Zbieranie, izolacja i wzbogacanie naturalnie występujących bakterii magnetotaktycznych ze środowiska
15 listopada 2012
Demonstrujemy metodę zbierania bakterii magnetotaktycznych (MTB), które można zastosować do naturalnych wód. MTB można wyizolować i wzbogacić z próbek osadu przy użyciu stosunkowo prostej konfiguracji, która wykorzystuje naturalny magnetyzm bakterii. Wyizolowany MTB można następnie szczegółowo zbadać zarówno za pomocą mikroskopii świetlnej, jak i elektronowej.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie bakterii magnetotaktycznych ze środowiska słodkowodnego. Osiąga się to poprzez pobranie najpierw próbek osadów wodnych z brzegu rzeki lub jeziora. Drugim krokiem jest wyizolowanie bakterii magnetotaktycznych zawartych w próbce środowiskowej za pomocą magnesu sztabkowego.
Następnie bakterie magnetotaktyczne są wzbogacane za pomocą szklanego kapilarnego toru wyścigowego i magnesu. Na koniec bakterie magnetotaktyczne są charakteryzowane za pomocą mikroskopii optycznej. Ostatecznie transmisyjna mikroskopia elektronowa służy do pokazania wielkości i kształtu bakterii oraz ich magnetytu zawierającego strefy magneto.
Ta metoda pomaga nam zrozumieć kluczowe pytania, mikrobiologię środowiskową, takie jak to, jak magneto ewoluowało na Ziemi i jak bakterie magnetotaktyczne syntetyzowały magnesy o rozmiarach nanometrów. Dzisiejszą procedurę zademonstruje Zachary a Stryker. Zachary jest doktorantem w moim laboratorium.
Pracuje ze mną i moim bratem na Uniwersytecie Stanowym Ohio. Decydując się na miejsce słodkowodne do zbierania bakterii magnetotaktycznych lub MTB, często najlepiej jest zacząć od stawu lub wolno płynącego strumienia, który ma miękką błotnistą warstwę osadu. W tej demonstracji pobraliśmy próbkę na brzegu rzeki Oland Tangy na terenie kampusu Uniwersytetu Stanowego Ohio w Columbus w stanie Ohio.
Znajdź miejsce, w którym głębokość wody wynosi od 10 do 100 centymetrów, i za pomocą przezroczystego zakręcanego pojemnika napełnij pojemnik najwyższą warstwą osadu i pozostałą przestrzenią wodą, zamykając pojemnik pod wodą z powrotem w laboratorium, poluzuj nakrętkę i pozostaw ją zakrywającą pojemnik, aby zmniejszyć parowanie i przechowuj go w ciemności przez kilka godzin do kilku dni, aby umożliwić osad i znajdź cząstki, aby się osiedlić. Tworzenie torów wyścigowych w celu wzbogacenia MTB. Zacznij od użycia diamentowego długopisu lub pilnika, aby odciąć górną część szklanej pipety o średnicy 5.75 cala, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca na jeden do dwóch mililitrów wody.
Następnie użyj palnika i do uszczelnienia autoklawu końcówki. Kilka gąsienic podnosi się wraz z bawełnianymi i długimi metalowymi igłami. Gdy będziesz gotowy do odizolowania MTB, umieść magnesy po bokach plastikowego pojemnika, około jednego centymetra powyżej granicy faz wody osadowej z biegunami południowym i północnym po przeciwnych stronach pojemnika.
Uważaj, aby nie naruszyć osadu. Odczekaj od 30 minut do kilku godzin, aż bakterie podpłyną do magnesu. Następnie za pomocą strzykawki usuń płyn z pojemnika na próbkę w pobliżu granicy faz osadu i wody.
Przymocuj filtr do strzykawki i metalową igłę do filtra, upewniając się, że w kapilarze nie ma pęcherzyków. Za pomocą igły dodaj przefiltrowaną próbkę wody na autoklaw tor wyścigowy ze sterylną bawełną i metalową igłą. Zatkaj tor wyścigowy, wciskając bawełnę do wnętrza kapilary na odległość od 0,5 do jednego centymetra od uszczelnionego końca.
