Name: Test wizualny do monitorowania konkurencji bakteryjnej za pośrednictwem T6SS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Poznaj test wizualny do monitorowania konkurencji bakteryjnej za pomocą systemu sekrecji typu VI (T6SS) u Pseudomonas aeruginosa. Ta metoda pozwala ocenić przeżywalność komórek Escherichia coli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez WT091939MA grantu Wellcome Trust. Alain Filloux jest wspierany przez Royal Society.

1. Szczepy i kultury bakterii
<ol>
 <li>Inżynieria komórki biorcy Escherichia coli (Prey, P) poprzez transformację (przy użyciu standardowego traktowania CaCl2 lub elektroporacji)15 komórek DH5α E. coli z plazmidem umożliwiającym komplementację a genu lacZ (Tabela 1). Ułożyć przekształcone komórki na płytkach agarowych Luria-Bertani (LBA, 1,5% agar) zawierających 5-bromo-4-chloro-indolilo-β-D-galaktopyranozyd (X-gal) w stężeniu końcowym 40 mg/ml i odpowiednim antybiotyku. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc, a następnego dnia rano wybrać niebieskie transformanty (patrz §1.3).</li>
 <li>Hodować komórki dawcy Pseudomonas aeruginosa, które są aktywne T6SS (D+) lub nieaktywne T6SS (D-) (Tabela 1) na LBA przez noc w temperaturze 37 °C. W przedstawionym przykładzie użyliśmy szczepu P. aeruginosa retS posiadającego konstytutywnie aktywny H1-T6SS16 i izogeniczny mutant z delecją klastra genów H1-T6SS (tab. 1).</li>
 <li>Następnego dnia przygotować przez noc płynną kulturę w napowietrzonej kolbie, zaszczepiając jasnoniebieski klon wśród transformantów E. coli (P) z płytki opisanej w §1.1, w 5 ml tryptycznego bulionu sojowego (TSB) uzupełnionego odpowiednim antybiotykiem. Rosnąć pod wpływem mieszania w temperaturze 37 °C. Postępować równo z pojedynczą kolonią (D+) i (D-) z płytki opisanej w §1.2.</li>
</ol>
2. Test konkurencji
<ol>
 <li>Przygotuj płytki LBA do eksperymentu następnego dnia. Upewnij się, że te płyty są odpowiednio wysuszone (w pobliżu palnika Bunsena lub w komorze z przepływem laminarnym). Przygotować płytkę "Wejście do testu" (A-Input) dla szczepów (D+), (D-) i (P). Przygotować płytkę "Wynik testu" (wyjście A) dla szczepów (D-+P) i (D++P). Podziel i odpowiednio oznacz talerze.</li>
 <li>Po nocnym wzroście (patrz §1.3) zmierzyć gęstość optyczną (OD600nm) wejściowej kultury bakteryjnej (D-, D+ i P) i obliczyć objętość wymaganą do uzyskania gęstości komórek odpowiadającej 1 jednostce OD600nm każdego szczepu. Każda "wejściowa" hodowla komórkowa (D-, D+ i P) jest początkowo pobierana w sterylnych probówkach Eppendorfa o pojemności 1,5 ml.</li>
 <li>Odwirować próbki bakteryjne z prędkością 13 000 obr./min w ciągu 1 minuty w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.</li>
 <li>Zawiesić osady kultur D-, D+ i P w 100 μl świeżego TSB za pomocą delikatnego pipetowania i zaszczepić 10 ml każdego odpowiedniego szczepu jako pojedyncze miejsce na płytce "wejściowej A" (przygotowanej w §2.1).</li>
 <li>Zaszczepić płytkę "A-wyjście" (przygotowaną w §2.1). Dokładniej, delikatnie wymieszaj 30 μl (D+) z 30 μl (P) i 30 μl (D-) z 30 ml (P) w dwóch oddzielnych probówkach Eppendorfa (należy pamiętać, że użyte kultury są opisane w §2.4). Zaszczepić 20 μl mieszanin (D+/P) i (D-/P) jako pojedyncze miejsca na płytce wyjściowej A. Pozostawić plamy do wyschnięcia w pobliżu palnika Bunsena i umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na odpowiedni okres czasu, podczas którego ma miejsce zabijanie bakterii. W przypadku P. aeruginosa skuteczne zabijanie bakterii obserwuje się po 5 godzinach inkubacji, porównując aktywny szczep T6SS z wadliwym szczepem T6SS.</li>
</ol>
3. Jakościowa obserwacja zabijania bakterii
<ol>
 <li>Przygotować płytki LBA zawierające 40 μg/ml X-gal do odczytu testu. Płytki będą nazywane "Wejście odczytu" lub "Wejście R", aby wykryć izolowane bakterie, lub "Wyjście odczytu" lub "Wyjście R", aby wykryć mieszane kultury bakterii, a tym samym odczytać skuteczność zabijania. Talerze te muszą być również odpowiednio wysuszone. Podzielić płytkę na cztery równe części znajdujące się na jej odwrocie i opatrzyć te części adnotacjami 0, 10-1, 10-2 i 10-3, wyznaczając rozcieńczenia kultury bakteryjnej do naznaczenia na płytkach agarowych (patrz §3.3). Rozcieńczenie pozwoli na półilościową ocenę stosunku bakterii niebieskich do białych w tym samym miejscu.</li>
 <li>Zebrać sterylną pętlą poszczególne plamki bakteryjne z płytki "A-wejściowej" (patrz §2.4) i płytki "A-wyjściowej" (patrz §2.5) i ponownie zawiesić każdą plamkę w oddzielnych 1,5 ml probówkach Eppendorfa zawierających 1 ml TSB. Umieść w bloku wytrząsarki Eppendorf na 30 minut, aby skutecznie zawiesić bakterie.</li>
 <li>Przygotować serię 5 razy po 3 probówki Eppendorfa zawierające 900 μl TSB i postępować dla każdego ponownie zawieszonego miejsca do dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń do 10-3. Upewnij się, że wymieniasz końcówki pipet i zmieniasz wiry na 5 sekund między każdym etapem rozcieńczania.</li>
 <li>Przejdź do nakrapiania rozcieńczeń bakteryjnych przygotowanych w §3.3 na dobrze wysuszonych płytkach LBA zawierających 40 μg/ml X-gal, zaczynając od najbardziej rozcieńczonej do nierozcieńczonej zawiesiny, tworząc płytki "R-wejściowe" dla miejsc "wejściowych A" i płytki "R-wyjściowe" dla miejsc "wyjściowych A" (Rysunek 2). Krótko wymieszaj każdą rurkę przed przystąpieniem do plamienia, aby utrzymać jednorodną zawiesinę bakteryjną. Aby uzyskać powtarzalność wyników, należy umieścić 20 μl w trzech egzemplarzach w kwadrancie (ryc. 2). Względna suchość talerza jest ważna na tym etapie, ponieważ plamki muszą pozostać indywidualnie oddzielone na talerzu i nie mogą przesuwać się do siebie. 
 Na tym etapie eksperymentu możliwe jest również ilościowe określenie testu konkurencji. Postępując zgodnie z krokiem 3.3, rozprowadzić 100 μl rozcieńczenia 10-3 na płytkach LBA zawierających 40 μg/ml X-gal. W celu odtworzenia wyników należy przystąpić do posiewu w trzech egzemplarzach dla każdego miejsca z płytki "A-wyjście". Umieścić płytki rozcieńczające w inkubatorze o temperaturze 37 °C na noc (co odpowiada 16-godzinnej inkubacji). Przejdź do liczenia niebieskich kolonii (komórek P, które pozostały przy życiu). Typowe wyniki uzyskiwane po 5 godzinach zawodów przedstawiono na rysunku 3.
 </li>
 <li>Pozostawić płytkę otwartą (bez pokrywki) w strefie sterylnej, aby umożliwić wchłanianie nadmiaru płynu w każdym miejscu.</li>
 <li>Umieścić płytkę na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C. W tym czasie inkubacji zabijanie nadal zachodzi w mieszance (D+/P), ponieważ oba szczepy są nadal w kontakcie.</li>
 <li>Zrób zdjęcie lub zeskanuj swoje płyty w celu przeprowadzenia analizy wyjściowej (Rysunek 2). Tam, gdzie plamki pozostają w dużej mierze niebieskie, oznacza to, że E. coli nie została zabita przez P. aeruginosa. Dzieje się tak w przypadku, gdy E. coli jest mieszana ze szczepem P. aeruginosa (D-) z wadą T6SS (D-) (ryc. 2, tabliczka w prawym dolnym rogu).</li>
</ol>

