Name: Kriosekcja zbiorowisk drożdży w celu zbadania wzorców fluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Poznaj metodę kriosekcji zbiorowisk drożdży z utrwalaniem metanolem i zanurzeniem w OCT w celu zachowania przestrzennego rozmieszczenia fluorescencyjnych komórek. Technika umożliwia mikroskopię fluorescencyjną wewnątrz struktur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Laboratorium Jonathana Coopera w Fred Hutchinson Cancer Research Center za zgodę na korzystanie z ich kriostatu. Praca ta była wspierana przez NIH i Fundację W.M. Kecka. BM jest stypendystką Gordon and Betty Moore w Life Science Research Foundation. Jesteśmy wdzięczni Danielowi Gottschlingowi za podzielenie się z nami swoim protokołem naprawczym.

1. Naprawianie społeczności drożdży
<ol>
	<li>Hoduj zbiorowiska drożdży na filtrze membranowym (np. filtr membranowy Millipore MF; Rysunek 2A). Protokół ten odpowiada typowemu zbiorowisku składającemu się z mniej niż 2x108 komórek na filtrze membranowym o średnicy 6 mm.</li>
	<li>Użyj kawałka bibuły filtracyjnej Whatman 541, aby przykryć dno studzienki o średnicy 1 cm (Rysunek 2B). Ten papier Whatman zostanie wykorzystany jako nośnik do przekazania społeczności w późniejszych etapach. Dodać 1 ml 100% metanolu do studzienki i pozostawić studzienkę w temperaturze -20 °C, aby temperatura się wyrównała.</li>
	<li>Wlej płyn N2 do dewara. Zamrozić społeczność w ciekłym azocie, zanurzając społeczność na co najmniej 15 sekund w ciekłymN2 za pomocą pęsety (rysunek 2C).</li>
	<li>Przenieść zamrożone zbiorowisko do studni metanolu o temperaturze -20 °C (rysunek 2D). Upewnij się, że zbiorowisko jest utrzymywane w pozycji poziomej podczas zanurzania go w metanolu. Odczekaj 20 min. Filtr membranowy MF zaczyna rozpadać się w metanolu.</li>
	<li>Przenieść zbiorowisko za pomocą bibuły filtracyjnej Whatman 541 z dołka metanolu na zimną szalkę Petriego utrzymywaną w temperaturze -20 °C w celu odparowania metanolu (rysunek 2E). Podczas przenoszenia trzymaj społeczność na filtrze Whatman i odbierz dodatkowe krople metanolu za pomocą innego kawałka grubego papieru Whatman przed włożeniem do zimnej szalki Petriego. Zapewni to, że czas parowania będzie stały dla każdej próbki.</li>
	<li>Poczekaj 4-6 godzin na odparowanie, aż filtr Whatman nośny będzie wyglądał na suchy. Niewystarczające parowanie pozostawia resztki metanolu, który przeszkadza w dzieleniu. Nadmierne przesuszenie powoduje pęknięcia i deformacje w społecznościach.</li>
	<li>Pobrać próbkę z zamrażarki o temperaturze -20 °C. Odetnij bibułę filtracyjną Whatman 541, która nie jest objęta przez społeczność.</li>
	<li>Wykonać prostokątny sześcienny pojemnik z folii aluminiowej, który jest wystarczająco duży, tak aby próbka miała co najmniej ~2 mm marginesu z każdej strony (rysunek 2F). Umieść społeczność na dolnej powierzchni pojemnika z folii aluminiowej; natychmiast przykryj próbkę OCT do 3 ~ 4 mm powyżej wysokości zbiorowiska. W razie potrzeby orientacja próbki może być dostosowana na tym etapie w odniesieniu do ścianek pojemnika. Odczekaj 10 min.</li>
	<li>Umieścić próbkę osadzoną w KTZ na metalowej płytce na suchym lodzie w celu zamrożenia. Zamrożone zgrupowania należy przechowywać w temperaturze -20 °C lub -80 °C w zamrażarce.</li>
</ol>
2. Dzielenie zamrożonych społeczności do obrazowania fluorescencyjnego
<ol>
	<li>Ustawić temperaturę komory kriosekcji na -25 °C i pozostawić próbki w komorze do momentu, aż jej temperatura osiągnie temperaturę komory.</li>
	<li>Zamontuj próbkę na uchwycie kriogenicznym po nałożeniu kropli OCT na uchwyt. Rozprowadzić OCT równomiernie po stronie próbki za pomocą odsłoniętej bibuły filtracyjnej Whatman (dno pojemnika) tak, aby grubość OCT wynosiła 2-3 mm. Pozwól OCT zamarznąć w komorze kriostatu przed podziałem. Zapewnienie marginesu OCT wynoszącego 2-3 mm ze wszystkich stron próbki pomaga zachować integralność sekcji.</li>
	<li>Boki bloku próbki OCT mogą być używane do wyrównania próbki. Jeśli próbka nie jest wyrównana w stosunku do ostrza, cięcie rozpocznie się od rogu lub boku próbki. Wyreguluj mocowanie, aby upewnić się, że ostrze tnie idealnie pionową (lub poziomą) powierzchnię bloku próbki.</li>
	<li>Typowe przekroje dla zbiorowisk drożdży mają grubość ~14 μm. Po wycięciu przekroju użyj szkiełka mikroskopowego utrzymywanego w temperaturze pokojowej, aby zebrać wycinek, powoli zbliżając szkiełko do wyciętego odcinka. Przekrój stopi się i zostanie przeniesiony na szkiełko mikroskopowe. Na jedną prowadnicę można przenieść do 18 sekcji.</li>
	<li>Szkiełka należy przechowywać w niskich temperaturach, najlepiej -20 °C, przed obrazowaniem. Utrata sygnału jest minimalna w przypadku przechowywania przez tydzień w temperaturze 4 °C. Aby uzyskać maksymalny sygnał fluorescencji, obrazowanie najlepiej wykonywać natychmiast po przekroju.</li>
</ol>

