Name: Pomiary sztywności na zginanie biopolimerów za pomocą testów ślizgowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj metodę pomiaru sztywności na zginanie mikrotubul za pomocą testów ślizgowych z kinezyną. Technika ta pozwala wyznaczyć długość utrwalenia pojedynczych mikrotubul i zastosować ją do badań aktyny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Melissie Klocke za pomoc w przygotowaniu rysunku 1 oraz Annie Ratliff za zademonstrowanie protokołu. Prace te były wspierane przez Korporację Badawczą na rzecz Rozwoju Nauki.

1. Roztwory podstawowe do testów ślizgowych mikrotubul
 Przygotuj się przed testem szybowania.
 <ol>
 <li>Polimeryzować mikrotubule 0,5 mg słabo znakowane jasnym organicznym fluoroforem 22. Docelowe stężenie znacznika wynosi 1 fluorofor na mikrometr mikrotubuli lub gęstość znakowania około 1 fluoroforu na 1,500 dimerów tubuliny. Przechowywać w temperaturze pokojowej, zabezpieczonej światłem aluminiowym, foliowym do dwóch tygodni.</li>
 <li>Oczyść biotynę-kinezynę21 w temperaturze około 1 μM. Przechowywać w temperaturze -80 °C w 5 μl porcji do stosowania w indywidualnych doświadczeniach.</li>
 <li>Przygotować bufor do oznaczania (AB) składający się z 50 mM imidiazolu, 50 mM chlorku potasu (KCl), 4 mM chlorku magnezu (MgCl2), 2 mM glikolu etylenowo-tetraoctowego (EGTA), pH 6,7. Sterylny filtr i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Rozpuścić biotynylowaną albuminę surowicy bydlęcej (biotyna-BSA) do 2 mg/ml w AB. Przefiltrować z filtrem strzykawkowym 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach 100 μl przez długi okres, w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca. </li>
 <li>Rozpuścić streptawidynę (SA) do 10 mg/ml w AB. Przefiltrować z filtrem strzykawkowym 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach 20 μl przez długi okres, w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.</li>
 <li>Rozpuścić α-kazeinę w 5 mg/ml w AB. Przefiltrować z filtrem strzykawkowym 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze -80 °C w 100 μl porcji przez długi czas, w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.</li>
 <li>Rozpuścić ditiotreitol (DTT) w wodzie dejonizowanej o stężeniu 200 mM. Przechowywać w temperaturze -20 °C w 100 μl porcji, zużyć w ciągu 8 godzin od rozmrożenia. Może być ponownie zainstalowany.</li>
 <li>Rozpuścić paklitaksel (PT) w dimetylosulfotlenku (DMSO) o czystości HPLC w stężeniu 4 mM. Przechowywać w 10 μl porcji w temperaturze -80 °C przez długi czas, -20 °C przez krótki czas. Zużyć w ciągu 8 godzin od rozmrożenia. Może być ponownie zainstalowany.</li>
 <li>Rozpuścić glukozę w wodzie dejonizowanej o stężeniu 120 mg/ml. Przechowywać w 100 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Może być ponownie zainstalowany.</li>
 <li>Rozpuść trifosforan adenozyny (ATP) w wodzie dejonizowanej o stężeniu 150 mM, pH 7,0. Przechowywać w 5 μl porcji w temperaturze -80 °C, zużyć w ciągu 8 godzin od rozmrożenia.</li>
 <li>Przygotuj 100-krotny zapas tlenu25, rozpuszczając 10 000 jednostek oksydazy glukozowej i 156 000 jednostek katalazy w 600 μl całkowitego buforu testowego. Krótko odwirować w mikrowirówce do osadzania ciał stałych; Filtruj supernatant z filtrem strzykawkowym 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze -80 °C w 10 μl porcji przez długi okres, w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.</li>
 </ol>
 2. Test ślizgowy mikrotubul, przygotowanie roztworu tego samego dnia
 Przygotuj roztwory w 2.1-2.6 w dniu eksperymentu. Przy odrobinie wprawy roztwory 2,2-2,6 można przygotować podczas mycia komorami przepływowymi. O ile nie zaznaczono inaczej, roztwory podstawowe należy przechowywać na lodzie.
 <ol>
 <li>Przygotować AB, 1 ml buforu do oznaczania z 10 μl wyjściowej umowy o unikaniu podwójnego użytku (AB z 2 mM naziemnej telewizji cyfrowej). Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przygotować bufor bio-BSA, 40 μl mieszaniny 1:1 biotyny-BSA i AB. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przygotować bufor BSA, mieszając 645 μl AB z 5,5 μl BSA (1 mg/ml BSA w AB). Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przygotować bufor SA, mieszając 57 μl AB z 3 μl streptawidyny (0,5 mg/ml streptawidyny w AB). Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przygotować bufor α-kazeinowy, mieszając 200 μl buforu BSA, 50 μl bulionu kazeinowego i 0,8 μl 15 μM ATP (1 mg/ml α-kazeiny, 0,8 mg/ml BSA, 50 nM ATP w AB). Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przygotować fluorescencyjny bufor przeciwwybielający, mieszając 95 μl buforu α-kazeinowego, 2,5 μl bulionu glukozy, 1 μl 100x mieszanki wychwytującej tlen, 1 μl paklitakselu, 1 μl 2-merkaptoetanolu (βME). Dodaj βME pod wyciągiem. Zużyć fluorescencyjny bufor przeciwwybielający w ciągu 1 godziny od przygotowania. UWAGA: βME jest wysoce toksyczny i okropnie pachnie. Pamiętaj, aby otwierać tylko pod wyciągiem. Przechowywać butelkę przy braku światła; światło degraduje βME i jego zdolność do zmniejszania fotowybielania.</li>
