Połączona immunofluorescencja i DNA FISH na zakonserwowanych w 3D jądrach interfazowych w celu zbadania zmian w organizacji jądrowej 3D

Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesne wykrycie modyfikacji chromatyny i sekwencji DNA za pomocą mikroskopii konfokalnej 3D, najpierw generowane są specyficzne sondy DNA. W międzyczasie komórki eksperymentalne są utrwalone perme i wybarwione immunologicznie. Dla markerów histonowych będących przedmiotem zainteresowania.

Komórki są następnie denaturowane, a w nocy dochodzi do fluorescencji w tobie. Hybrydyzacja lub ryba jest wykonywana za pomocą jednej lub więcej sond DNA. Na koniec ogniwa są myte i montowane w celu fluorescencji 3D.

Analiza mikroskopowa uzyskanych obrazów ujawnia lokalizację jądrową interesujących miejsc i związek z konkretnymi modyfikacjami kamienia. Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy wizualizację białka jądrowego, w tym kamieni z loci genomowych w jądrach 3D i może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu epigenetycznej organizacji jądra chromatyny czy regulacji genów. Do znakowania tej procedury można użyć plazmidów wstecznych lub produktów PCR.

Powinny one być przygotowane zgodnie z opisem w załączonym tekście. Należy pamiętać, że aby uzyskać solidny sygnał ryb, sondy powinny wydać co najmniej 10 kilopary zasad. Rozpocznij tę procedurę od połączenia jednego mikrograma DNA i 0,17 mikrograma RNA A w mikroprobówce wirówkowej.

Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji na krótko dezaktywuj RNA A na lodzie i dodaj odpowiednią ilość translacji Nicka. Mieszać, inkubować przez dwie godziny w temperaturze 16 stopni Celsjusza w schłodzonej łaźni wodnej lub chłodnym bloku, aby dezaktywować reakcję.

Umieść probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na godzinę lub minus 20 stopni Celsjusza przez noc. Następnie określ rozmiar sondy na 2%żelu agros. Rozmaz powinien wynosić od 101 000 par zasad, przy czym większość powinna mieć około 300 do 500 par zasad.

Zauważ, że smuga sond science-fiction nie jest widoczna. Po ustaleniu wielkości należy oczyścić sondy przez dializę pod wpływem 0,02. Pięciomilimetrowe filtry w dwulitrowych zlewkach wypełnionych wodą.

Delikatnie naniec pipetą 200 mikrogramów sondy na środek każdego pływającego filtra, a następnie inkubować przez dwie godziny w ciemności. Po inkubacji za pomocą pipety delikatnie przenieś sondę z filtrów do świeżej probówki mikrowirówkowej. Następnie dodaj czynniki blokujące do sond w następujący sposób.

Jeden mikrogram CO 1D NA. Jeden mikrogram DNA o wysokim bloku i 10 mikrogramów nasienia łososia na jeden mikrogram sondy DNA i mieszanki przechowuj sondy DNA w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza. W dniu zabiegu rybnego sondy są wytrącane i przygotowywane do użycia. Należy pamiętać, że kroki opisane w tej sekcji filmu powinny być wykonywane równolegle z krokami opisanymi w następnej sekcji.

Aby wytrącić sondy, podążaj za nimi i połącz je z 0,1 objętości trzech molowych octanów sodu o pH 5,2 i 2,5 objętości 100% etanolu inkubować przez godzinę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po inkubacji obracaj sondy w dół z prędkością 16 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut. Po wirowaniu wyrzuć supernatant i wysusz granulki na powietrzu w ciemności.

W zależności od ilości i koloru sond, granulka może, ale nie musi być widoczna. Resus zawiesić osad w 15 mikrolitrach buforu hybrydyzacyjnego na warunki testowe i wstrząsnąć za pomocą termomiksera einor w ciemności w temperaturze od 37 do 45 stopni Celsjusza przez około 20 minut. Następnie, w celu denaturacji, sondy inkubują je przez pięć minut w temperaturze od 75 do 95 stopni Celsjusza.

Następnie, aby uzyskać sondy wstępne, inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut na termomikserze. Bezpośrednio po inkubacji sondy zostaną nałożone na komórki na szkiełkach nakrywkowych, jak opisano w następnej części filmu. Należy zauważyć, że w przypadku kolejnych etapów czas inkubacji powinien być zmodyfikowany w razie potrzeby dla użytych przeciwciał i komórek.

Kroki opisane w tej sekcji filmu należy wykonywać równolegle z krokami opisanymi w poprzedniej sekcji, zgodnie z opisem w dołączonym tekście. Upuść nieprzylegające komórki na wierzch szkiełek nakrywkowych pokrytych polilizyną do studzienek z sześcioma dołkami i pozwól im się przymocować na pięć minut. Następnie delikatnie dodaj dwa mililitry 2% aldehydu paraform w inkubacji PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej po inkubacji.

Przepłucz każdą studzienkę PB S3 razy, a następnie, aby przepuszczalność komórek, dodać dwa mililitry lodowatego 0,4% Triton X 100 w PBS i inkubować przez pięć minut na lodzie. Po zassaniu przepuszczalnego roztworu, jeśli ryby DNA zostaną połączone z immunofluorescencją, należy postępować w następujący sposób. Najpierw odpipetować 100 mikrolitrów roztworu blokującego na param w wilgotnej komorze.

Umieścić szkiełko nakrywkowe stroną z komórką do dołu na roztworze blokującym i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś. Okładka wsuwa się do 100 mikrolitrów kropli pierwszorzędowego przeciwciała rozcieńczonego w roztworze blokującym.

Tutaj użyte przeciwciało rozpoznaje fosforylowane syryjskie 1 39 z H dwa A x lub gamma H dwa A x. Inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji za pomocą kleszczy ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe.

