Test wizualny do monitorowania konkurencji bakteryjnej za pośrednictwem T6SS

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena zdolności dwóch gatunków bakterii do konkurowania ze sobą, gdy rozwijają się w tej samej niszy. W szczególności ocenimy rolę systemu wydzielania typu szóstego lub typu szóstego w tym procesie konkursowym. Osiąga się to poprzez przygotowanie płytek wejściowych do testu z komórkami dawcy z aktywnym typem szóstym lub komórkami ofiary, które staną się niebieskimi płytkami w skali OnX.

Następnie przygotowuje się płytki wyjściowe testu, na których łączy się szczepy dawcy i pochwały. Następnie płytki są inkubowane, aby umożliwić wystąpienie aktywności typu szóstego. Następnie przygotowuje się rozcieńczanie szeregowe z płytek wejściowych i wyjściowych, a rozcieńczone kultury są nakrapiane na płytkach wejściowych i wyjściowych odczytu.

Uzyskano wyniki, które pokazują różnice w dominacji koloru niebieskiego w każdym miejscu na podstawie prostej obserwacji wizualnej wskazującej na przeżycie komórek ofiary w każdym przypadku. Im więcej niebieskiego oznacza, tym większa przeżywalność ofiary, a tym samym słaba aktywność zabijania komórek dawcy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak liczenie jednostek tworzących kolonie, jest to, że metoda ta jest łatwa, nie zajmuje dużo czasu i pozwala na bezpośrednią ocenę aktywności typu szóstego w stosunku do danej ofiary.

Tak więc ta technika ocenia aktywność fok bakteryjnych w mieszanych kulturach, a zatem może pomóc w zrozumieniu, dlaczego niektóre przewlekłe infekcje wielodrobnoustrojowe ostatecznie zostają zdominowane przez jeden gatunek bakterii, tak jak ma to miejsce w przypadku pseudomona shin w płucach pacjentów z mukowiscydozą. Aby rozpocząć grube komórki dawcy aerogenu Pseudomonas, które są typu szóstego aktywnego D dodatniego lub typu szóstego nieaktywnego D ujemnego na płytkach LB agar lub LBA przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W przedstawionym tutaj przykładzie użyliśmy szczepu Pseudomonas aerogen RET S, posiadającego konstytutywnie aktywny H jeden typ szósty oraz izogenicznego mutanta z delecją inżyniera klastra genu H jeden typu szóstego, komórki biorcy E. coli lub ofiary poprzez transformację DH 5 alfa z plazmidem, umożliwiając uzupełnienie alfa brakującego genu.

Wyizolować bakterie z wywaru glicerolu na LB za pomocą XGL i odpowiedniego antybiotyku i inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza następnego dnia. Wybierz i wybierz niebieskie transformanty i przygotuj nocną hodowlę w pięciu mililitrach tryptyków, bulionu sojowego lub TSB z antybiotykiem rosnąć pod mieszaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza do eksperymentu następnego dnia przygotuj płytki LBA oznaczone jako wejście do testu dla szczepów, D dodatnich, D, ujemnych i P oraz wynik testu dla D ujemnego plus P i D dodatniego plus P. Dla każdej wejściowej hodowli komórek, zmierzyć gęstość optyczną i obliczyć objętość wymaganą do uzyskania gęstości komórek odpowiadającej jednej jednostce OD 600. Zbierz każdą kulturę w sterylnej mikroprobówce o pojemności 1,5 mililitra.

Po pilotowaniu próbek bakteryjnych z prędkością 13 000 obr./min przez jedną minutę i zawieszeniu granulek przez Resus w 100 mikrolitrach świeżego TSB, zaszczepij 10 mikrolitrów każdego szczepu jako pojedyncze miejsce na płytce wejściowej A. Następnie delikatnie wymieszaj 30 mikrolitrów D dodatnich z 30 mikrolitrami P i w drugiej probówce 30 mikrolitrów D ujemnych z 30 mikrolitrami P. Następnie zaszczep wyjście A płytki 20 mikrolitrami plamki każdej mieszaniny. Po pozostawieniu plam do wyschnięcia w pobliżu abusa i palnika, inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić zabicie bakterii.

