Elektroporacja tyłomózgowia w celu śledzenia trajektorii aksonów i celów synaptycznych w zarodku pisklęcia

Ogólnym celem tej procedury jest oznaczenie określonych podzbiorów neuronów w tylnym mózgu pisklącia oraz prześledzenie ich trajektorii aksonalnych i celów. Osiąga się to poprzez otwarcie najpierw małego owalnego okienka w środku dnia embrionalnego.2.75. Kolejne plazmidy DNA z komórki jajowej są wstrzykiwane do światła tylnej części mózgu.

Następnie tylna część mózgu jest jednostronnie elektroporowana, aby umożliwić ekspresję konstruktów w pożądanej grupie neuronalnej i inkubację jaj. Na koniec pień mózgu jest wycinany z całego zarodka w celu przygotowania płaskiego montażu lub przekroju tkanki. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują projekcje aksonalne i cele synaptyczne w tylnej, mózgowiu i móżdżku na różnych etapach rozwoju poprzez barwienie immunofluorescencyjne i analizę mikroskopową.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii rozwojowej, takie jak to, w jaki sposób określone komórki neuronalne projektują swoje aksony i tworzą połączenia synaptyczne podczas rozwoju embrionalnego. Aby przygotować się do elektroporacji, inkubuj je w temperaturze od 37 do 38 i pół stopnia Celsjusza przez 65 do 70 godzin, aż osiągną stan od 16 do 17. Podczas inkubacji jaj szklane kapilary ciągnące łączą wygięte złote elektrody w kształcie litery L z uchwytem adaptera do narratora impulsów.

Ustaw parametry elektroporacji na 25 woltów, pięć liczb impulsów, długość impulsu 45 milisekund i 300 interwałów impulsów. Przygotuj pipetę do ust, 10-mililitrową igłę strzykawki, paski paraformowe, miękką szczoteczkę, ostre nożyczki do preparowania i 25 mililitrów sterylnego PBS. Przygotuj odpowiednią mieszaninę plazmidów DNA i dodaj szybki zielony barwnik, aby uwidocznić wstrzyknięte DNA.

Gdy jaja osiągną właściwy etap rozwoju, wyjmij je z inkubatora i trzymaj w pozycji poziomej. Użyj 70% etanolu do czyszczenia skorupek jaj. Dotykaj jednego jaja na raz, aby zminimalizować narażenie zarodka.

Czas przewietrzyć czubkami nożyczek. Zrób otwór w słupku jajka i za pomocą strzykawki usuń od trzech do czterech mililitrów albuminy. Za pomocą nożyczek preparacyjnych otwórz małe owalne okienko na górnym poziomym biegunie skorupki jajka.

Podczas całego procesu wlej kilka kropli PBS na wierzch zarodka, aby zapobiec wysuszeniu. Za pomocą pipety doustnej załaduj niewielką ilość mieszaniny DNA do szklanej kapilary. Następnie umieść zarodek tak, aby jego tylny koniec był widokiem pośrednim.

Następnie, trzymając naczynia włosowate pod kątem około 45 stopni, przeniknij do rozpieszczonej tylnej części mózgu. Nie usuwaj żadnej błony z okolic zarodka bez tworzenia pęcherzyków powietrza. Ostrożnie wydychać, aby wstrzyknąć roztwór DNA do światła tylnej części mózgu.

Roztwór rozprzestrzeni się do przodu natychmiast po wstrzyknięciu DNA. Umieść równoległe elektrody w precyzyjnych docelowych pozycjach tylnej części mózgu AP i DV. Nie dotykając serca, lekko popchnij elektrody brzusznie i pulsuj elektro.

Elektrody należy przykryć bąbelkami, aby wskazać przewodność elektryczną, ostrożnie usunąć elektrody i wlać kilka kropli PBS, aby schłodzić zarodek i usunąć pęcherzyki. Użyj paska perfilowego, aby prawidłowo uszczelnić otwór jaja, aby zapobiec wysuszeniu podczas inkubacji, za pomocą miękkiej szczoteczki, a PBS umyj elektrody, umieść jajo w inkubatorze na żądany czas. Przeżywalność zarodków wynosi około 90%dwa do trzech dni po elektroporacji i zmniejsza się do 50%12 dni po elektroporacji.

Aby przygotować tylną część mózgu do montażu na płasko, ostrożnie wypreparuj zarodek, oddzielając go od otaczających błon i naczyń krwionośnych. Umieść zarodek na małej pokrytej silikonem szalce Petriego zawierającej PBS, tak aby zarodek był skierowany grzbietowo. Użyj wolframowych kołków, aby przymocować go do naczynia.

