Name: Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Poznaj metody wielojednostkowej rejestracji aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy Schistocerca americana. Technika ta pozwala badać odpowiedzi na bodźce zapachowe w układzie nerwowym owadów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować następującym za sfinansowanie tej pracy: hojne fundusze na rozpoczęcie działalności z Wydziału Inżynierii Biomedycznej Uniwersytetu Waszyngtońskiego, grant McDonnell Center for Systems Neuroscience, grant Biura Badań Marynarki Wojennej (Grant#: N000141210089) dla B.R.

1. Przygotowanie i dostarczanie zapachu
<ol>
 <li>Rozcieńczyć objętościowo roztwory zapachowe w oleju mineralnym, aby osiągnąć pożądany poziom stężenia. Przechowuj 20 ml mieszaniny oleju mineralnego i środka zapachowego w szklanej butelce o pojemności 60 ml. Włożyć dwie igły strzykawki do gumowego korka (rys. 19), jedną od dołu, a drugą od góry, aby zapewnić przewód wlotowy i wylotowy. Uszczelnij szklaną butelkę tym gumowym korkiem i przymocuj specjalnie zaprojektowany filtr z węglem aktywnym do przewodu dolotowego (Rysunek 1A).</li>
 <li>Filtr węglowy wykonany jest za pomocą dwóch strzykawek o pojemności 6 ml. Przeciąć strzykawki na pół i wyrzucić koniec tłoka. Wypełnij każdy z pozostałych kawałków bawełną i węglem aktywnym przed połączeniem ich ze sobą za pomocą rurki termokurczliwej.</li>
 <li>Podłącz przewód wylotowy butelki na zapach (za pomocą rurki polietylenowej, średnica wewnętrzna 0.86 mm) do plastikowej rurki (rurka Nalgene FEP, średnica wewnętrzna 5.8 mm), która zapewnia stały przepływ powietrza przez antenę (rysunek 1B).</li>
 <li>Powietrze przefiltrowane przez węgiel, osuszone (gaz nośny; natężenie przepływu, 0,75 l/min) kieruje w stronę szarańczy za pomocą plastikowej rurki umieszczonej w odległości kilku cm od anteny szarańczy.</li>
 <li>W celu stymulacji zapachu należy przesunąć stałą objętość (0,1 l/min) statycznej przestrzeni nad roztworem zapachowym w butelce. Osiąga się to poprzez wstrzyknięcie równej ilości osuszonego powietrza do butelki za pomocą pompy Pico (WPI, PV-820). Opary z butelki na zapach są kierowane przez przewód wylotowy na rurkę przepływu powietrza (rysunek 1B).</li>
 <li>Usuń dostarczone opary zapachowe, umieszczając lejek próżniowy ~10 cm za anteną szarańczy.</li>
</ol>
2. Przygotowanie anteny szarańczy do pojedynczego nagrania Sensillum
<ol>
 <li>Wybierz młodą dorosłą szarańczę dowolnej płci z w pełni rozwiniętymi skrzydłami, ale przed etapem krycia z zatłoczonej kolonii. Aby powstrzymać szarańczę, najpierw amputuj jej nogi. Uszczelnij miejsca amputacji za pomocą kleju tkankowego (Vetbond, 3M). Przymocuj szarańczę do specjalnie zaprojektowanej komory za pomocą małego kawałka taśmy izolacyjnej owiniętej wokół jego klatki piersiowej (ryc. 2A).</li>
 <li>Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj płytki rowek w woskowej platformie (Rysunek 2A) w celu umieszczenia anteny. Umieść antenę w rowku i ustabilizuj ją za pomocą wosku batiku na dwóch końcach anteny (Rysunek 2B; do topienia wosku używana jest elektrowoskownica).</li>
 <li>Włóż elektrodę uziemiającą (drut chlorkowanego srebra) do klatki piersiowej (~1 cm od głowy). Użyj wosku batikowego, aby zarówno uszczelnić miejsce nacięcia, jak i przytrzymać przewód uziemiający na miejscu (Rysunek 2A).</li>
</ol>
3. Pojedynczy zapis sensillum do monitorowania reakcji wywołanych zapachem z neuronów receptorów węchowych (ORNs)
<ol>
 <li>Umieść ustabilizowaną antenę szarańczy pod mikroskopem stereoskopowym (Leica M205C) na stole do izolacji drgań (TMC) (Rysunek 3A). Upewnij się, że podstawa czujnika nagrywania jest wyraźnie widoczna (Rysunek 3B).</li>
 <li>Za pomocą ściągacza do mikropipet (Sutter P-1000) można wykonać szklane elektrody (impedancja 3-10 MΩ po napełnieniu solą świętojańską9, średnica końcówki 1-3 μm) za pomocą rurki kapilarnej ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1,2 mm, średnica wewnętrzna 0,69 mm).</li>
