Name: Zbieranie, izolacja i wzbogacanie naturalnie występujących bakterii magnetotaktycznych ze środowiska (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-15T11:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Poznaj metodę izolacji bakterii magnetotaktycznych ze środowisk słodkowodnych. Wykorzystaj naturalny magnetyzm i mikroskopię elektronową do badań mikrobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z U.S. National Science Foundation (EAR-0920299 i EAR-0745808); U.S. National Science Foundation East Asian and Pacific Summer Institutes; Geological Society of America Research Grant Program oraz Alumni Grants for Graduate Research and Scholarship z Uniwersytetu Stanowego Ohio. Dziękujemy redaktorowi i dwóm anonimowym recenzentom za wnikliwe komentarze.

1. Kolekcja MTB
<ol>
	<li>Decydując się na miejsce słodkowodne do zbierania bakterii magnetotaktycznych (MTB), często najlepiej jest zacząć od stawu lub wolno płynącego strumienia, który ma miękką błotnistą warstwę osadu. W tej demonstracji pobraliśmy próbkę na brzegu rzeki Olentangy na terenie kampusu Uniwersytetu Stanowego Ohio (OSU) w Columbus w stanie Ohio (USA). Chociaż była to dogodna lokalizacja dla naszej demonstracji, opisany tutaj protokół ma zastosowanie do każdej lokalizacji wodnej. Materiały użyte w tym protokole znajdują się w tabeli 1. Znajdź miejsce, w którym głębokość wody wynosi od 10 do 100 cm. W takim miejscu należy zebrać najwyższą warstwę osadu za pomocą przezroczystego, zakręcanego pojemnika. Nabierz osad i wodę do pojemnika, aż zostanie wypełniony jedną trzecią do połowy osadu, a pozostałą objętość wodą. Trzymaj pojemnik zanurzony, aż zostanie napełniony wodą, a następnie szczelnie zakręć pojemnik zakręcaną pokrywką. Nie ma potrzeby mieszania osadu. Wytrzyj zewnętrzną część pojemnika do sucha ręcznikiem, a następnie zabierz próbkę do laboratorium. Nie ma potrzeby spieszyć się z powrotem próbki do laboratorium. Zostawiliśmy próbki MTB w plastikowych pojemnikach na polu przez kilka dni, zanim przywieźliśmy je z powrotem do naszego laboratorium. MTB powinien być żywy przez kilka tygodni do miesięcy, o ile przechowujesz próbki w chłodnym, zacienionym miejscu na polu.</li>
	<li>Gdy próbka znajdzie się w laboratorium, poluzuj nakrętkę i pozostaw ją przykrywającą pojemnik, aby zmniejszyć ilość parowania. Przechowuj pojemnik w temperaturze pokojowej w ciemnym pomieszczeniu, szufladzie lub całkowicie przykryj pojemnik folią aluminiową. Pozwolić, aby osad i drobne cząstki całkowicie osiadły na dnie pojemnika, pozostawiając próbkę w nienaruszonym stanie przez kilka godzin do kilku dni. Nie jest konieczne mieszanie osadu, MTB preferuje niezakłócone środowisko. Przezroczyste ścianki plastikowego pojemnika pozwolą Ci potwierdzić, że cząstki osiadły na dnie. W zależności od próbki, MTB może pozostać żywy w próbce przez wiele miesięcy.</li>
</ol>
2. Izolacja MTB
<ol>
