Name: Zapis elektrofizjologiczny przodomózgowia u larw danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Poznaj metodę zapisu potencjałów polowych z przodomózgowia larw Danio rerio. Technika umożliwia monitorowanie aktywności napadowej in vivo w modelu genetycznym i farmakologicznym padaczki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor chciałby podziękować Peterowi Castro i Matthew Dindayowi za ich wczesne wysiłki na rzecz stworzenia danio pręgowanego w laboratorium. Praca ta została sfinansowana z grantu National Institutes of Health EUREKA (#R01NS079214-01).

1. Produkcja i zbiór jaj
<ol>
	<li>Hodowla danio pręgowanego odbywa się zgodnie ze standardowymi procedurami opisanymi wcześniej8. Krótko mówiąc, dorosłe danio pręgowane umieszcza się w zbiornikach hodowlanych z przegrodami. Kiedy następnego ranka zapalą się światła w pomieszczeniu, przegrody są usuwane ze zbiorników hodowlanych, a ryby mają około 20 do 60 minut niezakłóconego czasu godowego.</li>
	<li>Jaja ze zbiorników hodowlanych zbiera się na sitku i spłukuje wodą z jaj. Jaja są następnie przenoszone na szalkę Petriego z wodą jajeczną. Niezapłodnione jaja i zanieczyszczenia usuwa się za pomocą pipety transferowej.</li>
	<li>Umieścić szalkę Petriego zawierającą zebrane jaja w inkubatorze (28-32 °C). Po wykluciu się z jaj, około dwa dni po zapłodnieniu (dpf), usuń kosmówkę i wszelkie inne zanieczyszczenia za pomocą pipety transferowej.</li>
	<li>W wybranym dniu po zapłodnieniu (od 3 do 8 dpf) należy zdjąć szalkę Petriego zawierającą swobodnie pływające larwy i umieścić na stole laboratoryjnym w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. Pobieranie i przygotowanie mikroelektrod
<ol>
	<li>Za pomocą ściągacza do mikropipet przeciągnij kapilarnę ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1,2 mm do dwóch igieł i przechowuj na szalce Petriego o średnicy 150 mm lub pustym pudełku na pipety, kładąc je na głupich rampach szpachlowych. Igły można wyciągnąć z wyprzedzeniem. Można zastosować różne szklane kapilary o średnicy zewnętrznej w zależności od typu dostępnego stopnia głównego wzmacniacza.</li>
	<li>Ponownie napełnić mikroelektrodę zewnątrzkomórkowym roztworem rejestrującym (2 M NaCl) za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z dołączonym filtrem strzykawkowym Nalgene (4 mm) i dołączonym filamentem Microfil (Warner Precision Instruments). Potrząsać lub postukać bolusem w kierunku końcówki igły, aż pozostanie niewiele pęcherzyków lub nie pozostanie ich wcale.</li>
</ol>
3. Unieruchomienie w agarze
<ol>
	<li>Przygotuj świeży roztwór 1,2% agaru o niskiej temperaturze topnienia w wodzie jajecznej. Umieścić roztwór agaru w łaźni wodnej o temperaturze ~37 °C.</li>
	<li>Przygotuj szkiełko nakrywkowe z komorą nagrywającą i umieść w zamrażarce (5-10 min). Komora zapisu powinna być zgodna z tą używaną na stanowisku do elektrofizjologii. Korzystamy z niskoprofilowej otwartej komory obrazowania w kąpieli diamentowej firmy Warner Instruments (model RC-26GLP).</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura lub pipety transferowej umieść jedną larwę danio pręgowanego w małej kropelce wody z jaj na czystej płytce Petriego. Do tej kropli dodać kroplę roztworu zawierającego środek znieczulający (0,02% tricainy) i środek paraliżujący (1 mg/ml α-bungarotoksyny).</li>
	<li>Monitoruj danio pręgowanego pod kątem utraty ruchu (5 do 10 min).</li>
	<li>Wyjmij szkiełko nakrywkowe/komorę zapisu z zamrażarki. Umieść komorę na stoliku mikroskopu stereoskopowego. Za pomocą pipety transferowej wymieszać kilka ml 1,2% agarozy o niskiej temperaturze topnienia z kropelką i roztworem transferowym (z rybą) do szkiełka nakrywkowego/komory rejestrującej.</li>
	<li>Za pomocą końcówki pipety lub cienkiej, igły umieść larwy pod mikroskopem stereoskopowym tak, aby grzbietowa strona ryby była wystawiona na powierzchnię żelu agarozowego. Pozostaw agarozę do stwardnienia (5-10 min), a następnie za pomocą płaskiej szpatułki przenieś blok agaru do komory rejestracyjnej ustawionej na stanowisku do elektrofizjologii.</li>
</ol>
3. Rejestracja pola zewnątrzkomórkowego
<ol>
	<li>Dodać 2-5 ml nośnika do zapisu danio pręgowanego do komory zapisu. Jeśli konieczna jest zmiana leku, należy umieścić w komorze perfuzyjnej z roztworem rejestrującym o stężeniu około 1 ml/min. Nie jest konieczne natlenianie roztworu rejestrującego.</li>
	<li>Włóż mikroelektrodę (o średnicy końcówki około 1 μm, 2-7 MΩ) do wzmacniacza amplifier zamontowany na trójwymiarowym mikromanipulatorze. Sprawdź, czy mikromanipulator znajduje się we właściwej pozycji, aby umożliwić pewien zakres ruchu i regulacji. Umieść końcówkę mikroelektrody w płaszczyźnie view mikroskopu, wysoko od stolika i używając zgrubnej regulacji niżej do punktu tuż powyżej i nieco przed głową danio pręgowanego.</li>
	<li>Gdy wzmacniacz jest w trybie "cęgów prądowych", wyzeruj elektrodę.</li>
	<li>Korzystając z regulacji zgrubnej, opuść końcówkę elektrody tak, aby dotykała tylko powierzchni danio pręgowanego, nieco przed przodomózgowiem.</li>
	<li>Za pomocą precyzyjnych kroków regulacji przesuwaj końcówkę elektrody, aż przebije skórę danio pręgowanego. Pozostaw do ustabilizowania się, a następnie przesuń elektrodę o kilka mikronów do przodomózgowia.</li>
	<li>Rejestruj aktywność elektryczną w trybie cęgów prądowych za pomocą oprogramowania Axoscope. Dane są pozyskiwane z częstotliwością próbkowania 10 kHz.</li>
</ol>