Za pomocą sterylnej pipety usuń bakterie magnetotactic z pojemnika, w którym są zgrupowane w pobliżu południowego bieguna magnesu, i dodaj MTB zawierający wodę na otwartym końcu toru wyścigowego. Gdy tor wyścigowy zostanie wypełniony próbką płynu, połóż go na boku na poziomej powierzchni i umieść południowy biegun magnesu sztabkowego obok końcówki uszczelniającej toru wyścigowego. Poczekaj od pięciu do 30 minut, aż rower MTB przejdzie przez bawełnę.
Użyj diamentowego noża, aby delikatnie zrobić małe zadrapanie w pobliżu bawełnianej zatyczki i oderwać koniec toru wyścigowego. Użyj jednomililitrowej strzykawki z wąską igłą, aby usunąć płyn wzbogacony o MTB z końcówki toru wyścigowego. Aby zaobserwować MTB za pomocą mikroskopii świetlnej, umieść kroplę wzbogaconej próbki na szkiełku nakrywkowym.
Umieść szkiełko nakrywkowe na pierścieniu uszczelniającym o przekroju okrągłym, który spoczywa na szklanym szkiełku. Nazywa się to wiszącą kroplą. O-ring powinien mieć nieco mniejszą średnicę niż szkiełko nakrywkowe.
Następnie umieść szkiełko na stoliku mikroskopu świetlnego i skup się na jednej krawędzi kropli. Następnie, aby przyciągnąć MTB do jednej strony spadku, umieść południowy koniec magnesu sztabkowego blisko tej strony w ciągu kilku minut, wiele MTB powinno znajdować się na krawędzi spadku. Aby zaobserwować MTB za pomocą TEM, umieść stabilizowaną var i powlekaną węglem siatkę miedzianą o siatce 200 na kropli wzbogaconych bakterii i pozwól próbce osiąść przez 10 minut.
Po umyciu próbki na kropli wody przez 30 sekund, umieść ją na kropli 2% octanu pisuaru na 30 sekund do pięciu minut, a następnie użyj kawałka bibuły filtracyjnej do całkowitego wyschnięcia Przeanalizuj próbki za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej przy 200 kilowoltach. Pokazany tutaj jest obraz z transmisyjnego mikroskopu elektronowego pojedynczej bakterii magnetotaktycznej wzbogaconej z próbki osadu środowiskowego. Spirala i morfologia komórek i stref magneto są wyraźnie widoczne wraz z pojedynczym flegelem.
Po zebraniu bakterii magnetotaktycznych z otoczenia, technika separacji magnetycznej zajmie około trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza rybosomalnego RNA 16 s, które odpowiedzą na dodatkowe pytania, takie jak, jakie jest pokrewieństwo filogenetyczne nowo odkrytych bakterii magnetotaktycznych do innych, do innych mikroorganizmów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę izolacji bakterii magnetotaktycznych (MTB) ze środowisk słodkowodnych. Proces obejmuje pobieranie próbek osadów i wykorzystanie ich naturalnego magnetyzmu do izolacji oraz wzbogacenia, a następnie szczegółową analizę z wykorzystaniem technik mikroskopowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Nauki o środowisku
- Biotechnologia
Wstęp
- Bakterie magnetotaktyczne stanowią unikalną grupę mikroorganizmów, które orientują się wzdłuż pól magnetycznych.
- Występują one w różnych środowiskach wodnych i odgrywają rolę w cyklach biogeochemicznych.
- Izolacja MTB może dostarczyć wiedzy na temat ich biologii oraz potencjalnych zastosowań.
- Tradycyjne metody izolacji tych bakterii mogą być złożone i wymagające pod względem zasobów.
Cel badania
- Opracowanie prostej i skutecznej metody izolacji MTB ze naturalnych źródeł wody.
- Pogłębienie zrozumienia charakterystyki MTB za pomocą mikroskopii.
- Ułatwienie dalszych badań nad rolą ekologiczną MTB.
Zastosowane metody
- Pobieranie próbek osadów ze środowisk słodkowodnych.