<ol><li>Filloux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+type+VI+secretion+machine%3A+yet+another+player+for+protein+transport+across+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The bacterial type VI secretion machine: yet another player for protein transport across membranes.</a> Microbiology. 154 (6), 1570(2008).</li>
<li>Cascales, E., Cambillau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+type+VI+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Structural biology of type VI secretion systems.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 367 (1592), 1102(2012).</li>
<li>Leiman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+T4+tail+and+tail+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the T4 tail and tail fibers.</a> Virol. J. 7, 355(2010).</li>
<li>Ballister, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+self-assembly+of+tailorable+nanotubes+from+a+simple+protein+building+block%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vitro self-assembly of tailorable nanotubes from a simple protein building block.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (10), 3733(2008).</li>
<li>Leiman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+apparatus+and+phage+tail-associated+protein+complexes+share+a+common+evolutionary+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion apparatus and phage tail-associated protein complexes share a common evolutionary origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (11), 4154(2009).</li>
<li>Pukatzki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+system+translocates+a+phage+tail+spike-like+protein+into+target+cells+where+it+cross-links+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion system translocates a phage tail spike-like protein into target cells where it cross-links actin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (39), 15508(2007).</li>
<li>Ma, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+a+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+effector+requires+bacterial+endocytosis+by+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Translocation of a Vibrio cholerae type VI secretion effector requires bacterial endocytosis by host cells.</a> Cell Host Microbe. 5 (3), 234(2009).</li>
<li>Hood, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+type+VI+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa+targets+a+toxin+to+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa targets a toxin to bacteria.</a> Cell Host Microbe. 7 (1), 25(2010).</li>
<li>Russell, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+delivers+bacteriolytic+effectors+to+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion delivers bacteriolytic effectors to target cells.</a> Nature. 475 (7356), 343(2011).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+type+VI+secretion+effector+recognition+by+a+cognate+immunity+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Structural basis for type VI secretion effector recognition by a cognate immunity protein.</a> PLoS Pathog. 8 (4), e1002613(2012).</li>
<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+anti-amoebae+and+anti-bacterial+activities+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of anti-amoebae and anti-bacterial activities of the type VI secretion system in Vibrio cholerae.</a> PLoS One. 6 (8), (2011).</li>
<li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathog. 6 (8), e23876(2010).</li>
<li>Murdoch, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+opportunistic+pathogen+Serratia+marcescens+utilizes+type+VI+secretion+to+target+bacterial+competitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The opportunistic pathogen Serratia marcescens utilizes type VI secretion to target bacterial competitors.</a> J. Bacteriol. 193 (21), 6057(2011).</li>
<li>Boyer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+bacterial+type+VI+secretion+system+by+a+genome+wide+in+silico+analysis%3A+what+can+be+learned+from+available+microbial+genomic+resources%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources?</a> BMC Genomics. 10, 104(2009).</li>
<li>Maniatis, T., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring, NY. (1982).</li>
<li>Mougous, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virulence+locus+of+Pseudomonas+aeruginosa+encodes+a+protein+secretion+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A virulence locus of Pseudomonas aeruginosa encodes a protein secretion apparatus.</a> Science. 312 (5779), 1526(2006).</li>
<li>Records, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+VI+secretion+system%3A+a+multipurpose+delivery+system+with+a+phage-like+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">The type VI secretion system: a multipurpose delivery system with a phage-like machinery.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 24 (7), 751(2011).</li>
<li>Hachani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+system+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+secretion+and+multimerization+of+VgrG+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion system in Pseudomonas aeruginosa: secretion and multimerization of VgrG proteins.</a> J. Biol. Chem. 286 (14), 12317(2011).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Przedstawiona w artykule metoda pozwala na wizualną obserwację aktywności bakteriobójczej/bakteriostazy za pośrednictwem T6SS. Test przeprowadza się na powierzchni płytki agarowej. Wcześniej wykazano, że test zabijania zależny od T6SS przeprowadzony z mieszaną mieszaną płynną kulturą bakteryjną nie jest skuteczny, prawdopodobnie z powodu braku stałego kontaktu między dwiema bakteriami8. Uważa się, że T6SS działa z mechanizmem podobnym do tego, który jest używany przez bakteriofagi do wstrzykiwania DNA do komórek docelowych17. W hodowli płynnej rurkowata struktura T6SS może łatwiej pękać, może dojść do utraty kontaktu międzybakteryjnego, a toksyny nie są efektywnie dostarczane.
Jeśli chodzi o czas inkubacji, opisane przez nas 5 początkowych godzin kontaktu między szczepem dawcy a ofiarą jest wystarczające, aby zaobserwować zabijanie bakterii między P. aeruginosa i E. coli, jak pokazano na rycinie 3. Niemniej jednak wskazane jest dostosowanie czasu inkubacji poprzez wykonanie kinetycznego w celu optymalizacji warunków eksperymentalnych.
Ponieważ metoda ta jest techniką opartą na kolorze, wyniki wyjściowe mogą być zagrożone przez pigmentację szczepu dawcy. Na przykład w przypadku P. aeruginosa niektóre szczepy wytwarzają wysoki poziom kolorowych pigmentów, takich jak piocyjanina i pioweryna, które mogą zakłócać odczyt testu, co sprawia, że odróżnienie od ofiary jest stosunkowo trudne. Inne chromogenne substraty β-galaktozydazy, takie jak magenta-gal lub czerwony-gal, mogą być stosowane zamiast X-gal (Tabela 1).
Test konkurencji może wykorzystywać inne geny reporterowe do odczytu. Na przykład, podobny test przeprowadzono również przy użyciu zdobyczy znakowanych zielonym fluorescencyjnym białkiem12.
Nasz test, choć nie jest ilościowy, daje dobre wskazanie na aktywność T6SS, ponieważ opiera się na przeżyciu lub zabiciu ofiary reporterowej. Zaletą tej techniki jest to, że jest łatwa i wygodna do oceny aktywności bakteriobójczej/bakteriostazy T6SS z dowolnego gatunku bakterii. Do tej pory wykazano aktywność T6SS przeciwko bakteriom Gram-ujemnym i nie zgłoszono jeszcze żadnego wyraźnego przykładu wrażliwych na T6SS bakterii Gram-dodatnich12. Oczywiste jest również, że należy wziąć pod uwagę niezgodność w kulturze różnych gatunków bakterii do badania (np . temperatura wzrostu, natlenienie, określone podłoża).
Nasz test może być również wykorzystany do oceny, które ze składników T6SS są absolutnie niezbędne, ponieważ nawet ślady wydzielanej toksyny mogą wystarczyć do zabicia ofiary. Nawet słaba aktywność T6SS mogła być następnie wyraźnie wykryta przez nasz test w porównaniu ze standardową procedurą testowania wydzielania zależnego od T6SS przy użyciu supernatantu hodowli i analizy western blot. Jednak nadal wymagane jest prawidłowe zliczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) w celu dokładnego określenia ilościowego tej aktywności T6SS.