 <li>Umieść szklaną elektrodę w uchwycie na mikropipety, który jest przymocowany do zmotoryzowanego mikromanipulatora (Sutter MP-285). Delikatnie włóż elektrodę do podstawy czujnika (Rysunek 3B). Należy pamiętać, że każde sensillum może zawierać od 3 do 50 ORN w szarańczy10.</li>
 <li>Wzmocnij sygnał (10 000 razy) za pomocą wzmacniacza prądu przemiennego (Grass P-55). Filtruj sygnał w zakresie od 0,3 do 10,0 kHz i pobieraj go z częstotliwością próbkowania 15 kHz (rysunek 3D) za pomocą systemu akwizycji danych (LabView, karty DAQ PCI-MIO-16E-4; Instrumenty Krajowe).</li>
</ol>
4. Procedura preparowania szarańczy dla nagrań płatów antenowych i ciał grzybów
<ol>
 <li>Postępować zgodnie z procedurami krępowania opisanymi w sekcji 2.1. Umieść szarańczę w specjalnie zaprojektowanej komorze, jak pokazano na rysunkach 4A i B.</li>
 <li>Aby perfaktorować sól fizjologiczną podczas i po zabiegu sekcji, zbuduj woskowy kubek wokół głowy szarańczy. Miseczka woskowa powinna zaczynać się tuż nad częściami gębowymi i wychodzić poza oczy złożone, obejmując obszar między dwiema czułkami, jak pokazano na rysunku 4C.</li>
 <li>Aby umożliwić antenom przejście przez miskę na wosk, utwórz małe tunele po obu stronach za pomocą plastikowej (polietylenowej) rurki (o długości 5 mm, średnica wewnętrzna 0,86 mm). Upewnij się, że plastikowa rurka może przesunąć się przez pojemnik na wosk. To ostatnie osiąga się za pomocą gumowej uszczelki, która szczelnie owija się wokół plastikowej rurki, ale jest przymocowana do pojemnika na wosk (Rysunek 4C).</li>
 <li>Za pomocą żywicy epoksydowej przymocuj podstawę anten do dolnego końca plastikowej rurki. Ten krok zapewnia, że czułki są utrzymywane na miejscu nawet po usunięciu otaczającego naskórka.</li>
 <li>Od tego momentu utrzymuj pojemnik na wosk wypełniony roztworem solifizjologicznej 9. Zacznij od usunięcia środkowego prostokątnego obszaru między dwiema czułkami (dłuższy bok prostokąta wyrównany z osią przednio-tylną). Następnie usuń naskórek w sąsiednich regionach, nie naruszając oczu złożonych i naskórka u podstawy anteny (ryc. 4D).</li>
 <li>Za pomocą cienkich kleszczy delikatnie usuń worki powietrzne i ciała tłuszczowe otaczające mózg. Na końcu tego kroku mózg szarańczy powinien być wyraźnie widoczny (ryc. 4D). Zauważ, że obszary mózgu, które przetwarzają informacje węchowe (o jasnożółtej pigmentacji), znajdują się między dwiema czułkami.</li>
 <li>U szarańczy jelito biegnie poniżej mózgu i wzdłuż ciała. Aby ruch jelit nie mógł zdestabilizować preparatu, delikatnie pociągnij za jelito przednie i przetnij je cienkimi nożyczkami. Wykonaj małe nacięcie w jamie brzusznej tuż nad odbytnicą i usuń jelito, ciągnąc tylne jelito grubymi kleszczami. Aby zapobiec wyciekowi soli fizjologicznej, przywiąż brzuch bezpośrednio do przodu miejsca nacięcia za pomocą nici do szwów.</li>
 <li>Użyj małej platformy wykonanej z cienkiego drutu pokrytego cienką warstwą wosku, aby podnieść mózg i ustabilizować go11 podczas elektrofizjologii, jak pokazano na rysunku 4D.</li>
 <li>Mózg owada jest pokryty cienką osłoną izolacyjną, którą należy zdjąć przed eksperymentami. Aby usunąć mózg, delikatnie rozprowadź niewielką ilość enzymu (0,3-0,4 mg proteazy, Sigma Aldrich) na powierzchni mózgu za pomocą cienkich kleszczy9. Po ~5-10 s aplikacji enzymu dokładnie spłucz mózg solą fizjologiczną. Za pomocą bardzo cienkich kleszczyków bardzo delikatnie ściśnij i pociągnij osłonę do góry, a następnie rozerwij ją nad miejscami nagrywania (AL i MB; pokazane na rysunku 4E, F).</li>
</ol>
5. Nagrania wielojednostkowe z płata anteny i korpusu grzyba
<ol>
 <li>Preparat z szarańczy (ryc. 5A) umieścić pod mikroskopem stereoskopowym zawieszonym na stojaku na wysięgniku umieszczonym na stole do izolacji drgań.</li>
 <li>Utrzymuj stałą szybkość perfuzji soli fizjologicznej (około 0,04 l / h) przez cały czas trwania eksperymentu. Użyj chlorkowanego drutu srebrnego zanurzonego w woskowym kubku wypełnionym solą fizjologiczną jako elektrody uziemiającej.</li>
