Name: Elektroporacja tyłomózgowia w celu śledzenia trajektorii aksonów i celów synaptycznych w zarodku pisklęcia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Poznaj elektroporację tyłomózgowia pisklęcia w celu śledzenia trajektorii aksonów i celów synaptycznych. Ta metoda umożliwia badaczom analizę rozwoju sieci neuronowych w biologii rozwojowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Yuvalowi Gottlieb-Drorowi za ilustrację do elektroporacji. Praca ta była wspierana przez granty dla DSD z Narodowego Instytutu Psychobiologii w Izraelu oraz z programu współpracy badawczej Niedersachsen-Izrael oraz przez granty dla AK z Izraelskiej Fundacji Naukowej, izraelskiego Ministerstwa Zdrowia i partnerstwa The Center of Excellence-Legacy Heritage Biomedical Science.

1. Elektroporacja tyłomózgowia
1.1 Obchodzenie się z jajami
<ol>
	<li>Umieścić jaja poziomo w nawilżanym inkubatorze (37-38,5 °C). Zarodki są elektroporowane po 65-70 godzinach inkubacji, gdy osiągną stadium 16-17 (HH) (25-30 somitów).</li>
	<li>Wyjąć jaja z inkubatora; pozostają one w pozycji poziomej.</li>
</ol>
1.2 Przygotowania
<ol>
	<li>Wyciągnij szklane kapilary (średnica 0,5 mm).</li>
	<li>Podłącz wygięte złote elektrody Genetrodes w kształcie litery L (średnica 3 mm) z uchwytem adaptera do generatora impulsów. Parametry elektroporacji obejmują 25 woltów, 5 liczb impulsów, długość impulsu 45 ms, interwały impulsów 300 ms.</li>
	<li>Przygotuj pipetę do jamy ustnej, igłę do strzykawki o pojemności 10 ml, paski parafilmu, miękką szczoteczkę, ostre nożyczki preparacyjne i 25 ml sterylnego roztworu PBS. Ta ilość jest zwykle wystarczająca do obsługi tacki na jajka (18 jaj).</li>
	<li>Przygotuj odpowiednią mieszaninę plazmidów DNA (po 5 μg/μl każdy) i dodaj około 0,025% barwnika Fast Green, aby uwidocznić wstrzyknięcie DNA. Zazwyczaj do wstrzyknięcia tacki wystarcza objętość 4 μl.</li>
</ol>
1.3 Okienkowanie, iniekcja i elektroporacja
<ol>
	<li>Oczyść skorupki jaj 70% etanolem.</li>
	<li>Dotykaj jednego jaja na raz, aby zminimalizować czas ekspozycji zarodka na powietrze.</li>
	<li>Kończami nożyczek zrób dziurę w słupku jajka i usuń strzykawką 3-4 ml albuminy. Nie usuwaj większej ilości albuminy, ponieważ zmniejsza to żywotność.</li>
	<li>Otwórz małe owalne okienko (o wymiarach 2,5 x 2 cm) w górnej środkowej części skorupki jajka za pomocą nożyczek do preparowania.</li>
	<li>Wlej kilka kropli PBS na wierzch zarodka, aby zapobiec wysuszeniu podczas całego procesu.</li>
	<li>Załaduj niewielką ilość mieszaniny DNA do szklanej kapilary za pomocą pipety doustnej.</li>
	<li>Umieść zarodek tylnym końcem do siebie. Na tym etapie nie jest wymagane wstrzykiwanie atramentu, ponieważ zarodek jest wyraźnie widoczny. Unikanie wstrzykiwania atramentu zwiększa przeżywalność zarodka. Przeniknij do ogona tyłomózgowia, przytrzymując naczynia włosowate pod kątem ~45°. Nie usuwaj żadnej błony z okolic zarodka. Ostrożnie wstrzyknąć roztwór DNA do światła tyłomózgowia i wydychać powietrze bez tworzenia pęcherzyków powietrza. Roztwór DNA rozprzestrzenia się do przodu.</li>
	<li>Natychmiast po wstrzyknięciu DNA umieść równoległe elektrody w precyzyjnej pozycji AP i DV w tyłomózgowiu, do której dążysz. Lekko popchnij elektrody brzusznie, nie dotykając serca, ponieważ może to zmniejszyć żywotność. Impulsuj elektroporator. Elektrody powinny być pokryte pęcherzykami, aby wskazać przewodność elektryczną (rysunek 1A).</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij elektrody i wlej kilka kropli PBS, aby schłodzić zarodek i usunąć pęcherzyki. Prawidłowo uszczelnij otwór jaja paskiem parafilmowym, aby zapobiec wysuszeniu podczas inkubacji. Umyj elektrody w PBS miękką szczotką.</li>
	<li>Umieść jajo w inkubatorze na żądany czas. Przeżywalność zarodków wynosi około 90% 2-3 dni po elektroporacji i zmniejsza się do 50% 12 dni po elektroporacji.</li>
</ol>
2. Analiza zarodków
