Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Eksperyment ten monitoruje pęknięcie VA wywołane przez patogeny wewnątrzkomórkowe w pojedynczych komórkach. Najpierw załaduj komórki barwnikiem CCF 4:00 AM, który jest rozszczepiany przez esterazy komórkowe. Następnie przygotuj i zastosuj neurobakterie FL do CCF, cztery załadowane komórki inkubują komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu inwazji bakteryjnej komórek gospodarza.

Następnie określ stosunek intensywności emitowanych w kanałach 450 nanometrów i 535 nanometrów. Wyniki wskazują na obecność patogenów w cytozolu ze względu na jego zdolność adaptacji do wysokiej przepustowości. Technika ta ułatwia identyfikację nowych antybiotyków, rozwiązując kluczowy problem lokalizacji subkomórkowej bakterii podczas interakcji patogenów gospodarza.

Wraz z moim kolegą Tranem Vanu byliśmy zainteresowani opracowaniem podejść do badania patogenów wewnątrzkomórkowych z wysoką rozdzielczością czasową. Doprowadziło to do opracowania testu regularnego pękania czterech betalaktamaz CCF. Dzisiaj podejście to zostanie zaprezentowane eksperymentalnie przez dwie doktorantki w laboratorium, Norę MellU i Charlotte Keller Zaszczep dzikie i zmutowane szczepy bakteryjne w ośmiu mililitrach TCSB zawierających 50 mikrogramów na mililitr ampicyliny, umieść kultury w wytrząsarce o temperaturze 37 stopni Celsjusza, teraz zasiewaj pięć razy 10 do trzeciej komórki hela na studzienkę.

W 100 mikrolitrach DMEM zawierających 10% płodowej surowicy cielęcej 1% penicyliny hodowli streptomycyny, komórki w inkubatorze 5% dwutlenku węgla następnego dnia subkulturują bakterie w jednym 100. rozcieńczeniu w TCSB uzupełnionym 50 mikrogramami na mililitr ampicyliny rosną w shakerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie i pół godziny. Teraz do załadowania komórek hela przygotuj barwnik CCF 4:00 AM w buforze em, umyj komórki raz PBS. Następnie dodać 25 mikrolitrów CCF 4:00 rano ładując mieszankę na studzienkę w temperaturze pokojowej w ciemności przez dwie godziny i 30 minut, aby przygotować bakterie do infekcji, jeden mililitr kultury przez odwirowanie po jednym przemyciu 500 mikrolitrami PBS Resus, zawiesić bakterie w 500 mikrolitrach PBS uzupełnionych 10 mikrogramami na mililitr polioli lizyny i 40 mikrogramów na mililitr beta-laktamazy.

Inkubować przez 10 na obracającym się kole w temperaturze pokojowej, następnie przemyć raz 500 mikrolitrami PBS i ponownie zawiesić każdą osadkę bakteryjną w 500 mikrolitrach jednego milimolowego Probenecydu w buforze EM, przemyć komórki raz 150 mikrolitrami jednej milimolowej sondy w buforze em. Następnie rozcieńczyć 10 mikrolitrów bakterii w 100 mikrolitrach jednego milimolowego roztworu sondowanego i rozprowadzić go do każdej studzienki komórek hela. Po 15 minutach inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej przenieś płytkę do 37 stopni Celsjusza na godzinę.

Przemyć raz 150 mikrolitrami jednego milimolowego roztworu probitu. Następnie utrwal próbki za pomocą 50 mikrolitrów 4% aldehydu paraform w jednym milimolowym roztworze Pro przez 10 minut w ciemności Po jednym przemyciu roztworem Probenecydu dodaj 30 mikrolitrów 10 mikromolowego barwnika jądrowego drac pięć dla optymalnej segmentacji komórek. Inkubować komórki przez 30 minut, przemyć raz i dodać 100 mikrolitrów jednego milimolowego roztworu, aby uzyskać obrazy za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego.

Użyj długości fali wzbudzenia przy 405 nanometrach. Wykrywanie emisji za pomocą filtrów 450 nanometrów i 535 nanometrów przy użyciu czasów naświetlania wynoszących pięć milisekund dla światła przechodzącego. 1000 milisekund dla 535 nanometrów i 500 milisekund dla 450 nanometrów.

Zastosowanie urządzenia do kalibracji ostrości sprzężonego z mikroskopią zautomatyzowaną pozwala na jednoczesną akwizycję dziesiątek różnych pozycji w wielu dołkach. Jeśli używasz mikroskopu konfokalnego, użyj czasów naświetlania 240 milisekund przy 450 nanometrach, 360 milisekund przy 535 nanometrach dla lasera 405 nanometrów i 640 milisekund dla lasera 640 nanometrów. Analizuj dane za pomocą algorytmu komputerowego, który umożliwia automatyczną ocenę sygnału fluorescencyjnego dla każdej pojedynczej komórki.