 <li>Do zapisów PN należy użyć 16-kanałowej sondy krzemowej (NeuroNexus Technologies, pozycja #A2x2-tet-3mm-150-150-121-A16, rysunek 5B). Przed każdym eksperymentem należy galwanizować elektrody złotem, aby uzyskać impedancje w zakresie 200-300 kΩ. Użyj obwodu pokazanego na rysunku 7 do galwanizacji.</li>
 <li>Umieść elektrodę blisko powierzchni płata anteny i delikatnie wprowadź ją do tkanki za pomocą ręcznego mikromanipulatora (WPI, M3301R) (Rysunek 5D).</li>
 <li>Przesuwaj elektrodę w krokach co ~10 μm. Odczekaj 2-3 minuty na każdym kroku i oceń jakość uzyskanego sygnału. W idealnym miejscu nagrywania sygnały zewnątrzkomórkowe będą odbierane przez wiele kanałów nagrywania i będą miały wysoki stosunek sygnału do szumu (SNR, > 3-5 razy więcej niż szumy SD).</li>
 <li>Do nagrań KC należy użyć wykonanej na zamówienie tetrody ze skręconego drutu (Rysunek 5C; procedura wytwarzania krok po kroku przedstawiona w rozdziale 6). Galwanizować te elektrody, jak omówiono w kroku 5.3. Umieść tetrodę na powierzchni MB (Rysunek 5E), ponieważ somaty KC są ograniczone do powierzchownej warstwy MB8.</li>
 <li>Zarówno zapisy PN, jak i KC mogą być wykonywane jednocześnie z tego samego preparatu szarańczy, jak schematycznie pokazano na rysunku 5A.</li>
 <li>Odczekaj co najmniej 15 minut po znalezieniu miejsca nagrywania, aby umożliwić stabilizację elektrod.</li>
 <li>Odbieraj wszystkie sygnały zewnątrzkomórkowe o częstotliwości 15 kHz, filtruj w zakresie 0,3-6 kHz i wzmacniaj (10 000 razy) za pomocą 16-kanałowego wzmacniacza AC (Biology Electronics Shop; Caltech, Pasadena, Kalifornia) (Rysunek 6A, B).</li>
</ol>
6. Procedury tworzenia elektrody skręcanej do nagrań KC
<ol>
 <li>Aby zaprojektować elektrodę wielojednostkową do nagrań KC, należy użyć izolowanego drutu niklowo-chromowego (RO800, żarnik 0,0005")8.</li>
 <li>Jeśli pożądanych jest osiem elektrod, owiń drut wokół kawałka tektury o długości 10-15 cm 4 razy. Końce kartonu można przykryć plastikową rurką, aby zapobiec przecinaniu drutu przez krawędzie. Podczas owijania upewnij się, że jest mały luz, ale upewnij się, że drut nie jest napięty. Z drutem należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ łatwo się łamie.</li>
 <li>Zwiąż druty razem na górze kartonu i użyj kawałka taśmy (Time Tape, T-534-RP), aby utrzymać je razem. Odetnij pasma na drugim końcu. Usuń pasma drutu i zgrupuj druty na odciętym końcu, również za pomocą innego kawałka taśmy.</li>
 <li>Za pomocą wytrząsarki do płytki mianowej (Thermo Scientific, model 4625Q) nawiń pasma razem (~72 obr/min przez 3 min), aby utworzyć jeden skręcony drut. Dolną część przyklejonych pasm można przypiąć do wirnika płytki mianownika, a górną część można przypiąć do stojaka wysięgnika. Podczas nawijania drut powinien mieć niewielki luz, ale nie być napięty.</li>
 <li>Stopić izolację razem z opalarką (Weller 6966C), aby skleić poszczególne pasma ze sobą i utworzyć pojedynczy drut. 3-4 powolne przejścia (3-4 sekundy każde) na całej długości drutu powinny wystarczyć do podgrzania i stopienia pasm ze sobą. Następnie zwolnij drut od dołu i pozwól mu się rozluźnić. Przytnij drut w pobliżu końców, aby usunąć taśmę.</li>
 <li>Przełóż jeden koniec drutu przez szklaną rurkę kapilarną o długości 5-6 cm (średnica zewnętrzna 1.0 mm, średnica wewnętrzna 0.58 mm). Rozerwij skręcony drut na jednym końcu za pomocą cienkiej pęsety i usuń powłokę, bardzo krótko podpalając koniec płomieniem. Ten krok należy wykonać ostrożnie; Zbyt długie wystawienie drutu na działanie płomienia spowoduje stopienie i splątanie pasm.</li>
 <li>Delikatnie oddziel 8 pasm na płomieniowanym końcu i każde pasmo osobno do 8-pinowego gniazda IC. Pokryj górną część gniazda IC żywicą epoksydową, aby utrzymać pasma i szklaną kapilarnę na miejscu. Umieść również niewielką kroplę żywicy epoksydowej na drugim końcu kapilary, aby utrzymać drut na miejscu (Rysunek 5C).</li>
 <li>Na koniec przeciąć końcówkę drutu pod kątem 45 stopni nożyczkami z węglików spiekanych około 0,5 cm od końcówki kapilarnej.</li>
</ol>