<table><tbody><tr><td>P. aeruginosa PAK&#916; retS (D+) (aktywny T6SS)</td><td>Szczep laboratoryjny</td><td></td><td>Opisany w numerze referencyjnym 16</td></tr><tr><td>P. aeruginosa PAK&#916; retS&#916; H1-T6SS (D-)(nieaktywny T6SS)</td><td>To badanie</td><td></td><td>Klaster H1-T6SS (obejmujący geny od PA0070 do PA0095) został usunięty w wyniku wymiany alleli zgodnie z procedurą opisaną w pozycji 18. Fragment mutatora został wygenerowany za pomocą następującego zestawu starterów: Startery fragmentów Up: 5'-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3' oraz 5'CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3'. Podkłady do fragmentów puchu : 5'-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3', <pre>5'-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3' </pre> </td></tr><tr><td>E.coli DH5&alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>18258-012</td><td>F- &#966; 80lacZ&#916; M15 &#916; (lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 &#955;- thi-1 gyrA96 relA1 </td></tr><tr><td>pBluescript II SK(+)</td><td>Agilent</td><td>212205</td><td>Ten wektor wyraża peptyd &alpha; &#946;-galaktozydazy używany do &alfa;-komplementacji.</td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520-018</td><td>Stosować w 40 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>agar Luria Bertani</td><td>Merck-chemicals</td><td>1.10283.0500</td><td></td></tr><tr><td>TSB (bulion sojowy kazeinowy)</td> <td>Oxoid</td><td>CM109</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka Vortex Skaner Genius 3</td><td>IKA</td><td>3340000</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Epson</td> V700 <td>Miernik gęstości komórek WPA Biowave CO8000</td> Magenta-gal <td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td> Bioworld <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>30350001-1 (715241)</td><td></td></tr><tr><td>Red-gal</td><td>Research organics</td><td>1364c</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 1. Użyte obciążenie, plazmid, materiał i odczynnik.</td></tr></tbody></table>

