Name: Połączona immunofluorescencja i DNA FISH na zakonserwowanych w 3D jądrach interfazowych w celu zbadania zmian w organizacji jądrowej 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: Poznaj połączoną metodę immunofluorescencji i DNA FISH do jednoczesnego wykrywania modyfikacji chromatyny i sekwencji DNA w zakonserwowanych jądrach 3D. Ta technika umożliwia badanie dynamiki chromatyny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Skok, szczególnie Susannah Hewitt, za dyskusje i komentarze. Prace te są wspierane przez granty Narodowego Instytutu Zdrowia R01GM086852, RC1CA145746 (J.A.S.). J.A.S. jest stypendystą Towarzystwa Białaczki i Chłoniaka. J.C. jest członkiem Instytutu Irvington w Instytucie Badań nad Rakiem. M.M. jest wspierany przez National Science Foundation Grant Integrative Graduate Education and Research Traineeship (NSF IGERT 0333389).

1. Znakowanie sondą DNA za pomocą fluoroforów: Nick Translation (~ 6 godz.)
<ol>
 <li>Do znakowania można użyć czystego DNA BAC (przygotowanego przez maxi-prep) lub plazmidów lub produktów PCR, wszystkie ponownie zawieszone wH2O. Należy pamiętać, że aby uzyskać solidny sygnał FISH, sondy powinny mieć co najmniej 10 kb.</li>
 <li>Inkubować DNA w RNazie A przez 30 minut w temperaturze 37 °C (wszystkie odczynniki są wymienione w Tabeli 1).</li>
 <li>Inkubować reakcję translacji nacięć przez 2 godziny w temperaturze 16 °C (patrz tabele 2 i 3). Można stosować alternatywne metody bezpośredniego etykietowania (Przykład: FISH Tag, Invitrogen).</li>
 <li>Dezaktywować reakcję na jedną godzinę w temperaturze -80 °C lub przez noc w temperaturze -20 °C.</li>
 <li>Określ rozmiar sondy na 2% żelu agarozowym. Rozmaz powinien wynosić od 100 do 1000 pz, przy czym większość powinna wynosić około 300-500 pz (należy pamiętać, że rozmaz sond Cy5 nie jest widoczny). Jeżeli DNA nie jest wystarczająco strawione, do reakcji można dodać więcej DNA, Pol I i DNazy I, i inkubować przez kolejne dwie godziny w temperaturze 16 °C.</li>
 <li>Oczyść sondy na filtrach 0,025 mm w dwulitrowych zlewkach wypełnionych H20 przez dwie godziny w ciemności.</li>
 <li>Dodaj czynniki blokujące do sond w następujący sposób: 10 μg DNA Cot-1, 10 μg DNA Hybloc i 100 μg nasienia łososia na 10 μg sond DNA. Sondy DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Wytrącanie sondy/Denaturacja/Wyżarzanie wstępne (3-4 godziny)
<ol>
 <li>Na szkiełko nakrywkowe stosuje się od 0,3 μg do 1 μg sondy DNA. Wymieszać sondy z 0,1 objętości 3M NaAc (pH 5,2) i 2,5 objętości 100% etanolu, inkubować przez jedną godzinę w temperaturze -80 °C lub przez noc w temperaturze -20 °C i wirować z prędkością 13 000 obr./min w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Należy pamiętać, że ilość sondy DNA można dostosować w zależności od jakości DNA i regionu jądrowego hybrydyzacji. Alternatywne metody bezpośredniego etykietowania mogą pozwolić na użycie zmniejszonej ilości sondy. W celu wykrycia wielu sygnałów DNA FISH na jednym szkiełku, różne sondy mogą być wytrącane razem (z wyjątkiem sond, które nie powinny być wstępnie wyżarzane, takich jak sekwencje powtórzeń). Sondy do kilku eksperymentów wykonywanych w tym samym czasie mogą być również wytrącane razem. Granulki powinny być lekko zabarwione zgodnie z użytymi fluoroforami (w przypadku wytrącenia się niewielkich ilości sond osad może nie być widoczny).</li>
 <li>Wysuszyć granulki i ponownie zawiesić je w 15 μl buforu do hybrydyzacji (patrz tabela 4) na szkiełko nakrywkowe, wstrząsając (przy użyciu termomiksera Eppendorf) w ciemności w temperaturze 37-45 °C (przez około 20 minut).</li>
 <li>Denaturyzacja sond przez 5 minut w temperaturze 75-95 °C.</li>
 <li>Sondy do wyżarzania wstępnego w temperaturze 37 °C przez 30-60 min. Długość wyżarzania wstępnego można dostosować w zależności od złożoności i jakości sond.</li>
 <li>Nałożyć sondy na szkiełka nakrywkowe w celu hybrydyzacji przez noc (patrz sekcja 3).</li>
</ol>
3. 3-wymiarowe DNA RYBA - Pierwszy dzień (~ 3 godz.)
<ol>
 <li>Nieprzylegające komórki są skoncentrowane w małej objętości 1x PBS (~ 2x105 komórek po 5-10 μl 1x PBS na szkiełko nakrywkowe) i upuszczane na środek szkiełka nakrywkowego pokrytego poli-L-lizyną. Przylegające komórki należy hodować na szkiełkach nakrywkowych przez co najmniej 24 godziny (~ 70% konfluencji) (szkiełka nakrywkowe mogą być pokryte 0,1% żelatyny). Kwadratowe szkiełka nakrywkowe o wymiarach od 18x18 do 24-24 mm umieszcza się w płytkach 6-dołkowych, a w całym protokole stosuje się po dwa ml każdego roztworu na dołek (alternatywnie okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 1,5 mm można umieścić w płytkach 12/24-dołkowych).</li>
 <li>Utrwalić komórki w 2% paraformaldehydzie / 1x PBS, pH 7-7,4, przez 10 minut w temperaturze pokojowej (można podzielić na porcje 4% zapasów PFA, przechowywać w temperaturze -20 °C). Paraformaldehyd można kupić w roztworze (16%) lub 4% roztwory podstawowe można przygotować z proszku/bryłek. Proszek paraformaldehydu rozpuszcza się w 1x PBS w temperaturze > 60 °C (pH można zwiększyć do 8-9 w celu ułatwienia rozpuszczania), schładza się na lodzie, dostosowuje do pH 7-7,4, filtruje, porcjuje w sokołach i przechowuje przez tygodnie w temperaturze -20 °C. </li>
 <li>Po trzech płukaniach w 1x PBS, przepuszczalność komórek w lodowato zimnym 0,4% Triton-X-100 / 1x PBS przez 5 minut na lodzie. Długość przepuszczalności można dostosować w zależności od typu komórki. N.B.: Jeśli DNA FISH jest połączone z immunofluorescencją, barwienie immunologiczne powinno być przeprowadzone na tym etapie (patrz punkt 4).</li>
 <li>Po trzech płukaniach w 1x PBS, inkubować komórki z 0,1 μg/μl RNazy A w 1x PBS przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Szkiełka nakrywkowe umieszcza się komórką do dołu na kropli 100 μl roztworu na parafilmie lub na szkiełku w wilgotnej komorze. Szkiełka nakrywkowe są następnie ostrożnie usuwane za pomocą kleszczy. W przypadku napotkania jakiegokolwiek oporu, szkiełka nakrywkowe należy zalać 1x PBS, aby uniknąć uszkodzenia komórek.</li>
 <li>Po trzech płukaniach w 1x PBS, przepuszczalność komórek w lodowato zimnym 0,7% Triton-X-100 / 0,1 M HCl przez 10 minut na lodzie.</li>
 <li>Po trzech płukaniach w 1x PBS, denaturować komórki w 1,9 M HCl przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, komórki można denaturować w 50% formamidzie / 2x SSC w temperaturze 75-80 °C przez co najmniej 30 minut. Należy pamiętać, że długość hybrydyzacji (i temperatura) może być zoptymalizowana w zależności od typu komórki.</li>