2.1 Przygotowanie do montażu płaskiego i immunofluorescencja
<ol>
	<li>Preparacje tyłomózgowia z płaskim mocowaniem można wykonać do E6,5, aby łatwo uwidocznić aksony pod mikroskopem lub mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Ostrożnie wypreparuj zarodek, oddzielając go od otaczających błon i naczyń krwionośnych. Umieść zarodek na małej pokrytej silikonem szalce Petriego zawierającej PBS. Przymocuj zarodek do naczynia za pomocą wolframowych szpilek skierowanych grzbietowo. Wykonaj szczelinę grzbietową w tylnej płycie dachowej mózgu za pomocą ostrych szklanych naczyń włosowatych.</li>
	<li>Za pomocą ostrej pęsety i mikronożyczek przytrzymaj górną część głowy i bardzo ostrożnie pociągnij tkankę tylnego mózgu od rostralnego do ogonowego. Po oddzieleniu tyłomózgowia usuń pozostałe tkanki brzuszne, aby uzyskać czysty preparat.</li>
	<li>Inkubuj tyłomózgowie z 4% roztworem paraformaldehydu (PFA) przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej (RT). Umyj tyłomózgowie PBT (PBS/0,1% Triton X-100) w celu usunięcia PFA.</li>
	<li>W celu immunofluorescencji w płasko zamontowanym tyłomózgowiu dodać 500 μl roztworu blokującego (5% koziej surowicy w PBT i inkubować przez 2 godziny w RT Inkubować z 1st przeciwciałem ON w temperaturze 4 °C. Przemyć PBT (15 min x 3). Inkubować z 2nd przeciwciałem przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Przemyć PBT (15 min x 3).</li>
	<li>Umieść tyłomózgowie skierowane grzbietowo na szklanym szkiełku. Dodaj fluorescencyjny nośnik montażowy na tyłomózgowie. Użyj szklanych naczyń włosowatych lub igieł wolframowych, aby spłaszczyć tyłomózgowie na szkiełku.</li>
	<li>Dodaj niewielką ilość tłuszczu w każdym rogu, aby zapobiec ściskaniu chusteczki przez szkiełko nakrywkowe. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na tylnym mózgowiu i unikaj pęcherzyków powietrza. Aby uzyskać przyczepność, dodaj lakier do paznokci na krawędzie szkła.</li>
</ol>
2.2 Kriosekcje i immunofluorescencja
<ol>
	<li>Kriowycinki pnia mózgu można wykonać na dowolnym etapie, aby uwidocznić trajektorie aksonów. Jednak po E6,5 powinna to być preferowana metoda ze względu na trudność w wizualizacji aksonów w płasko zamontowanym zarodku, który staje się zbyt gruby. Co więcej, demonstracja działania synaps wymaga przekroju tkanki i obejrzenia jej w dużym powiększeniu pod mikroskopem.</li>
	<li>Wypreparuj zarodek i usuń wszystkie otaczające tkanki. Spłucz PBS. Przetnij zarodek w ogonowej części rdzenia za pomocą mikronożyczek i ostrej pęsety. Wykonaj szerokie nacięcie między móżdżkiem a śródmózgowiem i usuń cały pień mózgu. Tkanka powinna zawierać rdzeń, most i móżdżek.</li>
	<li>Utrwalić pień mózgu w 4% PFA na noc (ON) w temperaturze 4 °C, spłukać PBS (10 min x 3) i inkubować z 30% sacharozą w celu ON w temperaturze 4 °C aż do zatonięcia.</li>
	<li>Osadź tyłomózgowie w krioformie ze związkiem OCT (optymalna temperatura cięcia) i umieść je w temperaturze -20 °C do momentu zamrożenia, jak opisano w innym miejscu 11.</li>
	<li>Umieść blok OCT w kriostacie na żądanej osi przekroju. Szerokość przekroju wynosi 12 μm.</li>
	<li>Wysuszyć szkiełka. Dodać 100 μl roztworu blokującego na każde szkiełko przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Dodać 100 μl przeciwciał (rozcieńczonych w roztworze blokującym do pożądanego stężenia). Okres inkubacjidla 1. i 2. przeciwciał wynosi ON odpowiednio w temperaturze 4 °C lub 2 godziny w temperaturze pokojowej. Na każdy czas inkubacji delikatnie dodaj pasek parafilmu na wierzch szkiełka, aby zapobiec wysuszeniu. Przemyć PBS (10 min x 3) między przeciwciałami. W razie potrzeby dodać 1:1 000 Dapi (4'-6-Diamidino-2-fenyloindol), rozcieńczonego w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Spłukać PBS.</li>
	<li>Zamontuj szkiełko za pomocą fluorescencyjnych nośników montażowych. Pozostaw do wyschnięcia na 1 godzinę przed analizą.</li>
</ol>