<ol><li>Tolker-Nielsen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+of+Microbial+Biofilm+Communities%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities.</a> Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).</li>
<li>Moller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+In+Situ+Gene+Expression+in+Mixed-Culture+Biofilms%3A+Evidence+of+Metabolic+Interactions+between+Community+Members%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)"> In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).</li>
<li>Lepp, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanogenic+Archaea+and+human+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Methanogenic Archaea and human periodontal disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).</li>
<li>Váchová, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony%3A+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).</li>
<li>Mináriková, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+Gene+Expression+in+Cells+within+Yeast+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies.</a> Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).</li>
<li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+cooperation+in+engineered+yeast+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synthetic cooperation in engineered yeast populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).</li>
<li>Momeni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+generates+a+unique+spatial+signature+in+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities.</a> , Submitted (2012).</li>
<li>Kiernan, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKiernan%2C+J+%22Histological+and+Histochemical+Methods%3A+Theory+and+Practice%22">Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice</a>. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4(2008).</li>
<li>Piccirillo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rim101p%2FPacC+Pathway+and+Alkaline+pH+Regulate+Pattern+Formation+in+Yeast+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies.</a> Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Przedstawiona tutaj procedura umożliwia zbadanie wewnętrznej struktury zbiorowisk drożdży. Etap wiązania metanolu sprawia, że kolonia drożdży jest sztywna8 i zachowuje integralność kolonii; Powoduje to jednak również skurcz8 , który należy wziąć pod uwagę przy interpretacji wyników. Zazwyczaj obserwujemy około 30% spadek wysokości kolonii drożdży, w porównaniu z koloniami bezpośrednio osadzonymi w OCT bez wiązania9.
Aby uniknąć kurczenia się, alternatywnym pod...

<table><tbody><tr><td>100% metanol</td><td>J.T. Baker</td><td>9070-01</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Andwin Scientific</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Grade No. 541 Ilościowa bibuła filtracyjna</td><td>Whatman</td><td>1541-047</td><td></td></tr><tr><td>Filtr membranowy Millipore-MF</td><td>Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 1510 S</td><td></td></tr></tbody></table>

kriosekcja zbiorowisk drożdży w celu zbadania wzorców fluorescencji

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Mikroby zazwyczaj żyją w społecznościach. Uważa się, że organizacja przestrzenna komórek w społeczności wpływa na przetrwanie i funkcjonowanie społeczności1. Techniki przekroju optycznego, w tym mikroskopia konfokalna i dwufotonowa, okazały się przydatne do obserwacji organizacji przestrzennej zbiorowisk bakteryjnych i archeonów2,3. Połączenie obrazowania konfokalnego i fizycznego podziału kolonii drożdży ujawniło wewnętrzną organizację komórek4. Jednak bezpośrednia sekcja optyczna przy użyciu mikroskopii konfokalnej lub dwufotonowej była w stanie dotrzeć tylko do kilku warstw komórek w głąb kolonii drożdży. To ograniczenie jest prawdopodobnie spowodowane silnym rozpraszaniem światła z komórek drożdży4.
Tutaj prezentujemy metodę opartą na utrwalaniu i kriosekcji w celu uzyskania przestrzennego rozmieszczenia komórek fluorescencyjnych w społecznościach Saccharomyces cerevisiae. Używamy metanolu jako utrwalacza, aby zachować przestrzenne rozmieszczenie komórek. Stałe społeczności są infiltrowane związkiem OCT, zamrażane i kriowycinane w kriostacie. Obrazowanie fluorescencyjne skrawków ujawnia wewnętrzną organizację komórek fluorescencyjnych w społeczności.
Przykłady społeczności drożdży składających się ze szczepów wyrażających czerwone i zielone białka fluorescencyjne pokazują potencjał metody kriosekcji do ujawnienia przestrzennego rozmieszczenia komórek fluorescencyjnych, jak również ekspresji genów w koloniach drożdży2,3. Mimo że skupiliśmy się na zbiorowiskach Saccharomyces cerevisiae, tę samą metodę można potencjalnie zastosować do badania innych zbiorowisk drobnoustrojów.