 <li>Po trzech płukaniach w lodowato zimnym 1x PBS, hybrydyzuj komórki z sondami przez noc w temperaturze 37 °C w ciemnej i wilgotnej komorze. Szkiełka nakrywkowe umieszcza się komórką do dołu na kropli 15 μl sondy na szkiełku podstawowym i uszczelnia cementem gumowym.</li>
</ol>
4. 3-wymiarowy Immuno-FISH - Pierwszy dzień (~ 6-7 godz.)
<ol>
 <li>W przypadku immunofluorescencji złożonej / DNA FISH barwienie immunologiczne należy przeprowadzić po permeabilizacji w 0,4% Triton-X-100 (krok 3.3).</li>
 <li>Inkubować komórki w roztworze blokującym przez 30 minut w temperaturze pokojowej (2,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 10% normalnej surowicy koziej, 0,1% Tween-20). Roztwór blokujący jest filtrowany, podawany w 1,5 ml Eppendorfs i przechowywany przez miesiące w temperaturze -20 °C.</li>
 <li>Inkubować komórki z pierwszorzędowym przeciwciałem podniesionym przeciwko białku lub modyfikacji histonów będących przedmiotem zainteresowania, rozcieńczonymi w roztworze blokującym, przez jedną godzinę w temperaturze RT w wilgotnej komorze. Tutaj pokazujemy przykład przeciwciała przeciwko fosforylowanej serynie-139 H2AX (γ-H2AX, Millipore; Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 5). Szkiełka nakrywkowe umieszcza się komórką do dołu na kropli 100 μl roztworu na parafilmie lub na szkiełku w wilgotnej komorze. Szkiełka nakrywkowe są następnie ostrożnie usuwane za pomocą kleszczy (w razie potrzeby zalewane 1x PBS). Należy pamiętać, że długość rozcieńczania i inkubacji może być dostosowana w zależności od jakości przeciwciała i typów komórek.</li>
 <li>Umyj komórki w 0,2% BSA / 0,1% Tween-20 / 1x PBS, trzy razy po 5 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem.</li>
 <li>Inkubować komórki z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem, rozcieńczonym w roztworze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w ciemnej i wilgotnej komorze. Tutaj pokazujemy przykład wykrywania za pomocą wtórnego przeciwciała przeciwko mysi kóz (Alexa Fluor 488 lub 555, Invitrogen; Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 5). Można również stosować przeciwciała drugorzędowe sprzężone haptenem (biotyna, digoksygenina itp.). W takim przypadku dodatkowy krok w celu odpowiedniego wykrycia (streptawidyna, anti-dig itp.) można wykonać przed lub po nocnej hybrydyzacji DNA-FISH.</li>
 <li>Wypłucz komórki w 0,1% Tween-20 / 1x PBS, trzy razy po 5 minut w temperaturze pokojowej z potrząsaniem w ciemności.</li>
 <li>Komórki post-fix w 2% paraformaldehydzie / 1x PBS przez 10 min w RT w ciemności.</li>
 <li>Kontynuuj DNA FISH jak powyżej od inkubacji w RNazie A (krok 3.4).</li>
</ol>
5. 3-wymiarowe DNA RYBA / Immuno-FISH - Drugi dzień (~ 2 godz.)
<ol>
 <li>Ostrożnie usuń cement kauczukowy, zalej szkiełka nakrywkowe 2x SSC, ostrożnie usuń kleszczami i umieść je w studzienkach zawierających roztwór myjący.</li>
 <li>Myć komórki w 2x SSC przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności z potrząsaniem.</li>
 <li>Myć komórki w 2x SSC przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności z potrząsaniem.</li>
 <li>Myć komórki w 1x SSC przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności z potrząsaniem. Należy pamiętać, że w przypadku denaturacji formamidem pranie należy zastąpić następującymi: 3 prania w 50% formamidzie / 2x SSC i 3 prania w 2x SSC po 5 minut, w temperaturze 37 °C.</li>
 <li>Zamontuj komórki w pożywce montażowej ProLong Gold zawierającej 1,5 μg/ml DAPI (4,6-diamidino-2-fenyloindol) w celu przeciwbarwienia całkowitego DNA. Szkiełka nakrywkowe umieszcza się komórką do dołu na kropli 10-15 μl podłoża montażowego na szkiełku podstawowym i uszczelnia lakierem do paznokci. Szkiełka są przechowywane przez miesiące w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
6. 3D Mikroskopia i analiza
<ol>
 <li>Obrazy 3D można uzyskiwać za pomocą różnych systemów mikroskopowych. W naszych eksperymentach skrawki optyczne oddalone od siebie o 0,3 μm są zbierane na systemie konfokalnym Leica SP5 AOBS (Acousto-Optical Beam Splitter). Należy pamiętać, że separacja między płaszczyznami optycznymi może być dostosowywana w zależności od rodzaju analizy.</li>
 <li>Stosy obrazów 3D można analizować za pomocą różnych programów i narzędzi. Używamy oprogramowania Image J do oceny pomiarów odległości między interesującymi nas loci oraz do analizy różnych typów asocjacji interesujących nas loci z subjądrowymi przedziałami lub białkami.</li>
 <li>Wszystkie analizy statystyczne są wykonywane w celu porównania dwóch (lub więcej) różnych warunków biologicznych z parami ocen istotności: porównanie różnych typów komórek lub etapów, porównanie między różnymi loci będącymi przedmiotem zainteresowania. We wszystkich testach statystycznych przyjmuje się, że wartości P ≤ 5,00E-2 (a = 0,05) są istotne (1,00E-2 ≤ P ≤ 5,00E-2 * istotne; 1,00E-3 ≤ P ≤ 1,00E-2 ** bardzo istotne; P < 1.00E-3 *** bardzo znaczące).</li>
</ol>
Analiza statystyczna całego rozkładu odległości między dwoma allelami. Najpierw konstruujemy krzywe częstości rozkładu skumulowanego w całym zakresie mierzonych odległości między dwoma allelami. Do oceny istotności różnic w rozkładach empirycznych odległości międzyallelicznych stosuje się nieparametryczny test Kołmogorowa-Smirnowa (KS) dla dwóch prób 13,14 .
Analiza statystyczna ścisłego związku (np. parowanie) dwóch alleli przy użyciu optymalnego odcięcia odległości. Aby określić zakres najbardziej wytrzymałych różnic w odległościach między dwoma allelami lub loci, używamy serii dokładnego testu Fishera z dwoma ogonami 15 s. Mianowicie, przy każdej zmierzonej odległości sprawdzamy, czy jeden warunek jest znacząco nadreprezentowany na krótszych odległościach między dwiema próbkami. Minimum w rozkładzie wartości P wskazuje zakres odległości, które należy uznać za punkt odcięcia dla ścisłego powiązania (tj. parowania) dwóch alleli. Następnie stosuje się dokładny test Fishera z dwoma ogonami do oceny znaczenia parowania dwóch alleli przy zidentyfikowanej wartości odcięcia15. Stosuje się wiele poprawek testowych, aby uwzględnić łączną liczbę wykonanych testów Fishera 16.
Analiza statystyczna związku interesującego miejsca z sub-jądrowymi kompartmentami lub białkami. Dokładny test Fishera z dwoma ogonami służy do analizy znaczenia związku miejsca zainteresowania z różnymi przedziałami lub białkami 15.