Następnie za pomocą ostrej szklanej kapilary. Zrób szczelinę grzbietową w tylnej płycie dachowej mózgu za pomocą ostrej pęsety i mikronożyczek. Przytrzymaj górną część głowy i bardzo ostrożnie pociągnij tylną tkankę mózgową od rostralu do ddadle.

Po oddzieleniu tylnej części mózgu usuń pozostałe tkanki brzuszne. Inkubuj tylną część mózgu w 4% roztworze aldehydu paraform lub PFA przez jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej. Następnie umyj go PBT, aby usunąć PFA.

Po wykonaniu preparatu immunofluorescencyjnego opisanego w protokole tekstowym, należy umieścić tylną część mózgu skierowaną grzbietowo na szkiełku podstawowym. Dodaj fluorescencyjną pożywkę montażową na tylną część mózgu i użyj szklanych naczyń włosowatych lub igieł wolframowych, aby spłaszczyć tylną część mózgu na szkiełku. Dodaj niewielką ilość tłuszczu w każdym rogu, aby zapobiec ściskaniu chusteczki przez szkiełko nakrywkowe.

Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na tylnej części mózgu, unikając pęcherzyków powietrza w celu przylegania. Dodaj lakier do paznokci na krawędziach szkła nakrywkowego. Kriowycinki pnia mózgu mogą być wykonywane na każdym etapie rozwoju, ale po E 6,5.

Powinny być preferowaną metodą ze względu na trudność w wizualizacji aksonów w płasko zamontowanym zarodku, który staje się bardzo gruby. Co więcej, wykazanie synapsy wymaga przekroju tkanki i obejrzenia jej w dużym powiększeniu pod mikroskopem. Aby przygotować próbkę do kriosekcji, należy wypreparować zarodek i usunąć wszystkie tkanki otaczające mózg.

Spłucz PBS. Następnie za pomocą mikronożyczek i ostrej pęsety przeciąć zarodek w obszarze rozpieszczonym rdzenia. Wykonaj szerokie nacięcie między móżdżkiem a śródmózgowiem i usuń cały pień mózgu.

Tkanka powinna zawierać rdzeń mostu i móżdżek em. W poniższym przykładzie element wzmacniający, który ulega ekspresji w DA jednej podgrupie neuronów inter neuronów w tylnym mózgu, został sklonowany przed rekombinazą Cree i poddany elektropostacji z cytoplazmatycznym plazmidem reporterowym GFP zależnym od Cree. Przygotowanie do montażu płaskiego na etapie E 4.5 ujawnia dwa kontralateralne wznoszące się wzorce projekcji aksonalnej w celu zmapowania projekcji aksonalnych neuronów DA one na późniejszych etapach rozwoju.

Bezwarunkowa kaseta reporterska GFP przed konkonem została sklonowana między dwoma ramionami typu piggyback, wraz z wzmacniaczem A TOH one creen i wektorem transpozycji. Korzystając z tej strategii, elektroporowany warunkowy MG FP C jest integrowany z chromosomami piskląt, w wyniku czego kaseta zatrzymania jest usuwana tylko w neuronach D, umożliwiając przedłużoną ekspresję GFP. W DA jedna komórka.

Mezylowana forma GFP wiąże go z błoną w taki sposób, że jest zlokalizowany wzdłuż błony aksonalnej, a nie rozcieńczany w cytoplazmie. W pniach mózgowych zebrane w E 13,5 i analizowane w przekrojach strzałkowych. Stwierdzono, że aksony DA one gromadzą się w móżdżku i rozciągają się w kierunku zewnętrznej warstwy ziarnistej lub EGL, która jest oznaczona przez komórki dodatnie ZI one.

Przeanalizowano również cele synaptyczne aksonów D one w móżdżku. Zarodki E 2,75 poddano elektroporacji białkiem pęcherzyków synaptycznych dwoma plazmidami reporterowymi, wraz ze wzmacniaczem H one Cree i transpozycjami na barana. Metoda ta umożliwia ekspresję reportera GFP w presynaptycznym DA na jednym końcu aksonalnym.

Móżdżek został podzielony na E 13,5 i zabarwiony ogólnym markerem presynaptycznym tamanem, a także kalbindyną, która oznacza warstwę bikini. Widok przekroju w dużym powiększeniu pokazuje SV dwa pęcherzyki synaptyczne GFP dodatnie w wielu obszarach móżdżku, w tym w warstwie bikini. Wynik ten ujawnia połączenia synaptyczne DA jednego tylnego mózgu w neuronach międzyneuronowych w móżdżku.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić elektrooperację DNA w ptasim Heinie w drugim dniu embrionalnym w punkcie 75 embrionalnego, aby specyficznie oznaczyć podzbiór komórek neuronalnych. Procedura ta umożliwia śledzenie projekcji aksonalnych i połączeń synaptycznych znakowanych komórek neuronalnych na wielu etapach rozwoju.