test wizualny do monitorowania konkurencji bakteryjnej za pośrednictwem t6ss

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Systemy wydzielania typu VI (T6SSs) to molekularne nanomaszyny pozwalające bakteriom Gram-ujemnym na transport i wstrzykiwanie białek do szerokiej gamy komórek docelowych1,2. T6SS składa się z 13 podstawowych komponentów i wykazuje podobieństwa konstrukcyjne do rurki ogonowej bakteriofagów3. wykorzystuje rurkę i urządzenie do nakłuwania, aby przeniknąć do otoczki komórkowej docelowych bakterii i wstrzyknąć DNA. Sugeruje się, że T6SS jest odwróconym urządzeniem bakteriofagowym, tworzącym specyficzną ścieżkę w otoczce komórki bakteryjnej, aby wyprowadzić efektory i toksyny na powierzchnię. Proces ten można posunąć dalej, a urządzenie T6SS może perforować inne komórki, z którymi bakteria ma kontakt, wstrzykując w ten sposób efektory do tych celów. Rurka ogonowa i elementy urządzenia do nakłuwania T6SS są wykonane z białek Hcp i VgrG, odpowiednio4,5.
Wszechstronność T6SS została wykazana w badaniach z użyciem różnych patogenów bakteryjnych. Vibrio cholerae T6SS może przemodelować cytoszkielet eukariotycznych komórek gospodarza poprzez wstrzyknięcie "wyewoluowanego" VgrG niosącego C-końcową domenę sieciującą aktynę6,7. Inny uderzający przykład został niedawno udokumentowany przy użyciu Pseudomonas aeruginosa, który jest w stanie namierzać i zabijać bakterie w sposób zależny od T6SS, sprzyjając w ten sposób tworzeniu się bakterii w określonych niszach mikrobiologicznych i konkurencyjnym środowisku8,9,10.
W tym ostatnim przypadku, trzy białka wydzielane przez T6SS, a mianowicie Tse1, Tse2 i Tse3 zostały zidentyfikowane jako toksyny wstrzyknięte do docelowych bakterii (Rysunek 1). Komórka dawcy jest chroniona przed szkodliwym działaniem tych efektorów poprzez mechanizm antytoksynowy, w którym pośredniczą białka odpornościowe Tsi1, Tsi2 i Tsi38,9,10. Ta aktywność przeciwdrobnoustrojowa może być monitorowana, gdy bakterie biegłe w T6SS są współhodowane na powierzchniach stałych w konkurencji z innymi gatunkami bakterii lub z nieaktywnymi bakteriami T6SS tego samego gatunku8,11,12,13.
Dostępne dane kładą nacisk na numeryczne podejście do testu konkurencji bakteryjnej, w tym czasochłonne liczenie CFU, które w dużej mierze zależy od producentów antybiotyków. W przypadku szczepów opornych na antybiotyki, takich jak P. aeruginosa, metody te mogą być nieodpowiednie. Ponadto, dzięki identyfikacji około 200 różnych loci T6SS w ponad 100 genomach bakteryjnych14, wygodne narzędzie do badań przesiewowych jest wysoce pożądane. Opracowaliśmy test, który jest łatwy w użyciu i wymaga standardowego materiału laboratoryjnego i odczynników. Metoda oferuje szybką i jakościową technikę monitorowania zależnej od T6SS aktywności bakteriobójczej/bakteriostazy poprzez wykorzystanie szczepu reporterowego jako ofiary (w tym przypadku Escherichia coli DH5α), co pozwala na uzupełnienie genu lacZ. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta jest graficzna i umożliwia szybką identyfikację fenotypów związanych z T6SS na płytkach agarowych. Ten protokół eksperymentalny może być dostosowany do innych szczepów lub gatunków bakterii, biorąc pod uwagę specyficzne warunki, takie jak pożywka wzrostowa, temperatura lub czas kontaktu.