<ol><li>Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome+inactivation+in+mouse+embryonic+stem+cells%3A+analysis+of+histone+modifications+and+transcriptional+activity+using+immunofluorescence+and+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH.</a> Methods in enzymology. , 376-405 (2004).</li>
<li>Cremer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+3D+fluorescence+in+situ+hybridization+for+imaging+interphase+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes.</a> Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).</li>
<li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunofluorescence%2C+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization%2C+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes%2C+transcriptional+activity%2C+nuclear+organization%2C+and+X-chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).</li>
<li>Solovei, I., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-FISH+on+cultured+cells+combined+with+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining.</a> Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).</li>
<li>Markaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+3D-FISH+and+super-resolution+structured+illumination+microscopy+for+studies+of+3D+nuclear+architecture%3A+3D+structured+illumination+microscopy+of+defined+chromosomal+structures+visualized+by+3D+%28immuno%29-FISH+opens+new+perspectives+for+studies+of+nuclear+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays+%3A+news+and+reviews+in+molecular%2C+cellular+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture.</a> BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).</li>
<li>Heard, E., Bickmore, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+gene+regulation+and+chromosome+territory+organisation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation.</a> Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).</li>
<li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+sequence%3A+cellular+organization+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (1016).</li>
<li>Fraser, P., Bickmore, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+organization+of+the+genome+and+the+potential+for+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation.</a> Nature. 447, 413-417 (2007).</li>
<li>Cremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+territories--a+functional+nuclear+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Chromosome territories--a functional nuclear landscape.</a> Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).</li>
<li>Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+function+of+nuclear+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics+%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and function of nuclear bodies.</a> Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).</li>
<li>Dostie, J., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+organization+in+the+nucleus+-+charting+new+territory+across+the+Hi-Cs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs.</a> Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).</li>
<li>van Steensel, B., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+tools+for+unraveling+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomics tools for unraveling chromosome architecture.</a> Nature. 28, 1089-1095 (2010).</li>
<li>Massey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kolmogorov-Smirnov+Test+for+Goodness+of+Fit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Statistical+Association%22%5BJournal%5D)">The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit.</a> Journal of the American Statistical Association. 253, 1951(1951).</li>
<li>Collins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RUNX+transcription+factor-mediated+association+of+Cd4+and+Cd8+enables+coordinate+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation.</a> Immunity. 34, 303-314 (2011).</li>
<li>Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+interpretation+of+%CF%872+from+contingency+tables%2C+and+the+calculation+of+P%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society%22%5BJournal%5D)">On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P.</a> Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).</li>
<li>Benjamini, Y. H., Yosef, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+false+discovery+rate%3A+a+practical+and+powerful+approach+to+multiple+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society%2C+Series+B+%28Methodological%29%22%5BJournal%5D)">Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).</li>
<li>Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+accessibility%2C+nuclear+positioning%2C+recombination%2C+and+transcription+at+the+Igkappa+locus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus.</a> J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).</li>
<li>Fuxa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax5+induces+V-to-DJ+rearrangements+and+locus+contraction+of+the+immunoglobulin+heavy-chain+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene.</a> Genes Dev. 18, 411-422 (2004).</li>
<li>Goldmit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+ontogeny+of+the+Igk+locus+during+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development.</a> Nature. 6, 198-203 (2005).</li>
<li>Hewitt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+the+Igk+and+Igh+immunoglobulin+loci+mediated+by+the+3%27+Igk+enhancer+induces+%27decontraction%27+of+the+Igh+locus+in+pre-B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells.</a> Nature. 9, 396-404 (2008).</li>
<li>Johnson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+Functionally+Segregates+the+Pro-B+Cell+Stage+by+Regulating+Transcription+of+Recombination+Mediators+across+Cell+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle.</a> Journal of Immunology. , (2012).</li>
<li>Karnowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+and+nuclear+repositioning+of+the+lambda5+gene+locus+at+the+pre-b+cell+stage+requires+Aiolos+and+OBF-1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1.</a> PLoS ONE. 3, e3568(2008).</li>
<li>Kosak, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnuclear+compartmentalization+of+immunoglobulin+loci+during+lymphocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development.</a> Science. 296, 158-162 (2002).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+is+a+critical+regulator+of+B-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development.</a> Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).</li>
<li>Parker, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pre-B-cell+receptor+induces+silencing+of+VpreB+and+lambda5+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription.</a> Embo J. 24, 3895-3905 (2005).</li>
<li>Roldan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus+%27decontraction%27+and+centromeric+recruitment+contribute+to+allelic+exclusion+of+the+immunoglobulin+heavy-chain+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene.</a> Nature immunology. 6, 31-41 (2005).</li>
<li>Skok, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonequivalent+nuclear+location+of+immunoglobulin+alleles+in+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes.</a> Nature. 2, 848-854 (2001).</li>
<li>Skok, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+contraction+by+looping+of+the+Tcra+and+Tcrb+loci+in+rearranging+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes.</a> Nature immunology. 8, 378-387 (2007).</li>
<li>Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+element+in+the+mouse+Igkappa+locus+that+specifies+repertoire+and+Ig+loci+subnuclear+location%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location.</a> Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).</li>
<li>Hewitt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAG-1+and+ATM+coordinate+monoallelic+recombination+and+nuclear+positioning+of+immunoglobulin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci.</a> Nature immunology. 10, 655-664 (2009).</li>
<li>Deriano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAG2+C+terminus+suppresses+genomic+instability+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis.</a> Nature. 471, 119-123 (2011).</li>
<li>Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+repositioning+of+genes+in+the+nucleus+of+lymphocytes+preparing+for+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division.</a> Molecular cell. 3, 207-217 (1999).</li>
<li>Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+the+histone+guardian+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">H2AX: the histone guardian of the genome.</a> DNA repair. 3, 959-967 (2004).</li>
<li>Croft, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+localization+and+morphology+of+chromosomes+in+the+human+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus.</a> The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).</li>
<li>Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li>
<li>Walter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+many+colors+in+FISH+on+3D-preserved+interphase+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+genome+research%22%5BJournal%5D)">Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei.</a> Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+wave+of+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A new wave of cellular imaging.</a> Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).</li>
<li>Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMX%3A+a+new+platform+for+multimodal%2C+multichannel+wide-field+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).</li>
<li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+research+%3A+an+international+journal+on+the+molecular%2C+supramolecular+and+evolutionary+aspects+of+chromosome+biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Techniki opisane powyżej zostały wykorzystane w naszym laboratorium do analizy regulacji rekombinacji V(D)J loci immunoglobuliny i TCRA / d w rozwijających się limfocytach 30,31 . Jesteśmy przekonani, że technika ta może być zaadaptowana do wykrywania różnych białek jądrowych, przedziałów jądrowych i loci w różnych typach komórek. Modyfikacje protokołu mogą być konieczne, a w tym przypadku główne kroki, na których należy się skupić, są następujące. Po pierwsze, długość przepuszczalności można...