Jeśli szkiełka nakrywkowe są trudne do zebrania, zalej je PBS i spróbuj ponownie. Przenieś każde szkiełko do studzienki z sześcioma. Płytka studzienkowa zawierająca dwa mililitry 0,2% BSA 0,1% tween 20 w PBS przemyć szkiełka nakrywkowe w tym roztworze trzy razy przez pięć minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem, następnie inkubować komórki z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem rozcieńczonym w roztworze blokującym przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemnej i wilgotnej komorze na param.

Podobnie jak przed inkubacją, przepłukać komórki w 0,1% tween 20 w PB S3 razy przez pięć minut w temperaturze pokojowej w ciemności, aby utrwalić komórki, zanurzyć je w dwóch mililitrach 2% para formaldehydu w PBS na 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Po wybarwieniu komórek lub jeśli nie są barwione, kontynuuj rybowanie DNA, trzykrotnie spłukując szkiełka nakrywkowe w PBS. Następnie umieść szkiełka nakrywkowe stroną z komórkami do dołu na kropli o pojemności 100 mikrolitrów 0,1 miligrama na mililitr.

RNA na param w wilgotnej komorze i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji przepłucz szkiełka osłonowe trzykrotnie w PBS, a następnie przetrzyj komórki w lodowatym kwasie solnym 0,7% Trix 100 w 0,1 molowym kwasie solnym przez 10 minut na lodzie w ciemności. Po trzech płukaniach w PBS denaturuj komórki w 1,9-molowym kwasie solnym przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności i umyj jeszcze trzy razy w lodowatym PBS obok, aby zhybrydyzować komórki z sondami.

Umieść szkiełka nakrywkowe komórką do dołu na 15-mikrolitrowej kropli sondy przygotowanej w poprzedniej sekcji tego filmu na szkiełku mikroskopowym, uszczelnij szkiełko cementem gumowym i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemnej, wilgotnej komorze. Następnego dnia za pomocą kleszczy ostrożnie usuń cement gumowy ze szkiełek. Następnie przetrzyj szkiełka nakrywkowe dwoma aktami SSC i użyj kleszczy, aby ostrożnie usunąć szkiełka nakrywkowe z komórkami.

Następnie umieść je w studzienkach zawierających roztwór myjący. Następnie wykonaj następujące prania z potrząsaniem w ciemności dwa XSSC przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, dwa XSSC przez 30 minut w temperaturze pokojowej i jeden XSSC przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby zamontować szkiełka, umieść szkiełka nakrywkowe stroną do dołu na 10 do 15 mikrolitrów kropli przedłużonego złotego medium montażowego zawierającego 1,5 miligrama na mililitr DPI z lakierem do paznokci. Preparaty mogą być przechowywane przez wiele miesięcy w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Gdy szkiełka są gotowe, zbierz obrazy 3D z sekcjami optycznymi oddzielonymi o 0,3 mikrona i przeanalizuj zgodnie z opisem w dokumencie towarzyszącym, aby ustalić, czy zmiany w asocjacji dwóch alleli loci receptora antygenowego są związane z regulacją procesu rekombinacji VDJ podczas rozwoju limfocytów, komórki typu dzikiego i zmutowane z niedoborem białka rekombinazy rag zostały wykorzystane do zbadania interesującego miejsca za pomocą DNA Sonda rybna wygenerowana z grzbietu, który obejmuje około 200 kilopar zasad obejmujących region genomu. Odległości między allelami mierzono między środkiem masy każdego sygnału zwrotnego w stosach obrazów 3D, przerywanymi okręgami, konturowymi kształtami jąder. Pokazane paski skali to krzywe skumulowanego rozkładu częstotliwości o długości jednego mikrona, a następnie wygenerowano cały zakres odległości między dwoma allelami mierzonymi w komórkach typu dzikiego i zmutowanych.

Nieparametryczny test KS dla dwóch prób został następnie wykorzystany do oceny istotności różnic między dwoma rozkładami. Zakres najistotniejszych różnic w odległościach międzyallelicznych oceniono za pomocą serii dwóch dokładnych testów rybaków ogonowych oznaczonych niebieskimi kropkami. Najbardziej wiarygodne wartości P wskazane przez wyższe kropki znaleziono dla odległości około jednego mikrona.

W ten sposób punkt odcięcia dla ścisłego powiązania lub parowania dwóch alleli został ustalony na jednym mikronie. Przedstawione tutaj skumulowane krzywe częstości wskazują zakres odległości dla ścisłego powiązania dwóch alleli od zera do 1,5 mikrona w dwóch różnych warunkach biologicznych. Znaczenie parowania dwóch alleli oceniono za pomocą dokładnego testu dwóch rybaków ogonowych dla odcięcia na jednym mikronie.

Ten wykres pokazuje, że w stanie zmutowanym te dwa allele nie są związane z dużą częstotliwością, jak w typie dzikim. W ten sposób brakująca białkowa jest zaangażowana w parowanie iniczne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak połączyć immunofluorescencję i DNA ryb.

Technika ta utorowała drogę naukowcom, dostarczając wglądu w globalne zmiany w architekturze jądrowej, zachowaniu określonych loci i regionów genomu w przestrzeni jądrowej oraz asocjacji określonych białek jądrowych w tych regionach. Pomaga to zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw różnych chorób po tej procedurze. Inne metody, takie jak techniki przepustowości lodu w całym genomie, takie jak chromatyna, wytrącanie immunologiczne lub wyszukiwanie chipów lub potwierdzenie wychwytu chromosomów w połączeniu z głębokim sekwencjonowaniem, takie jak pierwsza piątka C lub IC, mogą być wykonywane w celu uzyskania globalnych danych na temat populacji komórek.