Typowe wyniki przedstawiono na Rysunku 1, z wykorzystaniem szczepów i odczynników opisanych w Tabeli 1. Płytki pokazane na tym rysunku zostały zeskanowane po inkubacji przez noc. Płytki „Readout-Input” wykazują schemat rozcieńczeń seryjnych dla szczepów użytych w tym teście. Zgodnie z oczekiwaniami, plamki ofiar E. coli (P) nadprodukujących gen lacZ wykazują niebieski kolor na pożywce uzupełnionej o X-gal, podczas gdy szczepy dawcy P. aeruginosa (D+, T6SS aktywny) oraz (D-, T6SS nieaktywny) pozostają białe. Płytki „Readout-output”, na które nanieśliśmy mieszaninę ofiary i szczepu z aktywnym T6SS (D+/P), wykazują zanik niebieskiej ofiary, co wskazuje na jej śmierć. Dowodzi to zdolności dawcy do wyparcia ofiary. Utrzymanie niebieskiego koloru na płytce (D-/P) wykazuje niezdolność dawcy z nieaktywnym T6SS do zabicia niebieskiej ofiary.
<img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig1.jpg" alt="Schemat interakcji bakteryjnych; mechanizm T6SS; P. aeruginosa atakująca E. coli; oznaczone cytoplazma." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Zabijanie E. coli przez P. aeruginosa posiadające T6SS. P. aeruginosa wstrzykuje toksyny do docelowej komórki E. coli w sposób zależny od T6SS (wskazano białą strzałką). Dwie toksyny, Tse1 i Tse3 (pomarańczowe i czerwone kółka), są wstrzykiwane do peryplazmy E. coli i degradują peptydoglikan9. Toksyna Tse2 (żółte kółko) jest wstrzykiwana do cytoplazmy E. coli i wykazuje działanie bakteriostatyczne8,10. Połączone działanie toksyn zabija komórki docelowe (symbol błyskawicy i czaszki). Przeżywalność komórek docelowych można wykryć poprzez monitorowanie aktywności produkowanej β-galaktosydazy (patrz również Rycina 2). P. aeruginosa jest chroniona przed działaniem toksyn przez białka odpornościowe Tsi1, Tsi2 i Tsi3 (odpowiednio pomarańczowe, żółte i czerwone kwadraty)8,9,10.
<img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2.jpg" alt="Bacterial growth experiment results; petri dish diagram with different conditions; microbiology analysis." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Rysunek 2. Test na szalcach agarowych w celu monitorowania zależnego od T6SS zabijania bakterii. Na górnej części tej ryciny przedstawiono płytki „Readout-Input” zawierające rozcieńczenia seryjne D-, D+oraz P komórki. Te P komórki wejściowe są niebieskie dzięki α-komplementacji lacZ genu, a w konsekwencji wyprodukowaną $\beta$-galaktozydazę, która rozszczepia X-gal. W dolnej części przedstawiono płytki „Readout-Output”, zawierające szeregowe rozcieńczenia mieszaniny bakteryjnej pomiędzy aktywną (D+/P), lub nieaktywny (D-/P), donor T6SS P. aeruginosa szczep z E. coli ofiara <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50103/50103fig2large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony schemat</a>.
<img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig3.jpg" alt="Wykres słupkowy ilustrujący porównanie danych (D+/P) i (D-/P) z pionowymi słupkami błędu." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Ilościowe oznaczenie zabijania E. coli przez P. aeruginosa po 5 h inkubacji. Wykres przedstawia liczenie CFU E. coli opisane w kroku 3.4. Przedstawione tutaj wyniki wykazują trzykrotną różnicę między szczepami T6SS+ a T6SS-, co sugeruje, że większość procesu zabijania zachodzi w ciągu pierwszych 5 godzin kontaktu.