Mechanizmy epigenetyczne powodują tworzenie i dziedziczenie profili transkrypcyjnych specyficznych dla rozwoju i typu komórki. Na jednym poziomie wiąże się to z modulacją upakowania chromatyny, która definiuje aktywne lub ciche regiony genomu. Na większą skalę globalna organizacja 3D genomu i architektura jądrowa również odgrywają rolę w kontroli wzorców transkrypcyjnych. W związku z tym analiza tych cech epigenomicznych jest niezbędna do pełnego zrozumienia, w jaki sposób geny są regulowane 6-11.
Połączenie immunofluorescencji i 3D DNA FISH daje unikalną okazję do uzupełnienia analiz molekularnych i biochemicznych poprzez ocenę specyficznych interakcji/asocjacji sekwencji DNA i/lub białek w jądrze. Ponadto, podczas gdy techniki wysokoprzepustowe obejmujące cały genom, takie jak immunoprecypitacja chromatyny (ChIP-seq) lub konformacja wychwytywania chromosomów w połączeniu z głębokim sekwencjonowaniem (sekwencjonowanie 4C, 5C, Hi-C) dostarczają globalnych danych na temat populacji komórek12, techniki immunofluorescencji/DNA FISH umożliwiają analizy na poziomie pojedynczej komórki.
Tutaj opisujemy protokół jednoczesnego wykrywania modyfikacji histonów przez immunofluorescencję i sekwencje DNA przez DNA FISH, a następnie mikroskopię 3D i analizy (3D immuno-FISH). Zaletą tego protokołu jest połączona wizualizacja DNA i zachowanie struktur białkowych. Nasze doświadczenie w tej dziedzinie pozwoliło nam ulepszyć i uprościć istniejące protokoły. Chociaż zastosowaliśmy ten protokół do wykrywania dwuniciowych pęknięć DNA w limfocytach ulegających rekombinacji, metoda ta może być stosowana do innych białek i innych typów komórek.