<ol><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+precerebellar+nuclei+in+the+rat%3A+II.+The+intramural+olivary+migratory+stream+and+the+neurogenetic+organization+of+the+inferior+olive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive.</a> J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).</li>
<li>Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+neurons+of+the+proprioceptive%2C+interoceptive%2C+and+arousal+hindbrain+networks+share+a+developmental+requirement+for+Math1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).</li>
<li>Storm, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bHLH+transcription+factor+Olig3+marks+the+dorsal+neuroepithelium+of+the+hindbrain+and+is+essential+for+the+development+of+brainstem+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei.</a> Development. 136, 295-305 (2009).</li>
<li>Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+of+segmentation+in+the+developing+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain.</a> Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+precerebellar+neuron+development+by+Olig3+bHLH+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor.</a> J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).</li>
<li>Muller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bHLH+factor+Olig3+coordinates+the+specification+of+dorsal+neurons+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord.</a> Genes Dev. 19, 733-743 (2005).</li>
<li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+and+dorsal+root+ganglion+axons+serve+as+choice+points+for+the+ipsilateral+turning+of+dI3+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons.</a> J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).</li>
<li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Dev. 4, 21(2009).</li>
<li>Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+axonal+pathways+of+genetically+defined+groups+of+neurons+in+the+chick+neural+tube+utilizing+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation.</a> J. Vis. Exp. (39), e1792(2010).</li>
<li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+Patterns+and+Targets+of+dA1+Interneurons+in+the+Chick+Hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain.</a> J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).</li>
<li>Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+delineation+of+ischemic+tissue+in+rat+brain+cryosections+by+high-contrast+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining.</a> Stroke. 30, 1134-1141 (1999).</li>
<li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li>
<li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.+Patterns%22%5BJournal%5D)">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).</li>
<li>Lu, Y., Lin, C., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac+transgenic+strategies+in+the+developing+chicken+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord.</a> Nucleic Acids Res. 37, e141(2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-like+elements+in+the+pink+bollworm%2C+Pectinophora+gossypiella%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella.</a> Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).</li>
<li>Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+synapse+formation+in+arborizing+optic+axons+in+vivo%3A+dynamics+and+modulation+by+BDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF.</a> Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).</li>
<li>Leal-Ortiz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piccolo+modulation+of+Synapsin1a+dynamics+regulates+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis.</a> J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).</li>
<li>Gardzinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+synaptotagmin+I+C2A+calcium-binding+domain+in+synaptic+vesicle+clustering+during+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation.</a> J. Physiol. 581, 75-90 (2007).</li>
<li>Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SV2+regulates+neurotransmitter+release+via+multiple+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).</li>
<li>Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+Hox+expression+in+the+vertebrate+hindbrain%3A+influence+of+paraxial+mesoderm+and+rhombomere+transposition%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition.</a> Neuron. 16, 487-500 (1996).</li>
<li>Clarke, J. D., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+repetition+of+neuronal+phenotype+sets+in+the+chick+embryo+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain.</a> Development. 118, 151-162 (1993).</li>
<li>Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+hodological+and+cytoarchitectonic+organization+in+the+vestibular+complex+of+the+11-day+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo.</a> J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).</li>
<li>Marin, F., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+fate+of+rhombomeres+in+quail%2Fchick+chimeras%3A+a+segmental+analysis+of+hindbrain+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Elektroporacja in ovo jest wykonalnym, niezawodnym i skutecznym narzędziem do badania specyfikacji komórek i prowadzenia aksonów podczas rozwoju układu nerwowego piskląt 20. W tym protokole opisujemy tryb elektroporacji w tyłomózgowiu pisklącia przy E2,75 przy użyciu elementów wzmacniających, które umożliwiają warunkowe znakowanie określonych interneuronów. Strategia ta jest połączona z systemem transpozycji, w którym pośredniczy PiggyBac, w celu wprowadzenia obcych genów do genomu pisklęcia, co umożl...