Opisujemy jakościowy test do monitorowania konkurencji bakteryjnej, w której pośredniczy system sekrecji Pseudomonas aeruginosa typu VI (T6SS). Test opiera się na przeżyciu/zabiciu komórek docelowych Escherichia coli zawierających lacZ-reporter. Technika ta jest regulowana w celu oceny aktywności bakteriobójczej/bakteriostazy mikroorganizmów biegłych w T6SS.

Test wizualny do monitorowania konkurencji bakteryjnej za pośrednictwem T6SS

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena zdolności dwóch gatunków bakterii do konkurowania ze sobą, gdy rozwijają się w tej samej niszy. W szczególności ocenimy rolę systemu wydzielania typu szóstego lub typu szóstego w tym procesie konkursowym. Osiąga się to poprzez przygotowanie płytek wejściowych do testu z komórkami dawcy z aktywnym typem szóstym lub komórkami ofiary, które staną się niebieskimi płytkami w skali OnX.Następnie przygotowuje się płytki wyjściowe testu, na których łączy się szczepy dawcy i pochwały. Następnie płytki są inkubowane, aby umożliwić wystąpienie aktywności typu szóstego. Następnie przygotowuje się rozcieńczanie szeregowe z płytek wejściowych i wyjściowych, a rozcieńczone kultury są nakrapiane na płytkach wejściowych i wyjściowych odczytu.Uzyskano wyniki, które pokazują różnice w dominacji koloru niebieskiego w każdym miejscu na podstawie prostej obserwacji wizualnej wskazującej na przeżycie komórek ofiary w każdym przypadku. Im więcej niebieskiego oznacza, tym większa przeżywalność ofiary, a tym samym słaba aktywność zabijania komórek dawcy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak liczenie jednostek tworzących kolonie, jest to, że metoda ta jest łatwa, nie zajmuje dużo czasu i pozwala na bezpośrednią ocenę aktywności typu szóstego w stosunku do danej ofiary.Tak więc ta technika ocenia aktywność fok bakteryjnych w mieszanych kulturach, a zatem może pomóc w zrozumieniu, dlaczego niektóre przewlekłe infekcje wielodrobnoustrojowe ostatecznie zostają zdominowane przez jeden gatunek bakterii, tak jak ma to miejsce w przypadku pseudomona shin w płucach pacjentów z mukowiscydozą. Aby rozpocząć grube komórki dawcy aerogenu Pseudomonas, które są typu szóstego aktywnego D dodatniego lub typu szóstego nieaktywnego D ujemnego na płytkach LB agar lub LBA przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W przedstawionym tutaj przykładzie użyliśmy szczepu Pseudomonas aerogen RET S, posiadającego konstytutywnie aktywny H jeden typ szósty oraz izogenicznego mutanta z delecją inżyniera klastra genu H jeden typu szóstego, komórki biorcy E. coli lub ofiary poprzez transformację DH 5 alfa z plazmidem, umożliwiając uzupełnienie alfa brakującego genu.Wyizolować bakterie z wywaru glicerolu na LB za pomocą XGL i odpowiedniego antybiotyku i inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza następnego dnia. Wybierz i wybierz niebieskie transformanty i przygotuj nocną hodowlę w pięciu mililitrach tryptyków, bulionu sojowego lub TSB z antybiotykiem rosnąć pod mieszaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza do eksperymentu następnego dnia przygotuj płytki LBA oznaczone jako wejście do testu dla szczepów, D dodatnich, D, ujemnych i P oraz wynik testu dla D ujemnego plus P i D dodatniego plus P. Dla każdej wejściowej hodowli komórek, zmierzyć gęstość optyczną i obliczyć objętość wymaganą do uzyskania gęstości komórek odpowiadającej jednej jednostce OD 600. Zbierz każdą kulturę w sterylnej mikroprobówce o pojemności 1,5 mililitra.Po pilotowaniu próbek bakteryjnych z prędkością 13 000 obr./min przez jedną minutę i zawieszeniu granulek przez Resus w 100 mikrolitrach świeżego TSB, zaszczepij 10 mikrolitrów każdego szczepu jako pojedyncze miejsce na płytce wejściowej A. Następnie delikatnie wymieszaj 30 mikrolitrów D dodatnich z 30 mikrolitrami P i w drugiej probówce 30 mikrolitrów D ujemnych z 30 mikrolitrami P. Następnie zaszczep wyjście A płytki 20 mikrolitrami plamki każdej mieszaniny. Po pozostawieniu plam do wyschnięcia w pobliżu abusa i palnika, inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić zabicie bakterii.Aby przeanalizować skuteczność zabijania bakterii, przygotuj płytki LBA zawierające 40 mikrogramów na