<ol><li>Clark, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressing+zebrafish+for+behavioral+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stressing zebrafish for behavioral genetics.</a> Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49(2011).</li>
<li>Rinkwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+an+integrative+system+for+neurogenomics+and+neurosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences.</a> Progress in Neurobiology. 93 (2), 231(2011).</li>
<li>Penberthy, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for human disease.</a> Frontiers in Bioscience. 7, d1439(2002).</li>
<li>Letamendia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+automated+high-throughput+system+for+zebrafish+in+vivo+screenings%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings.</a> PLoS One. 7, e36690(2012).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216(2000).</li>
<li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+the+zebrafish+inner+ear+and+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line.</a> Development. 123, 1(1996).</li>
<li>Suster, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Molecular Biology. 561, 41(2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentylenetetrazole+induced+changes+in+zebrafish+behavior%2C+neural+activity+and+c-fos+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression.</a> Neuroscience. 131 (3), 759(2005).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+mutagenesis+screen+to+identify+seizure-resistant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish.</a> Epilepsia. 48 (6), 1151(2007).</li>
<li>Williams, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+radiotelemetry+to+evaluate+electrographic+seizures+in+rats+with+kainate-induced+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39(2006).</li>
<li>Marsh, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interictal+EEG+spikes+identify+the+region+of+electrographic+seizure+onset+in+some%2C+but+not+all%2C+pediatric+epilepsy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients.</a> Epilepsia. 51 (4), 592(2010).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+application+of+modularly+assembled+zinc-finger+nucleases+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish.</a> Development. 138 (20), 4555(2011).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Przedstawiona tu metoda zapisu zewnątrzkomórkowego umożliwia bardzo czułą i szybką analizę aktywności mózgu. Zapisy te są analogiczne do monitorowania elektroencefalograficznego (EEG) powszechnie stosowanego do oceny obecności nieprawidłowego wyładowania elektrycznego (tj. napadu) w modelach padaczki u gryzoni11 i pacjentów12. Zapisy zewnątrzkomórkowe można łączyć z manipulacjami farmakologicznymi, jak pokazano tutaj. Tego typu zapisy mogą być również wykorzystane do oceny potencjalnych fen...