Tyłomózgowie stanowi kluczowy węzeł przekaźnikowy układu nerwowego, komunikując się między centralnym i obwodowym układem nerwowym za pośrednictwem rosnących i opadających sieci neuronowych. Reguluje podstawowe funkcje, w tym oddychanie, świadomość, słuch i koordynację ruchową 1-3. We wczesnym rozwoju embrionalnym tyłomózgowie kręgowców jest przejściowo podzielone wzdłuż osi przednio-tylnej (AP) na powtarzające się rombomery, w których tworzą się odrębne typy komórek neuronalnych i generują wiele centrów jąder pnia mózgu 4. Tyłomózgowie jest również podzielone wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej (DV) na płytkę podstawną i alarową, na której wyodrębniają się dyskretne neuronalne komórki progenitorowe i różnicują się w różnych lokalizacjach DV 3,5,6. W dużej mierze nie wiadomo, w jaki sposób wczesne wzorce neuronalne specyficzne dla AP i DV rządzą ustanawianiem funkcjonalnych obwodów pnia mózgu.
Aby zdobyć wiedzę na temat tego fundamentalnego pytania, potrzebne są narzędzia do oznaczania konkretnych podzbiorów neuronów we wczesnym tyłomózgowiu oraz śledzenia ich trajektorii aksonalnych i połączeń w bardziej zaawansowanych stadiach. Wcześniej wykorzystaliśmy specyficzne elementy wzmacniające oraz system ekspresji warunkowej oparty na Cre / LoxP do śledzenia trajektorii aksonalnej grzbietowych interneuronów rdzeniowych we wczesnym zarodku piskląt 7-9. W obecnym manuskrypcie skupiliśmy się na tyłomózgowiu i ulepszyliśmy eksperymentalny paradygmat znakowania późnoembrionalnych interneuronów tyłomózgowia, aksonów i ich celów synaptycznych, używając zmodyfikowanej strategii elektroporacji i transpozycji DNA za pośrednictwem PiggyBac. Nasza nowa strategia pozwala na znakowanie odrębnych podtypów neuronów po jednej stronie tyłomózgowia i śledzenie ich projekcji aksonalnych i miejsc synaptycznych na różnych etapach embrionalnych, od 2 do 12 dni po elektroporacji. Opierając się na tej metodzie, oznaczyliśmy najbardziej grzbietową podgrupę interneuronów tyłomózgowia (komórki dA1 / Atoh1 +) i ujawniliśmy dwa kontralateralne wznoszące się wzorce projekcji aksonalnej, z których każdy pochodzi z innej lokalizacji AP i wydłuża się w odrębnym funiculus. Stwierdzono, że aksony dA1 wystają i tworzą synapsy w jądrach słuchowych, śródmózgowiu i w wielu warstwach móżdżku 10.
Połączenie elektroporacji piskląt, genetycznego śledzenia neuronów i analizy miejsc projekcji na bardzo zaawansowanych etapach rozwoju stanowi unikalną platformę do badania powstawania sieci neuronowych w mózgu i wyjaśnienia mechanizmów molekularnych, które rządzą powstawaniem obwodów.

