Izolacja i analiza sekwestrowanych w mózgu leukocytów myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie przylegających leukocytów zapalnych z naczyń krwionośnych mózgu myszy zakażonych Plasmodium burge eye anca w celu wywołania eksperymentalnej malarii mózgowej. Myszy są zakażone krwinkami czerwonymi pasożytniczymi Plasmodium berge eye anca przez wstrzyknięcie. Po tym, jak myszy zaczną wykazywać oznaki choroby, krążące komórki myszy zakażonych malarią są usuwane przez perfuzję wewnątrzustną.

Mózgi są następnie pobierane, a tkanka jest trawiona przez enzymy, aby umożliwić izolację leukocytów zapalnych. Następnie wykonuje się wielobarwną cytometrię przepływową do fenotypu immunologicznego. Analiza leukocytów sekwestrowanych w mózgu na podstawie uzyskanych danych ujawnia procentową i bezwzględną liczbę leukocytów migrujących do mózgu myszy zakażonych malarią.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie patogenezy malarii, takie jak to, jaki rodzaj komórek zapalnych migruje do miejsca sekwestracji pasożytów w mózgu zakażonych zwierząt w różnych warunkach eksperymentalnych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Etapy perfuzji są trudne do nauczenia, ponieważ wymagają zarówno szybkości, jak i ostrożności, aby nie uszkodzić żadnych znaczących naczyń krwionośnych Niektóre części tej procedury zademonstrują Leanna Mcic, technik zwierząt, pani Victoria, Rick, doktorant i dr Lisa Aez, doktorant z mojego laboratorium.

Rozpocznij ten protokół od zakażenia myszy za pomocą p berge eye anca rozmrażania kriokonserwowanej podwielokrotności P berge eye anca pasożytujących czerwonych krwinek lub pbc, pozwalając mu osiągnąć temperaturę pokojową. Wyjmij ośmio- do 12-tygodniową mysz dawcy z klatki i umieść ją na stacji roboczej. Chwyć kark szyi między palcem wskazującym a kciukiem.

Odwróć mysz i wstrzyknij od 100 do 200 mikrolitrów oka plasmodium berge do jamy otrzewnej. Rutynowo dwóm myszom-dawcom wstrzykuje się pbcs. Po wstrzyknięciu umieść myszy w klatce cztery do pięciu dni po zakażeniu.

Wyjmij mysz dawcy z klatki i umieść ją na stacji roboczej. Umieść kroplę krwi z żyły ogonowej myszy w pobliżu końca matowego szkiełka mikroskopowego. Umieść drugi szkiełko pod kątem 45 stopni i włóż je z powrotem do kropli krwi.

Gdy krew rozprzestrzeni się wzdłuż krawędzi, dociśnij szkiełko rozsiewacza równomiernie po szkiełku mikroskopu, aby rozmazać krew. Pozostaw rozmaz do wyschnięcia na powietrzu, aby utrwalić rozmazy krwi. Zanurz szkiełka w 100% metanolu na 30 sekund.

Następnie zabarwić szkiełka w świeżo przygotowanym GIM ZA przez 10 minut po zabarwieniu gim za, płukać szkiełko pod bieżącą wodą przez 30 sekund. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu, a następnie zbadaj je pod mikroskopem za pomocą soczewki zanurzeniowej 100 x z olejkiem. Wylicz PRBC w obrębie tysiąca erytrocytów i oblicz procent para, jeśli mysz dawca osiągnęła wymagane poziomy od 2,5 do 5% Parsit Zbierz krew od myszy dawcy przez nakłucie serca w znieczuleniu lub krwawienie zaoczodołowe za pomocą heparynizowanej mikrohematokrytu rurki kapilarnej.

Rozpuść krew w pożywce RPMI w końcowym stężeniu od jednego razy 10 do sześciu PRBC na 0,2 mililitra na mysz. Weź pod uwagę, że normalny hematokryt myszy wynosi około sześć razy 10 do dziewiątych czerwonych krwinek na mililitr. W rzeczywistości ośmio- do 12-tygodniowych eksperymentalnych czarnych myszy C 57 przez wstrzyknięcie jednego razy 10 do szóstego PRBC w 0,2 mililitra dootrzewnowego, jak poprzednio.

Aby monitorować poziom para zakażonych myszy, przygotuj rozmas krwi jak poprzednio. Para należy oznaczać co dwa do trzech dni, począwszy od drugiego lub trzeciego dnia po zakażeniu, począwszy od piątego dnia. Po zakażeniu i później.

Myszy są codziennie monitorowane pod kątem objawów ciężkiej malarii, gdy poziom para jest większy niż 5%, a myszy wykazują objawy neurologiczne około szóstego dnia po zakażeniu. Zakażone myszy są poddawane eutanazji przez wdychanie CO2 i natychmiast poddawane perfuzji PBS, jak opisano w towarzyszącym dokumencie. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest perfuzja wewnątrzsercowa.

Poniżej przedstawiono szereg wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów: Z myszą przypiętą do styropianowej deski do rozwarstwiania. Na tacy sekcyjnej. Przetrzyj stronę brzuszną 70% etanolem, a następnie użyj dużych nożyczek i kleszczy, aby otworzyć skórę wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić jamę piersiową, fałdować i przypinać skórę na boki.

Przytrzymaj mostek cienkimi kleszczami i przetnij przeponę oraz wzdłuż obu stron mostka, przecinając żebra. Uważaj, aby nie uszkodzić żadnych dużych naczyń krwionośnych. Przypnij klatkę piersiową za mostek luźno obok głowy.