<table><tbody><tr><td>Agaroza niskotopliwa</td><td>Fisher-Scientific</td><td>BP1360-100</td><td>Rozpuszczać w pożywkach zarodkowych o stężeniu 1,2%</td></tr><tr><td>Nośniki zapisujące</td><td>Fisher-Scientific</td><td>BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500</td><td>1 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1,2 mM MgCl2, 10 mM dekstroza, 2,1 mM CaCl2 pH do około 7,3 z 1 N NaOH</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Argent Labs</td><td>MS-222</td><td>0,02%</td></tr><tr><td>&alfa;-bungarotoksyna</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2133</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Rurka ze szkła kapilarnego</td><td>Warner Instruments</td><td>G120TF-3</td><td>Pociągnij do oporu 2 -7 M&#937;</td></tr><tr><td>Wzmacniacz z zaciskiem krosowym</td><td>Warner Instruments</td><td>PC-505B</td><td>Używamy wzmacniacza Warner w trybie cęgów prądowych; Wzmocnienie ustawione na 2 mV/pA i filtr Bessela ustawione na 2K. Porównywalne modele mogą być używane zgodnie z instrukcjami producenta.</td></tr><tr><td>Filtr/wzmacniacz</td><td>Cygnus Technology</td><td>FLA-01</td><td>Używamy przedwzmacniacza Cygnus; Wzmocnienie ustawione na 10-20; Częstotliwość graniczna ustawiona na 1-2K; Filtr wycinający IN. Porównywalne modele mogą być używane zgodnie z instrukcjami producenta.</td></tr><tr><td>Płytka Axon A/D i oprogramowanie Axoscope</td><td>, Molecular Devices</td><td>, Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2</td><td>Dane są zbierane w Axoscope w trybie akwizycji bez przerw; próbkowanie z częstotliwością 10 KHz. Porównywalne modele i programy mogą być używane zgodnie z instrukcjami producenta.</td></tr><tr><td>Woda jajeczna</td><td>Instant Ocean</td><td></td><td>3 g Sól morska Instant Ocean, 2 ml 0,1% błękitu metylenowego w 10 ml wody dejonizowanej</td></tr></tbody></table>

zapis elektrofizjologiczny przodomózgowia u larw danio pręgowanego

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsja dotyka prawie 3 miliony ludzi w Stanach Zjednoczonych i do 50 milionów ludzi na całym świecie. Padaczka, definiowana jako występowanie spontanicznych, niesprowokowanych napadów, może być nabyta w wyniku uszkodzenia mózgu lub mutacji genetycznej. Próby modelowania napadów padaczkowych u zwierząt wykorzystywały przede wszystkim nabyte zniewagi (leki drgawkowe, stymulacja lub uszkodzenie mózgu) oraz manipulacje genetyczne (knockdown antysensowny, rekombinacja homologiczna lub transgeneza) u gryzoni. Danio pręgowany to system modelowykręgowców 1-3, który może stanowić cenną alternatywę dla badań nad padaczką na gryzoniach. Danio pręgowany jest szeroko stosowany w badaniach nad genetyką lub rozwojem kręgowców, wykazuje wysoki stopień podobieństwa genetycznego do ssaków i wyraża homologi dla ~ 85% znanych mutacji padaczki jednogenowej u ludzi. Ze względu na niewielkie rozmiary (4-6 mm długości) larwy danio pręgowanego mogą być utrzymywane w płynnych objętościach już od 100 μl we wczesnym okresie rozwoju i umieszczane w płytkach wielodołkowych. Odczynniki mogą być dodawane bezpośrednio do roztworu, w którym rozwijają się zarodki, co upraszcza podawanie leków i umożliwia szybkie badania przesiewowe in vivo badanych związków4. Syntetyczne oligonukleotydy (morfolinos), mutageneza, nukleaza palca cynkowego i podejścia transgeniczne mogą być stosowane do szybkiego generowania knockdownu lub mutacji genów u danio pręgowanego5-7. Właściwości te dają danio pręgowanemu bezprecedensową przewagę nad gryzoniami w badaniach nad zaburzeniami neurologicznymi, takimi jak padaczka. Ponieważ "złotym standardem" w badaniach nad padaczką jest monitorowanie i analizowanie nieprawidłowych wyładowań elektrycznych, które powstają w centralnej strukturze mózgu (tj. napadów), opisano tutaj metodę efektywnego rejestrowania aktywności mózgu u larw danio pręgowanego. Metoda ta jest adaptacją konwencjonalnych technik rejestracji zewnątrzkomórkowej i pozwala na stabilne, długoterminowe monitorowanie aktywności mózgu u nienaruszonych larw danio pręgowanego. Przykładowe zapisy są pokazane dla ostrych napadów padaczkowych wywołanych przez stosowanie w kąpieli leków przeciwdrgawkowych oraz napadów spontanicznych zarejestrowanych u ryb zmodyfikowanych genetycznie.