<table><tbody><tr><td>Złote Genetrody w kształcie litery L Elektrody 3 mm</td><td>BTX, Generator impulsów Harvard Apparatus</td><td>45-0162</td><td></td></tr><tr><td>, ECM 830</td><td>BTX, Aparat Harvarda</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>OCT (Optymalna temperatura cięcia)</td><td>Tissue-Tek Sakura</td><td>4583 O.C.T. Compound</td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>od dowolnego komercyjnego dostawcy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

elektroporacja tyłomózgowia w celu śledzenia trajektorii aksonów i celów synaptycznych w zarodku pisklęcia

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Elektroporacja embrionalnej cewy nerwowej piskląt ma wiele zalet, takich jak szybkość i skuteczność ekspresji obcych genów w komórkach neuronalnych. W tym manuskrypcie przedstawiamy metodę, która w unikalny sposób pokazuje, jak elektrorazować DNA do ptasiego tyłomózgowia w E2.75 w celu specyficznego oznakowania podzbioru neuronalnych komórek progenitorowych oraz jak śledzić ich projekcje aksonalne i cele synaptyczne w znacznie zaawansowanych stadiach rozwoju, aż do E14.5. Wykorzystaliśmy nowatorskie narzędzia genetyczne, w tym specyficzne elementy wzmacniające, plazmidy na bazie Cre / Lox i system transpozycji DNA za pośrednictwem PiggyBac, aby napędzać ekspresję GFP w podtypie komórek tyłomózgowia (najbardziej grzbietowa podgrupa interneuronów, dA1). Trajektorie aksonów i cele aksonów dA1 są śledzone we wczesnych i późnych stadiach embrionalnych w różnych regionach pnia mózgu. Strategia ta przyczynia się do zaawansowanych technik celowania w komórki będące przedmiotem zainteresowania w embrionalnym tyłomózgowiu oraz śledzenia tworzenia się obwodów na wielu etapach rozwoju.

Niniejszy protokół został niedawno zastosowany w celu odkrycia wzorców aksonalnych i miejsc projekcji podgrupy neuronów dA1 w tylnym mózgowiu kurczaka 10. Aby specyficznie oznakować te aksony, potwierdzono, że element wzmacniający (Atoh1), który wcześniej opisano jako specyficzny dla neuronów dI1 rdzenia kręgowego 8,12,13, jest wyrażany w komórkach dA1 tylnego mózgowia 10. Element ten sklonowano powyżej rekombinazy Cre, a następnie w dniu E2.75 przeprowadzono ko-elektroporację wraz z zale...

Jak sieci neuronowe są tworzone w embrionalnym mózgu, jest fundamentalnym pytaniem w neurobiologii rozwojowej. Połączyliśmy technikę elektroporacji z nowatorskimi narzędziami genetycznymi, takimi jak plazmidy Cre/Lox i system transpozycji DNA za pośrednictwem PiggyBac w tyłomózgowiu ptaków, aby oznaczyć interneurony grzbietowe i śledzić ich projekcje aksonalne i cele synaptyczne na różnych etapach rozwoju.

Elektroporacja tyłomózgowia w celu śledzenia trajektorii aksonów i celów synaptycznych w zarodku pisklęcia