- Izolacja MTB przy użyciu magnesu słupkowego w celu wykorzystania ich naturalnego magnetyzmu.
- Namnażanie wyizolowanych bakterii przy użyciu szklanego toru kapilarnego i magnesu.
- Charakterystyka MTB za pomocą mikroskopii optycznej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja i namnożenie MTB z próbek osadów.
- Szczegółowa charakterystyka morfologii bakterii oraz zawierających magnetyt magnetosomów.
- Wykazanie efektywności proponowanej metody zbierania MTB.
- Wnioski dotyczące znaczenia ekologicznego MTB w środowiskach słodkowodnych.
Wnioski
- Opracowana metoda stanowi prosty sposób izolacji MTB.
- Technikę tę można zastosować w badaniach ekologicznych różnych naturalnych zbiorników wodnych.
- Dalsze badania mogą wykorzystać te wyniki do eksploracji zastosowań MTB w biotechnologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Izolacja i namnażanie bakterii magnetotaktycznych (MTB) z próbek środowiskowych umożliwiają precyzyjne badanie ich unikalnych mechanizmów biomineralizacji i nawigacji, co wspiera wczesną walidację celów w biotechnologii mikrobiologicznej. Ilościowa charakterystyka morfologii MTB oraz struktury magnetosomów zapewnia wiarygodność prognostyczną dla późniejszych zastosowań w biologii syntetycznej i badaniach nad nanomateriałami. Przedstawiony schemat pracy pozycjonuje MTB jako odnawialny zasób biologiczny dla portfeli badawczo-rozwojowych eksplorujących bioinżynieryjne nanocząstki magnetyczne i funkcjonalizację mikrobiologiczną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków mikrobijnej biomineralizacji oraz formowania się magnetosomów.
- Wspiera walidację funkcjonalną MTB jako źródła biologicznie syntetyzowanych nanomateriałów.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego w ramach inicjatyw inżynierii mikrobiologicznej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowane wzbogacanie MTB w celu uzyskania powtarzalnych wyników w późniejszych analizach.
- Dostarcza ilościowych danych na temat morfologii komórek i charakterystyki magnetosomów za pomocą mikroskopii.
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych próbek biologicznych do porównawczego przesiewu cech mikrobiologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie nanomateriałów pochodzących z MTB z translacyjnym odkrywaniem biomarkerów w badaniach nad nanomedycyną.
- Zapewnia ciągłość procesu, od izolacji środowiskowej po ewaluację przedkliniczną produktów mikrobiologicznych.
- Minimalizuje ryzyko rozwoju platform opartych na MTB poprzez umożliwienie szczegółowej charakterystyki fenotypowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje cały proces badawczy, od pobierania próbek środowiskowych, poprzez walidację mikrobiologicznych celów, aż po przedkliniczną charakterystykę materiałów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących nawigacji mikrobów oraz biosyntezy magnetosomów.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne wzbogacanie oraz ilościowe wyniki mikroskopowe niezbędne do opracowania analiz.
- Analityka: Dostarcza odczyty morfologiczne i strukturalne do analizy porównawczej izolatów MTB.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia środowiskowe z badaniami przedklinicznymi nanomateriałów pochodzących z MTB.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny schemat postępowania w celu izolacji MTB z różnorodnych źródeł środowiskowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celów mikrobiologicznych i walidacji funkcjonalnej.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje wzbogacanie i charakterystykę MTB dla skalowalnych procesów badawczo-rozwojowych.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) w zakresie rozwoju nanomateriałów mikrobiologicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów odkrywania opartych na MTB z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu mikrobiologii środowiskowej i technik mikroskopii.
- Wymaga dostępu do magnesów słupkowych, torów kapilarnych oraz zaawansowanej infrastruktury obrazowania.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie protokołów pobierania i wzbogacania próbek.
- Metoda jest dostosowalna do różnych środowisk wodnych, przy uwzględnieniu składu osadów.
- Wymaga ostrożnego obchodzenia się z materiałem, aby uniknąć zaburzeń próbek i zapewnić powtarzalność.