<table><tbody><tr><td>H2O</td><td>Fisher</td><td># BP2470</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma</td><td># R4642</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma</td><td># DNTP100</td><td></td></tr><tr><td>Alexa dUTP</td><td>Invitrogen</td><td># C11397 do C-11401</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 lub Cy5 dUTP</td><td>Fisher</td><td># 45-001-xxx</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td># 04536282001</td><td></td></tr><tr><td>DNA Pol I</td><td>Biolabs</td><td># M0209</td><td></td></tr><tr><td>0,025 &mu; m filtry</td><td>Millipore</td><td># VSWP02500</td><td></td></tr><tr><td>Cot-1 DNA 1 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td># 18440</td><td></td></tr><tr><td>Hybloc DNA 1 mg/ml</td><td>Genetyka stosowana</td><td># MHB</td><td></td></tr><tr><td>Nasienie łososia</td><td>Sigma</td> <td># D1626</td><td>proszek do ponownego zawieszenia w stężeniu 10 mg/ml w H2O</td></tr><tr><td>NaAc (octan sodu, pH 5,2, roztwór buforowy)</td><td>Sigma</td><td># S7899</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400 (klasa Mol Biol)</td><td>Fisher</td><td># 525</td><td></td></tr><tr><td>Poliwinylopirolidon (klasa Mol Biol)</td><td>Fisher</td><td># BP431</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan dekstranu w proszku</td><td>Sigma</td> <td># D8906</td><td></td></tr><tr><td>SSPE (sól fizjologiczno-sodowo-fosforanowa-EDTA) 20x roztwór</td><td>Fisher</td><td># BP1328</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Fisher</td><td># BP227</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher</td><td># 12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td>Fisher</td><td># 12-550</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Fisher</td><td># 0720080</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 10x</td><td>Fisher</td><td># MT-46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny</td><td>Sigma</td><td># P8920</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, bryłki, 95%</td><td>Sigma</td><td># 441244</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100, Mol Biol grade</td><td>Sigma</td><td># T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumina surowicy bydlęcej) Frakcja V</td><td>Fisher</td><td># BP 1600</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Vector Labs</td><td># S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, Mol Biol grade</td><td>Sigma</td> <td># P9416</td><td></td></tr><tr><td>SSC (Solan Sodium Citrate) 20x roztwór</td><td>Fisher</td><td># BP1325</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold odczynnik zapobiegający blaknięciu</td><td>Invitrogen</td><td># P36930</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol)</td><td>Sigma</td><td># D9542</td><td></td></tr><tr><td>Najlepszy test jednowarstwowego cementu gumowego</td><td>Sklepy z artykułami</td><td></td><td></td></tr><tr> artystycznymi lub biurowymi<td colspan="4"><silny>Tabela 1. </mocny> Specyficzne odczynniki i drobny sprzęt.</td></tr></tbody></table>

połączona immunofluorescencja i dna fish na zakonserwowanych w 3d jądrach interfazowych w celu zbadania zmian w organizacji jądrowej 3d

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ przy użyciu sond DNA na trójwymiarowo zachowanych jądrach, a następnie mikroskopia konfokalna 3D (3D DNA FISH) stanowi najbardziej bezpośredni sposób wizualizacji lokalizacji loci genów, podregionów chromosomowych lub całych terytoriów w pojedynczych komórkach. Ten rodzaj analizy zapewnia wgląd w globalną architekturę jądra, a także zachowanie określonych loci genomowych i regionów w przestrzeni jądrowej. Z drugiej strony immunofluorescencja pozwala na wykrycie białek jądrowych (zmodyfikowanych histonów, wariantów i modyfikatorów histonów, maszynerii i czynników transkrypcyjnych, podkompartmentów jądrowych itp.). Głównym wyzwaniem w połączeniu immunofluorescencji i 3D DNA FISH jest z jednej strony zachowanie epitopu wykrytego przez przeciwciało, a także architektury 3D jądra, a z drugiej strony, umożliwienie penetracji sondy DNA w celu wykrycia loci genów lub terytoriów chromosomów 1-5. Tutaj przedstawiamy protokół, który łączy wizualizację modyfikacji chromatyny z loci genomowymi w jądrach zachowanych w 3D.

