Kriosekcja zbiorowisk drożdży w celu zbadania wzorców fluorescencji
26 grudnia 2012
Przedstawiamy protokół zamrażania i kriosekcji społeczności drożdży w celu obserwacji wewnętrznych wzorców komórek fluorescencyjnych. Metoda opiera się na wiązaniu metanolu i osadzaniu OCT w celu zachowania przestrzennego rozmieszczenia komórek bez inaktywacji białek fluorescencyjnych w społeczności.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wytworzenie przekrojów poprzecznych społeczności drożdży w celu zbadania przestrzennego rozmieszczenia różnych populacji komórek fluorescencyjnych w społeczności. Osiąga się to poprzez najpierw zamrożenie społeczności, a następnie utrwalenie jej za pomocą metanolu, aby zachować przestrzenne rozmieszczenie komórek w społeczności. W drugim etapie metanol jest odparowywany, aby umożliwić penetrację zatapiającego się związku OCT.
Osadzona społeczność jest następnie zamrażana w ramach przygotowań do kriosekcji. Następnie sekcje krioomowe. Społeczność i przekroje czynne można obrazować pod mikroskopem fluorescencyjnym Uzyskuje się wyniki, które pokazują przestrzenne rozmieszczenie populacji komórek fluorescencyjnych w społeczności.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak sekcja optyczna, jest to, że ujawnia ona przestrzenne rozmieszczenie populacji głęboko w tych społecznościach. Aby rozpocząć tę procedurę, hoduj społeczności drożdży na filtrze membranowym. Protokół ten odpowiada typowej społeczności mniejszej niż dwa razy 10 do ośmiu komórek na filtrze membranowym o średnicy sześciu milimetrów następnie w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.
Aby zachować większy stopień fluorescencji, użyj kawałka bibuły filtracyjnej watman 5 4 1, aby pokryć spód o średnicy jednego centymetra. Cóż, ta bibuła filtracyjna służy jako nośnik do przenoszenia społeczności W późniejszych etapach dodaj jeden mililitr minus 20 stopni Celsjusza, 100% metanolu do studni i pozostaw studnię w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aby temperatura się zrównoważyła. Teraz zamroź społeczność drożdży za pomocą pęsety, aby zanurzyć filtr membranowy ze społecznością w ciekłym azocie na co najmniej 15 sekund.
Następnie przenieś zamrożoną społeczność do studni o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Metanol w zamrażarce zapewnia, że społeczność jest utrzymywana w pozycji poziomej. Po zanurzeniu go w metanolu odczekaj 20 minut, filtr membranowy zacznie rozpadać się w metanolu.
Po 20 minutach przenieś zbiorowisko za pomocą bibuły filtracyjnej watmana z dołka metanolowego na zimną szalkę Petriego utrzymywaną w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Podczas przenoszenia utrzymuj społeczność na bieżąco z filtrem Watman przewoźnika. Odbierz dodatkowe krople metanolu za pomocą innego kawałka grubego papieru watmana przed włożeniem go na zimną szalkę Petriego.
Zapewni to, że czas parowania metanolu będzie spójny dla każdej próbki. Odczekaj od czterech do sześciu godzin, aż metanol odparuje. Zakończenie parowania we właściwym czasie ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tej procedury.
Aby uniknąć nadmiernego wysuszenia próbki, należy okresowo sprawdzać stan społeczności drożdży podczas parowania, podczas parowania metanolu. Wykonaj prostokątny sześcienny pojemnik z folii aluminiowej, który jest wystarczająco duży, tak aby próbka miała co najmniej dwa milimetry marginesów z każdej strony. Dodaj kroplę OCT na dno tego pojemnika, aby upewnić się, że próbka jest otoczona OCT ze wszystkich stron.
Po zakończeniu parowania wyjmij próbkę z zamrażarki o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Odetnij części bibuły filtracyjnej, które nie są pokryte zbiorowiskiem drożdży. Ważne jest, aby wykonać ten krok szybko.
Aby uniknąć przesuszenia próbki. Umieść społeczność na dolnej powierzchni pojemnika z folii aluminiowej i natychmiast przykryj próbkę OCT na wysokości trzech do czterech milimetrów powyżej wysokości społeczności. Poczekaj 10 minut.
