Obrazowanie na żywo odpowiedzi na leki w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi

Ogólnym celem tej procedury jest śledzenie w czasie rzeczywistym penetracji leku i odpowiedzi terapeutycznej na podanie leku terapeutycznego. Osiąga się to poprzez najpierw potraktowanie zwierzęcia lekiem. Następnie pachwinowy gruczoł sutkowy zawierający guz jest odsłaniany poprzez utworzenie płata skórnego.

Następnie mysz jest przenoszona do etapu mikroskopowego i mierzy się nasycenie krwi tlenem oraz częstość tętna i wprowadza się linię do podawania płynów i leków lub barwników. Na koniec pozyskiwane są zdjęcia poklatkowe do późniejszych analiz. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują zmiany w śmierci komórki lub interakcjach zrębu guza w odpowiedzi na lek za pomocą mikroskopii konfokalnej na żywo z wirującym dyskiem guzów sutka myszy.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrośrodowiska guza, takie jak to, w jaki sposób różne składniki zrębu guza wpływają na odpowiedź na terapię. Zanim zaczniesz, zapoznaj się z pisemnym protokołem, aby zapoznać się z typowymi harmonogramami podawania leków i obrazowania. Włącz sterylizator z gorącymi kulkami i pozwól mu osiągnąć co najmniej 200 stopni Celsjusza.

Po umyciu narzędzi chirurgicznych w wodzie z mydłem, w tym kleszczy z zębami, pary ząbkowanych kleszczy i dwóch par nożyczek, użyj sterylizatora z gorącymi kulkami, aby sterylizować je przez co najmniej 30 sekund. To pozwól im. Chłodny. Umieść nasącz laboratoryjny na styropianowej pokrywie, która będzie służyć jako platforma chirurgiczna.

Użyj taśmy laboratoryjnej, aby przymocować stożek nosowy z linią do systemu znieczulenia do namaczacza laboratoryjnego i pewną igłę o rozmiarze 18 na półtora cala przez taśmę do styropianowej pokrywy po obu stronach stożka nosowego, aby utrzymać stożek nosowy na miejscu. Odłóż na bok sterylną gazę Betadine. Dwa chusteczki z 70% izopropanolu to szkiełko mikroskopowe, super klej i cztery kawałki taśmy laboratoryjnej o szerokości pół cala.

Po znieczuleniu zwierzęcia w komorze indukcyjnej, gdy oddycha głęboko i powoli przenosi mysz na platformę chirurgiczną, stroną brzuszną skierowaną do góry. Aby uniknąć wysokiego ciśnienia, należy otworzyć linię anestezjologiczną do platformy chirurgicznej, a następnie zamknąć linię anestezjologiczną do komory indukcyjnej. Zmniejsz stężenie izofluranu z 4% do 2,5%Sprawdź, czy głębokość znieczulenia jest wystarczająca do operacji, wykonując szczypanie opuszki stopy.

Jeśli zwierzę nie zareaguje, użyj czterech kawałków taśmy laboratoryjnej, aby przymocować jego kończyny do platformy chirurgicznej i użyj elektrycznej maszynki do golenia, aby usunąć włosy z powierzchni brzusznej. Użyj chusteczek z 70% izopropanolem, a następnie Betadine nałożonej na sterylną gazę, aby zdezynfekować brzuszną powierzchnię zwierzęcia za pomocą nożyczek i kleszczy z zębami. Wykonaj podskórne brzuszne nacięcie linii środkowej od około trzech milimetrów powyżej cewki moczowej do wyrostka mieczykowatego.

Uważaj, aby nie przekłuwać ani nie przecinać otrzewnej nożyczkami i ząbkowanymi kleszczami. Delikatnie oderwano skórę od jamy otrzewnej z pachwinowym gruczołem sutkowym zawierającym guz, który ma być zobrazowany, nadal przyczepiony. Umieść szkiełko mikroskopowe na płatku skóry tak, aby większość guza leżała płasko po umieszczeniu myszy na scenie i aby nie była zasłonięta przez tylne kończyny.