 </ol>
 3. Test ślizgowy mikrotubul
 <ol>
 <li>Zbuduj około czterech torów przepływu między szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 x 60 mm a szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 x 22 mm, używając smaru próżniowego, wytłaczanego ze strzykawki przez końcówkę pipety, jako przekładki. Każdy tor przepływu powinien mieć objętość około 10 μl (odpowiednio skaluj kolejne objętości).</li>
 <li>Przemyć 10 μl buforu bio-BSA do każdego pasa. Inkubować przez 5 minut, aby BSA mógł pokryć szklane powierzchnie.</li>
 <li>Przemyć każdy tor trzykrotnie buforem BSA o pojemności 15 μl, aby usunąć wolną biotynę-BSA, jednocześnie kontynuując blokowanie powierzchni zjeżdżalni. Użyj Kimwipe lub bibuły filtracyjnej, aby usunąć bufor z przeciwnej strony komory przepływowej, uważając, aby pęcherzyki powietrza nie przedostały się przez komorę przepływową.</li>
 <li>Przemyć 15 μl buforu SA do każdego pasa. Odczekaj 10 minut lub do 2 godzin. Streptawidyna wiąże się z powierzchniowo związaną biotyną-BSA.</li>
 <li>Przemyć każdy pas trzykrotnie buforem BSA o pojemności 15 μl, aby usunąć wolny SA, kontynuując blokowanie powierzchni zjeżdżalni. </li>
 <li>Przemyć każdą linię 15 μl buforem α-kazeinowym. α-kazeina pomaga dodatkowo blokować niespecyficzne wiązanie kinezyny i mikrotubul ze szkłem.</li>
 <li>Rozcieńczyć kinezynę do 10 nM w buforze α-kazeiny i przemyć każdy pas 15 μl roztworu tej kinezyny - α-kazeiny. Odczekaj 15 minut (lub do godziny), aż biotynylowana kinezyna zwiąże się specyficznie ze streptawidyną związaną z powierzchnią. Domeny motoryczne kinezyny pozostaną wolne do wiązania mikrotubul.</li>
 <li>Rozcieńczyć paklitaksel do 40 μM w buforze α-kazeinowym o temperaturze pokojowej i przemyć każdy pas 15 μl tego roztworu w celu wypłukania wolnej kinezyny i wstępnego obciążenia każdej komory przepływowej roztworem paklitakselu, aby zapobiec depolimeryzacji mikrotubul. Zimno również depolimeryzuje mikrotubule, więc upewnij się, że te kroki zachodzą w temperaturze pokojowej z roztworami o temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Rozcieńczyć znakowane fluorescencyjnie mikrotubule 1:100-1:1,000 we fluorescencyjnym buforze przeciwwybielającym z 1 mM ATP. Wymyj 15 μl na jednym torze i obserwuj w ciągu 30 minut.</li>
 </ol>
 4. Gromadzenie danych
 <ol>
 <li>Obserwuj przesuwające się mikrotubule za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej; wymagany jest mikroskop zdolny do rozpoznawania pojedynczych fluoroforów, taki jak komercyjny lub domowy zestaw TIRF26 (Rysunek 2). 
Mikrotubule powinny być napędzane przez silniki kinezynowe po podłożu z prędkością około 0,5 μm/s, w zależności od temperatury. Jeżeli pole widzenia mikroskopu wynosi 50 μm, poszczególne mikrotubule powinny być widoczne przez około 100 sekund. Ustaw intensywność oświetlenia tak, aby pojedyncze fluorofory nie fotowybielały szybciej niż 100 sekund. W przypadku korzystania ze wzbudzenia laserowego odpowiednie jest ustawienie mocy około 3-5 mW.
 </li>
 <li>Zbierz sekwencje obrazów do analizy. 600 obrazów przy 5 Hz (łącznie 2 minuty) działa dobrze. Użyj sekwencji na tyle długich, aby mikrotubule przecinały całe pole widzenia.</li>
 </ol>
 5. Analiza danych
 Procedura IDL, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50117/50117IDL_Routines.zip" target="_blank">get_lp.pro</a>, jest dołączona. Ta procedura zwraca wartość długości trwałości na podstawie wszystkich mikrotubul przesuwających się w danej sekwencji obrazu. Uruchom tę procedurę dla każdej sekwencji obrazu, modyfikując parametry intensywności w zależności od konkretnej konfiguracji mikroskopu, lub wykonaj następujące czynności:
 <ol>
 <li>Śledź każdy fluorofor przyłączony do mikrotubuli, aby utworzyć trajektorie fluoroforu.</li>
 <li>Połącz wszystkie trajektorie fluoroforów na danej mikrotubuli w ogólną trajektorię mikrotubul; powtórz dla każdej mikrotubuli w sekwencji obrazu (ryc. 3).</li>
 <li>Oblicz kąt styczny do każdego punktu wzdłuż trajektorii (rysunek 4) i oblicz <cosθs> w równaniu 1, uśredniając cosinus różnicy kątów dla każdej pary punktów oddzielonych długością ścieżki s (rysunek 5). Znajdź długość trwałości dla pojedynczej mikrotubuli lub grupy mikrotubul, dopasowując <cosθs> do równania 1, ważąc poszczególne punkty danych w dopasowaniu przez liczbę niezależnych wartości cosθs, które są używane do obliczenia średniej.</li>
 </ol>