Na przykład użyj oprogramowania takiego jak metamorph i acapella, aby utworzyć skrypt do pomiaru stosunku między sygnałami emisyjnymi 450 nanometrów i 535 nanometrów. W tym teście rozpocznij hodowlę HELOC z dwoma razy 10 do piątych komórek w końcowej objętości dwóch mililitrów. Przygotuj bakterie do infekcji i załaduj komórki hela CCF 4:00 rano, ustaw mikroskop konwojowy z obiektywem powietrznym o planie N w komorze grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Ustaw laser 405 nanometrów i emisję za pomocą filtrów 450 nanometrów i 535 nanometrów. Wprowadź również czasy naświetlania wynoszące pięć milisekund dla światła przechodzącego. 200 milisekund dla 535 nanometrów i 100 milisekund dla 450 nanometrów.

Ustaw akwizycję danych co 90 sekund przez 60 minut. Teraz umyj komórki raz dwoma mililitrami jednego milimolowego roztworu Probenecydu. Dodaj dwa mililitry jednego sondy milimolowej do bufora em.

Następnie zamontuj czaszę na stoliku mikroskopu i rozpocznij akwizycję po sześciu minutach. Wstrzymaj przejęcie. Dodaj 250 mikrolitrów zawiesiny bakterii na wierzch komórek i ponownie rozpocznij akwizycję w celu analizy po akwizycji.

Wizualizuj filmy za pomocą metamorfu prędkości lub obrazu J. Uzyskaj współczynniki intensywności od 450 do 535 nanometrów dla każdej pojedynczej komórki. Podejście CCF 4:00 AM beta-laktamazy jest solidną i czułą metodą śledzenia pęknięcia wewnątrzkomórkowego patogenów, takich jak żel flexneri, po zakażeniu komórkami HELOC. Dzięki nieinwazyjnemu BS 176 AFA jeden szczep przez jedną godzinę, czteroprogowa sonda CCF pozostaje nienaruszona i emituje zielony sygnał.

Natomiast zjadliwy szczep M 90 TFA I przełącza sygnał w kierunku niebieskim zgodnie z rozszczepieniem sondy w cytozolu w celu określenia wskaźnika sygnału metrycznego. Opracowaliśmy skrypt dla oprogramowania metamorph i acapella, aby zautomatyzować wykrywanie komórek i pomiary w kanałach 535 i 450 nanometrów. Jądra i cytozol komórek są segmentowane za pomocą pięciu kanałów DR.

Następnie algorytm jest w stanie wykryć i określić ilościowo populacje komórek dodatnich o długości 450 nanometrów i 535 nanometrach. Obliczone średnie współczynniki są niskie dla zmutowanego szczepu i wysokie dla zjadliwego szczepu. Eksperymenty można przeprowadzać na różnych typach komórek ludzkich, takich jak komórki nabłonkowe Gila i komórki podobne do makrofagów THP.

Oba typy komórek reagują na zjadliwy szczep M 90 T AFA one cha, przełączając emitowany sygnał z zielonego na niebieski pod wpływem infekcji. W przypadku szczepu nieinwazyjnego zielony sygnał utrzymuje się w kwantyfikacji za pomocą skryptu opracowanego na oprogramowaniu metamorficznym, a makro opracowane w Excelu przedstawia histogramy pęknięcia układu moczowego w funkcji rozmieszczenia komórek. Metodę tę można z powodzeniem zaadaptować do zrozumienia zakaźności różnych bakterii.

Na przykład ten zestaw danych pokazuje Mycobacterium Bovis. BCG rezyduje w fagosomie przez cały czas trwania eksperymentu, o czym świadczy utrzymujący się zielony sygnał. W przeciwieństwie do tego, Mycobacterium tuberculosis wywołuje pęknięcie błony błędnej u makrofagów THP po siedmiu dniach infekcji, co podkreślono przez pojawienie się sygnału 450 nanometrów po siedmiu dniach infekcji przy użyciu tego samego algorytmu.

Jeśli chodzi o badanie pęknięcia kości wątrobowej przez Ellę, stwierdziliśmy, że komórki zakażone Mycobacterium tuberculosis wykazują wyższe proporcje od 450 do 535 nanometrów niż Mycobacterium bovis BCG po siedmiu dniach infekcji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać pęknięcie układu moczowego przez patogeny za pomocą testu CCL czterech betalaktamaz Po opanowaniu tego protokołu można wykonać w ciągu czterech godzin, ale pamiętaj, że musisz dodać proce do każdego bufora przez cały czas trwania protokołu. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia elektronowa czy frakcjonowanie błonowe, jest to, że można ją wykonywać w czasie rzeczywistym bez żadnych zabiegów biochemicznych.

Można przeprowadzić dalsze analizy, takie jak znakowanie aktyny lub test ochrony gentamycyny, w celu oceny wychwytu i proliferacji bakterii w komórkach gospodarza.