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Ogólnym celem tej procedury jest oznaczenie określonych podzbiorów neuronów w tylnym mózgu pisklącia oraz prześledzenie ich trajektorii aksonalnych i celów. Osiąga się to poprzez otwarcie najpierw małego owalnego okienka w środku dnia embrionalnego.2.75. Kolejne plazmidy DNA z komórki jajowej są wstrzykiwane do światła tylnej części mózgu.Następnie tylna część mózgu jest jednostronnie elektroporowana, aby umożliwić ekspresję konstruktów w pożądanej grupie neuronalnej i inkubację jaj. Na koniec pień mózgu jest wycinany z całego zarodka w celu przygotowania płaskiego montażu lub przekroju tkanki. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują projekcje aksonalne i cele synaptyczne w tylnej, mózgowiu i móżdżku na różnych etapach rozwoju poprzez barwienie immunofluorescencyjne i analizę mikroskopową.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii rozwojowej, takie jak to, w jaki sposób określone komórki neuronalne projektują swoje aksony i tworzą połączenia synaptyczne podczas rozwoju embrionalnego. Aby przygotować się do elektroporacji, inkubuj je w temperaturze od 37 do 38 i pół stopnia Celsjusza przez 65 do 70 godzin, aż osiągną stan od 16 do 17. Podczas inkubacji jaj szklane kapilary ciągnące łączą wygięte złote elektrody w kształcie litery L z uchwytem adaptera do narratora impulsów.Ustaw parametry elektroporacji na 25 woltów, pięć liczb impulsów, długość impulsu 45 milisekund i 300 interwałów impulsów. Przygotuj pipetę do ust, 10-mililitrową igłę strzykawki, paski paraformowe, miękką szczoteczkę, ostre nożyczki do preparowania i 25 mililitrów sterylnego PBS. Przygotuj odpowiednią mieszaninę plazmidów DNA i dodaj szybki zielony barwnik, aby uwidocznić wstrzyknięte DNA.Gdy jaja osiągną właściwy etap rozwoju, wyjmij je z inkubatora i trzymaj w pozycji poziomej. Użyj 70% etanolu do czyszczenia skorupek jaj. Dotykaj jednego jaja na raz, aby zminimalizować narażenie zarodka.Czas przewietrzyć czubkami nożyczek. Zrób otwór w słupku jajka i za pomocą strzykawki usuń od trzech do czterech mililitrów albuminy. Za pomocą nożyczek preparacyjnych otwórz małe owalne okienko na górnym poziomym biegunie skorupki jajka.Podczas całego procesu wlej kilka kropli PBS na wierzch zarodka, aby zapobiec wysuszeniu. Za pomocą pipety doustnej załaduj niewielką ilość mieszaniny DNA do szklanej kapilary. Następnie umieść zarodek tak, aby jego tylny koniec był widokiem pośrednim.Następnie, trzymając naczynia włosowate pod kątem około 45 stopni, przeniknij do rozpieszczonej tylnej części mózgu. Nie usuwaj żadnej błony z okolic zarodka bez tworzenia pęcherzyków powietrza. Ostrożnie wydychać, aby wstrzyknąć roztwór DNA do światła tylnej części mózgu.Roztwór rozprzestrzeni się do przodu natychmiast po wstrzyknięciu DNA. Umieść równoległe elektrody w precyzyjnych docelowych pozycjach tylnej części mózgu AP i DV. Nie dotykając serca, lekko popchnij elektrody brzusznie i pulsuj elektro.Elektrody należy przykryć bąbelkami, aby wskazać przewodność elektryczną, ostrożnie usunąć elektrody i wlać kilka kropli PBS, aby schłodzić zarodek i usunąć pęcherzyki. Użyj paska perfilowego, aby prawidłowo uszczelnić otwór jaja, aby zapobiec wysuszeniu podczas inkubacji, za pomocą miękkiej szczoteczki, a PBS umyj elektrody, umieść jajo w inkubatorze na żądany czas. Przeżywalność zarodków wynosi około 90%dwa do trzech dni po elektroporacji i zmniejsza się do 50%12 dni po elektroporacji.Aby przygotować tylną część mózgu do montażu na płasko, ostrożnie wypreparuj zarodek, oddzielając go od otaczających błon i naczyń krwionośnych. Umieść zarodek na małej pokrytej silikonem szalce Petriego zawierającej PBS, tak aby zarodek był skierowany grzbietowo. Użyj wolframowych kołków, aby przymocować go do naczynia.Następnie za pomocą ostrej szklanej kapilary. Zrób szczelinę grzbietową w tylnej płycie dachowej mózgu za pomocą ostrej pęsety i mikronożyczek. Przytrzymaj