<ol><li>Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanics%22%5BJournal%5D)">Mechanics of microtubules.</a> Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).</li>
<li>Pampaloni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+fluctuations+of+grafted+microtubules+provide+evidence+of+a+length-dependent+persistence+length%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+national+academy+of+sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length.</a> Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).</li>
<li>Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+depart+from+the+wormlike+chain+model%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics depart from the wormlike chain model.</a> Physical review letters. 100, 028102(2008).</li>
<li>Van den Heuvel, M. G., de Graaff, M. P., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+curvatures+under+perpendicular+electric+forces+reveal+a+low+persistence+length%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+national+academy+of+sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microtubule curvatures under perpendicular electric forces reveal a low persistence length.</a> Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 105, 7941-7946 (2008).</li>
<li>Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexural+rigidity+of+microtubules+and+actin+filaments+measured+from+thermal+fluctuations+in+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape.</a> Journal of cell biology. 120, 923-934 (1993).</li>
<li>Brangwynne, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+dynamics+of+fluctuating+biopolymers+probed+by+automated+high-resolution+filament+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking.</a> Biophysical journal. 93, 346-359 (2007).</li>
<li>Cassimeris, L., Gard, D., Tran, P. T., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XMAP215+is+a+long+thin+molecule+that+does+not+increase+microtubule+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">XMAP215 is a long thin molecule that does not increase microtubule stiffness.</a> Journal of cell science. 114, 3025-3033 (2001).</li>
<li>Valdman, D., Atzberger, P. J., Yu, D., Kuei, S., Valentine, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+analysis+methods+for+the+robust+measurement+of+the+flexural+rigidity+of+biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Spectral analysis methods for the robust measurement of the flexural rigidity of biopolymers.</a> Biophysical. 102, 1144-1153 (2012).</li>
<li>van Mameren, J., Vermeulen, K. C., Gittes, F., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+single+protein+polymers+to+measure+flexural+rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+physical+chemistry+b%22%5BJournal%5D)">Leveraging single protein polymers to measure flexural rigidity.</a> Journal of physical chemistry b. 113, 3837-3844 (2009).</li>
<li>Hua, W., Chung, J., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+inchworm+and+hand-over-hand+processive+kinesin+movement+by+neck+rotation+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinguishing inchworm and hand-over-hand processive kinesin movement by neck rotation measurements.</a> Science. 295, 844-848 (2002).</li>
<li>Duke, T., Holy, T. E., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Gliding+assays%22+for+motor+proteins%3A+A+theoretical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">"Gliding assays" for motor proteins: A theoretical analysis.</a> Physical review letters. 74, 330-333 (1995).</li>
<li>Mehrbod, M., Mofrad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+significance+of+microtubule+flexural+behavior+in+cytoskeletal+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+one%22%5BJournal%5D)">On the significance of microtubule flexural behavior in cytoskeletal mechanics.</a> PLoS one. 6, e25627(2011).</li>
<li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Kelley, M. W., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+changes+in+actin+and+microtubules+underlie+the+developing+surface+mechanical+properties+of+sensory+and+supporting+cells+in+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal changes in actin and microtubules underlie the developing surface mechanical properties of sensory and supporting cells in the mouse cochlea.</a> Development. 139, 2187-2197 (2012).</li>