	<li>Kiedy będziesz gotowy do odizolowania MTB, umieść magnesy po bokach plastikowego pojemnika około 1 cm nad powierzchnią styku osad-woda (rysunek 1A). Uważaj, aby nie naruszyć osadu na dnie pojemnika. Umieść południowy biegun magnesu sztabkowego po jednej stronie pojemnika, a północną stronę innego magnesu sztabkowego po przeciwnej stronie (Rysunek 1A). Można użyć prawie każdego magnesu, takiego jak mieszadło magnetyczne lub duży magnes na lodówkę. Do podparcia magnesów na odpowiedniej wysokości nad powierzchnią styku osad-woda można użyć wszystkiego. Odkryliśmy, że najlepiej jest umieścić magnesy na kartonie lub plastikowym pudełku, jednak magnesy można również przykleić taśmą na zewnątrz plastikowego pojemnika. Odczekaj od 30 minut do kilku godzin, aż bakterie podpłyną do magnesu.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety ostrożnie zebrać wodę z wnętrza pojemnika (Rysunek 1A) w pobliżu pozycji magnesu sztabkowego na biegunie południowym (dla próbek pobranych na półkuli północnej). Ta woda powinna zawierać MTB, które zostały przyciągnięte do magnesu sztabkowego na biegunie południowym. Następnie należy wykorzystać kapilarny tor wyścigowy, aby jeszcze bardziej wzbogacić MTB.</li>
</ol>
3. Tor wyścigowy MTB
<ol>
	<li>Aby wzbogacić próbkę w bakterie magnetotaktyczne, konieczny jest kapilarny tor wyścigowy (rysunki 1B i 1C). Należy je wykonać przed odizolowaniem komórek od przezroczystego plastikowego pojemnika.</li>
	<li>Użyj szklanej pipety Pasteura o średnicy 5,75 cala (146 mm), aby zrobić tor wyścigowy. Użyj diamentowego długopisu lub pilnika, aby odciąć górną część pipety, długość pipety nie jest kluczowa, ale powinna być w stanie pomieścić około 1-2 ml wody. Następnie użyj palnika Bunsena, aby stopić końcówkę, aby została uszczelniona (Rysunek 1C). Powstała pipeta powinna mieć otwarty koniec i uszczelniony koniec.</li>
	<li>Stwórz kilka takich torów wyścigowych, a następnie autoklaw. Dodatkowo będziesz musiał autoklawować bawełnę i kilka długich metalowych igieł.</li>
	<li>Dodać przefiltrowaną próbkę wody, pobraną z okolic granicy faz osadu z wodą pokazaną na rysunku 1A, do autoklawowanego toru wyścigowego za pomocą długiej metalowej igły przymocowanej do przefiltrowanej strzykawki. Wielkość porów filtra powinna wynosić 0,22 mm, aby wyeliminować zanieczyszczenia i zanieczyszczenia z wody. Ważne jest, aby mieć absolutną pewność, że w szklanej kapilarze nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Zatkaj spód toru wyścigowego sterylną bawełną (Rysunek 1B). Użyj metalowej igły, aby popchnąć bawełnę w kierunku uszczelnionego końca toru wyścigowego, tak aby znajdowała się w odległości 0.5 - 1 cm od uszczelnionej końcówki (Rysunek 1C).</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety dodaj wodę zawierającą MTB (z sekcji 2.2) do zbiornika próbki (otwarty koniec) przygotowanego toru wyścigowego MTB (rysunek 1B).</li>
</ol>
4. Wzbogacenie MTB
<ol>
	<li>Gdy tor wyścigowy zostanie wypełniony próbką płynu, połóż go na boku na poziomej powierzchni (np. blacie stołowym) i umieść południowy biegun magnesu sztabkowego (na półkuli północnej) obok uszczelnionej końcówki toru wyścigowego (rysunki 1B i 1C).</li>
	<li>Poczekaj od 5 do 30 minut, aż rower MTB przejdzie przez bawełnę. Następnie należy zebrać płyn w pobliżu końcówki toru wyścigowego. Zbyt długie czekanie może wprowadzić zanieczyszczenia, takie jak inne ruchliwe bakterie, do końca naczynia włosowatego. Opcjonalnie możesz użyć mikroskopu świetlnego, aby zobaczyć końcówkę toru wyścigowego i obserwować, jak MTB zbiera się na końcu toru wyścigowego. Pozwoli Ci to określić, ile czasu zajmuje rowerowi MTB migrację przez bawełnianą zatyczkę.</li>
