelli i transportu białek błony komórkowej w mysich astrocytach. W protokole tym przedstawiono również metodologię analizy obrazu w celu wyznaczenia tras transportu i kinetyki transportu ładunków.

Wizualizacja i analiza transportu wewnątrzkomórkowego organelli i innych ładunków w astrocytach

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół generowania wysoce wzbogaconych kultur astrocytów pochodzących z różnych regionów ośrodkowego układu nerwowego myszy po urodzeniu i ich bezpośredniej konwersji w funkcjonalne neurony przez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Izolacja i bezpośrednie przeprogramowanie neuronów astrocytów myszy

Ten protokół opisuje izolację oczyszczonych astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy, ułatwiając późniejsze zastosowania, takie jak analiza RNA i hodowla komórek. Zawiera szczegółowe metody i procedury dysocjacji komórek mające na celu poprawę zarówno jakości, jak i wydajności izolowanych komórek.

Izolacja czystych astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy do testów in vitro i badań transkryptomicznych

Naucz się izolować i hodować czyste kultury astrocytów korowych myszy. Ta metoda wykorzystuje trypsynizację i orbitalne wytrząsanie do separacji komórek, zapewniając wysoką czystość preparatu do badań neurobiologicznych.

Izolacja i hodowla astrocytów korowych myszy

Przeglądaj więcej filmów