<li>Gal, N., Weihs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Mechanics+and+Activity+of+Breast+Cancer+Cells+Correlate+with+Metastatic+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+biochemistry+and+biophysics%22%5BJournal%5D)">Intracellular Mechanics and Activity of Breast Cancer Cells Correlate with Metastatic Potential.</a> Cell biochemistry and biophysics. , (2012).</li>
<li>Volokh, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+tensegrity+in+cell+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biomech%22%5BJournal%5D)">On tensegrity in cell mechanics.</a> Mol. Cell Biomech. 8, 195-214 (2011).</li>
<li>Kasas, S., Dietler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+measuring+microtubule+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Current+nanoscience%22%5BJournal%5D)">Techniques for measuring microtubule stiffness.</a> Current nanoscience. 3, 85-96 (2007).</li>
<li>Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexural+rigidity+of+individual+microtubules+measured+by+a+buckling+force+with+optical+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps.</a> Biophysical journal. 90, 1687-1696 (2006).</li>
<li>Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+microtubule+rigidity+using+hydrodynamic+flow+and+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations.</a> Journal of biological chemistry. 269, 13353-13360 (1994).</li>
<li>van den Heuvel, M. G., Bolhuis, S., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+length+measurements+from+stochastic+single-microtubule+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Persistence length measurements from stochastic single-microtubule trajectories.</a> Nano letters. 7, 3138-3144 (2007).</li>
<li>Phillips, R., Kondev, J., Theriot, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPhillips%2C+R+%22Physical+biology+of+the+cell%22">Physical biology of the cell</a>. , Garland Science. (2008).</li>
<li>Berliner, E., Young, E. C., Anderson, K., Mahtani, H. K., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+a+single-headed+kinesin+to+track+parallel+to+microtubule+protofilaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Failure of a single-headed kinesin to track parallel to microtubule protofilaments.</a> Nature. 373, 718-721 (1995).</li>
<li>Anderson, E. K., Martin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+GTP+analog+as+a+specific%2C+high-precision+label+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A fluorescent GTP analog as a specific, high-precision label of microtubules.</a> Biotechniques. 51, 43-48 (2011).</li>
<li>Hyman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+modified+tubulins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of modified tubulins.</a> Methods in enzymology. 196, 478-485 (1991).</li>
<li>Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curve+reconstruction+from+unorganized+points%5BTitle%5D)+AND+%22Computer+aded+geometric+design%22%5BJournal%5D)">Curve reconstruction from unorganized points.</a> Computer aded geometric design. 17, 161-177 (2000).</li>
<li>Yildiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+walks+hand-over-hand%3A+Single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V walks hand-over-hand: Single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300, 2061-2065 (2003).</li>
<li>Friedman, L. J., Chung, J., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viewing+dynamic+assembly+of+molecular+complexes+by+multi-wavelength+single-molecule+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence.</a> Biophysical. 91, 1023-1031 (2006).</li>
<li>Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+single-molecule+localization+that+achieves+theoretically+minimum+uncertainty%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty.</a> Nature Methods. 7, 373-375 (2010).</li>
<li>Nitzsche, B., Ruhnow, F., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum-dot-assisted+characterization+of+microtubule+rotations+during+cargo+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantum-dot-assisted characterization of microtubule rotations during cargo transport.</a> Nature. 3, 552-556 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Pomiary długości trwałości są dobrą charakterystyką właściwości mechanicznych poszczególnych biopolimerów. W tym artykule opisaliśmy metodę pomiaru długości trwałości mikrotubul. Jak zauważono we wprowadzeniu, metoda ta może być łatwo rozszerzona o badanie właściwości mechanicznych mikrotubul w różnych warunkach, po prostu poprzez zmianę odczynników, temperatury lub lepkości w końcowym etapie testu ślizgowego, 3.9, lub przez polimeryzację mikrotubul, krok 1.1, w różnych warunkach.
	Sama techni...