	<li>Delikatnie użyj diamentowego noża, aby zrobić małe zadrapanie w pobliżu bawełnianej zatyczki i oderwać koniec toru wyścigowego.</li>
	<li>Użyj strzykawki o pojemności 1 ml z wąską igłą (rozmiar 25 lub 27), aby usunąć płyn z końcówki toru wyścigowego. Ta płynna próbka powinna teraz zawierać wzbogacony MTB.</li>
</ol>
5. Obserwacja MTB za pomocą mikroskopii świetlnej
<ol>
	<li>Umieścić kroplę (10-20 μl) wzbogaconej próbki MTB na szkiełku nakrywkowym.</li>
	<li>Szybko odwróć szkiełko nakrywkowe, tak aby kropla była teraz skierowana w dół i zwisała z szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na o-ringu, który spoczywa na szklanym szkiełku. O-ring powinien mieć nieco mniejszą średnicę niż szkiełko nakrywkowe (około 1 cm; Rysunek 2).</li>
	<li>Umieść tę wiszącą kroplę na lekkim mikroskopie i skup się na jednej krawędzi kropli. Suchy obiektyw 60X działa bardzo dobrze, ponieważ większość z nich ma wysoką aperturę numeryczną (NA; np. 0,93), ale nie wymagają oleju, który jest trudny w użyciu w przypadku metody wiszącej kropli (rysunek 2).</li>
	<li>Umieść południowy koniec magnesu sztabkowego blisko wiszącego spadku, a MTB zacznie migrować w kierunku krawędzi kropli znajdującej się najbliżej magnesu (Rysunek 3). W ciągu kilku minut wiele rowerów MTB powinno znaleźć się na skraju spadku (Rysunek 3). Udowodnij sobie, że bakterie są magnetyczne, odwracając biegun magnesu, a następnie obserwuj, jak bakterie pływają w przeciwnym kierunku.</li>
</ol>
6. Obserwacja MTB za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)
<ol>
	<li>Umieść kroplę (~20 μl) wzbogaconego MTB na miedzianej siatce i pozwól bakteriom osiąść przez 10 minut.</li>
	<li>Odetnij nadmiar wody kawałkiem czystej bibuły filtracyjnej.</li>
	<li>Opcjonalnie siatkę można barwić ujemnie 2% octanem uranylu, 2% kwasem fosfatungstycznym o pH 7,2 lub 2,5% molibdenianem sodu7, 8, 9. Odbywa się to poprzez umieszczenie miedzianej siatki na kropli bejcy natychmiast po inkubacji siatki ze wzbogaconym MTB. Inkubuj siatkę z ujemną plamą, czasy będą się różnić w zależności od użytej plamy, a następnie odchodź płyn kawałkiem czystej bibuły filtracyjnej.</li>
	<li>Obserwuj MTB za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM, rysunek 4). Do opisanej tutaj pracy MTB zostały zaadsorbowane na stabilizowanych i powlekanych węglem siatkach miedzianych Formvar o siatce 200 mesh (Ted Pella #01800). Kratki umieszczono stroną węglową do dołu na kropli zawiesiny ogniw na okres do 10 minut, a następnie natychmiast umyto jeden raz, umieszczając siatkę na kropli wody na 30 sekund. W celu barwienia siatki umieszczono na kropli 2% octanu uranylu (Ted Pella #19481) na 30 sekund do 5 minut, a następnie całkowicie wysuszono za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej. Sieci były analizowane przez TEM przy użyciu FEI Tecnai Spirit przy napięciu 80 kV lub FEI Tecnai F20 przy użyciu pierścieniowego STEM o wysokim kącie nachylenia przy napięciu 200 kV.</li>
</ol>