Przykłady elektrograficznych wyładowań przypominających napady drgawkowe, zarejestrowane w przedmózgowiu larw zebrafish zatopionych w agarze, przedstawiono na Rysunku 1. Wyładowania w postaci wielopiąstkowych serii o dużej amplitudzie w tych próbkach zostały wywołane poprzez aplikację kąpielową leku konwulsyjnego: 40 mM pilokarpiny (na A; 6 dpf) lub 1 mM piktoksyny (na B; 8 dpf). W tych pomiarach unieruchomione i zatopione w agarze zebrafish są monitorowane w sposób ciągły przez maksymalnie 90 min. Ryby ...

Opisana jest prosta metoda rejestrowania potencjałów pola zewnątrzkomórkowego w przodomózgowiu larwy danio pręgowanego. Metoda ta zapewnia solidny odczyt in vivo aktywności podobnej do napadowej. Technika ta może być stosowana w przypadku genetycznie zmodyfikowanych larw danio pręgowanego będących nosicielami genów związanych z padaczką lub napadów wywołanych podawaniem leków przeciwdrgawkowych.

Zapis elektrofizjologiczny przodomózgowia u larw danio pręgowanego

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie zewnątrzkomórkowych zapisów pola z przodomózgowia nienaruszonej larwy danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez unieruchomienie najpierw larwy danio pręgowanego w bloku aros. Następnie mikroelektroda rejestrująca jest umieszczana w przodomózgowiu pod bezpośrednią wizualizacją.Ostatnim krokiem jest zarejestrowanie aktywności elektrycznej przodomózgowia. Ostatecznie wyniki mogą być wykorzystane do monitorowania nieprawidłowej elektrograficznej aktywności napadowej u nienaruszonych larw danio pręgowanego. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, gdy starałem się wykazać, że napady mogą być wywoływane u larw danio pręgowanego, hodowli danio pręgowanego zgodnie ze standardowymi procedurami opisanymi wcześniej. Krótko.Dorosłe danio pręgowane umieszcza się w zbiornikach hodowlanych z umieszczonymi przegrodami. Kiedy następnego ranka zapalą się światła w pomieszczeniu, przegrody są usuwane, a ryby mają od 20 do 60 minut niezakłóconego czasu godowego. Jaja są następnie zbierane ze zbiorników, przenoszone na szalkę Petriego z wodą z jaj i oczyszczane z zanieczyszczeń za pomocą pipety transferowej, teraz umieszcza jaja w inkubatorze, a za około dwa dni jaja się wyklują.Po wykluciu usuń korion i wszelkie inne zanieczyszczenia za pomocą pipety transferowej, a następnie włóż larwy z powrotem do inkubatora, aż osiągną pożądany punkt czasowy rozwoju. W przygotowaniu wciągnij kapilary ze szkła krzemianowego o średnicy zewnętrznej 1,2 milimetra do igieł za pomocą ściągacza do mikropipet. Przechowuj igły na 150-milimetrowej szalce Petriego nad rampami szpachlowymi.Teraz zapakuj, załaduj mikroelektrodę dwumolowym roztworem chlorku sodu. Używając jednolitrowej strzykawki z czteromilimetrowym filtrem strzykawkowym i dołączonym filamentem, postukaj w bolus w pobliżu końcówki igły, aż pozostanie niewiele pęcherzyków lub nie pozostanie ich wcale. Przygotuj świeży roztwór 1,2% agaru LMP w wodzie jajecznej i utrzymuj go stopiony w kąpieli o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie przygotuj szkiełko nakrywkowe z odpowiednią komorą rejestracyjną i umieść je w zamrażarce na pięć do 10 minut. W tym przykładzie wykorzystano niskoprofilową otwartą komorę obrazowania w kąpieli diamentowej w czystej płytce szalki Petriego, zanurz jedną larwę seabra, rybę w kropli wody jajowej za pomocą pipety transferowej. Następnie mieszaj z kroplą roztworu zawierającego środek znieczulający i paraliżujący