<ol><li>Ache, B. W., Young, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfaction%3A+diverse+species%2C+conserved+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Olfaction: diverse species, conserved principles.</a> Neuron. 48, 417-430 (2005).</li>
<li>Laurent, G., Wehr, M., Davidowitz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+representations+of+odors+in+an+olfactory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal representations of odors in an olfactory network.</a> Journal of Neuroscience. 16, 3837-3847 (1996).</li>
<li>Stopfer, M., Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+identity+vs.+intensity+coding+in+an+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odor identity vs. intensity coding in an olfactory system.</a> Neuron. 39, 991-1004 (2003).</li>
<li>Steven de Belle, J., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+odor+learning+in+Drosophila+abolished+by+chemical+ablation+of+mushroom+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies.</a> Science. 263, 692-695 (1994).</li>
<li>Cassenaer, S., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+modulation+of+spike-timing-dependent+plasticity+for+olfactory+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conditional modulation of spike-timing-dependent plasticity for olfactory learning.</a> Nature. 482, 47-52 (2012).</li>
<li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125, 143-160 (2006).</li>
<li>Raman, B., Joseph, J., Tang, J., Stopfer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+diverse+firing+patterns+in+olfactory+receptor+neurons+underlie+spatiotemporal+neural+codes+for+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporally diverse firing patterns in olfactory receptor neurons underlie spatiotemporal neural codes for odors.</a> Journal of Neuroscience. 30, 1994-2006 (2010).</li>
<li>Perez-Orive, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillations+and+sparsening+of+odor+representations+in+the+mushroom+body%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oscillations and sparsening of odor representations in the mushroom body.</a> Science. 297, 359-365 (2002).</li>
<li>Naraghi, M., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-induced+oscillations+in+the+mushroom+bodies+of+the+locust%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Odorant-induced oscillations in the mushroom bodies of the locust.</a> The Journal of Neuroscience. 14, 2993-3004 (1994).</li>
<li>Ochieng, S. A., Hallberg, E., Hansson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+structure+and+distribution+of+antennal+sensilla+of+the+desert+locust%2C+Schistocerca+gregaria+%28Orthoptera%3A+Acrididae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Fine structure and distribution of antennal sensilla of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae).</a> Cell and Tissue Research. 291, 525-536 (1998).</li>
<li>Burrows, M., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Potentials+in+the+Central+Terminals+of+Locust+Proprioceptive+Afferents+Generated+by+Other+Afferents+from+the+Same+Sense+Organ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic Potentials in the Central Terminals of Locust Proprioceptive Afferents Generated by Other Afferents from the Same Sense Organ.</a> Journal of Neuroscience. 13, 808-819 (1993).</li>
<li>Pouzat, C., Mazor, O., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+noise+signature+to+optimize+spike-sorting+and+to+assess+neuronal+classification+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Using noise signature to optimize spike-sorting and to assess neuronal classification quality.</a> Journal of Neuroscience Methods. 122, 43-57 (2002).</li>
<li>Mazor, O., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+dynamics+versus+fixed+points+in+odor+representations+by+locust+antennal+lobe+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transient dynamics versus fixed points in odor representations by locust antennal lobe projection neurons.</a> Neuron. 48, 661-673 (2005).</li>
<li>Christensen, T. A., Pawlowski, V. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-unit+recordings+reveal+context+dependent+modulation+of+synchrony+in+odor-specific+neural+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Multi-unit recordings reveal context dependent modulation of synchrony in odor-specific neural ensembles.</a> Nature Neuroscience. 3, 927-931 (2000).</li>
<li>Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Sensillum+Recordings+in+the+Insects+Drosophila+melanogaster+and+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae.</a> J. Vis. Exp. (36), e1725(2010).</li>
<li>Geffen, M. N., Broome, B. M., Laurent, G., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Encoding+of+Rapidly+Fluctuating+Odors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural Encoding of Rapidly Fluctuating Odors.</a> Neuron. 61, 570-586 (2009).</li>
<li>Ito, I., Ong, R. C., Raman, B., Stopfer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sparse+odor+representation+and+olfactory+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sparse odor representation and olfactory learning.</a> Nature Neuroscience. 11, 1177-1184 (2008).</li>
<li>Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+network+dynamics+and+the+coding+of+multidimensional+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Olfactory network dynamics and the coding of multidimensional signals.</a> Nature Review Neuroscience. 3, 884-895 (2002).</li>
<li>Brown, S. L., Joseph, J., Stopfer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+a+temporally+structured+stimulus+with+a+temporally+structured+neural+representation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Encoding a temporally structured stimulus with a temporally structured neural representation.</a> Nature Neuroscience. 8, 1568-1576 (2005).</li>
<li>MacLeod, K., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mechanism+for+synchronization+and+temporal+patterning+of+odor-encoding+neural+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct mechanism for synchronization and temporal patterning of odor-encoding neural assemblies.</a> Science. 274, 976-979 (1996).</li>
<li>Wehr, M., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+afferent+and+central+temporal+patterns+in+the+locust+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Relationship between afferent and central temporal patterns in the locust olfactory system.</a> The Journal of Neuroscience. 19, 381-390 (1999).</li>
<li>Moreaux, L., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+firing+rates+from+calcium+signals+in+locust+projection+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Estimating firing rates from calcium signals in locust projection neurons in vivo.</a> Frontiers in Neural Circuits. 1, 1-13 (2007).</li>
<li>Galizia, C. G., Joerges, J., Kuttner, A., Faber, T., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-in-vivo+preparation+for+optical+recording+of+the+insect+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A semi-in-vivo preparation for optical recording of the insect brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 76, 61-69 (1997).</li>
<li>Galan, R. F., Sachse, S., Galizia, C. G., Hez, A. V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor-driven+attractor+dynamics+in+the+antennal+lobe+allow+for+simple+and+rapid+olfactory+pattern+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Computation%22%5BJournal%5D)">Odor-driven attractor dynamics in the antennal lobe allow for simple and rapid olfactory pattern classification.</a> Neural Computation. 16, 999-1012 (2004).</li>
<li>Kuebler, L. S., Schubert, M., Karpati, Z., Hansson, B. S., Olsson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antennal+Lobe+Processing+Correlates+to+Moth+Olfactory+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Antennal Lobe Processing Correlates to Moth Olfactory Behavior.</a> Journal of Neuroscience. 32, 5772-5782 (2012).</li>
<li>Silbering, A. F., Bell, R., Galizia, C. G., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Imaging+of+Odor-evoked+Responses+in+the+Drosophila+Antennal+Lobe%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe.</a> J. Vis. Exp. (61), e2976(2012).</li>
<li>Skiri, H. T., Galizia, C. G., Mustaparta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representation+of+Primary+Plant+Odorants+in+the+Antennal+Lobe+of+the+Moth+Heliothis+virescens+Using+Calcium+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Representation of Primary Plant Odorants in the Antennal Lobe of the Moth Heliothis virescens Using Calcium Imaging.</a> Chemical Senses. 29, 253-267 (2004).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Większość bodźców czuciowych wywołuje reakcje kombinatoryczne, które są rozmieszczone w zespołach neuronów. W związku z tym konieczne jest jednoczesne monitorowanie aktywności wielu neuronów, aby zrozumieć, w jaki sposób informacje specyficzne dla bodźca są reprezentowane i przetwarzane przez obwody neuronalne w mózgu. W tym miejscu zademonstrowaliśmy zewnątrzkomórkowe techniki rejestracji wielojednostkowej, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech centrach przetwarzania wzdłuż szlaku węchowego ...