<ol><li>Blakemore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Magnetotactic bacteria.</a> Science. 190, 377-379 (1975).</li>
<li>Blakemore, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Magnetotactic bacteria.</a> Annual Reviews in Microbiology. 36, 217-238 (1982).</li>
<li>Bazylinski, D. A., Frankel, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Biomineralization+of+Magnetite+%28Fe3O4%29+and+Greigite+%28Fe3S4%29+in+a+Magnetotactic+Bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Controlled Biomineralization of Magnetite (Fe3O4) and Greigite (Fe3S4) in a Magnetotactic Bacterium.</a> Applied and Environmental Microbiology. 61, 3232-3239 (1995).</li>
<li>Lefevre, C. T., Menguy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cultured+Greigite-Producing+Magnetotactic+Bacterium+in+a+Novel+Group+of+Sulfate-Reducing+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Cultured Greigite-Producing Magnetotactic Bacterium in a Novel Group of Sulfate-Reducing Bacteria.</a> Science. 334, 1720-1723 (2011).</li>
<li>Simmons, S. L., Bazylinski, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((South-seeking+magnetotactic+bacteria+in+the+Northern+Hemisphere%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">South-seeking magnetotactic bacteria in the Northern Hemisphere.</a> Science. 311, 371-374 (2006).</li>
<li>Wolfe, R., Thauer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%27capillary+racetrack%27+method+for+isolation+of+magnetotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 45, 31-35 (1987).</li>
<li>Rodgers, F. G., Blakemore, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+structure+in+a+many-celled+magnetotactic+prokaryote%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Intercellular structure in a many-celled magnetotactic prokaryote.</a> Archives of Microbiology. 154, 18-22 (1990).</li>
<li>Moench, T. T., Konetzka, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+isolation+and+study+of+a+magnetotactic+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel method for the isolation and study of a magnetotactic bacterium.</a> Archives of Microbiology. 119, 203-212 (1978).</li>
<li>Balkwill, D., Maratea, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+a+magnetotactic+spirillum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of a magnetotactic spirillum.</a> Journal of Bacteriology. 141, 1399-1408 (1980).</li>
<li>Lins, U., Freitas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+homemade+apparatus+for+harvesting+uncultured+magnetotactic+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Simple homemade apparatus for harvesting uncultured magnetotactic microorganisms.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 34, 111-116 (2003).</li>
<li>Jogler, C., Lin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+Cloning+of+the+Magnetotactic+Metagenome%3A+Identification+of+Magnetosome+Island+Gene+Clusters+in+Uncultivated+Magnetotactic+Bacteria+from+Different+Aquatic+Sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Toward Cloning of the Magnetotactic Metagenome: Identification of Magnetosome Island Gene Clusters in Uncultivated Magnetotactic Bacteria from Different Aquatic Sediments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 3972-3979 (2009).</li>
<li>Lin, W., Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+Isolated+but+Uncultivated+Magnetotactic+Bacterium+of+the+Phylum+Nitrospirae+from+Beijing%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Newly Isolated but Uncultivated Magnetotactic Bacterium of the Phylum Nitrospirae from Beijing, China.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78, 668-675 (2012).</li>
<li>Li, J., Pan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomineralization%2C+crystallography+and+magnetic+properties+of+bullet-shaped+magnetite+magnetosomes+in+giant+rod+magnetotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Earth+and+Planetary+Science+Letters%22%5BJournal%5D)">Biomineralization, crystallography and magnetic properties of bullet-shaped magnetite magnetosomes in giant rod magnetotactic bacteria.</a> Earth and Planetary Science Letters. 293, 368-376 (2010).</li>
<li>Oestreicher, Z., Valerde-Tercedor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetosomes+and+magnetite+crystals+produced+by+magnetotactic+bacteria+as+resolved+by+atomic+force+microscopy+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Magnetosomes and magnetite crystals produced by magnetotactic bacteria as resolved by atomic force microscopy and transmission electron microscopy.</a> Micron. 43, 1331-1335 (2012).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Bakterie magnetotaktyczne niekoniecznie występują w każdym środowisku wodnym8 ale kiedy już wystąpią, można je znaleźć rzędu 100 - 1,000 komórek na mililitr2. Aby obserwować MTB za pomocą mikroskopii optycznej, potrzebujesz około 50 bakterii/ml w próbce8. Jeśli w próbce nie ma MTB lub jest ich niewiele, będziesz musiał wybrać nowy teren środowiskowy w celu pobrania próbek lub będziesz musiał wypróbować jedną lub więcej technik omówionych w następnej sekcji.
Po...