Na koniec umieść osadzoną w OCT próbkę na metalowej płytce na suchym lodzie w celu zamrożenia i przechowuj zamrożone społeczności w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub minus 80 stopni Celsjusza. Przygotowując się do sekcji zamrożonych społeczności, ustaw temperaturę komory kriosekcji na minus 25 stopni Celsjusza. Pozostawić próbki w komorze do momentu, gdy jej temperatura osiągnie temperaturę komory.
Następnie usuń folię z próbki i odetnij nadmiar OCT. Nałóż kroplę OCT na uchwyt kriogeniczny i zamontuj próbkę na uchwycie krio. Rozprowadzić OCT równomiernie z boku próbki za pomocą odsłoniętej bibuły filtracyjnej Watmana, tak aby grubość OCT wynosiła od dwóch do trzech milimetrów.
Zapewnienie marginesu OCT wynoszącego od dwóch do trzech milimetrów ze wszystkich stron próbki pomaga zachować integralność sekcji. Pozwól OCT zamarznąć w komorze kriostatu przed podziałem. Użyj boków bloku próbki OCT, aby wyrównać próbkę względem ostrza.
Jeśli próbka nie jest wyrównana w stosunku do ostrza, cięcie rozpocznie się od rogu lub boku próbki. Wyreguluj mocowanie, aby upewnić się, że ostrze przecina idealnie pionową powierzchnię bloku próbki. Typowe przekroje dla zbiorowisk drożdży mają grubość około 14 mikrometrów.
Po wycięciu przekroju użyj szkiełka mikroskopowego przechowywanego w temperaturze pokojowej, aby pobrać wycinek. Powoli przesuwając szkiełko do wyciętej sekcji, sekcja stopi się i przeniesie do mikroskopu. Na jedną prowadnicę można przenieść do 18 sekcji.
Przechowuj szkiełka w niskich temperaturach, najlepiej minus 20 stopni Celsjusza przed obrazowaniem. Utrata sygnału jest minimalna, gdy jest przechowywany przez tydzień w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać maksymalny sygnał fluorescencyjny. Obrazowanie należy wykonać natychmiast po przekroju.
Przedstawiono reprezentatywne obrazy fluorescencyjne pionowych przekrojów poprzecznych zbiorowisk drożdży hodowanych w identycznych warunkach. Społeczność składa się z dwóch fototropowych szczepów Visier oznaczonych białkami fluorescencyjnymi. M wiśnia wizualizowana jako czerwona, a Y-E-G-F-P wizualizowana jako zielona konkurencja o współdzielone zasoby, w tym przestrzeń, prowadzi do kolumnowych wzorców wyświetlanych w ich pionowych przekrojach poprzecznych.
Rozdzielczości do pojedynczej komórki mogą być rozwiązywane w przekrojach poprzecznych. Na rysunku porównano przekroje poprzeczne uzyskane z mocowaniem metanolem pokazanym na dolnym panelu i bez mocowania metanolu pokazanym na górnym panelu. Sygnał fluorescencyjny jest zachowywany w sekcjach społeczności bez utrwalania, ale integralność społeczności jest zagrożona.
W rezultacie niektóre komórki odpływają wokół krawędzi sekcji, a ogólna wydajność jest niższa w porównaniu ze stałymi zbiorowiskami. Wiązanie metanolu utrzymuje komórki społeczności razem, ale powoduje kurczenie się, co obserwuje się w spadku wysokości zbiorowiska. Rysunek ten przedstawia reprezentatywne pionowe przekroje czynne jasnego pola i fluorescencji zbiorowiska drożdży składającego się z dwóch szczepów Protopic z białkami fluorescencyjnymi DS RED i YFP.
