Name: Izolacja i analiza sekwestrowanych w mózgu leukocytów myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Poznaj metodę izolacji leukocytów z mózgu myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA. Technika obejmuje perfuzję, trawienie tkanki i cytometrię przepływową do immunofenotypowania komórek zapalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Pani Lianie Mackiewicz za pomoc techniczną. Prace te były możliwe dzięki wsparciu infrastruktury operacyjnej rządu stanu Wiktoria oraz Krajowej Radzie ds. Zdrowia i Badań Medycznych rządu australijskiego IRIISS i grantowi projektu 1031212.

1. Zakażenie myszy P. berghei-ANKA
<ol>
 <li>Rozmrozić podwielokrotność kriokonserwowanego P. berghei ANKA pRBC.</li>
 <li>Unieruchomić odporną na malarię mózgową mysz dawcę BALB/c (8-12 tygodni) za pomocą techniki krępowania oburęcznego. Wstrzyknąć myszu 100-200 μl pRBC za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml (igła 28G). Rutynowo wstrzykuje się 1-2 myszy dawców.</li>
 <li>W 4-5 dniu po zakażeniu (p.i) wyjmij mysz dawcy z klatki i umieść ją na stacji roboczej lub jednorazowej podkładce roboczej.</li>
 <li>Delikatnie przytrzymaj mysz za koniec ogona i za pomocą małych nożyczek odetnij końcówkę ogona (około 1 mm). Alternatywnie można wykonać małe nakłucie ogona za pomocą igły o sile 25 G.</li>
 <li>Umieść kroplę krwi z żyły ogonowej myszy w pobliżu końca szkiełka mikroskopowego z matowym końcem.</li>
 <li>Umieść drugi szkiełko (rozsiewacz) pod kątem 45° i włóż go z powrotem do kropli krwi. Gdy krew rozprzestrzeni się wzdłuż krawędzi, dociśnij szkiełko rozsiewacza równomiernie po szkiełku mikroskopu, aby rozmazać krew. Pozostaw rozmaz do wyschnięcia na powietrzu.</li>
 <li>Utrwal rozmazy krwi w 100% metanolu przez 30 sekund, a następnie zaplamić szkiełka w świeżo przygotowanym Giemsie na 10 minut.</li>
 <li>Płukać rozmaz krwi bieżącą wodą przez 1 minutę, pozostawić do wyschnięcia na powietrzu i zbadać szkiełko pod mikroskopem (100x, zanurzenie w olejku). Wylicz pRBC w obrębie 1,000 erytrocytów i oblicz procent parazytemii. Myszy dawcy powinny osiągnąć poziom parazytemii między 2,5-5%, zanim będzie można je wykrwawić z powodu zakażenia zwierząt doświadczalnych.</li>
 <li>Pobrać krew od myszy dawcy przez krwawienie zaoczodołowe za pomocą heparynizowanej mikrohematokrytu rurki kapilarnej. Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane zgodnie z wymogami Komisji ds. Etyki Zwierząt Instytutu Waltera i Elizy Hall. W zależności od wymagań lokalnej Komisji Etyki Zwierząt mogą być stosowane inne procedury wykrwawiania. Rozpuścić wymaganą ilość krwi w pożywce RPMI w końcowym stężeniu 1X106 pRBC/0,2 ml. Weź pod uwagę, że normalny hematokryt myszy to ~6x109 czerwonych krwinek/1 ml.</li>
 <li>Zakażone eksperymentalne myszy C57BL/6 (w wieku 8-12 tygodni) należy wstrzyknąć dootrzewnowo (i.p) 1x106 pRBC/0,2 ml.</li>
 <li>Aby monitorować poziom pasożyta u zakażonych myszy, wykonaj kroki 1.3-1.8. Parazytemię należy oznaczać co 2-3 dni, począwszy od 2 lub 3 dnia.</li>
<li>Początek ciężkiej malarii u myszy C57BL/6 może objawiać się zgarbionym wyglądem, marszczoną sierścią i niską aktywnością. Niektóre myszy mogą wyzdrowieć na tym etapie, ale postęp do utraty odruchu samoprostowania wskazuje na nieodwracalną chorobę i zwierzęta muszą zostać poddane eutanazji. </li>
</ol>
2. Perfuzja wewnątrzsercowa myszy i ekstrakcja mózgu
<ol>
 <li>Zmontuj ręczny system perfuzji grawitacyjnej, mocując zbiornik o pojemności 500 ml do uchwytu kolumny przymocowanego do górnej części stojaka kolumny o średnicy 60 cm. Podłącz plastikową rurkę do dolnego końca zbiornika i zabezpiecz rurkę clamp, aby kontrolować przepływ bufora. Przymocuj rurkę do igły 23 G. Napełnij zbiornik PBS (utrzymywanym w temperaturze 22 °C), otwórz zacisk i pozwól, aby bufor przepłynął przez rurkę, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.</li>
 <li>Eutanazja myszy zakażonej P. berghei ANKA przez wdychanie CO2 . Potwierdź śmierć przez brak reakcji na pedał, orbitę i oddech.</li>
 <li>Przypnij uśpioną mysz tylną i przednią łapą grzbietowo do styropianowej deski preparacyjnej umieszczonej w plastikowej tacy. W zależności od wymagań lokalnej Komisji Etyki Zwierząt, znieczulenie może być podane przed rozpoczęciem pefuzji śródsercowej.</li>
 <li>Przetrzyj stronę brzuszną 70% etanolem.</li>
 <li>Użyj dużych nożyczek i kleszczy, aby otworzyć skórę wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić klatkę piersiową. Złóż i przypnij skórę do boków.</li>
 <li>Przytrzymaj mostek cienkimi kleszczami i przetnij przeponę oraz wzdłuż obu stron mostka, przecinając żebra. Uważaj, aby nie uszkodzić żadnych dużych naczyń krwionośnych.</li>
 <li>Przypnij klatkę piersiową za mostek luźno obok głowy.</li>
 <li>Przytrzymaj komory cienkimi kleszkami i ostrożnie naciąć prawy przedsionek cienkimi nożyczkami.</li>
 <li>Włóż igłę 23G przymocowaną do systemu perfuzji grawitacyjnej do lewej komory w kierunku aorty wstępującej podczas pracy PBS. Włożyć tylko 0,5 cm końcówki igły.</li>
 <li>Używaj myszy przez 5 minut lub do momentu, gdy ścieki będą czyste.</li>
 <li>Odepnij mysz i połóż ją na jej brzuchu. Przetrzyj głowę 70% etanolem.</li>
 <li>Za pomocą dużych nożyczek wykonaj cięcie tuż nad obszarem szyjnego rdzenia kręgowego.</li>
 <li>Użyj cienkich nożyczek, aby wykonać środkowe cięcie ogonowo-rostralne, zaczynając od podstawy czaszki i oderwij skórę, aby odsłonić czaszkę.</li>
 <li>Trzymając głowę, umieść ostrza małych nożyczek w każdej jamie oczodołu i wykonaj cięcie między oczodołami.</li>
 <li>Wykonaj podłużne cięcie wzdłuż szwu strzałkowego i ostrożnie oderwij czaszkę na każdej półkuli mózgu na zewnątrz.</li>
 <li>Za pomocą szpatułki delikatnie podnieś mózg i umieść go w 10 ml probówce wirówkowej zawierającej pożywkę RPMI.</li>
</ol>
3. Izolacja leukocytów sekwestrowanych w mózgu (BSL)
<ol>
 <li>Pracując w komorze bezpieczeństwa, umieść świeżo pobrany mózg na sitku do komórek ze stali nierdzewnej (rozmiar oczek 40-60) na szalce Petriego zawierającej 3-5 ml pożywki do hodowli tkankowych RPMI.</li>
 <li>Pokrój tkankę mózgową na małe kawałki.</li>
 <li>Przepchnij małe kawałki tkanki mózgowej przez sitko komórkowe za pomocą kryształowego tłoka.</li>
 <li>Przenieść homogenat mózgu do probówki o pojemności 10 ml i wirować przy 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Rozpuścić osad w 3 ml pożywki RPMI, zawierającej 0,05% kolagenazy D i 2U/ml DNAzy I.</li>
 <li>Obracaj mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć resztki komórek, przepychając mieszaninę przez sitko z nylonu o wielkości 70 μm i/lub inkubując na lodzie przez 5 minut.</li>
 <li>Ułożyć homogenat mózgu na poduszce Percoll o pojemności 7 ml 30% i wirować przy 400 x g (bez hamulców) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Zawiesić osad w 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek i inkubować na lodzie przez 5 minut w celu lizy przylegających pRBC, których nie można było usunąć z mózgu przez perfuzję wewnątrzsercową.</li>
 <li>Dodać 9 ml pożywki RPMI, przemyć komórki i odwirować w temperaturze 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Zawiesić osad zawierający BSL w 50-100 μl pożywki RPMI i przenieść komórki do probówki Eppendorfa.</li>
 <li>Rozcieńczyć 5-10 μl podwielokrotności próbki komórki w stosunku 1:2 w błękitu trypanowym w celu identyfikacji komórek żywotnych.</li>
 <li>Policz żywe komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru. Od 6 dnia p.i., kiedy myszy zakażone P. berghei ANKA wykazują objawy neurologiczne, można odzyskać 20 000-100 000 BSL.</li>
</ol>
4. Immunofenotypowanie BSL za pomocą wielobarwnej cytometrii przepływowej
<ol>
 <li>Odwirować komórki przy 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 50 μl buforu barwiącego (PBS, 1% płodowa surowica cielęca (FCS), 2 mm EDTA).</li>
 <li>Dodać 1 μl oczyszczonego przeciwciała anty-CD16/32 (Fcblock).</li>
 <li>Inkubuj komórki przez 10 minut na lodzie.</li>
 <li>Umyj komórki 1 ml buforu barwiącego. Odwirować komórki przy 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.</li>
 <li>Zawiesić komórki w 50 μl buforu barwiącego zawierającego z góry określone optymalne rozcieńczenia wymaganych przeciwciał fluorescencyjnych, tj. anty-CD4, anty-CD8, anty-TCR i anty-NK1.1.</li>
 <li>Inkubować przez 1 godzinę na lodzie.</li>
 <li>Umyj komórki 1 ml buforu barwiącego. Odwirować komórki przy 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.</li>
 <li>Zawieś komórki w 100 μl PBS.</li>
 <li>Przenieś komórki do plastikowej rurki do cytometrii przepływowej.</li>
 <li>Za pomocą cytometru przepływowego uzyskaj co najmniej 5 000-10 000 zdarzeń. W razie potrzeby należy dołączyć odpowiednie niebarwione kontrole komórkowe i próbki kompensacji fluorochromu.</li>
 <li>Analizuj wyniki za pomocą odpowiedniego oprogramowania do cytometrii przepływowej.</li>
</ol>

<ol><li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+malaria%3A+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li>
<li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li>
<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+basis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li>
<li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50(2012).</li>
<li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747(2011).</li>
<li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus%3A+immunity+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8%2B+T+cells+in+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li>
<li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li>
<li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3%2B+T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li>
<li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li>
<li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369(2009).</li>
<li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+malaria+parasite+sequestration%3A+CD36+is+the+major+receptor%2C+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li>
<li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8%2B+T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunololgy%22%5BJournal%5D)">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li>
<li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8%2B+T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens%2C+largely+regulated+by+CD8alpha%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Izolacja i analiza BSL to metoda, która umożliwia charakterystykę i kwantyfikację komórek zapalnych migrujących do mózgu w odpowiedzi na uszkodzenie tkanki lub infekcję w eksperymentalnych modelach mysich. Wprowadzenie etapu perfuzji wewnątrzsercowej w celu usunięcia przedziału krwi przed ekstrakcją narządu i późniejszą izolacją komórek jest przydatne, aby zapobiec zanieczyszczeniu komórek zapalnych niezapalnymi krążącymi leukocytami. Może to nie być niezbędne w przypadku zakażeń neurotropowych, takich jak wirus mysiego ...

<table><tbody><tr><td colspan="4">Roztwory i </td></tr><tr><td>Roztwór błękitu metylenowego azur Giemsy</td><td>Merck Millipore</td><td>1.09204.0500</td><td>1:10 rozcieńczenie w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td> RPMI <td>Toniczność myszy </td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>20 mM Fosforan sodu, 0,149 NaCl, pH 7,3</td></tr><tr><td>0,4%Trypan Blue </td><td>Sigma Aldrich</td><td>T-8154</td><td>Rozcieńczenie 1:2</td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Worthington Biochemiczna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>deoksyrybonukleaza (DNAse) I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4263-5VL</td><td>Z trzustki bydlęcej</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td>30% roztwór w PBS </td></tr><tr><td>Ultrapure Tris</td><td>Invitrogen</td><td>15505-020</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu (NH4Cl)</td><td>AnalaR</td><td>10017</td><td></td></tr><tr>Bufor <td></td><td></td><td>do lizy krwinek czerwonych</td><td>17 mM Tris, 14 nM NH4Cl, pH 7,2</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>1009</td><td></td></tr><tr><td>EDTA sól disodowa</td><td>Merck</td><td>10093.5V</td><td>0.1M, pH 7.2</td></tr><tr><td colspan="4"><silne>Przeciwciała i koniugaty </td></tr><tr><td>Anty-mysie CD16/CD32 (blok Fc), klon 2.4G2</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td>1 & l w 50 &mu; l bufor do barwienia (0,5 mg/50 ml)</td></tr> <tr><td>FITC-anty-myszy CD4, klon H129.19</td><td>BD Pharmingen</td><td>553651</td><td></td></tr><tr><td>PE-anty-mysz NK1.1, klon PK136</td><td>BD Pharmingen</td><td>553165</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCy5.5-anty-myszy CD8, klon 53-6-7</td><td>BD Pharmingen</td><td>551162</td><td></td></tr><tr><td>APC-anty-myszy TCR-&#946;, klon H57-597</td><td>BD Pharmingen</td><td>553174</td><td></td></tr><tr><td>PE-anty-myszy CXCR3, klon 220803</td><td>R& D Systems</td><td>FAB1685P</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowany-anty-mysz CCR5, klon C34-3448</td><td>BD Pharmingen</td><td>559922</td><td></td></tr><tr><td>Steptavidin-PerCP-Cy5.5</td><td>BD Pharmingen</td><td>551419</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Sprzęt i materiał</mocny> </td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe SuperFrost</td><td>Lomb Menzel-Gl&#228; ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne, nożyczki</td><td>REDA Instrumente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 ml Zbiornik PBS</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurka</td><td></td><td></td><td></td>gumowa</tr><tr><td>igła 23G</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>302008</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji komórek zawierający metalowe sito</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CD-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m nylonowe sitko do komórek</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>GmbH Neubauer</td><td>717810</td><td></td></tr><tr><td>Rurki do cytometrii przepływowej</td><td>BD Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i analiza sekwestrowanych w mózgu leukocytów myszy zakażonych plasmodium berghei anka

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Opisujemy metodę izolacji i charakterystyki przylegających komórek zapalnych z naczyń krwionośnych mózgu myszy zakażonych P. berghei ANKA. Zakażenie podatnych szczepów myszy tym szczepem pasożyta powoduje indukcję eksperymentalnej malarii mózgowej, zespołu neurologicznego, który podsumowuje pewne ważne aspekty ciężkiej malarii u ludzi za pośrednictwem Plasmodium falciparum 1,2 . Dojrzałe formy malarii we krwi wykazują ekspresję białek pasożytniczych na powierzchni zakażonego erytrocytu, co umożliwia im wiązanie się z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych. Proces ten indukuje przeszkody w przepływie krwi, co prowadzi do niedotlenienia i krwotoków 3 , a także stymuluje rekrutację leukocytów zapalnych do miejsca sekwestracji pasożytów.
W przeciwieństwie do innych infekcji, tj. wirusów neutrotopowych4-6, zarówno pasożytujące na malarii czerwone krwinki (pRBC), jak również związane z nimi leukocyty zapalne pozostają odizolowane w naczyniach krwionośnych, a nie infiltrują miąższ mózgu. Tak więc, aby uniknąć zanieczyszczenia sekwestrowanych leukocytów niezapalnymi komórkami krążącymi, w tej procedurze wymagana jest rozległa perfuzja wewnątrzsercowa zakażonych myszy przed ekstrakcją narządu i przetwarzaniem tkanek w celu usunięcia przedziału krwi. Po perfuzji mózgi są zbierane i preparowane na małe kawałki. Struktura tkanki jest dodatkowo zaburzona przez enzymatyczne traktowanie kolagenazą D i DNAzą I. Uzyskany homogenat mózgu jest następnie odwirowywany w gradiencie Percoll, który umożliwia oddzielenie leukocytów sekwestrowanych w mózgu (BSL) od mieliny i innych szczątków tkankowych. Wyizolowane komórki są następnie myte, liczone za pomocą hemocytometru i barwione przeciwciałami fluorescencyjnymi w celu późniejszej analizy za pomocą cytometrii przepływowej.
Ta procedura pozwala na kompleksową charakterystykę fenotypową leukocytów zapalnych migrujących do mózgu w odpowiedzi na różne bodźce, w tym udar oraz infekcje wirusowe lub pasożytnicze. Metoda ta stanowi również użyteczne narzędzie do oceny nowych metod leczenia przeciwzapalnego w przedklinicznych modelach zwierzęcych.

Wyniki przedstawione na Rys. 2 pokazują procentowe i bezwzględne liczby różnych populacji BSL odzyskanych z mózgów perfundowanych i nieperfundowanych myszy zakażonych malarią oraz naiwnych myszy kontrolnych. Izolowane BSL barwiono przeciwciałami PE-anty-NK1.1 oraz APC-anty-TCR-β, zgodnie z opisem w tekście protokołu. Zgodnie z wcześniejszymi odkryciami 7-9, limfocyty T αβTCR+ stanowiły wysoką proporcję puli BSL w mózgach perfundowanych myszy zakażonych malarią (dzień 6 p.i). Populacja ta wydawała si...

Opisano metodę izolacji przylegających leukocytów zapalnych z naczyń krwionośnych mózgu myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA. Metoda umożliwia kwantyfikację oraz charakterystykę fenotypową wyizolowanych leukocytów po barwieniu przeciwciałami fluorescencyjnymi, a następnie analizie za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja i analiza sekwestrowanych w mózgu leukocytów myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie przylegających leukocytów zapalnych z naczyń krwionośnych mózgu myszy zakażonych Plasmodium burge eye anca w celu wywołania eksperymentalnej malarii mózgowej. Myszy są zakażone krwinkami czerwonymi pasożytniczymi Plasmodium berge eye anca przez wstrzyknięcie. Po tym, jak myszy zaczną wykazywać oznaki choroby, krążące komórki myszy zakażonych malarią są usuwane przez perfuzję wewnątrzustną.Mózgi są następnie pobierane, a tkanka jest trawiona przez enzymy, aby umożliwić izolację leukocytów zapalnych. Następnie wykonuje się wielobarwną cytometrię przepływową do fenotypu immunologicznego. Analiza leukocytów sekwestrowanych w mózgu na podstawie uzyskanych danych ujawnia procentową i bezwzględną liczbę leukocytów migrujących do mózgu myszy zakażonych malarią.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie patogenezy malarii, takie jak to, jaki rodzaj komórek zapalnych migruje do miejsca sekwestracji pasożytów w mózgu zakażonych zwierząt w różnych warunkach eksperymentalnych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Etapy perfuzji są trudne do nauczenia, ponieważ wymagają zarówno szybkości, jak i ostrożności,

isolation-analysis-brain-sequestered-leukocytes-from-plasmodium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja i analiza leukocytów uwięzionych w mózgu od myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Opisano szybką metodę pozyskiwania leukocytów naciekających mózg myszy. Metoda ta wykorzystuje ciągły gradient Percoll oraz nieciągły gradient Ficoll w celu wyselekcjonowania i oczyszczenia warstwy wzbogaconej w leukocyty. Wyizolowane leukocyty mogą być następnie scharakteryzowane za pomocą pomiarów cytometrycznych.

Izolacja leukocytów naciekających mózg

Ten film demonstruje generowanie eksperymentalnego mysiego modelu malarii mózgowej. Sporozoity wyizolowane z samic komarów zakażonych Plasmodium berghei są wstrzykiwane do uwięzionych żył ogonowych myszy, co prowadzi do przerwania bariery krew-mózg i zapalenia mózgu, powodując malarię mózgową. Ten zakażony model myszy stanowi cenne narzędzie do badania in vivo patologii mikrokrążenia związanej z malarią mózgową.

Wygenerowanie mysiego modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem sporozoitów pochodzących od komarów gospodarzy

Ten film demonstruje test do immunizacji modelu myszy żywymi, atenuowanymi sporozoitami. Osłabione promieniowaniem sporozoity Plasmodium są wstrzykiwane do grzbietowej strony ucha myszy. Po wstrzyknięciach w wielu miejscach na obu uszach mysz może dojść do siebie.

Immunizacja śródskórna żywymi atenuowanymi sporozoitami w modelu mysim

Pasożyt malarii atakuje i replikuje się w czerwonych krwinkach. Dokładna ocena inwazji merozoitu i parazytemii ma zatem kluczowe znaczenie w ocenie przebiegu zakażenia malarią. W tym miejscu opisujemy protokół oparty na cytometrii przepływowej do pomiaru tych parametrów w mysim modelu malarii.

In vivo (in vivo) Ocena pasożytytemii zarodźca gryzoni i inwazji merozoitu za pomocą cytometrii przepływowej

Opisujemy tutaj protokół izolacji komórek szpikowych ze skóry myszy i drenowania węzłów chłonnych po śródskórnym wstrzyknięciu sporozoitów Plasmodium. Cytometria przepływowa pobranych komórek zapewnia wiarygodny test charakteryzujący reakcję zapalną skóry i węzłów chłonnych drenujących na pasożyta.

Izolacja komórek szpikowych ze skóry myszy i drenaż węzłów chłonnych po szczepieniu śródskórnym żywymi atenuowanymi sporozoitami zarodźca

Opisujemy mysi model eksperymentalnej malarii mózgowej i pokazujemy, jak można śledzić stan zapalny i patologię mikrokrążenia in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego.

In vivo (in vivo) Śledzenie rozwoju obrzęku i patologii mikrokrążenia w modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego

Ze względu na uderzające podobieństwa cyklu życia i biologii pasożytów malarii u gryzoni do pasożytów malarii u ludzi, modele malarii u gryzoni stały się niezbędne do badań nad malarią. W niniejszym artykule ustandaryzowaliśmy niektóre z najważniejszych technik stosowanych w analizie fenotypowej dzikich i transgenicznych gatunków gryzoni gryzoni.

Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów

Ogólnym celem tego protokołu jest instrukcja, jak wydobywać, utrzymywać i oddzielać mysie komórki astrocytów i mikrogleju od ośrodkowego układu nerwowego, a następnie infekować pasożytami pierwotniaków.

Jednoczesna izolacja pierwotnych astrocytów i mikrogleju w celu zakażenia pasożytami pierwotniaków

Do tej pory, protokoły jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od tej samej myszy są niezaspokojonym wymaganiem. Protokół przedstawia procedurę mającą zastosowanie u myszy z nieleczonym i eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia w celu zbadania złożonych sieci komórkowych podczas zapalenia nerwów i jednoczesnego zmniejszenia wymaganej liczby myszy.

Jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia

Rozwój płciowy zarodźca zachodzi w jelicie środkowym komara. Celowanie w stadia płciowe pasożyta jest obiecującą strategią blokowania transmisji. Opracowaliśmy Ookluc, transgeniczny P. berghei wykazujący ekspresję nanolucyferazy po utworzeniu zygoty, umożliwiający wysokoprzepustowe badania przesiewowe związków blokujących transmisję. W tym artykule szczegółowo opisano metody badań przesiewowych przy użyciu Ookluc.

Ookluc: Linia Plasmodium berghei do identyfikacji związków blokujących transmisję

Poznaj metodę izolacji leukocytów z mózgu myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA. Technika obejmuje perfuzję, trawienie tkanki i cytometrię przepływową do immunofenotypowania komórek zapalnych.

Izolacja i analiza sekwestrowanych w mózgu leukocytów myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA

Przeglądaj więcej filmów