Cytoškielet, sieć biopolimerów występująca w większości komórek eukariotycznych, odgrywa istotną rolę w organizacji komórkowej, transporcie wewnątrzkomórkowym oraz mechanice komórki. Charakterystyka mechaniczna biopolimerów cytoškieletu (przede wszystkim aktyny i mikrotubul) ma kluczowe znaczenie dla wyznaczania właściwości mechanicznych komórki jako całości12. Ponieważ mechanika całej komórki może służyć do charakterystyki komórek zdrowych i chorych13,14 oraz bierze udział w motyliczności komórkowej15, właściwości mechaniczne podstawowych komponentów cytoškieletu stanowią aktywny obszar badań w ciągu ostatnich dwóch dekad1.
Elastyczność (lub sztywność) biopolimerów charakteryzuje długość trwałości, czyli długość polimeru, który pod wpływem fluktuacji termicznych w temperaturze otoczenia ugina się o około jeden radian. Opracowano szereg technik pomiaru długości trwałości16, na przykład techniki aktywne, polegające na zginaniu polimeru za pomocą przepływu hydrodynamicznego, pułapek optycznych lub pól elektrycznych4,17,18, oraz techniki pasywne, w których mierzy się fluktuacje wolnych polimerów w roztworze5,6. Pomiary aktywne wymagają jednak specjalistycznej aparatury do przykładania znanych sił w skali mikrometrycznej, natomiast pomiary swobodnych fluktuacji mogą być problematyczne ze względu na dyfuzję poza płaszczyznę ostrości używanego mikroskopu.
W niniejszym artykule opisujemy komplementarną, pasywną technikę pomiaru długości persystencji mikrotubul, polimeru cytoszkieletowego. Technika ta wykorzystuje testy poślizgu (gliding assays), które zapewniają, że polimer zawsze pozostaje w płaszczyźnie ogniskowania19. Ponadto metoda obejmuje śledzenie pojedynczych fluoroforów trwale przyłączonych do badanego polimeru, co pozwala na dokładną charakterystykę konkretnych miejsc wzdłuż polimeru.
Schematyczna ilustracja metody przedstawiona jest na Rysunku 1. Kinezyna przemieszcza się specyficznie w kierunku końca + mikrotubul, w związku z czym mikrotubule w teście poślizgowym są napędzane jednokierunkowo. Przedni koniec mikrotubuli, znajdujący się poza ostatnią przyłączoną kinezyną, może swobodnie fluktuować pod wpływem sił termicznych otaczającego roztworu. W miarę jak mikrotubula jest napędzana do przodu, jej koniec fluktuuje, aż do momentu związania z nową cząsteczką kinezyny dalej na szkiełku przedmiotowym, co utrwala daną fluktuację. Ponieważ kinezyna wiąże mikrotubule bardzo silnie, mikrotubula jest zmuszona podążać ścieżką swojego przedniego końca. W związku z tym statystyczne fluktuacje utrwalone w trajektorii mikrotubuli są identyczne z fluktuacjami statystycznymi wolnego końca mikrotubul11, co pozwala na obliczenie długości persistencji zgodnie z20
<img alt="Równanie równowagi statycznej; ⟨cosθ_s⟩=e^(-s/l_p). Wzór do analizy naukowej." fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"> 
gdzie lp to długość persystencji mikrotubuli, θs to kąt między stycznymi do trajektorii oddalonymi o długość konturową s, a &lt;&gt; oznacza średnią dla wszystkich par pozycji oddzielonych długością konturową s.