<table><tbody><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95933</td><td></td></tr><tr><td>Szklane pipety Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td></td></tr><tr><td>O-ring</td><td>Sklep</td><td></td><td></td>z</tr><tr><td>narzędziami Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Magnes sztabkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95957</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik</td><td>dowolny</td><td></td><td>Każdy plastikowy lub szklany pojemnik, który może pomieścić co najmniej 0,5 l i może być zamknięty</td></tr><tr><td>Bawełna</td><td>Dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskop z suchą soczewką 60X</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Sucha soczewka 60X nie jest absolutnie konieczna, ale daje to wysokie NA bez użycia oleju</td></tr><tr><td>Długopis diamentowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-675</td><td></td></tr><tr><td>Filtr 0,22 mm</td><td></td> Strzykawka <td></td> Fisher Scientific 09-719C <td></td></tr> 1 <tr><td>ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9788564</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 200 mesh, siatki miedziane</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>01800</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>19481</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai Spirit TEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai F20 S/TEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zbieranie, izolacja i wzbogacanie naturalnie występujących bakterii magnetotaktycznych ze środowiska

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Bakterie magnetotaktyczne (MTB) to mikroorganizmy wodne, które po raz pierwszy zostały opisane w 1975 roku1 na podstawie próbek osadów zebranych na słonych bagnach Massachusetts (USA). Od tego czasu MTB zostały odkryte w warstwowych kolumnach wodnych i osadowych z całego świata2. Jedną z cech wspólnych dla wszystkich MTB jest to, że zawierają one magnetosomy, które są wewnątrzkomórkowymi, związanymi z błoną nanokryształami magnetycznymi magnetytu (Fe3O4) i / lub greigitu (Fe3S4) lub obu3, 4. Na półkuli północnej MTB są zazwyczaj przyciągane do południowego końca magnesu sztabkowego, podczas gdy na półkuli południowej są zwykle przyciągane do północnego końca magnesu3,5. Właściwość tę można wykorzystać przy próbie odizolowania MTB od próbek środowiskowych.
Jednym z najczęstszych sposobów na wzbogacenie MTB jest użycie przezroczystego plastikowego pojemnika do zbierania osadów i wody z naturalnego źródła, takiego jak staw słodkowodny. Na półkuli północnej południowy koniec magnesu sztabkowego jest umieszczony na zewnątrz pojemnika tuż nad osadem na granicy osad-woda. Po pewnym czasie bakterie można usunąć z wnętrza pojemnika w pobliżu magnesu za pomocą pipety, a następnie dodatkowo wzbogacić za pomocą kapilarnego toru wyścigowego6 i magnesu. Po wzbogaceniu bakterie można umieścić na szkiełku mikroskopowym za pomocą metody wiszącej kropli i obserwować w mikroskopie świetlnym lub zdeponować na miedzianej siatce i obserwować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).
Korzystając z tej metody, izolowane MTB mogą być badane mikroskopowo w celu określenia takich cech jak zachowanie podczas pływania, typ i liczba wici, morfologia komórek komórkowych, kształt kryształów magnetycznych, liczba magnetosomów, liczba łańcuchów magnetosomów w każdej komórce, skład kryształów nanomineralnych i obecność wewnątrzkomórkowych wakuoli.

Magnes jest skutecznym narzędziem, które może być wykorzystane do izolacji bakterii magnetotaktycznych (MTB) zawartych w próbkach środowiskowych (Rysunek 1A). Kapilarny tor wyścigowy (Rysunek 1B) wykorzystuje właściwości magnetyczne MTB, aby przyciągnąć je przez bawełniany czopek, gdzie mogą one zostać oddzielone od mikroorganizmów niemagnetotaktycznych, które również znajdują się w próbce środowiskowej.
<img alt="Schemat...

Demonstrujemy metodę zbierania bakterii magnetotaktycznych (MTB), które można zastosować do naturalnych wód. MTB można wyizolować i wzbogacić z próbek osadu przy użyciu stosunkowo prostej konfiguracji, która wykorzystuje naturalny magnetyzm bakterii. Wyizolowany MTB można następnie szczegółowo zbadać zarówno za pomocą mikroskopii świetlnej, jak i elektronowej.