Po prawidłowym ustawieniu szkiełka mikroskopu użyj super kleju, aby przymocować szkiełko do zewnętrznej powierzchni skóry. Usuń taśmę laboratoryjną zabezpieczającą kończyny zwierzęcia. Otwórz linię anestezjologiczną do etapu mikroskopu, a następnie zamknij linię anestezjologiczną do platformy chirurgicznej.

Szybko przenieś zwierzę na scenę mikroskopu Po przeniesieniu zwierzęcia ustaw i zabezpiecz linię anestezjologiczną i stożek nosowy, aby upewnić się, że mysz pozostaje znieczulona i znajduje się w wygodnej pozycji. Zmniejsz stężenie izofluranu do 1,5%Wystaw guz tak, aby znajdował się na górze i pośrodku jednego z pokrytych szkłem portów obrazowania na stoliku mikroskopu. Wprowadzić linię dootrzewnową na stałe z zestawem do infuzji ze skrzydełkami dołączonym do jednomililitrowej strzykawki zawierającej sterylny PBS sól fizjologiczną lub sól fizjologiczną z jodkiem propidyny.

Po wprowadzeniu linii dootrzewnowej wstrzyknąć zwierzęciu 100 mikrolitrów soli fizjologicznej z jodkiem propidyny i kontynuować wstrzykiwanie 50 mikrolitrów soli fizjologicznej z jodkiem propidyny co godzinę, aż do zakończenia sesji obrazowania. Za pomocą okularów sprawdź, czy guz jest prawidłowo ustawiony i delikatnie przyklejony taśmą do szkiełka mikroskopowego i linii dootrzewnowej. Szkiełko powinno być zabezpieczone na tyle luźno, aby nie utrudniać przepływu krwi do tkanki.

Przyklejenie taśmy do szkiełka mikroskopu pomaga zminimalizować artefakty obrazowania wprowadzane przez oddychanie zwierzęcia w celu uzyskania obrazów poklatkowych. Skorzystaj z oprogramowania micromanager o otwartym kodzie źródłowym, skompiluj i przeanalizuj surowe dane za pomocą IRIS lub innego oprogramowania do analizy obrazu. Fluorescencyjnie sprzężone nici DExT mogą być używane jako marker zastępczy do dostarczania leków do tkanek.

Pokazano tutaj przybycie fitzy sprzężonego dekstranu dwumegadaltonowego dożylnie wstrzykniętego myszu eksprymującego niebieskie białko fluorescencyjne w komórkach raka piersi. Po przybyciu leku do guza, wynaczynienie i dyfuzja mogą być obrazowane w celu określenia wewnątrznaczyniowego okresu półtrwania i dystrybucji leku. Tutaj pokazano wynaczynienie i dystrybucję 10-kilodaltonowego dekstranu LOR wstrzykniętego dożylnie myszowi wykazującemu ekspresję niebieskiego białka fluorescencyjnego w komórkach raka piersi i zielonego białka fluorescencyjnego w komórkach szpikowych.

Obrazowanie może dostarczyć informacji na temat rodzaju śmierci komórkowej, której podlegają komórki nowotworowe. W tym przypadku strukturalne zmiany jądrowe wskazujące na nekrozę lub apoptozę obserwuje się u myszy wyrażającej zielone białko fluorescencyjne sprzężone z jego dwoma b. Po leczeniu doksorubicyną, śmierć komórek nowotworowych wywołana chemioterapią często prowadzi do reaktywnej rekrutacji komórek odpornościowych do guzów.

Oto przykład tej zrębu odpowiedzi na ostre leczenie doksorubicyną u myszy wykazującej ekspresję niebieskich i zielonych białek fluorescencyjnych odpowiednio w raku piersi i komórkach szpikowych. Oprócz wizualizacji ogólnej odpowiedzi zrębu na chemioterapię, można tu również zobrazować specjalistyczne odpowiedzi zrębowe. Fagocytoza martwiczego materiału komórkowego przez sąsiednią komórkę jest pokazana po opanowaniu.

Technikę tę można wykonać w ciągu 30 do 60 minut, a zwierzęta można obrazować przez 12 do 40 godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.