Przytrzymaj komory cienkimi kleszkami i ostrożnie naciąć prawy przedsionek cienkimi nożyczkami. Włóż igłę o rozmiarze 23 przymocowaną do systemu perfuzji grawitacyjnej do lewej komory w kierunku aorty wstępującej. Podczas pracy PBS włóż tylko 0.5 centymetra końcówki igły, przetapiaj mysz przez pięć minut lub do momentu, gdy ścieki będą czyste.

Po perfuzji wewnętrznej wypreparuj mózg i umieść go w 10-mililitrowej probówce wirówkowej zawierającej RPMI. Średni. Umieść świeżo pobrany mózg na sitku do komórek ze stali nierdzewnej o wielkości od 40 do 60 oczek na szalce Petriego zawierającej od trzech do pięciu mililitrów pożywki do hodowli tkankowych RPMI. Pokrój tkankę mózgową na małe kawałki.

Następnie za pomocą kryształowego tłoka przepchnij małe kawałki tkanki mózgowej przez sitko komórkowe. Przenieś homogenat mózgu do 10-mililitrowej probówki i odwiruj go w temperaturze 250 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu wyrzuć supernatant i rozpuść osad w trzech mililitrach RPMI.

Pożywka zawierająca kolagenazę D i łabędzia DNA. Obracaj mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usuń wszelkie resztki komórek, przepychając mieszaninę przez sitko do ogniw nylonowych o grubości 70 mikronów.

Następnie inkubować na lodzie przez pięć minut po inkubacji w 10-mililitrowej probówce. Ostrożnie nałóż homogenat mózgu na siedmiomililitrową wirówkę z poduszką o stężeniu 30% na wywołanie o temperaturze 400 razy G przez 20 minut w temperaturze pokojowej z odrywaniem. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze lizy czerwonych krwinek, buforować i inkubować na lodzie przez pięć minut.

Do lizy przylegających pbc, które nie są usuwane z mózgu przez perfuzję wewnątrzustną. Dodaj dziewięć mililitrów pożywki płuczącej RPMI i odwiruj w temperaturze 250 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Resus zawiesić sekwestrowane leukocyty mózgu lub BSL zawierające osad w 50 do 100 mikrolitrach pożywki RPMI i przenieść komórki do mikroprobówki wirówkowej, policzyć żywe komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru i wykluczenia błękitu trianowego.

Sześć dni po zakażeniu można odzyskać od 20 000 do 100 000 BSL po uzyskaniu liczby żywotnych komórek. Komórki przygotowuje się do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Szczegółowe informacje na temat tej procedury znajdują się w dokumencie towarzyszącym, ale w tym miejscu są one najpierw streszczane.

Wszystkie komórki wyizolowane z każdego mózgu są odwirowywane w 1,5-mililitrowej mikroprobówce do fuge i ponownie zawieszane w buforze barwiącym z przeciwciałami blokującymi anty CD 16 i CD 32. Po 10 minutach inkubacji na lodzie, komórki przemywa się buforem barwiącym, ponownie odwirowuje i ponownie zawiesza w buforze barwiącym zawierającym przeciwciała fluorescencyjne anty CD cztery, anty CD ósem, anty TCR i anty NK 1,1. Komórki inkubuje się na lodzie przez jedną godzinę, przemywając je barwieniem, buforem i wirówką.

Po spinieniu komórki są ponownie zawieszane w PBS i co najmniej 5 000 do 10 000 zdarzeń jest rejestrowanych na cytometrze przepływowym. Uzyskane dane są analizowane za pomocą odpowiedniego oprogramowania do cytometrii przepływowej. Populacje BSL zostały odzyskane z mózgów myszy z perfuzją lub UN, zakażonych malarią i wcześniej nieleczonych myszy kontrolnych i wybarwionych przeciwciałami pe, anty NK 1.1 i PC anty TCR beta.

Te wykresy kropkowe przedstawiają procentowy udział komórek NK, limfocytów T, komórek NK 1.1 dodatnich TCR i komórek podwójnie ujemnych. NK 1.1 ujemny TCR ujemny u perfundowanych lub niepołączonych, zakażonych malarią i nieleczonych myszy kontrolnych, zgodnie z wcześniejszymi wynikami. Limfocyty T alfa beta TCR dodatnie stanowiły dużą część puli BSL w mózgach myszy zakażonych perfuzją malarii w szóstym dniu po zakażeniu.

Populacja ta wydawała się być znacznie niedostatecznie reprezentowana w mózgach zwierząt nieperfundowanych. Pozorne zmniejszenie częstości występowania komórek T w mózgach bez perfuzji wiązało się ze znacznie wyższym odsetkiem i całkowitą liczbą komórek podwójnie ujemnych u tych zwierząt. Wysoki odsetek i liczba podwójnie ujemnych komórek w nieperfundowanych mózgach wykryto nie tylko u myszy zakażonych malarią, ale także u naiwnych osób z grupy kontrolnej, co sugeruje, że komórki te są niezapalnymi leukocytami obecnymi w naczyniach krwionośnych mózgu, które są odzyskiwane wraz z komórkami zapalnymi, jeśli nie zostanie przeprowadzona perfuzja wewnątrzsercowa.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wykonaniu rozległej infuzji wewnątrzsercowej zakażonych myszy przed ekstrakcją narządów, aby uniknąć zanieczyszczenia sekwestrowanych leukocytów niezapalnymi komórkami krążącymi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i analizować sekwestrowane leukocyty w mózgu od myszy zakażonych Plasmodium virga za pomocą płynnej geometrii.