W laboratorium Skoka stosuje się techniki DNA-FISH i immuno-FISH do badania zmian w organizacji jądra komórkowego związanych z procesem rekombinacji V(D)J loci receptorów antygenowych podczas rozwoju limfocytów B i T. Opisane powyżej techniki pozwalają nam na: i) pomiar odległości między dwoma końcami locus (kontrakcja), ii) pomiar odległości między allelami lub loci (parowanie), iii) analizę uszkodzeń DNA występujących w obrębie loci, iv) ocenę lokalizacji alleli i loci względem podkompartymentów jądra (w naszym badaniu...

Tutaj opisujemy protokół jednoczesnego wykrywania modyfikacji histonów przez immunofluorescencję i sekwencje DNA przez DNA FISH, a następnie mikroskopię 3D i analizy (3D immuno-DNA FISH).

Połączona immunofluorescencja i DNA FISH na zakonserwowanych w 3D jądrach interfazowych w celu zbadania zmian w organizacji jądrowej 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesne wykrycie modyfikacji chromatyny i sekwencji DNA za pomocą mikroskopii konfokalnej 3D, najpierw generowane są specyficzne sondy DNA. W międzyczasie komórki eksperymentalne są utrwalone perme i wybarwione immunologicznie. Dla markerów histonowych będących przedmiotem zainteresowania.Komórki są następnie denaturowane, a w nocy dochodzi do fluorescencji w tobie. Hybrydyzacja lub ryba jest wykonywana za pomocą jednej lub więcej sond DNA. Na koniec ogniwa są myte i montowane w celu fluorescencji 3D.Analiza mikroskopowa uzyskanych obrazów ujawnia lokalizację jądrową interesujących miejsc i związek z konkretnymi modyfikacjami kamienia. Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy wizualizację białka jądrowego, w tym kamieni z loci genomowych w jądrach 3D i może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu epigenetycznej organizacji jądra chromatyny czy regulacji genów. Do znakowania tej procedury można użyć plazmidów wstecznych lub produktów PCR.Powinny one być przygotowane zgodnie z opisem w załączonym tekście. Należy pamiętać, że aby uzyskać solidny sygnał ryb, sondy powinny wydać co najmniej 10 kilopary zasad. Rozpocznij tę procedurę od połączenia jednego mikrograma DNA i 0,17 mikrograma RNA A w mikroprobówce wirówkowej.Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji na krótko dezaktywuj RNA A na lodzie i dodaj odpowiednią ilość translacji Nicka. Mieszać, inkubować przez dwie godziny w temperaturze 16 stopni Celsjusza w schłodzonej łaźni wodnej lub chłodnym bloku, aby dezaktywować reakcję.Umieść probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na godzinę lub minus 20 stopni Celsjusza przez noc. Następnie określ rozmiar sondy na 2%żelu agros. Rozmaz powinien wynosić od 101 000 par zasad, przy czym większość powinna mieć około 300 do 500 par zasad.Zauważ, że smuga sond science-fiction nie jest widoczna. Po ustaleniu wielkości należy oczyścić sondy przez dializę pod wpływem 0,02. Pięciomilimetrowe filtry w dwulitrowych zlewkach wypełnionych wodą.Delikatnie naniec pipetą 200 mikrogramów sondy na środek każdego pływającego filtra, a następnie inkubować przez dwie godziny w ciemności. Po inkubacji za pomocą pipety delikatnie przenieś sondę z filtrów do świeżej probówki mikrowirówkowej. Następnie dodaj czynniki blokujące do sond w następujący sposób.Jeden mikrogram CO 1D NA. Jeden mikrogram DNA o wysokim bloku i 10 mikrogramów nasienia łososia na jeden mikrogram sondy DNA i mieszanki przechowuj sondy DNA w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza. W dniu zabiegu rybnego sondy są wytrącane i przygotowywane do użycia. Należy pamiętać, że kroki opisane w tej sekcji filmu powinny być wykonywane równolegle z krokami opisanymi w następnej sekcji.Aby wytrącić sondy, podążaj za nimi i połącz je z 0,1 objętości trzech molowych octanów sodu o pH 5,2 i 2,5 objętości 100% etanolu inkubować przez godzinę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po inkubacji obracaj sondy w dół z prędkością 16 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut. Po wirowaniu wyrzuć supernatant i wysusz granulki na powietrzu w ciemności.W zależności od ilości i koloru sond, granulka może, ale nie musi być widoczna. Resus zawiesić osad w 15 mikrolitrach buforu hybrydyzacyjnego na warunki testowe i wstrząsnąć za pomocą termomiksera einor w ciemności w temperaturze od 37 do 45 stopni Celsjusza przez około 20 minut. Następnie, w celu denaturacji, sondy inkubują je przez pięć minut w temperaturze od 75 do 95 stopni Celsjusza.Następnie, aby uzyskać sondy wstępne, inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut na termomikserze. Bezpośrednio po inkubacji sondy zostaną nałożone na komórki na szkiełkach nakrywkowych, jak opisano w następnej części filmu. Należy zauważyć, że w przypadku kolejnych etapów czas inkubacji powinien być zmodyfikowany w razie potrzeby dla użytych przeciwciał i komórek.Kroki opisane w tej sekcji filmu należy wykonywać równolegle z krokami opisanymi w poprzedniej sekcji, zgodnie z opisem w dołączonym tekście. Upuść nieprzylegające komórki na wierzch szkiełek nakrywkowych pokrytych polilizyną do studzienek z sześcioma dołkami i pozwól im się przymocować na pięć minut. Następnie delikatnie dodaj dwa mililitry 2% aldehydu paraform w inkubacji PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej po inkubacji.Przepłucz każdą studzienkę PB S3 razy, a następnie, aby przepuszczalność komórek, dodać dwa mililitry lodowatego 0,4% Triton X 100 w PBS i inkubować przez pięć minut na lodzie. Po zassaniu przepuszczalnego roztworu, jeśli ryby DNA zostaną połączone z immunofluorescencją, należy postępować w następujący sposób. Najpierw odpipetować 100 mikrolitrów roztworu blokującego na param w wilgotnej komorze.Umieścić szkiełko nakrywkowe stroną z komórką do dołu na roztworze blokującym