Komórki na szczycie społeczności tworzą koronę, która wydaje się odróżniać od komórek macierzystych, charakteryzując się silniejszym rozpraszaniem w jasnym polu i jaśniejszą fluorescencją. Wzorce te są zgodne z raportowanymi wzorcami różnicowania w koloniach drożdży. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać kriosekcji do badania wzorców przestrzennych fluorescencji su w społecznościach drożdży.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W tym artykule przedstawiono protokół zamrażania i kriosekcji społeczności drożdży w celu obserwacji wewnętrznych wzorców komórek świecących. Metoda wykorzystuje utrwalanie metanolem i osadzanie OCT w celu utrzymania przestrzennego rozmieszczenia komórek przy jednoczesnym zachowaniu białek fluorescencyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórkowa
- Mikroskopia fluorescencyjna
- Społeczności drożdży
Wprowadzenie
- Zrozumienie przestrzennego rozmieszczenia komórek w społecznościach jest kluczowe dla różnych badań biologicznych.
- Białka fluorescencyjne są powszechnie stosowane do znakowania specyficznych populacji komórek.
- Tradycyjne metody mogą zakłócać przestrzenne ułożenie komórek.
- Badanie to ma na celu dostarczenie niezawodnej metody zachowania rozmieszczenia komórek.
Cel badania
- Opracowanie protokołu obserwacji populacji komórek świecących w społecznościach drożdży.
- Zapewnienie zachowania przestrzennego rozmieszczenia podczas procesu zamrażania.
- Ułatwienie obrazowania przekrojów przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.
Wykorzystane metody
- Zamrażanie społeczności drożdży w celu przygotowania do kriosekcji.
- Wykorzystanie utrwalania metanolem w celu zachowania rozmieszczenia komórek.
- Odparowywanie metanolu w celu umożliwienia osadzania OCT.
- Wykonanie kriosekcji i obrazowania za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
Główne wyniki
- Pomyślne zachowanie populacji komórek świecących w przekrojach.
- Wyraźna wizualizacja przestrzennego rozmieszczenia w społeczności drożdży.
- Demonstracja skuteczności proponowanej metody.
- Wyniki wspierają dalsze badania nad dynamiką społeczności drożdży.
Wnioski
- Protokół skutecznie zachowuje przestrzenne ułożenie komórek świecących.
- Metodę tę można zastosować do różnych badań dotyczących drożdży i innych społeczności mikroorganizmów.
- Przyszłe badania mogą bazować na tych ustaleniach, aby zbadać interakcje komórkowe.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding spatial organization in microbial communities is critical for de-risking target validation in antimicrobial and microbiome therapeutics. Cryosectioning yeast communities enables high-resolution fluorescence mapping of gene expression and cell distribution, supporting mechanistic insights into community function and stability. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by preserving native spatial architecture without disrupting fluorescent reporters.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of spatial hypotheses in microbial communities by preserving fluorescent reporter patterns for target validation studies.
- Operational Value: Provides a reproducible method to assess gene expression localization without disrupting community integrity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively imageable sections for screening fluorescent reporters in spatially resolved microbial assays.
- Operational Value: Supports assay standardization through consistent cryosection thickness and fluorescence preservation across replicates.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational biomarker analysis by linking spatial gene expression patterns to community-level phenotypes in yeast models.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical evaluation by preserving spatial context in frozen, sectioned samples.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by enabling spatially resolved fluorescence readouts that inform target engagement and pathway modulation in microbial systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of spatial organization in microbial communities through preserved fluorescence imaging.
- Screening: Delivers assay-ready sections with quantitative fluorescence outputs for evaluating modulator effects on community structure.
- Analytics: Provides spatial fluorescence measurements that allow comparison of conditions based on internal organization patterns.
- Translational Research: Connects spatial gene expression to community function, supporting biomarker alignment in preclinical yeast models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for spatial profiling applicable across microbial strain panels and culture conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by revealing true spatial distribution of fluorescent populations, reducing artifacts from optical scattering.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, embedding, and sectioning parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing spatially resolved data on target engagement in community contexts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated spatial mechanisms in microbial systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and cryostat operation for sectioning and imaging.
- Depends on cryostat, microtome, and fluorescence microscope infrastructure for section preparation and visualization.
- Necessitates standardization of fixation duration, OCT infiltration, and section thickness across teams.
- Involves adaptation considerations for different microbial community sizes and extracellular matrix compositions.
- Limited by tissue integrity during methanol evaporation and OCT embedding, requiring precise timing to avoid over-drying or poor infiltration.