Sam test poślizgu (gliding assay) wykorzystuje kinezynę biotynilowaną w obrębie splotu coiled-coil21, która jest specyficznie związana z szkiełkiem przedmiotowym za pomocą wiązania streptawidyna-biotyna. Takie przytwierdzenie zapewnia, że domeny motorowe mogą swobodnie wiązać mikrotubule i napędzać ich ruch. Aby móc śledzić trajektorie mikrotubul, są one rzadko znakowane organicznymi fluoroforami22,23 – gęstość znakowania musi być na tyle niska, aby pojedyncze fluorofory były rozdzielne przy użyciu fluorescencyjnej mikroskopii pojedynczych cząsteczek. Pojedyncze fluorofory są śledzone przy użyciu procedur analizy obrazu napisanych w języku IDL. Trajektorie każdego fluoroforu związanego z daną mikrotubulą są automatycznie łączone w kompozytową trajektorię mikrotubuli24. Obliczane są kąty styczne θ dla każdego punktu wzdłuż trajektorii; z tych kątów stycznych obliczana jest wartość &lt;cosθs&gt; dla każdej długości konturu s. Na koniec dane te są dopasowywane do równania 1 w celu wyznaczenia długości uporządkowania (persistence length) dla danej mikrotubuli lub dla wielu mikrotubul w tym samym teście poślizgu.
Metoda ta jest wystarczająco odporna, aby działać z mikrotubulami przygotowanymi w szerokim zakresie warunków (z różnymi czynnikami stabilizującymi lub innymi małymi cząsteczkami związanymi z mikrotubulą, ze związanymi białkami towarzyszącymi mikrotubulom (MAPs) lub w różnych lepkich roztworach). W naszym laboratorium technika ta była wykorzystywana do charakterystyki długości persystencji mikrotubul w funkcji długości wzdłuż mikrotubul oraz mikrotubul z różnymi czynnikami stabilizującymi. Głównym ograniczeniem jest wymóg, aby mikrotubule nadal umożliwiały ruch kinesyny. Ponieważ kinesyna jest odpornym enzymem motorycznym, jest to ograniczenie dość mało rygorystyczne. Zastępując mikrotubule aktyną, a kinesynę enzymem z rodziny miozyn, można zmierzyć długość persystencji aktyny przy użyciu tej samej techniki.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynniki </td></tr><tr><td>imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Calbiochem</td><td>126615</td><td></td></tr><tr><td>biotynylowany BSA</td><td>Thermo Scientific</td><td>29130</td><td></td></tr><tr><td>&alfa-kazeina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6780</td><td></td></tr><tr><td>streptawidyna</td><td>Thermo Scientific</td><td>21125</td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>paklitaksel</td><td>LC Laboratories</td><td>P-9600</td><td></td></tr><tr><td>oksydaza glukozowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>katalaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C100</td><td></td></tr><tr><td>glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>2-mercapt&#8211; tanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>Toksyczny. Kup niewielką ilość.</td></tr><tr><td>24X60 mm Nr 1 1/2 szyby osłonowej</td><td>VWR</td><td>48393-252</td><td></td></tr><tr><td>22X22 mm Szkło pokrywowe nr 1</td><td>Gold Seal</td><td>3306</td><td></td></tr><tr><td>Smar wysokopróżniowy</td><td>Dow-Corning</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment </td></tr><tr><td>Mikroskop TIRF</td><td>wiele</td><td>NA</td><td>Mikroskop TIRF używany w tej metodzie był domowej roboty.</td></tr><tr><td>IDL (oprogramowanie)</td><td>Exelis</td><td>NA</td><td>Może zastąpić MATLAB, ImageJ lub inne oprogramowanie do analizy obrazu.</td></tr></tbody></table>