i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś. Okładka wsuwa się do 100 mikrolitrów kropli pierwszorzędowego przeciwciała rozcieńczonego w roztworze blokującym.Tutaj użyte przeciwciało rozpoznaje fosforylowane syryjskie 1 39 z H dwa A x lub gamma H dwa A x. Inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji za pomocą kleszczy ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe.Jeśli szkiełka nakrywkowe są trudne do zebrania, zalej je PBS i spróbuj ponownie. Przenieś każde szkiełko do studzienki z sześcioma. Płytka studzienkowa zawierająca dwa mililitry 0,2% BSA 0,1% tween 20 w PBS przemyć szkiełka nakrywkowe w tym roztworze trzy razy przez pięć minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem, następnie inkubować komórki z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem rozcieńczonym w roztworze blokującym przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemnej i wilgotnej komorze na param.Podobnie jak przed inkubacją, przepłukać komórki w 0,1% tween 20 w PB S3 razy przez pięć minut w temperaturze pokojowej w ciemności, aby utrwalić komórki, zanurzyć je w dwóch mililitrach 2% para formaldehydu w PBS na 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Po wybarwieniu komórek lub jeśli nie są barwione, kontynuuj rybowanie DNA, trzykrotnie spłukując szkiełka nakrywkowe w PBS. Następnie umieść szkiełka nakrywkowe stroną z komórkami do dołu na kropli o pojemności 100 mikrolitrów 0,1 miligrama na mililitr.RNA na param w wilgotnej komorze i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji przepłucz szkiełka osłonowe trzykrotnie w PBS, a następnie przetrzyj komórki w lodowatym kwasie solnym 0,7% Trix 100 w 0,1 molowym kwasie solnym przez 10 minut na lodzie w ciemności. Po trzech płukaniach w PBS denaturuj komórki w 1,9-molowym kwasie solnym przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności i umyj jeszcze trzy razy w lodowatym PBS obok, aby zhybrydyzować komórki z sondami.Umieść szkiełka nakrywkowe komórką do dołu na 15-mikrolitrowej kropli sondy przygotowanej w poprzedniej sekcji tego filmu na szkiełku mikroskopowym, uszczelnij szkiełko cementem gumowym i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemnej, wilgotnej komorze. Następnego dnia za pomocą kleszczy ostrożnie usuń cement gumowy ze szkiełek. Następnie przetrzyj szkiełka nakrywkowe dwoma aktami SSC i użyj kleszczy, aby ostrożnie usunąć szkiełka nakrywkowe z komórkami.Następnie umieść je w studzienkach zawierających roztwór myjący. Następnie wykonaj następujące prania z potrząsaniem w ciemności dwa XSSC przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, dwa XSSC przez 30 minut w temperaturze pokojowej i jeden XSSC przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby zamontować szkiełka, umieść szkiełka nakrywkowe stroną do dołu na 10 do 15 mikrolitrów kropli przedłużonego złotego medium montażowego zawierającego 1,5 miligrama na mililitr DPI z lakierem do paznokci. Preparaty mogą być przechowywane przez wiele miesięcy w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Gdy szkiełka są gotowe, zbierz obrazy 3D z sekcjami optycznymi oddzielonymi o 0,3 mikrona i przeanalizuj zgodnie z opisem w dokumencie towarzyszącym, aby ustalić, czy zmiany w asocjacji dwóch alleli loci receptora antygenowego są związane z regulacją procesu rekombinacji VDJ podczas rozwoju limfocytów, komórki typu dzikiego i zmutowane z niedoborem białka rekombinazy rag zostały wykorzystane do zbadania interesującego miejsca za pomocą DNA Sonda rybna wygenerowana z grzbietu, który obejmuje około 200 kilopar zasad obejmujących region genomu. Odległości między allelami mierzono między środkiem masy każdego sygnału zwrotnego w stosach obrazów 3D, przerywanymi okręgami, konturowymi kształtami jąder. Pokazane paski skali to krzywe skumulowanego rozkładu częstotliwości o długości jednego mikrona, a następnie wygenerowano cały zakres odległości między dwoma allelami mierzonymi w komórkach typu dzikiego i zmutowanych.Nieparametryczny test KS dla dwóch prób został następnie wykorzystany do oceny istotności różnic między dwoma rozkładami. Zakres najistotniejszych różnic w odległościach międzyallelicznych oceniono za pomocą serii dwóch dokładnych testów rybaków ogonowych oznaczonych niebieskimi kropkami. Najbardziej wiarygodne wartości P wskazane przez wyższe kropki znaleziono dla odległości około jednego mikrona.W ten sposób punkt odcięcia dla ścisłego powiązania lub parowania dwóch alleli został ustalony na jednym mikronie. Przedstawione tutaj skumulowane krzywe częstości wskazują zakres odległości dla ścisłego powiązania dwóch alleli od zera do 1,5 mikrona w dwóch różnych warunkach biologicznych. Znaczenie parowania dwóch alleli oceniono za pomocą dokładnego testu dwóch rybaków ogonowych dla odcięcia na jednym mikronie.Ten wykres pokazuje, że w stanie zmutowanym te dwa allele nie są związane z dużą częstotliwością, jak w typie dzikim. W ten sposób brakująca białkowa jest zaangażowana w parowanie iniczne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak połączyć immunofluorescencję i DNA ryb.Technika ta utorowała drogę naukowcom, dostarczając wglądu w globalne zmiany w architekturze jądrowej, zachowaniu określonych loci i regionów genomu w przestrzeni jądrowej oraz asocjacji określonych białek jądrowych w tych regionach. Pomaga to zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw różnych chorób po tej procedurze. Inne metody, takie jak techniki przepustowości lodu w całym genomie, takie jak chromatyna, wytrącanie immunologiczne lub wyszukiwanie chipów lub potwierdzenie wychwytu chromosomów w połączeniu z głębokim sekwencjonowaniem, takie jak pierwsza piątka C lub IC, mogą być wykonywane w celu uzyskania globalnych danych na temat populacji komórek.