<table><tbody><tr><td colspan="4">Sprzęt do elektrofizjologii</td></tr><tr><td>A.C. wzmacniacz</td><td>GRASS</td><td>Model P55</td><td>do nagrań single sensillum</td></tr><tr><td>Monitor audio (model 3300) </td><td>A-M Systems</td><td>940000</td><td></td></tr><tr><td>Wykonany na zamówienie 16-kanałowy przedwzmacniacz i wzmacniacz</td><td>Cal. Tech. Biologia Elektronika Sklep</td><td></td><td>z nagraniami AL i MB</td></tr><tr><td>Jednostka akwizycji danych</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2090</td><td></td></tr><tr><td>Światłowód WPI</td><td></td><td>SI-72-8</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła 115 V</td><td>WPI</td><td>NOVA</td><td></td></tr><tr><td>Ręczny mikromanipulator</td><td>WPI</td><td>M3301R</td><td>do zapisów mózgu szarańczy</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy1 na stojaku</td><td>Leica</td><td>M80</td><td>do nagrań mózgu szarańczy</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy2</td><td>Leica</td><td>M205C</td><td>do nagrań jednozmysłowych</td></tr><tr><td>Stół wibroizolacyjny</td> Seria <td></td><td>TMC</td><td>63-500</td></tr><tr><td>Mikromanipulator z napędem</td><td>silnikowym Sutter Instruments</td><td>Oscyloskop MP285/T</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tektronix</td><td>TD2014B</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Elektrody/Narzędzia budowlane</td></tr><tr><td>16-kanałowa elektroda</td><td>NeuroNexus</td><td>A2x2-tet-3mm-150-121</td><td>do nagrań krzywkowych antenowych</td></tr><tr><td>Borokrzemianowe rurki kapilarne z żarnikiem, ID 0,69 mm</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td>do wykonywania elektrod szklanych</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Generator funkcyjny</td><td>Multimetr Magazyn</td><td>SG1639A</td><td>do pozłacania elektrod</td></tr><tr><td>Roztwór do złocenia (bez cyjanku) </td><td>SIFCO Industries</td><td>NC SPS 5355</td><td></td></tr><tr><td>Tester impedancji</td><td>BAK Electronics Inc.</td><td>IMP-2</td><td>do elektrod złoconych</td></tr><tr><td>Przełącznik obrotowy</td><td>Elektroprzełącznik</td><td>C7D0123N</td><td>do pozłacania elektrod</td></tr><tr><td>Izolator impulsów</td><td>WPI</td><td>A365</td><td>do elektrod pozłacanych</td></tr><tr><td>Uchwyt elektrody serii Q</td><td>Warner</td><td>Instruments 64-1091</td><td></td></tr><tr><td>Srebrny drut o średnicy 0,010"</td><td>Elektroda</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>uziemiająca AM Systems 7825008-pinowe gniazdo DIP IC</td><td>Digikey</td><td>ED90032-ND</td><td></td></tr><tr><td>borokrzemianowe rurki kapilarne z żarnikiem, ID 0,58 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0787</td><td></td></tr><tr><td>Opalarka</td><td>Weller</td><td>6966C</td><td></td></tr><tr><td>Rediohm-800 drut</td><td>Kanthal Precision Technologies</td><td>PF002005</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka płytkowa Thermo</td><td>Scientific</td><td>4625Q</td><td>druty</td></tr> <tr><td>skręcaneNożyczki z węglików spiekanych, 4,5"</td><td>Biomedical Research Instr</td><td>25-1000</td><td>do cięcia skręconych drutów tetrodowych</td></tr><tr><td>Pęseta z cienkim czubkiem</td><td>HECO</td><td>91-EF5-SA</td><td>do rozdzielania</td></tr><tr> drutów tetrody<td colspan="4">Odor Delivery</td></tr><tr><td>6 ml strzykawka</td><td>Kendall</td><td>1180600777</td><td>do specjalnie zaprojektowanego filtra z węglem aktywnym </td></tr><tr><td>Brązowe butelki zapachowe</td><td>Fisher</td><td>08-912-165</td><td></td></tr><tr><td>Węgiel drzewny</td><td><a href="http://BuyActivatedCharcoal.com" target="_blank">BuyActivatedCharcoal.com</a></td><td>GAC-48C</td><td></td></tr><tr><td>Suszarka adsorpcyjna</td><td></td><td>23005</td><td></td></tr><tr><td>Suszarka do gazów Drierite </td><td>Fischer Scientific</td><td>09-204</td><td></td></tr><tr><td>Rurka termokurczliwa</td><td>3M</td><td>EPS-200</td><td>przygotowanie filtra zapachów</td></tr><tr><td>Aluminiowa piasta igły podskórnej, manometr 19</td><td>Kendall</td><td>8881-200136</td><td>do dostarczania przewodów wlotowych i wylotowych do butelek zapachowych</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>6357-04</td><td>do rozcieńczania zapachów</td></tr><tr><td>Rurka z tworzywa sztucznego Nalgene, 890 FEP</td><td>Thermo Scientific</td><td>8050-0310</td><td>do dostarczania gazu nośnego</td></tr><tr><td>Pneumatyczna pompa pikopump</td><td>WPI</td><td>sys-pv820</td><td>do dostarczania zapachów</td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa ID 0,86 mm</td><td>Intramedic</td><td>427421</td><td>do przyłączy wylotowych butelek zapachowych i rurki do obfitości soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Korki</td><td>Lab Pure</td><td>97041</td><td>do uszczelniania butelek zapachowych</td></tr><tr><td>Taśma czasu</td><td>PDC</td><td>T-534-RP</td><td></td></tr><tr><td>Rurka luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>30600-66</td><td></td></tr><tr><td>Rura próżniowa</td><td>McMaster-Carr</td><td>5488K66</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><mocny>Przygotowanie/Rozwarstwienie</mocny></td></tr><tr><td>100 x 15 mm szalka Petriego</td><td>VWR International</td><td>89000-304</td><td></td></tr><tr><td>18 AWG drut miedziany</td><td>Lapp</td><td>4510013</td><td></td></tr><tr><td>22 AWG linka połączeniowa</td><td>AlphaWire</td><td>1551</td><td>platforma</td></tr><tr><td>mózgowa Wosk batikowy</td><td>Żakard</td><td>7946000</td><td></td></tr><tr><td>Peryferia dentystyczne Wosk</td><td>Henry-Schein Dental</td><td></td><td></td>6652151</tr><tr><td>Electrowaxer</td><td>Almore International</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>Epoksyd, 5 min</td><td>Permatex</td><td>84101</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowa piasta igły podskórnej</td><td>Kendall</td><td>8881-200136</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza z Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td>do usuwania pochwy mózgu szarańczy</td></tr><tr><td>Nić do szwów niesterylna</td><td>Fisher</td><td>NC9087024</td><td>do wiązania brzucha po usunięciu jelit </td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>do uszczelniania miejsc amputacji</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #1 (grube)</td><td>Kleszcze tytanowe WPI</td><td>500335</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 (cienkie)</td><td>WPI</td><td>14096</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do #5SF Dumont (bardzo cienkie)</td><td></td><td>500085</td><td>pochwy do mózgu szarańczy</td></tr><tr><td>10 cm nożyczki preparacyjne</td><td>WPI</td><td>14393</td><td>do usuwania nóg i skrzydeł</td></tr><tr><td>Nożyczki Vannas (cienkie)</td><td>WPI</td><td>500086</td><td>do usuwania naskórka, przecinania jelita</td></tr><tr> przedniego<td colspan="4">Saline Profusion</td></tr><tr><td>Zestaw przedłużający z regulatorem przepływu</td><td>Moore Medical</td><td>69136</td><td>do regulacji przepływu soli</td></tr><tr><td>fizjologicznej Zestaw do podawania IV z miejscem wstrzyknięcia Y</td><td>Moore Medical</td><td>73190</td><td>do regulacji przepływu soli fizjologicznej</td></tr></tbody></table>

wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (schistocerca americana)

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Wykrywanie i interpretacja sygnałów węchowych są kluczowe dla przetrwania wielu organizmów. Co ciekawe, gatunki z różnych typów mają uderzająco podobne systemy węchowe, co sugeruje, że biologiczne podejście do wykrywania chemicznego zostało zoptymalizowane w czasie ewolucji1. W układzie węchowym owadów substancje zapachowe są przenoszone przez neurony receptora węchowego (ORN) w antenie, które przekształcają bodźce chemiczne w ciągi potencjałów czynnościowych. Dane sensoryczne z ORN są następnie przekazywane do płata antenowego (AL; struktura analogiczna do opuszki węchowej kręgowców). W AL neuronalne reprezentacje zapachów przyjmują formę czasoprzestrzennych wzorców wypalania rozmieszczonych w zespołach głównych neuronów (PN; określanych również jako neurony projekcyjne)2,3. Wyjście AL jest następnie przetwarzane przez komórki Kenyona (KC) w dalszym ciele grzyba (MB), strukturze związanej z pamięcią węchową i uczeniem się4,5. W tym miejscu przedstawiamy techniki rejestracji elektrofizjologicznej w celu monitorowania reakcji neuronalnych wywołanych zapachem w tych obwodach węchowych.
Po pierwsze, prezentujemy metodę pojedynczego rejestrowania sensillum do badania reakcji wywołanych zapachem na poziomie populacji ORNs6,7. Omawiamy zastosowanie zaostrzonych szklanych pipet wypełnionych solą fizjologiczną jako elektrod do zewnątrzkomórkowego monitorowania odpowiedzi ORN. Następnie przedstawiamy metodę zewnątrzkomórkowego monitorowania odpowiedzi PN przy użyciu komercyjnej 16-kanałowej elektrody3. Podobne podejście przy użyciu wykonanej na zamówienie 8-kanałowej tetrody ze skrętu drutowego zostało zademonstrowane dla nagrań z ogniw Kenyon8. Podajemy szczegóły naszej eksperymentalnej konfiguracji i przedstawiamy reprezentatywne ślady nagrań dla każdej z tych technik.

Reakcje pojedynczego ORN wywołane zapachami dwóch różnych alkoholi przedstawiono na Rysunku 3D. W zależności od miejsca rejestracji (typ sensilli, umiejscowienie elektrody) możliwe jest uzyskanie rejestracji wielojednostkowych.
Surowy przebieg fali zewnątrzkomórkowej z rejestracji AL przedstawiono na Ryc. 6A. W tym zapisie napięcia można zaobserwować potencjały czynnościowe lub kolce o różnych amplitudach, pochodzące od różnych PN. Chociaż płat antenny szarańc...

Pokazujemy różne warianty techniki wewnątrzkomórkowego zapisu wielojednostkowego, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech etapach szlaku węchowego bezkręgowców. Techniki te można łatwo zaadaptować do badania aktywności zespołu również w innych systemach neuronowych.

Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana)

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Ogólnym celem tej procedury jest zarejestrowanie odwołanej przez zapach wielojednostkowej aktywności neuronalnej z pierwszych trzech centrów przetwarzania sygnałów szlaku węchowego owadów. Osiąga się to poprzez najpierw unieruchomienie szarańczy w specjalnie zaprojektowanej komorze i ustabilizowanie jednej z jej anten do nagrań elektrofizjologicznych. Drugim krokiem jest wyprodukowanie szklanej mikroelektrody i umieszczenie jej u podstawy słońca w celu monitorowania reakcji wywołanych zapachem.Obok rejestruj aktywność neuronalną z mózgu szarańczy. Przeprowadzana jest wieloetapowa procedura preparacji w celu odsłonięcia tkanki nerwowej, która przetwarza dane wejściowe z węchowych neuronów czuciowych. Ostatnim krokiem jest odpowiednie rozmieszczenie układów wieloelektrodowych w celu zarejestrowania zespołowej aktywności neuronalnej z płata szarańczy i anteny oraz korpusu grzyba.Ostatecznie zademonstrowane tutaj metody rejestracji zewnątrzkomórkowej są wykorzystywane do scharakteryzowania reakcji wywołanych zapachem w pierwszych trzech centrach przetwarzania wzdłuż szlaku węchowego owadów. Chociaż metoda ta została wykorzystana do scharakteryzowania reakcji neurologicznej wywołanej zapachem w stosunkowo prostym układzie węchowym bezkręgowców, można ją również dostosować do badania aktywności zespołu w innych układach nerwowych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ niektóre kluczowe aspekty tej procedury, takie jak umieszczenie elektrod i niektóre etapy sekcji, są bardzo trudne do nauczenia.Ponadto metody są w większości jakościowe, a różne laboratoria z biegiem czasu udoskonaliły je w różny sposób. Aby rozpocząć tę procedurę, wybierz młodą dorosłą szarańczę dowolnej płci z w pełni rozwiniętymi skrzydłami, ale przed etapem krycia z zatłoczonej kolonii. Następnie powstrzymaj szarańczę, amputując jej nogi.Uszczelnij miejsca amputacji klejem tkankowym. Następnie przymocuj szarańczę do specjalnie zaprojektowanej komory za pomocą małego kawałka taśmy izolacyjnej owijającej się wokół jego klatki piersiowej. Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj płytki rowek w woskowej platformie do umieszczenia anteny.Umieść antenę w rowku i ustabilizuj ją za pomocą wosku bati na dwóch końcach anteny. Następnie włóż elektrodę uziemiającą do klatki piersiowej. Użyj wosku Batik, aby uszczelnić miejsce nacięcia i przytrzymać przewód uziemiający na miejscu.Następnie umieść ustabilizowaną antenę szarańczy pod mikroskopem stereoskopowym na stole do izolacji drgań. Podłącz przewody wylotowe butelek zapachowych do rurki doprowadzającej zapachy. Umieść rurkę doprowadzającą zapachy w odległości kilku centymetrów od dostarczonej anteny, opary zapachowe są usuwane przez lejek próżniowy, umieszczony około 10 centymetrów za anteną szarańczy.Następnie wyprodukuj szklane elektrody za pomocą kapilary ze szkła krzemionkowego za pomocą mikropipety biegunowej, napełnij szklaną elektrodę solą fizjologiczną. Następnie umieść szklaną elektrodę w uchwycie na mikropipety, który jest przymocowany do zmotoryzowanego mikromanipulatora. Upewnij się, że podstawa nagrania jest wyraźnie widoczna pod mikroskopem.Delikatnie włóż elektrodę do podstawy syna. Następnie wzmocnij sygnał 10 000 razy. Korzystanie z AC amplifier.Przefiltruj sygnał w zakresie od 0,3 do 10,0 kiloherców i uzyskaj go z częstotliwością próbkowania 15 kiloherców. Za pomocą systemu akwizycji danych, gdy elektroda jest odpowiednio ustawiona, można wykryć spontaniczną aktywność neuronalną. Reakcje wywołane bodźcem można monitorować, dostarczając impuls zapachowy przez rurkę doprowadzającą zapach.Umieszczony blisko anteny i śledzący zmianę aktywności zewnątrzkomórkowej, postępował zgodnie z procedurami ograniczającymi, jak opisano wcześniej. Umieść szarańczę w specjalnie zaprojektowanej komorze. Rozpocznij proces preparacji od zbudowania woskowego kubka wokół głowy szarańczy.Zbuduj dwie woskowe wieże po obu stronach głowy szarańczy, sięgające do wysokości anten. Następnie przełóż każdą antenę przez mały kawałek rurki polietylenowej, która jest ciasno dopasowana do gumowej uszczelki. Następnie przymocuj uszczelki do wież woskowych tak, aby plastikowa rurka mogła swobodnie przesuwać się w kierunku lub od podstawy anteny, jednocześnie zapobiegając przesuwaniu się anteny.Następnie pod mikroskopem zacznij budować woskowy kubek wokół głowy szarańczy, aby umożliwić perfuzję soli fizjologicznej podczas i po zabiegu sekcji. Miseczka na wosk powinna zaczynać się tuż nad częściami ustnymi, obejmować obie wieże woskowe i wychodzić poza oczy złożone. Gdy kubek na wosk jest w pełni skonstruowany, przymocuj podstawę anteny do dolnego końca plastikowej rurki za pomocą żywicy epoksydowej.Zapewni to, że czułki będą utrzymywane na miejscu nawet po usunięciu otaczającego naskórka. Od tego momentu utrzymuj kubek na wosk wypełniony roztworem soli fizjologicznej. Teraz usuń środkowy prostokątny obszar między nimi.Anteny. Następnie usuń naskórek w sąsiednich regionach, nie naruszając złożonych oczu ani naskórka u podstawy czułków. Za pomocą cienkich kleszczy delikatnie usuń worki powietrzne i ciała tłuszczowe otaczające mózg.Mózg