mililitr xal. W celu odczytu testu oznacz wejście odczytu płytki w celu wykrycia wyizolowanych bakterii lub wyjście wyjściowe, aby wykryć mieszane kultury bakteryjne z tyłu każdej płytki podzielone na cztery równe części i oznaczyć sekcję zero 10 do minus jeden, 10 do minus dwa i 10 do minus trzy. Każde rozcieńczenie pozwoli na półilościową ocenę stosunku niebiesko-białych bakterii w tym samym miejscu.Za pomocą sterylnej pętli zbierz poszczególne plamki bakteryjne z płytki wejściowej A i płytki wyjściowej A i ponownie zawieś każdą plamkę w oddzielnych mikroprobówkach o pojemności 1,5 mililitra zawierających jeden mililitr TSB. Potrząsaj probówkami przez 30 minut, aby ponownie zawiesić bakterie, podczas gdy kultury się trzęsą. Przygotuj pięć zestawów po trzy mikroprobówki, z których każda zawiera 900 mikrolitrów TSB.Następnie, zaczynając od każdego ponownie zawieszonego miejsca, przygotować dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia, używając świeżych końcówek i krótko wirując między punktami rozcieńczania każdego rozcieńczenia na płytkach LVA xal, zaczynając od najbardziej rozcieńczonej próbki, a kończąc na próbce nierozcieńczonej. Posiewanie probówek wejściowych A na płytkach wejściowych R i rozcieńczenie wyjściowe A na płytkach wyjściowych R na punkt odtwarzalności 20 mikrolitrów w trzech egzemplarzach w każdym kwadrancie. Aby określić ilościowo esej konkursowy na tym etapie, podaj 100 mikrolitrów z 10 do minus trzech rozcieńczeń z próbek wyjściowych A w trzech powtórzeniach na płytkach LBA, xga inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i policz niebieskie kolonie w sterylnym obszarze, pozostaw płytki otwarte, aby umożliwić wchłonięcie nadmiaru płynu i zysk inkubatora przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, w którym to czasie nadal ma miejsce zabijanie.Ponieważ oba szczepy są nadal w kontakcie z wyjściowym obrazem analizy lub zeskanuj płytki. Plamy, które pozostają w dużej mierze niebieskie, wskazują, że E. coli nie została zabita. Jak to jest typowe w przypadku hodowli z pokazanym wadliwym szczepem pozowym typu szóstego, oto seryjne rozcieńczenie płytek wejściowych do odczytu dla szczepów użytych w tym teście.Zgodnie z oczekiwaniami, plamki P przed ekspresją brakującego genu P wydają się niebieskie na pożywkach uzupełnionych XGL, podczas gdy szczepy D dodatnie typu 6 aktywne i D ujemny typ 6 nieaktywne pozostają białe. Płytki wyjściowe odczytu, na których zauważono mieszankę między zdobyczą a aktywnym szczepem D dodatnim P typu szóstego, pokazują zniknięcie niebieskiej ofiary, wskazując w ten sposób, że została ona zabita. Pokazuje to zdolność dawcy do prześcignięcia ofiary.Trwałość niebieskiego koloru na płytce D ujemnego P pokazuje niezdolność nieaktywnego dawcy typu szóstego do zabicia niebieskiej ofiary. Tak więc, próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, że wymagania dotyczące wzrostu lub aktywności wydzielania typu szóstego mogą się różnić w zależności od gatunku bakterii, a zatem może wymagać niewielkiej korekty konfiguracji eksperymentalnej. Ponadto musisz również pamiętać, że jeśli chcesz ocenić aktywność wydzielania typu szóstego u jednego gatunku, bardzo ważne jest również ścisłe porównanie aktywności mutanta wydzielającego typu szóstego ze szczepem rodzicielskim, gdy tylko jest to możliwe.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś lepiej zrozumieć, jak przygotować esej wizualny, aby ocenić przeżycie komórek pre po kontakcie ze szczepem biegłym typu szóstego lub wadliwym typu szóstego.

a-visual-assay-to-monitor-t6ss-mediated-bacterial-competition

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wizualny test do monitorowania konkurencji bakterii pośredniczonej przez T6SS

Źródło: Speare, L., et al. Test komonetacyjności do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri.  J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia test współinkubacji używany do badania, w jaki sposób szczepy bakteryjne konkurują ze sobą we wspólnym środowisku. Jest szeroko stosowany w mikrobiologii do identyfikacji mechanizmów, takich jak zabijanie zależne od kontaktu lub niezależne od kontaktu, które napędzają te interakcje.