pomiary sztywności na zginanie biopolimerów za pomocą testów ślizgowych

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Mikrotubule to polimery cytoszkieletu, które odgrywają rolę w podziale komórek, mechanice komórkowej i transporcie wewnątrzkomórkowym. Każda z tych funkcji wymaga mikrotubul, które są wystarczająco sztywne i proste, aby objąć znaczną część średnicy komórki. W rezultacie, długość trwałości mikrotubul, miara sztywności, była aktywnie badana przez ostatnie dwie dekady1. Niemniej jednak pozostają otwarte pytania: krótkie mikrotubule są 10-50 razy mniej sztywne niż długie mikrotubule2-4, a nawet długie mikrotubule mają zmierzone długości trwałości, które różnią się o rząd wielkości5-9.
	Tutaj prezentujemy metodę pomiaru długości trwałości mikrotubul. Metoda opiera się na teście ślizgowym mikrotubul napędzanym kinezyną10. Łącząc rzadkie znakowanie fluorescencyjne pojedynczych mikrotubul ze śledzeniem pojedynczych cząstek pojedynczych fluoroforów przyczepionych do mikrotubul, trajektorie ślizgu pojedynczych mikrotubul są śledzone z precyzją na poziomie nanometrów. Długość trwałości trajektorii jest taka sama jak długość trwałości mikrotubuli w zastosowanych warunkach11. Zautomatyzowana procedura śledzenia jest wykorzystywana do tworzenia trajektorii mikrotubul z fluoroforów przyłączonych do poszczególnych mikrotubul, a długość trwałości tej trajektorii jest obliczana przy użyciu procedur napisanych w IDL.
	Ta technika jest szybko możliwa do wdrożenia i jest w stanie zmierzyć długość trwałości 100 mikrotubul w ciągu jednego dnia eksperymentów. Metodę tę można rozszerzyć w celu pomiaru długości trwałości w różnych warunkach, w tym długości trwałości w funkcji długości wzdłuż mikrotubul. Co więcej, stosowane procedury analityczne można rozszerzyć na testy ślizgowe oparte na miozynie, aby zmierzyć również długość trwałości włókien aktynowych.

Klatka z testu poślizgu (gliding assay) została przedstawiona na Rysunku 2. Odpowiednia gęstość mikrotubul wynosi 1-10 mikrotubul na pole widzenia; znacznie większa liczba spowoduje błędy w śledzeniu trajektorii z powodu przecinania się mikrotubul. Wykres 11 trajektorii mikrotubul z testu poślizgu przedstawionego na Rysunku 2 znajduje się na Rysunku 3. Typowe trajektorie mają długość od 10 do 30 μm; niektóre z nich posiadają przerwy w miejscach, gdzie jedna mikrotubula p...

Opisano metodę pomiaru trwałości lub sztywności zginania biopolimerów. Metoda wykorzystuje test ślizgowy mikrotubul napędzany kinezyną do eksperymentalnego określenia długości trwałości poszczególnych mikrotubul i można ją dostosować do testów ślizgowych opartych na aktynie.

Pomiary sztywności na zginanie biopolimerów za pomocą testów ślizgowych

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Ogólnym celem tej procedury jest zastosowanie testu ślizgowego do pomiaru sztywności UAL mikrotubul. Osiąga się to poprzez najpierw specyficzne przymocowanie białka motorycznego kinezyny do szkiełka mikroskopowego z domenami motorycznymi wolnymi do wiązania mikrotubul. Drugim krokiem jest dodanie do próbki znakowanych fluorescencyjnie mikrotubul, które są tłumaczone przez kinezynę.Kolejne filmy przedstawiające ślizgające się mikrotubule są zbierane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ostatnim krokiem jest analiza filmów z testów ślizgowych w celu obliczenia sztywności zginania mikrokanalików. Ostatecznie testy ślizgowe służą do określenia sztywności zginania pojedynczych mikrotubul.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu mechaniki cytoszkieletu, takie jak sztywność zginania poszczególnych polimerów cytoszkieletu. Zademonstruje tę procedurę Anna Ratliff, studentka z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować bufor roboczy do oznaczania, dodając 10 mikrolitrów 200 mililitrów 200 milimoli DIO, trzech atoli lub DTT do jednego mililitra podstawowego roztworu buforowego do oznaczania i wymieszać.Podczas zabiegu należy przechowywać ten

flexural-rigidity-measurements-of-biopolymers-using-gliding-assays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Pomiary sztywności zginającej biopolimerów za pomocą testów zsuwania

W tym filmie prezentujemy techniki eksperymentalne wykorzystywane do wytwarzania elastycznych podłoży powleczonych macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), które nadają się do hodowli komórkowej oraz pozwalają na zastosowanie mikroskopii sił trakcyjnych i obserwację wpływu sztywności ECM na zachowanie komórek.

Przygotowanie podatnych macierzy do ilościowego pomiaru skurczu komórkowego

Trwałość polimerów i kompozytów polimerowych wzmocnionych włóknami w eksploatacji jest krytycznym aspektem dla ich projektowania i konserwacji w oparciu o stan. Przedstawiamy nowatorską, niskokosztową platformę do badań laboratoryjnych do badania wpływu jednoczesnych obciążeń mechanicznych i środowiskowych, która może pomóc w projektowaniu bardziej wydajnych, a jednocześnie bezpieczniejszych struktur kompozytowych.