combined-immunofluorescence-dna-fish-on-3d-preserved-interphase

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Połączona immunofluorescencja i DNA FISH na 3D-zachowanych jądrach interfazowych w celu badania zmian w 3D organizacji jądra

Niniejszy protokół opisuje niepromienną procedurę hybrydyzacji in-situ, która umożliwia jednoczesną identyfikację dwóch gatunków transkryptów z rozdzielczością pojedynczych komórek w cienkich przekrojach mózgu kręgowców.

Podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w świeżych przekrojach mózgu

Niniejszy artykuł opisuje dobór odpowiednich sond do techniki single-cell FISH, metody preparowania jąder blastomerów, a także hybrydyzację in situ i ocenę sygnałów w kontekście diagnostyki przedimplantacyjnej (PGD) stosowanej w warunkach klinicznych.

FISH w diagnostyce preimplantacyjnej

W tym filmie opisujemy metodę immunofluorescencji, aby zobrazować lokalizację białek naprawy DNA γH2AX i 53BP1 w miejscach pęknięć dwuniciowego DNA w napromieniowanych jądrach komórkowych.

Oparta na immunofluorescencji wizualizacja interakcji białek naprawy DNA

Opisujemy solidny i wszechstronny protokół do analizy architektury jądrowej za pomocą 3D DNA FISH przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond fluorescencyjnych.

Solidna ryba DNA 3D przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond

Materiał tutaj opisuje metodę opracowaną w celu zachowania trójwymiarowej struktury chromatyny komórek rozrodczych jąder. Zostało to nazwane metodą slajdów trójwymiarowych (3D). Metoda ta poprawia czułość wykrywania struktur subjądrowych i ma zastosowanie do immunofluorescencji, fluorescencji DNA i fluorescencji RNA hybrydyzacji in situ (FISH).

Metoda przygotowania szkiełek w celu zachowania trójwymiarowej architektury chromatyny komórek rozrodczych jąder

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców.  Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Ten protokół demonstruje sekwencyjną immunofluorescencję i immunohistochemię na kriosekcjach z wczesnych stadiów zarodków danio pręgowanego, umożliwiając precyzyjne analizy kolokalizacji w określonych populacjach komórek.

Sekwencyjna immunofluorescencja i immunohistochemia na kriowyciętych zarodkach danio pręgowanego

3D wielokolorowe DNA FISH reprezentuje narzędzie do wizualizacji wielu loci genomowych w zachowanych jądrach 3D, jednoznacznie definiując ich wzajemne oddziaływania i lokalizację w przestrzeni jądrowej na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu opisano protokół krok po kroku dla szerokiego spektrum ludzkich komórek pierwotnych.

Wielokolorowe narzędzie 3D DNA FISH do badania architektury jądrowej w ludzkich komórkach pierwotnych

Prezentujemy tutaj ulepszony protokół przygotowania całego mocowania i barwienia immunologicznego jąder Drosophila, odpowiedni do mikroskopii konfokalnej, a także umożliwiający powtarzalne i wiarygodne znakowanie. Ilustrujemy ten protokół poprzez reprezentację 3D i kwantyfikację eksperymentów kolokalizacyjnych na dużych spermatocytach S4-S5.

Barwienie immunologiczne jąder Drosophila w celu analizy konfokalnej 3D dużych spermatocytów

Poznaj połączoną metodę immunofluorescencji i DNA FISH do jednoczesnego wykrywania modyfikacji chromatyny i sekwencji DNA w zakonserwowanych jądrach 3D. Ta technika umożliwia badanie dynamiki chromatyny.

Połączona immunofluorescencja i DNA FISH na zakonserwowanych w 3D jądrach interfazowych w celu zbadania zmian w organizacji jądrowej 3D (Wideo) | JoVE Journal

Połączona immunofluorescencja i DNA FISH na zakonserwowanych w 3D jądrach interfazowych w celu zbadania zmian w organizacji jądrowej 3D

Przeglądaj więcej filmów