Zbieranie, izolacja i wzbogacanie naturalnie występujących bakterii magnetotaktycznych ze środowiska

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie bakterii magnetotaktycznych ze środowiska słodkowodnego. Osiąga się to poprzez pobranie najpierw próbek osadów wodnych z brzegu rzeki lub jeziora. Drugim krokiem jest wyizolowanie bakterii magnetotaktycznych zawartych w próbce środowiskowej za pomocą magnesu sztabkowego.Następnie bakterie magnetotaktyczne są wzbogacane za pomocą szklanego kapilarnego toru wyścigowego i magnesu. Na koniec bakterie magnetotaktyczne są charakteryzowane za pomocą mikroskopii optycznej. Ostatecznie transmisyjna mikroskopia elektronowa służy do pokazania wielkości i kształtu bakterii oraz ich magnetytu zawierającego strefy magneto.Ta metoda pomaga nam zrozumieć kluczowe pytania, mikrobiologię środowiskową, takie jak to, jak magneto ewoluowało na Ziemi i jak bakterie magnetotaktyczne syntetyzowały magnesy o rozmiarach nanometrów. Dzisiejszą procedurę zademonstruje Zachary a Stryker. Zachary jest doktorantem w moim laboratorium.Pracuje ze mną i moim bratem na Uniwersytecie Stanowym Ohio. Decydując się na miejsce słodkowodne do zbierania bakterii magnetotaktycznych lub MTB, często najlepiej jest zacząć od stawu lub wolno płynącego strumienia, który ma miękką błotnistą warstwę osadu. W tej demonstracji pobraliśmy próbkę na brzegu rzeki Oland Tangy na terenie kampusu Uniwersytetu Stanowego Ohio w Columbus w stanie Ohio.Znajdź miejsce, w którym głębokość wody wynosi od 10 do 100 centymetrów, i za pomocą przezroczystego zakręcanego pojemnika napełnij pojemnik najwyższą warstwą osadu i pozostałą przestrzenią wodą, zamykając pojemnik pod wodą z powrotem w laboratorium, poluzuj nakrętkę i pozostaw ją zakrywającą pojemnik, aby zmniejszyć parowanie i przechowuj go w ciemności przez kilka godzin do kilku dni, aby umożliwić osad i znajdź cząstki, aby się osiedlić. Tworzenie torów wyścigowych w celu wzbogacenia MTB. Zacznij od użycia diamentowego długopisu lub pilnika, aby odciąć górną część szklanej pipety o średnicy 5.75 cala, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca na jeden do dwóch mililitrów wody.Następnie użyj palnika i do uszczelnienia autoklawu końcówki. Kilka gąsienic podnosi się wraz z bawełnianymi i długimi metalowymi igłami. Gdy będziesz gotowy do odizolowania MTB, umieść magnesy po bokach plastikowego pojemnika, około jednego centymetra powyżej granicy faz wody osadowej z biegunami południowym i północnym po przeciwnych stronach pojemnika.Uważaj, aby nie naruszyć osadu. Odczekaj od 30 minut do kilku godzin, aż bakterie podpłyną do magnesu. Następnie za pomocą strzykawki usuń płyn z pojemnika na próbkę w pobliżu granicy faz osadu i wody.Przymocuj filtr do strzykawki i metalową igłę do filtra, upewniając się, że w kapilarze nie ma pęcherzyków. Za pomocą igły dodaj przefiltrowaną próbkę wody na autoklaw tor wyścigowy ze sterylną bawełną i metalową igłą. Zatkaj tor wyścigowy, wciskając bawełnę do wnętrza kapilary na odległość od 0,5 do jednego centymetra od uszczelnionego końca.Za pomocą sterylnej pipety usuń bakterie magnetotactic z pojemnika, w którym są zgrupowane w pobliżu południowego bieguna magnesu, i dodaj MTB zawierający wodę na otwartym końcu toru wyścigowego. Gdy tor wyścigowy zostanie wypełniony próbką płynu, połóż go na boku na poziomej powierzchni i umieść południowy biegun magnesu sztabkowego obok końcówki uszczelniającej toru wyścigowego. Poczekaj od pięciu do 30 minut, aż rower MTB przejdzie przez bawełnę.Użyj diamentowego noża, aby delikatnie zrobić małe zadrapanie w pobliżu bawełnianej zatyczki i oderwać koniec toru wyścigowego. Użyj jednomililitrowej strzykawki z wąską igłą, aby usunąć płyn wzbogacony o MTB z końcówki toru wyścigowego. Aby zaobserwować MTB za pomocą mikroskopii świetlnej, umieść kroplę wzbogaconej próbki na szkiełku nakrywkowym.Umieść szkiełko nakrywkowe na pierścieniu uszczelniającym o przekroju okrągłym, który spoczywa na szklanym szkiełku. Nazywa się to wiszącą kroplą. O-ring powinien mieć nieco mniejszą średnicę niż szkiełko nakrywkowe.Następnie umieść szkiełko na stoliku mikroskopu świetlnego i skup się na jednej krawędzi kropli. Następnie, aby przyciągnąć MTB do jednej strony spadku, umieść południowy koniec magnesu sztabkowego blisko tej strony w ciągu kilku minut, wiele MTB powinno znajdować się na krawędzi spadku. Aby zaobserwować MTB za pomocą TEM, umieść stabilizowaną var i powlekaną węglem siatkę miedzianą o siatce 200 na kropli wzbogaconych bakterii i pozwól próbce osiąść przez 10 minut.Po umyciu próbki na kropli wody przez 30 sekund, umieść ją na kropli 2% octanu pisuaru na 30 sekund do pięciu minut, a następnie użyj kawałka bibuły filtracyjnej do całkowitego wyschnięcia Przeanalizuj próbki za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej przy 200 kilowoltach. Pokazany tutaj jest obraz z transmisyjnego mikroskopu elektronowego pojedynczej bakterii magnetotaktycznej wzbogaconej z próbki osadu środowiskowego. Spirala i morfologia komórek i stref magneto są wyraźnie widoczne wraz z pojedynczym flegelem.Po zebraniu bakterii magnetotaktycznych z otoczenia, technika separacji magnetycznej zajmie około trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza rybosomalnego RNA 16 s, które odpowiedzą na dodatkowe pytania, takie jak, jakie jest pokrewieństwo filogenetyczne nowo odkrytych bakterii magnetotaktycznych do innych, do innych mikroorganizmów.