przez pięć do 10 minut.Monitoruj danio pręgowanego pod kątem utraty ruchu. Następnie wyjmij szkiełko nakrywkowe i komorę nagrywania z zamrażarki. Umieść komorę na stoliku mikroskopu stereoskopowego do komory.Za pomocą pipety transferowej dodaj kilka mililitrów agros do ryb w wodzie i wymieszaj je ze sobą za pomocą końcówki mikropipety lub cienkiej, igły. Ustaw larwy tak, aby grzbietowa strona ryby była wystawiona na nieruchomą powierzchnię agros. Po stwardnieniu agrosu za pomocą płaskiej szpatułki przenieś blok agro z larwami do komory rejestracyjnej ustawionej na stanowisku do elektrofizjologii.Na platformie dodaj od dwóch do pięciu mililitrów nośnika do zapisu danio pręgowanego do komory nagrywania. Jeśli konieczna jest zmiana leku, należy przelać komorę roztworem rejestrującym z szybkością około jednego mililitra na minutę, natlenianie nie jest konieczne. Następnie włóż mikroelektrodę do stopnia głowicy wzmacniacza zamontowanego na trójwymiarowym mikromanipulatorze.Po załadowaniu sprawdź, czy manipulator mikrom ma dobry zakres ruchu i regulacji. Następnie umieść końcówkę mikroelektrody w płaszczyźnie view mikroskopu wysoko nad stolikiem i korzystając z regulacji kursu, opuść ją do punktu tuż nad i nieco przed głową danio pręgowanego. Po umieszczeniu mikroelektrody na miejscu ustaw wzmacniacz w trybie cęgów prądowych i wyzeruj elektrodę w polu view.Użyj regulacji kursu, aby opuścić końcówkę elektrody tak, aby dotykała powierzchni danio pręgowanego lekko przed przodomózgowiem. Następnie, wykonując krok precyzyjnej regulacji, przesuń końcówkę elektrody, aż przebije skórę danio pręgowanego. Po nakłuciu pozwól, aby mikropipeta opadła, powoli przesuwaj elektrodę o kilka mikronów do przodomózgowia.Teraz użyj oprogramowania aScope do rejestrowania aktywności elektrycznej. W bieżącym trybie cęgowania pozyskuj dane z częstotliwością próbkowania 10 kiloherców. Ryba pozostaje żywotna przez 24 godziny nagrywania, aby zastosować leki, dodać je w objętościach od dwóch do pięciu mililitrów i odczekać od 30 do 45 minut, aż leki dyfundują przez agar i do ryby danio pręgowanego.Cztery mózgi. Dopuszczalna jest konfiguracja kąpieli statycznej, dzięki czemu ciągła perfuzja nie jest konieczna. Za pomocą tych metod można również uzyskać zapisy zewnątrzkomórkowe z guza nerwu wzrokowego.Wyładowania elektrograficzne podobne do napadów zostały zarejestrowane w przodomózgowiu osiem dni po zapłodnieniu, larwy danio pręgowanego, wielokrotne wybuchy kolców o dużej amplitudzie zostały cofnięte przez zastosowanie kąpieli 40-milimolowej pilokarpiny, leku drgawkowego. Podobne wybuchy wywoływano za pomocą leku konwulsyjnego. Ritoksyna stosowana na jeden milimol.Spontaniczne wyładowanie zaobserwowano u genetycznie zmodyfikowanej danio pręgowanej po trzech dniach od zapłodnienia. U tego zwierzęcia zastrzyki z oligonukleotydu morpho w stadium od jednej do dwóch komórek zastosowano w celu obniżenia ekspresji genu kompleksu stwardnienia guzowatego, dziecięcej postaci padaczki związanej z napadami padaczkowymi i autyzmem. Jeśli zostanie wykonana prawidłowo, tę procedurę można wykonać w ciągu 30 minut lub krócej.

forebrain-electrophysiological-recording-in-larval-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestracja elektrofizjologiczna przedniej części mózgu u larw rybki Danio pręgowanej

Protokół opisuje procedurę wykonywania elektrofizjologii u dorosłych ryb danio pręgowanych. Metodę tę można wykorzystać do pomiaru aktywności neuronalnej in vivo.