Test Coincubation do badania konkurencyjnych interakcji między szczepami bakterii

Źródło: Perinbam, K., i Siryaporn, A. Szybki test wirulencji bakteryjnej oparty na obrazach z użyciem ameby. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje szybką, opartą na obrazach metodę oceny zjadliwości bakterii poprzez inkubację ameb z bakteriami przytwierdzonymi do powierzchni lub planktonicznymi, zastosowanie podkładki kalcein-acetoxymetyloesterowej (kalcein-AM) agarozy oraz obrazowanie fluorescencji w celu wykrycia uszkodzeń komórek gospodarza.

Szybki test obrazowy do wykrywania zjadliwości bakteryjnej indukowanej powierzchnią

Ten film demonstruje metodę opartą na mikroskopii fluorescencyjnej do badania konkurencji bakterii na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta dostarcza informacji na temat struktury i funkcji społeczności bakteryjnych.

Test koinkubacji bakterii: technika oparta na mikroskopii fluorescencyjnej do wizualizacji wewnątrzgatunkowej konkurencji bakteryjnej na poziomie pojedynczej komórki

Ten film demonstruje technikę oceny działania bakteriobójczego przeciwciał obecnych w surowicy, w którym pośredniczy dopełniacz. Podejście to łączy wyizolowaną surowicę z bakteriami chorobotwórczymi i egzogennymi białkami dopełniacza. Podczas inkubacji bakterie są hodowane na płytce agarowej, a wytworzone kolonie są oznaczane ilościowo w celu zmierzenia miana bakteriobójczego surowicy.

Test bakteriobójczy surowicy na działanie bakteriobójcze przeciwciał za pośrednictwem dopełniacza

Bakterie mogą gromadzić zarówno szkodliwe, jak i korzystne mutacje w ciągu swojego życia. W populacji komórek osobniki, które zgromadziły korzystne mutacje, mogą szybko prześcignąć swoich pobratymców. W tym miejscu przedstawiamy prostą procedurę wizualizacji konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych w czasie przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych osobników.

Monitorowanie konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych poprzez kohodowlę szczepów znakowanych fluorescencyjnie

Opisano dwa testy do wysokoprzepustowych badań przesiewowych opartych na mikroskopii czynników gospodarza związanych z infekcją Brucellą. Test wejściowy wykrywa czynniki gospodarza wymagane do wniknięcia Brucella, a test końcowy te, które są wymagane do replikacji wewnątrzkomórkowej. Chociaż ma zastosowanie do alternatywnych podejść, badania przesiewowe siRNA w komórkach HeLa są wykorzystywane do zilustrowania protokołów.

Testy mikroskopowe do wysokoprzepustowych badań przesiewowych czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie komórek hela Brucellą

Test odroczonego hamowania wzrostu może być użyty do oceny wpływu konkurencji jednego izolatu bakteryjnego na drugi. Hamowanie określa się ilościowo, mierząc strefę oczyszczania wokół izolatu wytwarzającego inhibitor, lub ocenia się jakościowo, określając widoczny zakres hamowania.

Test odroczonego hamowania wzrostu w celu ilościowego określenia wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych pochodzenia bakteryjnego na konkurencję

To oparte na molekularnym podejściu do określania sprawności bakterii umożliwia precyzyjne i dokładne wykrywanie mikroorganizmów za pomocą unikalnych kodów kreskowych genomowego DNA, które są określane ilościowo za pomocą cyfrowego PCR. W protokole opisano obliczanie indeksu konkurencyjnego dla szczepów Salmonella; Technologia ta jest jednak łatwa do zaadaptowania do protokołów wymagających bezwzględnej kwantyfikacji każdego genetycznie plastycznego organizmu.

Cyfrowy indeks konkurencyjności oparty na PCR do wysokoprzepustowej analizy sprawności w Salmonelli

Bakterie kodują różne mechanizmy do angażowania się w międzybakteryjną rywalizację. W tym miejscu przedstawiamy oparty na kulturze protokół charakteryzujący konkurencyjne interakcje między izolatami bakteryjnymi i ich wpływ na strukturę przestrzenną populacji mieszanej.

Test komonetacyjności do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri

Ten manuskrypt opisuje metodę wykorzystania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej komórki do wizualizacji i ilościowego określenia konkurencji bakterii w kokulturze.

Kwantyfikacja konkurencji międzybakteryjnej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego pojedynczych komórek

Poznaj test wizualny do monitorowania konkurencji bakteryjnej za pomocą systemu sekrecji typu VI (T6SS) u Pseudomonas aeruginosa. Ta metoda pozwala ocenić przeżywalność komórek Escherichia coli.

Test wizualny do monitorowania konkurencji bakteryjnej za pośrednictwem T6SS

Przeglądaj więcej filmów