Platforma testowa do badań trwałości polimerów i kompozytów polimerowych wzmacnianych włóknami w warunkach jednoczesnych bodźców higrotermomechanicznych

Tutaj opisana jest metoda, która umożliwia szybkie, efektywne i niedrogie przygotowanie żeli poliakrylamidowych w formacie wielodołkowej płytki. Metoda nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być z łatwością zaadoptowana przez każde laboratorium badawcze. Byłoby to szczególnie przydatne w badaniach skoncentrowanych na zrozumieniu odpowiedzi komórek zależnych od sztywności.

Prosty test sztywności wielodołkowej na bazie poliakrylamidu do badania odpowiedzi komórek zależnych od sztywności

Przedstawiono nowatorską metodologię syntezy i programowania elastomerów ciekłokrystalicznych w łańcuchu głównym przy użyciu dostępnych na rynku monomerów wyjściowych. Szeroki zakres właściwości termomechanicznych został dostosowany poprzez dostosowanie ilości środka sieciującego, podczas gdy wydajność uruchamiania zależała od wielkości zastosowanego naprężenia podczas programowania.

Synteza programowalnych elastomerów ciekłokrystalicznych w łańcuchu głównym z wykorzystaniem dwuetapowej reakcji tiolowo-akrylowej

Półelastyczne polimery wykazują unikalne właściwości mechaniczne, które są szeroko stosowane przez żywe systemy. Jednak systematyczne badania nad biopolimerami są ograniczone, ponieważ właściwości takie jak sztywność polimeru są niedostępne. Niniejszy manuskrypt opisuje, w jaki sposób to ograniczenie jest obchodzone przez programowalne nanorurki DNA, umożliwiając eksperymentalne badania wpływu sztywności włókien.

Nanorurki DNA jako wszechstronne narzędzie do badania polimerów półelastycznych

Przedstawiamy protokół do przeprowadzania trzypunktowych testów zginania na włóknach w skali submilimetrowej za pomocą specjalnie skonstruowanego urządzenia do testowania mechanicznego. Urządzenie może mierzyć siły w zakresie od 20 μN do 10 N, dzięki czemu może dostosować się do różnych rozmiarów włókien.

System do badania zginania w skali milimetrowej do pomiaru właściwości mechanicznych iglic z gąbek morskich

Substraty o sztywności w zakresie kilopaskali są przydatne do badania reakcji komórek na fizjologicznie istotną sztywność mikrośrodowiska. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu widzenia można określić moduł Younga miękkich żeli silikonowych za pomocą wgłębienia z odpowiednią kulą.

Pomiar sztywności miękkich podłoży silikonowych do badań mechanobiologicznych przy użyciu szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego

Nowa technika reometrii siłowo-zaciskowej jest używana do badania właściwości mechanicznych próbek hydrożelu na bazie białek o małej objętości, połączonych między silnikiem cewki drgającej a czujnikiem siły. Analogowy układ proporcjonalno-całkująco-pochodny (PID) pozwala na "zaciśnięcie" doświadczanej siły do pożądanego protokołu.

Reometria siłowo-zaciskowa do charakteryzowania hydrożeli na bazie białek

Tutaj prezentujemy protokół koniugacji monomeru białkowego za pomocą enzymów tworzących polimer białkowy o kontrolowanej sekwencji i unieruchamiania go na powierzchni w celu badań spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek.

Synteza enzymatyczna i immobilizacja spolimeryzowanego białka za pośrednictwem OaAEP1 do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

Mimo że sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) jest kluczowym regulatorem zachowania komórkowego, podstawowe mechanizmy wyczuwania i przekazywania sygnałów pozostają niejasne. Aby temu zaradzić, udostępniamy protokoły tworzenia podłoży na bazie poliakryloamidu i silikonu o regulowanej sztywności, aby poszerzyć naszą wiedzę o komunikacji między komórkami a ECM.

Generowanie substratów ekstrakomórkowych z poliakryloamidu i silikonu o określonej sztywności dla zastosowań w biologii komórki

Poznaj metodę pomiaru sztywności na zginanie mikrotubul za pomocą testów ślizgowych z kinezyną. Technika ta pozwala wyznaczyć długość utrwalenia pojedynczych mikrotubul i zastosować ją do badań aktyny.

Pomiary sztywności na zginanie biopolimerów za pomocą testów ślizgowych

Przeglądaj więcej filmów