collection-isolation-enrichment-naturally-occurring-magnetotactic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zbieranie, izolowanie i wzbogacanie naturalnie występujących bakterii magnetotaktycznych ze środowiska

Eukarioty mikrobiologiczne są zarówno źródłem węgla pochodzenia fotosyntetycznego, jak i drapieżnymi gatunkami szczytowymi w stale pokrytych lodem jeziorach Antarktydy. Niniejszy raport opisuje podejście oparte na kulturach wzbogaconych w celu izolacji metabolicznie wszechstronnych eukariotów mikrobiologicznych z antarktycznego jeziora Bonney oraz ocenia potencjał asymilacji węgla nieorganicznego przy użyciu testu radioizotopowego na aktywność rybulozo-1,5-bisfosforanowej...

Ustanowienie mikrobialnych kultur wzbogaconych eukariotów z chemicznie uwarstwionego jeziora antarktycznego oraz ocena potencjału wiązania węgla

Źródło: Le Nagard, L., et al. Hodowla bakterii magnetotaktycznych z rodzaju Magnetospirillum: szczepy MSR-1, AMB-1 i MS-1. J. Vis. Exp. (2018).Ten film pokazuje, jak hodować bakterie Magnetospirillum w warunkach mikrotlenowych przy użyciu pożywek zarówno płynnych, jak i półstałych. Podkreśla tworzenie się widocznego pasma bakteryjnego na granicy faz tlenowo-beztlenowych i jego migrację w górę wraz z wyczerpaniem tlenu. Film pokazuje również, jak ocenić zachowanie magnetotaktyczne poprzez...

Hodowla bakterii Magnetospirillum i ocena ich zachowania magnetotaktycznego

Źródło: Watson, D. C., et.al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje izolację i koncentrację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z zewnętrznej błony genetycznie zmodyfikowanych bakterii. Proces ten obejmuje hodowlę bakterii w celu uwolnienia EV, a następnie sekwencyjne etapy wirowania i filtracji w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń. Wreszcie, ultrafiltracja jest stosowana...