górną część głowy i bardzo ostrożnie pociągnij tylną tkankę mózgową od rostralu do ddadle.Po oddzieleniu tylnej części mózgu usuń pozostałe tkanki brzuszne. Inkubuj tylną część mózgu w 4% roztworze aldehydu paraform lub PFA przez jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej. Następnie umyj go PBT, aby usunąć PFA.Po wykonaniu preparatu immunofluorescencyjnego opisanego w protokole tekstowym, należy umieścić tylną część mózgu skierowaną grzbietowo na szkiełku podstawowym. Dodaj fluorescencyjną pożywkę montażową na tylną część mózgu i użyj szklanych naczyń włosowatych lub igieł wolframowych, aby spłaszczyć tylną część mózgu na szkiełku. Dodaj niewielką ilość tłuszczu w każdym rogu, aby zapobiec ściskaniu chusteczki przez szkiełko nakrywkowe.Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na tylnej części mózgu, unikając pęcherzyków powietrza w celu przylegania. Dodaj lakier do paznokci na krawędziach szkła nakrywkowego. Kriowycinki pnia mózgu mogą być wykonywane na każdym etapie rozwoju, ale po E 6,5.Powinny być preferowaną metodą ze względu na trudność w wizualizacji aksonów w płasko zamontowanym zarodku, który staje się bardzo gruby. Co więcej, wykazanie synapsy wymaga przekroju tkanki i obejrzenia jej w dużym powiększeniu pod mikroskopem. Aby przygotować próbkę do kriosekcji, należy wypreparować zarodek i usunąć wszystkie tkanki otaczające mózg.Spłucz PBS. Następnie za pomocą mikronożyczek i ostrej pęsety przeciąć zarodek w obszarze rozpieszczonym rdzenia. Wykonaj szerokie nacięcie między móżdżkiem a śródmózgowiem i usuń cały pień mózgu.Tkanka powinna zawierać rdzeń mostu i móżdżek em. W poniższym przykładzie element wzmacniający, który ulega ekspresji w DA jednej podgrupie neuronów inter neuronów w tylnym mózgu, został sklonowany przed rekombinazą Cree i poddany elektropostacji z cytoplazmatycznym plazmidem reporterowym GFP zależnym od Cree. Przygotowanie do montażu płaskiego na etapie E 4.5 ujawnia dwa kontralateralne wznoszące się wzorce projekcji aksonalnej w celu zmapowania projekcji aksonalnych neuronów DA one na późniejszych etapach rozwoju.Bezwarunkowa kaseta reporterska GFP przed konkonem została sklonowana między dwoma ramionami typu piggyback, wraz z wzmacniaczem A TOH one creen i wektorem transpozycji. Korzystając z tej strategii, elektroporowany warunkowy MG FP C jest integrowany z chromosomami piskląt, w wyniku czego kaseta zatrzymania jest usuwana tylko w neuronach D, umożliwiając przedłużoną ekspresję GFP. W DA jedna komórka.Mezylowana forma GFP wiąże go z błoną w taki sposób, że jest zlokalizowany wzdłuż błony aksonalnej, a nie rozcieńczany w cytoplazmie. W pniach mózgowych zebrane w E 13,5 i analizowane w przekrojach strzałkowych. Stwierdzono, że aksony DA one gromadzą się w móżdżku i rozciągają się w kierunku zewnętrznej warstwy ziarnistej lub EGL, która jest oznaczona przez komórki dodatnie ZI one.Przeanalizowano również cele synaptyczne aksonów D one w móżdżku. Zarodki E 2,75 poddano elektroporacji białkiem pęcherzyków synaptycznych dwoma plazmidami reporterowymi, wraz ze wzmacniaczem H one Cree i transpozycjami na barana. Metoda ta umożliwia ekspresję reportera GFP w presynaptycznym DA na jednym końcu aksonalnym.Móżdżek został podzielony na E 13,5 i zabarwiony ogólnym markerem presynaptycznym tamanem, a także kalbindyną, która oznacza warstwę bikini. Widok przekroju w dużym powiększeniu pokazuje SV dwa pęcherzyki synaptyczne GFP dodatnie w wielu obszarach móżdżku, w tym w warstwie bikini. Wynik ten ujawnia połączenia synaptyczne DA jednego tylnego mózgu w neuronach międzyneuronowych w móżdżku.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić elektrooperację DNA w ptasim Heinie w drugim dniu embrionalnym w punkcie 75 embrionalnego, aby specyficznie oznaczyć podzbiór komórek neuronalnych. Procedura ta umożliwia śledzenie projekcji aksonalnych i połączeń synaptycznych znakowanych komórek neuronalnych na wielu etapach rozwoju.