Elektrofizjologia dorosłego danio pręgowanego: metoda pomiaru zewnątrzkomórkowej aktywności elektrycznej neuronów in vivo

Ten film demonstruje rejestrację sygnałów elektrycznych z neuronów doprowadzających u sparaliżowanej larwy danio pręgowanego poprzez umieszczenie mikropipety w pobliżu zwoju linii bocznej i utworzenie luźnej uszczelki do przechwytywania sygnału. Roztwór zewnątrzkomórkowy utrzymuje żywotność neuronów podczas tego procesu.

Monitorowanie sygnałów elektrycznych z neuronów aferentnych w unieruchomionej larwie danio pręgowanego

W tym filmie pokażemy, jak rejestrować aktywność elektryczną z zidentyfikowanych pojedynczych neuronów w całym preparacie mózgu, który zachowuje złożone obwody neuronowe. Używamy transgenicznych ryb, u których neurony hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH) są genetycznie znakowane białkiem fluorescencyjnym w celu identyfikacji w nienaruszonym preparacie mózgu.

Rejestrowanie aktywności elektrycznej ze zidentyfikowanych neuronów w nienaruszonym mózgu ryb transgenicznych

Ten artykuł opisuje, jak dorosły danio pręgowany może zostać unieruchomiony, zaintubowany i wykorzystany do eksperymentów elektrofizjologicznych in vivo, aby umożliwić rejestrację i manipulację aktywnością neuronalną u nienaruszonego zwierzęcia.

Zapis elektrofizjologiczny w mózgu nienaruszonego dorosłego danio pręgowanego

Ten manuskrypt opisuje metody zapisów elektrofizjologicznych z neuronów rdzeniowych zarodków i larw danio pręgowanego. Preparat utrzymuje neurony in situ i często wiąże się z minimalnym rozwarstwieniem. Metody te pozwalają na badanie elektrofizjologiczne różnych neuronów rdzeniowych, od początkowego nabycia pobudliwości elektrycznej do wczesnych stadiów larwalnych.

Przygotowanie rdzenia kręgowego danio pręgowanego in situ do zapisów elektrofizjologicznych z rdzeniowych neuronów czuciowych i ruchowych

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki epilepsji u danio pręgowanego, wynikającej z przejściowego zahamowania genu DEPDC5.

Analiza behawioralna i fizjologiczna w modelu padaczki danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół, który upraszcza pomiar odpowiedzi elektroretinogramu wywołanego światłem od larw danio pręgowanego. Nowatorska elektroda w kształcie stożka z końcówką gąbki może pomóc w łatwiejszym do osiągnięcia badaniu rozwoju wzrokowego u larw danio pręgowanego za pomocą elektroretinogramu ERG, zapewniając wiarygodne wyniki i obniżając koszty.

Zapis elektroretinogramu u larw danio pręgowanego przy użyciu nowatorskiej elektrody gąbczastej w kształcie stożka

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania in vivo całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej. Procedura eksperymentalna obejmuje przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i wizualizację.

In vivo (in vivo) Obrazowanie całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej

Przedstawiamy tutaj protokół przeprowadzania dwufotonowego obrazowania wapnia w grzbietowej części przedniej mózgu dorosłego danio pręgowanego.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia aktywności przedmózgu u zachowujących się dorosłych danio

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania aktywności neuronalnej w obszarach mózgu transgenicznego danio pręgowanego, które wyrażają wskaźniki wapnia GCaMP za pomocą mikroskopii konfokalnej.

In vivo (in vivo) Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne aktywności neuronalnej wywołanej stymulacją sensoryczną u częściowo unieruchomionych larw danio pręgowanego

Poznaj metodę zapisu potencjałów polowych z przodomózgowia larw Danio rerio. Technika umożliwia monitorowanie aktywności napadowej in vivo w modelu genetycznym i farmakologicznym padaczki.

Zapis elektrofizjologiczny przodomózgowia u larw danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów