Name: Izolacja i analiza sekwestrowanych w mózgu leukocytów myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Poznaj metodę izolacji leukocytów z mózgu myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA. Technika obejmuje perfuzję, trawienie tkanki i cytometrię przepływową do immunofenotypowania komórek zapalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Pani Lianie Mackiewicz za pomoc techniczną. Prace te były możliwe dzięki wsparciu infrastruktury operacyjnej rządu stanu Wiktoria oraz Krajowej Radzie ds. Zdrowia i Badań Medycznych rządu australijskiego IRIISS i grantowi projektu 1031212.

1. Zakażenie myszy P. berghei-ANKA
<ol>
 <li>Rozmrozić podwielokrotność kriokonserwowanego P. berghei ANKA pRBC.</li>
 <li>Unieruchomić odporną na malarię mózgową mysz dawcę BALB/c (8-12 tygodni) za pomocą techniki krępowania oburęcznego. Wstrzyknąć myszu 100-200 μl pRBC za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml (igła 28G). Rutynowo wstrzykuje się 1-2 myszy dawców.</li>
 <li>W 4-5 dniu po zakażeniu (p.i) wyjmij mysz dawcy z klatki i umieść ją na stacji roboczej lub jednorazowej podkładce roboczej.</li>
 <li>Delikatnie przytrzymaj mysz za koniec ogona i za pomocą małych nożyczek odetnij końcówkę ogona (około 1 mm). Alternatywnie można wykonać małe nakłucie ogona za pomocą igły o sile 25 G.</li>
 <li>Umieść kroplę krwi z żyły ogonowej myszy w pobliżu końca szkiełka mikroskopowego z matowym końcem.</li>
 <li>Umieść drugi szkiełko (rozsiewacz) pod kątem 45° i włóż go z powrotem do kropli krwi. Gdy krew rozprzestrzeni się wzdłuż krawędzi, dociśnij szkiełko rozsiewacza równomiernie po szkiełku mikroskopu, aby rozmazać krew. Pozostaw rozmaz do wyschnięcia na powietrzu.</li>
 <li>Utrwal rozmazy krwi w 100% metanolu przez 30 sekund, a następnie zaplamić szkiełka w świeżo przygotowanym Giemsie na 10 minut.</li>
 <li>Płukać rozmaz krwi bieżącą wodą przez 1 minutę, pozostawić do wyschnięcia na powietrzu i zbadać szkiełko pod mikroskopem (100x, zanurzenie w olejku). Wylicz pRBC w obrębie 1,000 erytrocytów i oblicz procent parazytemii. Myszy dawcy powinny osiągnąć poziom parazytemii między 2,5-5%, zanim będzie można je wykrwawić z powodu zakażenia zwierząt doświadczalnych.</li>
 <li>Pobrać krew od myszy dawcy przez krwawienie zaoczodołowe za pomocą heparynizowanej mikrohematokrytu rurki kapilarnej. Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane zgodnie z wymogami Komisji ds. Etyki Zwierząt Instytutu Waltera i Elizy Hall. W zależności od wymagań lokalnej Komisji Etyki Zwierząt mogą być stosowane inne procedury wykrwawiania. Rozpuścić wymaganą ilość krwi w pożywce RPMI w końcowym stężeniu 1X106 pRBC/0,2 ml. Weź pod uwagę, że normalny hematokryt myszy to ~6x109 czerwonych krwinek/1 ml.</li>
 <li>Zakażone eksperymentalne myszy C57BL/6 (w wieku 8-12 tygodni) należy wstrzyknąć dootrzewnowo (i.p) 1x106 pRBC/0,2 ml.</li>
 <li>Aby monitorować poziom pasożyta u zakażonych myszy, wykonaj kroki 1.3-1.8. Parazytemię należy oznaczać co 2-3 dni, począwszy od 2 lub 3 dnia.</li>
<li>Początek ciężkiej malarii u myszy C57BL/6 może objawiać się zgarbionym wyglądem, marszczoną sierścią i niską aktywnością. Niektóre myszy mogą wyzdrowieć na tym etapie, ale postęp do utraty odruchu samoprostowania wskazuje na nieodwracalną chorobę i zwierzęta muszą zostać poddane eutanazji. </li>
</ol>
2. Perfuzja wewnątrzsercowa myszy i ekstrakcja mózgu
<ol>
 <li>Zmontuj ręczny system perfuzji grawitacyjnej, mocując zbiornik o pojemności 500 ml do uchwytu kolumny przymocowanego do górnej części stojaka kolumny o średnicy 60 cm. Podłącz plastikową rurkę do dolnego końca zbiornika i zabezpiecz rurkę clamp, aby kontrolować przepływ bufora. Przymocuj rurkę do igły 23 G. Napełnij zbiornik PBS (utrzymywanym w temperaturze 22 °C), otwórz zacisk i pozwól, aby bufor przepłynął przez rurkę, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.</li>
 <li>Eutanazja myszy zakażonej P. berghei ANKA przez wdychanie CO2 . Potwierdź śmierć przez brak reakcji na pedał, orbitę i oddech.</li>
 <li>Przypnij uśpioną mysz tylną i przednią łapą grzbietowo do styropianowej deski preparacyjnej umieszczonej w plastikowej tacy. W zależności od wymagań lokalnej Komisji Etyki Zwierząt, znieczulenie może być podane przed rozpoczęciem pefuzji śródsercowej.</li>
 <li>Przetrzyj stronę brzuszną 70% etanolem.</li>
 <li>Użyj dużych nożyczek i kleszczy, aby otworzyć skórę wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić klatkę piersiową. Złóż i przypnij skórę do boków.</li>
 <li>Przytrzymaj mostek cienkimi kleszczami i przetnij przeponę oraz wzdłuż obu stron mostka, przecinając żebra. Uważaj, aby nie uszkodzić żadnych dużych naczyń krwionośnych.</li>
 <li>Przypnij klatkę piersiową za mostek luźno obok głowy.</li>
 <li>Przytrzymaj komory cienkimi kleszkami i ostrożnie naciąć prawy przedsionek cienkimi nożyczkami.</li>
 <li>Włóż igłę 23G przymocowaną do systemu perfuzji grawitacyjnej do lewej komory w kierunku aorty wstępującej podczas pracy PBS. Włożyć tylko 0,5 cm końcówki igły.</li>
 <li>Używaj myszy przez 5 minut lub do momentu, gdy ścieki będą czyste.</li>
 <li>Odepnij mysz i połóż ją na jej brzuchu. Przetrzyj głowę 70% etanolem.</li>
 <li>Za pomocą dużych nożyczek wykonaj cięcie tuż nad obszarem szyjnego rdzenia kręgowego.</li>
 <li>Użyj cienkich nożyczek, aby wykonać środkowe cięcie ogonowo-rostralne, zaczynając od podstawy czaszki i oderwij skórę, aby odsłonić czaszkę.</li>
 <li>Trzymając głowę, umieść ostrza małych nożyczek w każdej jamie oczodołu i wykonaj cięcie między oczodołami.</li>
 <li>Wykonaj podłużne cięcie wzdłuż szwu strzałkowego i ostrożnie oderwij czaszkę na każdej półkuli mózgu na zewnątrz.</li>
 <li>Za pomocą szpatułki delikatnie podnieś mózg i umieść go w 10 ml probówce wirówkowej zawierającej pożywkę RPMI.</li>
</ol>
3. Izolacja leukocytów sekwestrowanych w mózgu (BSL)
<ol>
 <li>Pracując w komorze bezpieczeństwa, umieść świeżo pobrany mózg na sitku do komórek ze stali nierdzewnej (rozmiar oczek 40-60) na szalce Petriego zawierającej 3-5 ml pożywki do hodowli tkankowych RPMI.</li>
 <li>Pokrój tkankę mózgową na małe kawałki.</li>
 <li>Przepchnij małe kawałki tkanki mózgowej przez sitko komórkowe za pomocą kryształowego tłoka.</li>
 <li>Przenieść homogenat mózgu do probówki o pojemności 10 ml i wirować przy 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Rozpuścić osad w 3 ml pożywki RPMI, zawierającej 0,05% kolagenazy D i 2U/ml DNAzy I.</li>
 <li>Obracaj mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć resztki komórek, przepychając mieszaninę przez sitko z nylonu o wielkości 70 μm i/lub inkubując na lodzie przez 5 minut.</li>
 <li>Ułożyć homogenat mózgu na poduszce Percoll o pojemności 7 ml 30% i wirować przy 400 x g (bez hamulców) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Zawiesić osad w 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek i inkubować na lodzie przez 5 minut w celu lizy przylegających pRBC, których nie można było usunąć z mózgu przez perfuzję wewnątrzsercową.</li>
 <li>Dodać 9 ml pożywki RPMI, przemyć komórki i odwirować w temperaturze 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Zawiesić osad zawierający BSL w 50-100 μl pożywki RPMI i przenieść komórki do probówki Eppendorfa.</li>
 <li>Rozcieńczyć 5-10 μl podwielokrotności próbki komórki w stosunku 1:2 w błękitu trypanowym w celu identyfikacji komórek żywotnych.</li>
 <li>Policz żywe komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru. Od 6 dnia p.i., kiedy myszy zakażone P. berghei ANKA wykazują objawy neurologiczne, można odzyskać 20 000-100 000 BSL.</li>
</ol>
4. Immunofenotypowanie BSL za pomocą wielobarwnej cytometrii przepływowej
<ol>
 <li>Odwirować komórki przy 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 50 μl buforu barwiącego (PBS, 1% płodowa surowica cielęca (FCS), 2 mm EDTA).</li>
 <li>Dodać 1 μl oczyszczonego przeciwciała anty-CD16/32 (Fcblock).</li>
 <li>Inkubuj komórki przez 10 minut na lodzie.</li>
 <li>Umyj komórki 1 ml buforu barwiącego. Odwirować komórki przy 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.</li>
 <li>Zawiesić komórki w 50 μl buforu barwiącego zawierającego z góry określone optymalne rozcieńczenia wymaganych przeciwciał fluorescencyjnych, tj. anty-CD4, anty-CD8, anty-TCR i anty-NK1.1.</li>
 <li>Inkubować przez 1 godzinę na lodzie.</li>
 <li>Umyj komórki 1 ml buforu barwiącego. Odwirować komórki przy 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.</li>
 <li>Zawieś komórki w 100 μl PBS.</li>
 <li>Przenieś komórki do plastikowej rurki do cytometrii przepływowej.</li>
 <li>Za pomocą cytometru przepływowego uzyskaj co najmniej 5 000-10 000 zdarzeń. W razie potrzeby należy dołączyć odpowiednie niebarwione kontrole komórkowe i próbki kompensacji fluorochromu.</li>
 <li>Analizuj wyniki za pomocą odpowiedniego oprogramowania do cytometrii przepływowej.</li>
</ol>

<ol><li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+malaria%3A+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li>
<li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li>
<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+basis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li>
<li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50(2012).</li>
<li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747(2011).</li>
<li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus%3A+immunity+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8%2B+T+cells+in+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li>
<li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li>
<li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3%2B+T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li>
<li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li>
<li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369(2009).</li>
<li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+malaria+parasite+sequestration%3A+CD36+is+the+major+receptor%2C+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li>
<li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8%2B+T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunololgy%22%5BJournal%5D)">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li>
<li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8%2B+T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens%2C+largely+regulated+by+CD8alpha%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Izolacja i analiza BSL to metoda, która umożliwia charakterystykę i kwantyfikację komórek zapalnych migrujących do mózgu w odpowiedzi na uszkodzenie tkanki lub infekcję w eksperymentalnych modelach mysich. Wprowadzenie etapu perfuzji wewnątrzsercowej w celu usunięcia przedziału krwi przed ekstrakcją narządu i późniejszą izolacją komórek jest przydatne, aby zapobiec zanieczyszczeniu komórek zapalnych niezapalnymi krążącymi leukocytami. Może to nie być niezbędne w przypadku zakażeń neurotropowych, takich jak wirus mysiego ...

<table><tbody><tr><td colspan="4">Roztwory i </td></tr><tr><td>Roztwór błękitu metylenowego azur Giemsy</td><td>Merck Millipore</td><td>1.09204.0500</td><td>1:10 rozcieńczenie w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td> RPMI <td>Toniczność myszy </td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>20 mM Fosforan sodu, 0,149 NaCl, pH 7,3</td></tr><tr><td>0,4%Trypan Blue </td><td>Sigma Aldrich</td><td>T-8154</td><td>Rozcieńczenie 1:2</td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Worthington Biochemiczna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>deoksyrybonukleaza (DNAse) I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4263-5VL</td><td>Z trzustki bydlęcej</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td>30% roztwór w PBS </td></tr><tr><td>Ultrapure Tris</td><td>Invitrogen</td><td>15505-020</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu (NH4Cl)</td><td>AnalaR</td><td>10017</td><td></td></tr><tr>Bufor <td></td><td></td><td>do lizy krwinek czerwonych</td><td>17 mM Tris, 14 nM NH4Cl, pH 7,2</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>1009</td><td></td></tr><tr><td>EDTA sól disodowa</td><td>Merck</td><td>10093.5V</td><td>0.1M, pH 7.2</td></tr><tr><td colspan="4"><silne>Przeciwciała i koniugaty </td></tr><tr><td>Anty-mysie CD16/CD32 (blok Fc), klon 2.4G2</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td>1 & l w 50 &mu; l bufor do barwienia (0,5 mg/50 ml)</td></tr> <tr><td>FITC-anty-myszy CD4, klon H129.19</td><td>BD Pharmingen</td><td>553651</td><td></td></tr><tr><td>PE-anty-mysz NK1.1, klon PK136</td><td>BD Pharmingen</td><td>553165</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCy5.5-anty-myszy CD8, klon 53-6-7</td><td>BD Pharmingen</td><td>551162</td><td></td></tr><tr><td>APC-anty-myszy TCR-&#946;, klon H57-597</td><td>BD Pharmingen</td><td>553174</td><td></td></tr><tr><td>PE-anty-myszy CXCR3, klon 220803</td><td>R& D Systems</td><td>FAB1685P</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowany-anty-mysz CCR5, klon C34-3448</td><td>BD Pharmingen</td><td>559922</td><td></td></tr><tr><td>Steptavidin-PerCP-Cy5.5</td><td>BD Pharmingen</td><td>551419</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Sprzęt i materiał</mocny> </td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe SuperFrost</td><td>Lomb Menzel-Gl&#228; ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne, nożyczki</td><td>REDA Instrumente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 ml Zbiornik PBS</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurka</td><td></td><td></td><td></td>gumowa</tr><tr><td>igła 23G</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>302008</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji komórek zawierający metalowe sito</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CD-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m nylonowe sitko do komórek</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>GmbH Neubauer</td><td>717810</td><td></td></tr><tr><td>Rurki do cytometrii przepływowej</td><td>BD Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i analiza sekwestrowanych w mózgu leukocytów myszy zakażonych plasmodium berghei anka

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Opisujemy metodę izolacji i charakterystyki przylegających komórek zapalnych z naczyń krwionośnych mózgu myszy zakażonych P. berghei ANKA. Zakażenie podatnych szczepów myszy tym szczepem pasożyta powoduje indukcję eksperymentalnej malarii mózgowej, zespołu neurologicznego, który podsumowuje pewne ważne aspekty ciężkiej malarii u ludzi za pośrednictwem Plasmodium falciparum 1,2 . Dojrzałe formy malarii we krwi wykazują ekspresję białek pasożytniczych na powierzchni zakażonego erytrocytu, co umożliwia im wiązanie się z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych. Proces ten indukuje przeszkody w przepływie krwi, co prowadzi do niedotlenienia i krwotoków 3 , a także stymuluje rekrutację leukocytów zapalnych do miejsca sekwestracji pasożytów.
W przeciwieństwie do innych infekcji, tj. wirusów neutrotopowych4-6, zarówno pasożytujące na malarii czerwone krwinki (pRBC), jak również związane z nimi leukocyty zapalne pozostają odizolowane w naczyniach krwionośnych, a nie infiltrują miąższ mózgu. Tak więc, aby uniknąć zanieczyszczenia sekwestrowanych leukocytów niezapalnymi komórkami krążącymi, w tej procedurze wymagana jest rozległa perfuzja wewnątrzsercowa zakażonych myszy przed ekstrakcją narządu i przetwarzaniem tkanek w celu usunięcia przedziału krwi. Po perfuzji mózgi są zbierane i preparowane na małe kawałki. Struktura tkanki jest dodatkowo zaburzona przez enzymatyczne traktowanie kolagenazą D i DNAzą I. Uzyskany homogenat mózgu jest następnie odwirowywany w gradiencie Percoll, który umożliwia oddzielenie leukocytów sekwestrowanych w mózgu (BSL) od mieliny i innych szczątków tkankowych. Wyizolowane komórki są następnie myte, liczone za pomocą hemocytometru i barwione przeciwciałami fluorescencyjnymi w celu późniejszej analizy za pomocą cytometrii przepływowej.
Ta procedura pozwala na kompleksową charakterystykę fenotypową leukocytów zapalnych migrujących do mózgu w odpowiedzi na różne bodźce, w tym udar oraz infekcje wirusowe lub pasożytnicze. Metoda ta stanowi również użyteczne narzędzie do oceny nowych metod leczenia przeciwzapalnego w przedklinicznych modelach zwierzęcych.

Wyniki przedstawione na Rys. 2 pokazują procentowe i bezwzględne liczby różnych populacji BSL odzyskanych z mózgów perfundowanych i nieperfundowanych myszy zakażonych malarią oraz naiwnych myszy kontrolnych. Izolowane BSL barwiono przeciwciałami PE-anty-NK1.1 oraz APC-anty-TCR-β, zgodnie z opisem w tekście protokołu. Zgodnie z wcześniejszymi odkryciami 7-9, limfocyty T αβTCR+ stanowiły wysoką proporcję puli BSL w mózgach perfundowanych myszy zakażonych malarią (dzień 6 p.i). Populacja ta wydawała si...

Opisano metodę izolacji przylegających leukocytów zapalnych z naczyń krwionośnych mózgu myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA. Metoda umożliwia kwantyfikację oraz charakterystykę fenotypową wyizolowanych leukocytów po barwieniu przeciwciałami fluorescencyjnymi, a następnie analizie za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja i analiza sekwestrowanych w mózgu leukocytów myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie przylegających leukocytów zapalnych z naczyń krwionośnych mózgu myszy zakażonych Plasmodium burge eye anca w celu wywołania eksperymentalnej malarii mózgowej. Myszy są zakażone krwinkami czerwonymi pasożytniczymi Plasmodium berge eye anca przez wstrzyknięcie. Po tym, jak myszy zaczną wykazywać oznaki choroby, krążące komórki myszy zakażonych malarią są usuwane przez perfuzję wewnątrzustną.Mózgi są następnie pobierane, a tkanka jest trawiona przez enzymy, aby umożliwić izolację leukocytów zapalnych. Następnie wykonuje się wielobarwną cytometrię przepływową do fenotypu immunologicznego. Analiza leukocytów sekwestrowanych w mózgu na podstawie uzyskanych danych ujawnia procentową i bezwzględną liczbę leukocytów migrujących do mózgu myszy zakażonych malarią.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie patogenezy malarii, takie jak to, jaki rodzaj komórek zapalnych migruje do miejsca sekwestracji pasożytów w mózgu zakażonych zwierząt w różnych warunkach eksperymentalnych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Etapy perfuzji są trudne do nauczenia, ponieważ wymagają zarówno szybkości, jak i ostrożności, aby nie uszkodzić żadnych znaczących naczyń krwionośnych Niektóre części tej procedury zademonstrują Leanna Mcic, technik zwierząt, pani Victoria, Rick, doktorant i dr Lisa Aez, doktorant z mojego laboratorium.Rozpocznij ten protokół od zakażenia myszy za pomocą p berge eye anca rozmrażania kriokonserwowanej podwielokrotności P berge eye anca pasożytujących czerwonych krwinek lub pbc, pozwalając mu osiągnąć temperaturę pokojową. Wyjmij ośmio- do 12-tygodniową mysz dawcy z klatki i umieść ją na stacji roboczej. Chwyć kark szyi między palcem wskazującym a kciukiem.Odwróć mysz i wstrzyknij od 100 do 200 mikrolitrów oka plasmodium berge do jamy otrzewnej. Rutynowo dwóm myszom-dawcom wstrzykuje się pbcs. Po wstrzyknięciu umieść myszy w klatce cztery do pięciu dni po zakażeniu.Wyjmij mysz dawcy z klatki i umieść ją na stacji roboczej. Umieść kroplę krwi z żyły ogonowej myszy w pobliżu końca matowego szkiełka mikroskopowego. Umieść drugi szkiełko pod kątem 45 stopni i włóż je z powrotem do kropli krwi.Gdy krew rozprzestrzeni się wzdłuż krawędzi, dociśnij szkiełko rozsiewacza równomiernie po szkiełku mikroskopu, aby rozmazać krew. Pozostaw rozmaz do wyschnięcia na powietrzu, aby utrwalić rozmazy krwi. Zanurz szkiełka w 100% metanolu na 30 sekund.Następnie zabarwić szkiełka w świeżo przygotowanym GIM ZA przez 10 minut po zabarwieniu gim za, płukać szkiełko pod bieżącą wodą przez 30 sekund. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu, a następnie zbadaj je pod mikroskopem za pomocą soczewki zanurzeniowej 100 x z olejkiem. Wylicz PRBC w obrębie tysiąca erytrocytów i oblicz procent para, jeśli mysz dawca osiągnęła wymagane poziomy od 2,5 do 5% Parsit Zbierz krew od myszy dawcy przez nakłucie serca w znieczuleniu lub krwawienie zaoczodołowe za pomocą heparynizowanej mikrohematokrytu rurki kapilarnej.Rozpuść krew w pożywce RPMI w końcowym stężeniu od jednego razy 10 do sześciu PRBC na 0,2 mililitra na mysz. Weź pod uwagę, że normalny hematokryt myszy wynosi około sześć razy 10 do dziewiątych czerwonych krwinek na mililitr. W rzeczywistości ośmio- do 12-tygodniowych eksperymentalnych czarnych myszy C 57 przez wstrzyknięcie jednego razy 10 do szóstego PRBC w 0,2 mililitra dootrzewnowego, jak poprzednio.Aby monitorować poziom para zakażonych myszy, przygotuj rozmas krwi jak poprzednio. Para należy oznaczać co dwa do trzech dni, począwszy od drugiego lub trzeciego dnia po zakażeniu, począwszy od piątego dnia. Po zakażeniu i później.Myszy są codziennie monitorowane pod kątem objawów ciężkiej malarii, gdy poziom para jest większy niż 5%, a myszy wykazują objawy neurologiczne około szóstego dnia po zakażeniu. Zakażone myszy są poddawane eutanazji przez wdychanie CO2 i natychmiast poddawane perfuzji PBS, jak opisano w towarzyszącym dokumencie. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest perfuzja wewnątrzsercowa.Poniżej przedstawiono szereg wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów: Z myszą przypiętą do styropianowej deski do rozwarstwiania. Na tacy sekcyjnej. Przetrzyj stronę brzuszną 70% etanolem, a następnie użyj dużych nożyczek i kleszczy, aby otworzyć skórę wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić jamę piersiową, fałdować i przypinać skórę na boki.Przytrzymaj mostek cienkimi kleszczami i przetnij przeponę oraz wzdłuż obu stron mostka, przecinając żebra. Uważaj, aby nie uszkodzić żadnych dużych naczyń krwionośnych. Przypnij klatkę piersiową za mostek luźno obok głowy.Przytrzymaj komory cienkimi kleszkami i ostrożnie naciąć prawy przedsionek cienkimi nożyczkami. Włóż igłę o rozmiarze 23 przymocowaną do systemu perfuzji grawitacyjnej do lewej komory w kierunku aorty wstępującej. Podczas pracy PBS włóż tylko 0.5 centymetra końcówki igły, przetapiaj mysz przez pięć minut lub do momentu, gdy ścieki będą czyste.Po perfuzji wewnętrznej wypreparuj mózg i umieść go w 10-mililitrowej probówce wirówkowej zawierającej RPMI. Średni. Umieść świeżo pobrany mózg na sitku do komórek ze stali nierdzewnej o wielkości od 40 do 60 oczek na szalce Petriego zawierającej od trzech do pięciu mililitrów pożywki do hodowli tkankowych RPMI. Pokrój tkankę mózgową na małe kawałki.Następnie za pomocą kryształowego tłoka przepchnij małe kawałki tkanki mózgowej przez sitko komórkowe. Przenieś homogenat mózgu do 10-mililitrowej probówki i odwiruj go w temperaturze 250 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu wyrzuć supernatant i rozpuść osad w trzech mililitrach RPMI.Pożywka zawierająca kolagenazę D i łabędzia DNA. Obracaj mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usuń wszelkie resztki komórek, przepychając mieszaninę przez sitko do ogniw nylonowych o grubości 70 mikronów.Następnie inkubować na lodzie przez pięć minut po inkubacji w 10-mililitrowej probówce. Ostrożnie nałóż homogenat mózgu na siedmiomililitrową wirówkę z poduszką o stężeniu 30% na wywołanie o temperaturze 400 razy G przez 20 minut w temperaturze pokojowej z odrywaniem. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze lizy czerwonych krwinek, buforować i inkubować na lodzie przez pięć minut.Do lizy przylegających pbc, które nie są usuwane z mózgu przez perfuzję wewnątrzustną. Dodaj dziewięć mililitrów pożywki płuczącej RPMI i odwiruj w temperaturze 250 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Resus zawiesić sekwestrowane leukocyty mózgu lub BSL zawierające osad w 50 do 100 mikrolitrach pożywki RPMI i przenieść komórki do mikroprobówki wirówkowej, policzyć żywe komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru i wykluczenia błękitu trianowego.Sześć dni po zakażeniu można odzyskać od 20 000 do 100 000 BSL po uzyskaniu liczby żywotnych komórek. Komórki przygotowuje się do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Szczegółowe informacje na temat tej procedury znajdują się w dokumencie towarzyszącym, ale w tym miejscu są one najpierw streszczane.Wszystkie komórki wyizolowane z każdego mózgu są odwirowywane w 1,5-mililitrowej mikroprobówce do fuge i ponownie zawieszane w buforze barwiącym z przeciwciałami blokującymi anty CD 16 i CD 32. Po 10 minutach inkubacji na lodzie, komórki przemywa się buforem barwiącym, ponownie odwirowuje i ponownie zawiesza w buforze barwiącym zawierającym przeciwciała fluorescencyjne anty CD cztery, anty CD ósem, anty TCR i anty NK 1,1. Komórki inkubuje się na lodzie przez jedną godzinę, przemywając je barwieniem, buforem i wirówką.Po spinieniu komórki są ponownie zawieszane w PBS i co najmniej 5 000 do 10 000 zdarzeń jest rejestrowanych na cytometrze przepływowym. Uzyskane dane są analizowane za pomocą odpowiedniego oprogramowania do cytometrii przepływowej. Populacje BSL zostały odzyskane z mózgów myszy z perfuzją lub UN, zakażonych malarią i wcześniej nieleczonych myszy kontrolnych i wybarwionych przeciwciałami pe, anty NK 1.1 i PC anty TCR beta.Te wykresy kropkowe przedstawiają procentowy udział komórek NK, limfocytów T, komórek NK 1.1 dodatnich TCR i komórek podwójnie ujemnych. NK 1.1 ujemny TCR ujemny u perfundowanych lub niepołączonych, zakażonych malarią i nieleczonych myszy kontrolnych, zgodnie z wcześniejszymi wynikami. Limfocyty T alfa beta TCR dodatnie stanowiły dużą część puli BSL w mózgach myszy zakażonych perfuzją malarii w szóstym dniu po zakażeniu.Populacja ta wydawała się być znacznie niedostatecznie reprezentowana w mózgach zwierząt nieperfundowanych. Pozorne zmniejszenie częstości występowania komórek T w mózgach bez perfuzji wiązało się ze znacznie wyższym odsetkiem i całkowitą liczbą komórek podwójnie ujemnych u tych zwierząt. Wysoki odsetek i liczba podwójnie ujemnych komórek w nieperfundowanych mózgach wykryto nie tylko u myszy zakażonych malarią, ale także u naiwnych osób z grupy kontrolnej, co sugeruje, że komórki te są niezapalnymi leukocytami obecnymi w naczyniach krwionośnych mózgu, które są odzyskiwane wraz z komórkami zapalnymi, jeśli nie zostanie przeprowadzona perfuzja wewnątrzsercowa.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wykonaniu rozległej infuzji wewnątrzsercowej zakażonych myszy przed ekstrakcją narządów, aby uniknąć zanieczyszczenia sekwestrowanych leukocytów niezapalnymi komórkami krążącymi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i analizować sekwestrowane leukocyty w mózgu od myszy zakażonych Plasmodium virga za pomocą płynnej geometrii.

isolation-analysis-brain-sequestered-leukocytes-from-plasmodium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja i analiza leukocytów uwięzionych w mózgu od myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Opisano szybką metodę pozyskiwania leukocytów naciekających mózg myszy. Metoda ta wykorzystuje ciągły gradient Percoll oraz nieciągły gradient Ficoll w celu wyselekcjonowania i oczyszczenia warstwy wzbogaconej w leukocyty. Wyizolowane leukocyty mogą być następnie scharakteryzowane za pomocą pomiarów cytometrycznych.

Izolacja leukocytów naciekających mózg

Ten film demonstruje generowanie eksperymentalnego mysiego modelu malarii mózgowej. Sporozoity wyizolowane z samic komarów zakażonych Plasmodium berghei są wstrzykiwane do uwięzionych żył ogonowych myszy, co prowadzi do przerwania bariery krew-mózg i zapalenia mózgu, powodując malarię mózgową. Ten zakażony model myszy stanowi cenne narzędzie do badania in vivo patologii mikrokrążenia związanej z malarią mózgową.

Wygenerowanie mysiego modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem sporozoitów pochodzących od komarów gospodarzy

Ten film demonstruje test do immunizacji modelu myszy żywymi, atenuowanymi sporozoitami. Osłabione promieniowaniem sporozoity Plasmodium są wstrzykiwane do grzbietowej strony ucha myszy. Po wstrzyknięciach w wielu miejscach na obu uszach mysz może dojść do siebie.

Immunizacja śródskórna żywymi atenuowanymi sporozoitami w modelu mysim

Opisujemy tutaj protokół izolacji komórek szpikowych ze skóry myszy i drenowania węzłów chłonnych po śródskórnym wstrzyknięciu sporozoitów Plasmodium. Cytometria przepływowa pobranych komórek zapewnia wiarygodny test charakteryzujący reakcję zapalną skóry i węzłów chłonnych drenujących na pasożyta.

Izolacja komórek szpikowych ze skóry myszy i drenaż węzłów chłonnych po szczepieniu śródskórnym żywymi atenuowanymi sporozoitami zarodźca

Opisujemy mysi model eksperymentalnej malarii mózgowej i pokazujemy, jak można śledzić stan zapalny i patologię mikrokrążenia in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego.

In vivo (in vivo) Śledzenie rozwoju obrzęku i patologii mikrokrążenia w modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego

Ze względu na uderzające podobieństwa cyklu życia i biologii pasożytów malarii u gryzoni do pasożytów malarii u ludzi, modele malarii u gryzoni stały się niezbędne do badań nad malarią. W niniejszym artykule ustandaryzowaliśmy niektóre z najważniejszych technik stosowanych w analizie fenotypowej dzikich i transgenicznych gatunków gryzoni gryzoni.

Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów

Ogólnym celem tego protokołu jest instrukcja, jak wydobywać, utrzymywać i oddzielać mysie komórki astrocytów i mikrogleju od ośrodkowego układu nerwowego, a następnie infekować pasożytami pierwotniaków.

Jednoczesna izolacja pierwotnych astrocytów i mikrogleju w celu zakażenia pasożytami pierwotniaków

Malaria jest przenoszona przez inokulację stadium sporozoitu Plasmodium przez zakażone komary. Transgeniczne zarodźce pozwoliły nam lepiej zrozumieć biologię malarii i bezpośrednio przyczyniły się do opracowania szczepionki przeciwko malarii. W tym miejscu opisujemy uproszczoną metodologię generowania transgenicznych sporozoitów Plasmodium berghei.

Wytwarzanie genetycznie zmodyfikowanych sporozoitów Plasmodium berghei

Do tej pory, protokoły jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od tej samej myszy są niezaspokojonym wymaganiem. Protokół przedstawia procedurę mającą zastosowanie u myszy z nieleczonym i eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia w celu zbadania złożonych sieci komórkowych podczas zapalenia nerwów i jednoczesnego zmniejszenia wymaganej liczby myszy.

Jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia

Rozwój płciowy zarodźca zachodzi w jelicie środkowym komara. Celowanie w stadia płciowe pasożyta jest obiecującą strategią blokowania transmisji. Opracowaliśmy Ookluc, transgeniczny P. berghei wykazujący ekspresję nanolucyferazy po utworzeniu zygoty, umożliwiający wysokoprzepustowe badania przesiewowe związków blokujących transmisję. W tym artykule szczegółowo opisano metody badań przesiewowych przy użyciu Ookluc.

Ookluc: Linia Plasmodium berghei do identyfikacji związków blokujących transmisję

Poznaj metodę izolacji leukocytów z mózgu myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA. Technika obejmuje perfuzję, trawienie tkanki i cytometrię przepływową do immunofenotypowania komórek zapalnych.

Izolacja i analiza sekwestrowanych w mózgu leukocytów myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA

Przeglądaj więcej filmów