electroporation-hindbrain-to-trace-axonal-trajectories-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Elektroporacja płata tylnego mózgu w celu prześledzenia ścieżek aksonowych i docelowych synaps u zarodków kurczaka

Elektroporacja in ovo zarodka kurczaka jest techniką pozwalającą na manipulacje genetyczne w embrionie ptaka. Typowe zastosowania tej metody obejmują analizę funkcjonalną genów oraz domniemanych elementów wzmacniających. Niniejszy film prezentuje elektroporację cewy nerwowej w embrionach kurczaka w stadium HH 10. Omówiono technikę iniekcji oraz prawidłową obsługę jaj.

Elektroporacja in ovo embrionów kurzych w stadium 10 według HH

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób wizualizacji szlaków aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w embrionalnym rdzeniu kręgowym kurczaka, z wykorzystaniem elektroporacji in ovo genów reporterowych pod kontrolą specyficznych elementów enhancera.

Rozszyfrowanie dróg aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w cewie nerwowej kurczaka z wykorzystaniem elektroporacji in ovo

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

W celu oceny funkcji i regulacji genów podczas rozwoju dopaminergicznych neuronów śródmózgowia opisujemy metodę obejmującą elektroporację in ovo konstruktów plazmidowego DNA do embrionalnych progenitorów dopaminergicznych neuronów brzusznej części śródmózgowia kurczaka. Technika ta może być wykorzystana do uzyskania wydajnej ekspresji genów zainteresowania w celu zbadania różnych aspektów rozwoju śródmózgowia i różnicowania neuronów dopaminergicznych.

In ovo elektroporacja śródmózgowia kurczaka w celu badania funkcji genów w rozwoju neuronów dopaminergicznych

Opisano metodę, która pozwala na specyficzne dla typu komórek i możliwe do śledzenia obniżenie ekspresji genów w rurce nerwowej. Wykazujemy, w jaki sposób elektroporacja in ovo plazmidów opartych na mikroRNA, które wywołują kontrolowaną przestrzennie i czasowo interferencję RNA, może być wykorzystana do badania prowadzenia aksonów komisuralnych w rozwijającej się rurce nerwowej.

In ovo elektroporacja plazmidów opartych na miRNA w rozwijającej się rurze neuronalnej i ocena fenotypów poprzez wstrzykiwanie DiI w preparatach typu open-book

Neurony słuchowe pnia mózgu ptaków i ssaków są wyspecjalizowane w szybkim kodowaniu neuronalnym, podstawowym procesie dla normalnych funkcji słuchowych. Neurony te powstają z odrębnych prekursorów embrionalnego tyłomózgowia. Przedstawiamy techniki wykorzystujące elektroporację do ekspresji genów w tyłomózgowiu zarodków kurczaków w celu zbadania funkcji genów podczas rozwoju słuchowego.

In Ovo Elektroporacja w słuchowym pniu mózgu kurczaka

Opisujemy metody fluorescencyjnego znakowania stycznie migrujących komórek za pomocą elektroporacji, oraz obrazowania poklatkowego ruchu oznaczonej komórki w hodowli płaskiej w celu wizualizacji zachowania migrujących komórek w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt.

Wizualizacja migracji komórek stycznych w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Poznaj elektroporację tyłomózgowia pisklęcia w celu śledzenia trajektorii aksonów i celów synaptycznych. Ta metoda umożliwia badaczom analizę rozwoju sieci neuronowych w biologii rozwojowej.

Elektroporacja tyłomózgowia w celu śledzenia trajektorii aksonów i celów synaptycznych w zarodku pisklęcia

Przeglądaj więcej filmów