Obrazy fluorescencyjne przekrojów pionowych społeczności drożdży zawierających populacje konkurencyjne oznakowane czerwonym i zielonym barwnikiem6 przedstawiono na Rysunku 3. Społeczności te składają się z dwóch szczepów drożdży prototroficznych, a ich konkurencja o wspólne zasoby, w tym przestrzeń, prowadzi do powstania wzorów kolumnowych7, co widać w ich przekrojach pionowych. W przekrojach możliwa jest rozdzielczość na poziomie pojedynczej komórki. Rysunek 3 poró...

Przedstawiamy protokół zamrażania i kriosekcji społeczności drożdży w celu obserwacji wewnętrznych wzorców komórek fluorescencyjnych. Metoda opiera się na wiązaniu metanolu i osadzaniu OCT w celu zachowania przestrzennego rozmieszczenia komórek bez inaktywacji białek fluorescencyjnych w społeczności.

Kriosekcja zbiorowisk drożdży w celu zbadania wzorców fluorescencji

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wytworzenie przekrojów poprzecznych społeczności drożdży w celu zbadania przestrzennego rozmieszczenia różnych populacji komórek fluorescencyjnych w społeczności. Osiąga się to poprzez najpierw zamrożenie społeczności, a następnie utrwalenie jej za pomocą metanolu, aby zachować przestrzenne rozmieszczenie komórek w społeczności. W drugim etapie metanol jest odparowywany, aby umożliwić penetrację zatapiającego się związku OCT.Osadzona społeczność jest następnie zamrażana w ramach przygotowań do kriosekcji. Następnie sekcje krioomowe. Społeczność i przekroje czynne można obrazować pod mikroskopem fluorescencyjnym Uzyskuje się wyniki, które pokazują przestrzenne rozmieszczenie populacji komórek fluorescencyjnych w społeczności.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak sekcja optyczna, jest to, że ujawnia ona przestrzenne rozmieszczenie populacji głęboko w tych społecznościach. Aby rozpocząć tę procedurę, hoduj społeczności drożdży na filtrze membranowym. Protokół ten odpowiada typowej społeczności mniejszej niż dwa razy 10 do ośmiu komórek na filtrze membranowym o średnicy sześciu milimetrów następnie w zamrażarce o t

cryosectioning-yeast-communities-for-examining-fluorescence-patterns

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kryosekcjowanie spółek drożdży w celu zbadania wzorców fluorescencji

Opisano niezawodną metodę monitorowania transportu organelli do kwaśnego światła wakuoli drożdżowej w celu ich degradacji i recyklingu. Metoda ta opiera się na specyficznym znakowaniu docelowych organelli za pomocą genetycznie kodowanego dwuemisyjnego fluorescencyjnego biosensora pH oraz wizualizacji pojedynczych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii w drożdżach Saccharomyces cerevisiae

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do liczenia mRNA w pojedynczych komórkach w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki.

Wizualizacja i analiza cząsteczek mRNA z wykorzystaniem fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ u Saccharomyces cerevisiae

Ten manuskrypt opisuje łatwą w użyciu i tanią metodę kriofiksacji do wizualizacji komórek zawiesinowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Zamrażanie wgłębne: narzędzie do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Ten protokół jest skuteczną, szybką metodą hodowli drożdży i pleśni Aspergillus fumigatus z dużych zestawów próbek gleby w ciągu zaledwie 7 dni. Metody te można łatwo modyfikować w celu dostosowania do różnych pożywek inkubacyjnych i temperatur w zależności od potrzeb eksperymentów.

Izolacja drożdży i pleśni nadających się do hodowli z gleb w celu zbadania struktury populacji grzybów

Drożdże rozszczepienia są tutaj używane jako heterologiczne gospodarze do ekspresji bakteryjnych białek cytoszkieletu, takich jak FtsZ i MreB, jako translacyjnych białek fuzyjnych z GFP, aby uwidocznić ich polimeryzację. Również związki, które wpływają na polimeryzację, są identyfikowane przez obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

Ten protokół dostarcza wyczerpujących wytycznych dotyczących konfiguracji i ilościowego monitorowania kokultur, w tym fotoautotroficznych cyjanobakterii wydzielających cukier i drożdży heterotroficznych.

Składanie i kwantyfikacja kokultur łączących drożdże heterotroficzne z fototroficznymi cyjanobakteriami wydzielającymi cukier

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Poznaj metodę kriosekcji zbiorowisk drożdży z utrwalaniem metanolem i zanurzeniem w OCT w celu zachowania przestrzennego rozmieszczenia fluorescencyjnych komórek. Technika umożliwia mikroskopię fluorescencyjną wewnątrz struktur.

Kriosekcja zbiorowisk drożdży w celu zbadania wzorców fluorescencji

Przeglądaj więcej filmów