Izolacja i wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z błony zewnętrznej od bakterii

Zacznij od kultury wzbogacającej glebę pochodzącej z terenów podmokłych, zawierającej zbiorowiska bakterii.Kultura wykazuje aktywność Feammox, utlenianie amonu sprzężone z redukcją żelaza, co wskazuje na wzbogacenie bakterii zdolnej do tego procesu metabolicznego.Seryjnie rozcieńczyć kulturę za pomocą pożywki.Rozcieńczone próbki rozprowadzić na badanych płytkach agarowych uzupełnionych żelazem i amonem.Używaj płytek kontrolnych, które nie zawierają żelaza lub amonu lub zawierają żelazo z węglem...

Izolacja reduktorów żelaza utleniających amonu z kultury wzbogacania gleby pochodzącej z terenów podmokłych 

Źródło: Villela, H. D. M. i in. Poszukiwanie szczepów mikroorganizmów do bioremediacji oraz rozwój probiotyków do badań i ochrony metaorganizmów. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje izolację bakterii morskich degradujących zanieczyszczenia poprzez seryjne rozcieńczanie, selekcję kolonii oraz wzrost w medium zawierającym EE2. Wykorzystując EE2 jako jedyne źródło węgla, protokół identyfikuje szczepy bakterii zdolne do metabolizowania tego zanieczyszczenia środowiska.

Przesiewowe bakterie morskie pod kątem izolacji szczepów degradujących zanieczyszczenia

Źródło: Villela, H. D. M. i in. Poszukiwanie szczepów mikroorganizmów do bioremediacji oraz rozwój probiotyków do badań i ochrony metaorganizmów. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje selektywną izolację bakterii morskich degradujących ropę poprzez wzbogacanie próbek wody morskiej na nośnikach olejowych, co umożliwia odzyskiwanie czystych szczepów z potencjalnymi zastosowaniami w bioremediacji ropy naftowej i oczyszczaniu środowiska.

Selektywne wzbogacanie i izolacja bakterii morskich degradujących ropę z próbek wody morskiej

Techniki wzbogacania mikroorganizmów na miejscu lub hodowli in situ mogą ułatwić izolację trudnych do hodowli taksonów mikroorganizmów, zwłaszcza z ekstremalnych środowisk o niskiej biomasie lub geochemicznie. W tym miejscu opisujemy układ elektrochemiczny bez użycia zewnętrznego źródła zasilania w celu wzbogacenia szczepów drobnoustrojów, które są zdolne do zewnątrzkomórkowego transportu elektronów (EET).

Wolnostojący zestaw elektrochemiczny do wzbogacania bakterii oddychających anodą na miejscu

Przedstawiamy procedurę uprawy kilku szczepów Magnetospirillum w dwóch różnych typach pożywek wzrostowych. Szczep Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 jest uprawiany zarówno w pożywkach półstałych w postaci płynnej, jak i gradientu stężeniaO2, podczas gdy szczep M. magneticum AMB-1 i szczep M. magnetotacticum MS-1 są uprawiane w płynnym podłożu.

Hodowla bakterii magnetotaktycznych z rodzaju Magnetospirillum: szczepy MSR-1, AMB-1 i MS-1

Izolacja odpornych na metale ciężkie mikroorganizmów ze źródeł geotermalnych jest gorącym tematem dla rozwoju biosystemów bioremediacji i monitorowania środowiska. Badanie to zapewnia metodologiczne podejście do izolowania i identyfikacji bakterii tolerujących metale ciężkie z gorących źródeł.

Bioprospekcja mikroorganizmów ekstremofilnych w celu rozwiązania problemu zanieczyszczenia środowiska

Komórki natural killer stanowią niewielką populację limfocytów. W niniejszym materiale pokazujemy, jak izolować te komórki z ludzkiej krwi metodą selekcji negatywnej, wykorzystując zestaw firmy StemCell Technologies. Uzyskane komórki są żywe i nieoznaczone przeciwciałami, w związku z czym nadają się do zastosowania w wielu procedurach.

Wzbogacanie komórek NK z ludzkiej krwi za pomocą zestawu RosetteSep firmy StemCell Technologies

Poznaj metodę izolacji bakterii magnetotaktycznych ze środowisk słodkowodnych. Wykorzystaj naturalny magnetyzm i mikroskopię elektronową do badań mikrobiologicznych.

Zbieranie, izolacja i wzbogacanie naturalnie występujących bakterii magnetotaktycznych ze środowiska

Przeglądaj więcej filmów