Aby przeanalizować skuteczność zabijania bakterii, przygotuj płytki LBA zawierające 40 mikrogramów na mililitr xal. W celu odczytu testu oznacz wejście odczytu płytki w celu wykrycia wyizolowanych bakterii lub wyjście wyjściowe, aby wykryć mieszane kultury bakteryjne z tyłu każdej płytki podzielone na cztery równe części i oznaczyć sekcję zero 10 do minus jeden, 10 do minus dwa i 10 do minus trzy. Każde rozcieńczenie pozwoli na półilościową ocenę stosunku niebiesko-białych bakterii w tym samym miejscu.

Za pomocą sterylnej pętli zbierz poszczególne plamki bakteryjne z płytki wejściowej A i płytki wyjściowej A i ponownie zawieś każdą plamkę w oddzielnych mikroprobówkach o pojemności 1,5 mililitra zawierających jeden mililitr TSB. Potrząsaj probówkami przez 30 minut, aby ponownie zawiesić bakterie, podczas gdy kultury się trzęsą. Przygotuj pięć zestawów po trzy mikroprobówki, z których każda zawiera 900 mikrolitrów TSB.

Następnie, zaczynając od każdego ponownie zawieszonego miejsca, przygotować dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia, używając świeżych końcówek i krótko wirując między punktami rozcieńczania każdego rozcieńczenia na płytkach LVA xal, zaczynając od najbardziej rozcieńczonej próbki, a kończąc na próbce nierozcieńczonej. Posiewanie probówek wejściowych A na płytkach wejściowych R i rozcieńczenie wyjściowe A na płytkach wyjściowych R na punkt odtwarzalności 20 mikrolitrów w trzech egzemplarzach w każdym kwadrancie. Aby określić ilościowo esej konkursowy na tym etapie, podaj 100 mikrolitrów z 10 do minus trzech rozcieńczeń z próbek wyjściowych A w trzech powtórzeniach na płytkach LBA, xga inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i policz niebieskie kolonie w sterylnym obszarze, pozostaw płytki otwarte, aby umożliwić wchłonięcie nadmiaru płynu i zysk inkubatora przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, w którym to czasie nadal ma miejsce zabijanie.

Ponieważ oba szczepy są nadal w kontakcie z wyjściowym obrazem analizy lub zeskanuj płytki. Plamy, które pozostają w dużej mierze niebieskie, wskazują, że E. coli nie została zabita. Jak to jest typowe w przypadku hodowli z pokazanym wadliwym szczepem pozowym typu szóstego, oto seryjne rozcieńczenie płytek wejściowych do odczytu dla szczepów użytych w tym teście.

Zgodnie z oczekiwaniami, plamki P przed ekspresją brakującego genu P wydają się niebieskie na pożywkach uzupełnionych XGL, podczas gdy szczepy D dodatnie typu 6 aktywne i D ujemny typ 6 nieaktywne pozostają białe. Płytki wyjściowe odczytu, na których zauważono mieszankę między zdobyczą a aktywnym szczepem D dodatnim P typu szóstego, pokazują zniknięcie niebieskiej ofiary, wskazując w ten sposób, że została ona zabita. Pokazuje to zdolność dawcy do prześcignięcia ofiary.

Trwałość niebieskiego koloru na płytce D ujemnego P pokazuje niezdolność nieaktywnego dawcy typu szóstego do zabicia niebieskiej ofiary. Tak więc, próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, że wymagania dotyczące wzrostu lub aktywności wydzielania typu szóstego mogą się różnić w zależności od gatunku bakterii, a zatem może wymagać niewielkiej korekty konfiguracji eksperymentalnej. Ponadto musisz również pamiętać, że jeśli chcesz ocenić aktywność wydzielania typu szóstego u jednego gatunku, bardzo ważne jest również ścisłe porównanie aktywności mutanta wydzielającego typu szóstego ze szczepem rodzicielskim, gdy tylko jest to możliwe.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś lepiej zrozumieć, jak przygotować esej wizualny, aby ocenić przeżycie komórek pre po kontakcie ze szczepem biegłym typu szóstego lub wadliwym typu szóstego.