szarańczy powinien być teraz wyraźnie widoczny. Obszary mózgu, które przetwarzają informacje węchowe, znajdują się pomiędzy nimi. Czułki delikatnie pociągają za jelito i przecinają je cienkimi nożyczkami.Następnie usuń skrzydła i wykonaj małe nacięcie w jamie brzusznej tuż nad odbytnicą. Usuń jelito, ciągnąc tylne jelito grubymi kleszczami. Ten krok zapewnia, że ruch jelit nie destabilizuje preparatu.Aby zapobiec wyciekom soli fizjologicznej. Przywiąż brzuch tuż przed miejscem nacięcia za pomocą nici do szwów. Następnie użyj małej platformy wykonanej z cienkiej drucianej pętli pokrytej cienką warstwą wosku, aby podnieść mózg i ustabilizować go do elektrofizjologiczności.Nagrywanie mózgu jest chronione przez półprzezroczystą osłonę, którą należy zdjąć przed nagraniami. Aby osłabić osłonkę, częściowo opróżnij miseczkę woskową i ostrożnie rozprowadź niewielką ilość proteazy na powierzchni mózgu. Po około pięciu do 10 sekundach od aplikacji enzymu dokładnie spłucz mózg solą fizjologiczną.Następnie bardzo delikatnie ściśnij i pociągnij osłonę za pomocą bardzo cienkich kleszczy, aby ją rozerwać i odsłonić miejsca nagrywania. W tej procedurze należy umieścić preparat z szarańczy pod mikroskopem stereoskopowym na stole do izolacji drgań. Utrzymuj stałą szybkość perfuzji soli fizjologicznej wynoszącą około 40 mililitrów na godzinę.Podczas eksperymentu użyj drutu chlorkowo-srebrnego zanurzonego w woskowym kubku wypełnionym solą fizjologiczną jako elektrody uziemiającej. Przygotuj konfigurację dostarczania zapachu podobną do eksperymentu z nagrywaniem z jednym czujnikiem. Przed eksperymentem należy galwanizować elektrody złotem, aby osiągnąć impedancje w zakresie od 200 do 300 kilo.Użyj 16-kanałowej sondy krzemowej do nagrań głównych neuronów. Pod mikroskopem. Umieść elektrodę blisko powierzchni płata anteny i delikatnie włóż do tkanki za pomocą ręcznego manipulatora mikrom w idealnym miejscu nagrywania, sygnały zewnątrzkomórkowe zostaną odebrane przez wiele kanałów rejestrujących i będą miały wysoki stosunek sygnału do szumu.W przypadku nagrań komórek Kenyon stosuje się specjalnie wykonane tero ze skręconego drutu, galwanizowane tero zgodnie z procedurami galwanizacji. Następnie sonda krzemowa umieszcza tero na powierzchni korpusu grzyba. Ponieważ Samara komórek kenijskich jest ograniczona do powierzchownej warstwy tego regionu, zarówno główne zapisy neuronów, jak i komórek kenijskich mogą być wykonane jednocześnie z tego samego preparatu szarańczy.Po zidentyfikowaniu miejsca nagrywania odczekaj co najmniej 15 minut, aby umożliwić stabilizację elektrod. Następnie uzyskaj sygnał zewnątrzkomórkowy o częstotliwości 15 kiloherców. Przefiltruj go w zakresie od 0,3 do sześciu kiloherców i wzmocnij za pomocą 16-kanałowego wzmacniacza prądu przemiennego, zarówno spontanicznego, jak i wywołanego bodźcem.Można zaobserwować wielojednostkową aktywność neuronalną neuronów projekcyjnych w płacie anteny. Surowe ślady napięcia zewnątrzkomórkowego pokazujące reakcje neuronu receptora węchowego na dwa różne zapachy. Pokazano tutaj dwa etanol ósemkowy i jeden H.Reprezentatywny ślad zewnątrzkomórkowy z wieloczęściowego nagrania płata anteny jest pokazany tutaj. W tym śladzie napięcia można zaobserwować potencjały czynnościowe lub skoki o różnych amplitudach pochodzące z różnych neuronów zasadniczych. Zwróć uwagę, że czterosekundowy impuls zapachowy został zastosowany w okresie wskazanym przez szare pole.Przykładowy zapis zewnątrzkomórkowy ciała grzyba jest pokazany tutaj. W przeciwieństwie do neuronów receptorów węchowych i neuronów zasadniczych, komórki Kenyona w ciele grzyba owada mają niższą aktywność wyjściową i reagują na zapachy w rzadki i selektywny sposób. Aby wyizolować odpowiedzi pojedynczej jednostki z tych nagrań wielojednostkowych, przeprowadzamy procedurę sortowania wartości szczytowych przy użyciu opublikowanego oprogramowania w trybie offline.Przykłady zasadniczego sortowania neuronów i kenijskich kolców komórkowych są pokazane tutaj Po obejrzeniu tego filmu. Powinien dobrze rozumieć, jak wykonywać zewnątrzkomórkowe nagrania wielojednostkowe w celu scharakteryzowania zespołowej aktywności neuronalnej w pierwszych trzech ośrodkach węchowych wzdłuż ścieżki węchowej wstawki.

multi-unit-recording-methods-to-characterize-neural-activity-locust

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Metody rejestracji wielojednostkowej do charakteryzacji aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca Americana)

Rejestracje za pomocą macierzy mikroelektrod (MEA) stanowią metodę badania aktywności elektrycznej dużych populacji neuronów. W niniejszym materiale przedstawiamy szczegóły przygotowania MEA do rejestracji sygnałów z nabłonka womeronasalnego myszy przy jednoczesnej stymulacji tkanki.

Rejestracje z macierzy wieloelektrodowej nabłonka narządu Jacobsona

Układy węchowe owadów zapewniają wyjątkowe możliwości rejestrowania odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w formie elektroantenogramów (EAG) oraz rejestracji z pojedynczych sensyli (SSR), które stanowią odpowiednio sumaryczne odpowiedzi wszystkich neuronów receptorowych zapachowych (ORNs) zlokalizowanych na antenie oraz tych znajdujących się w poszczególnych sensylach.

Pomiary elektrofizjologiczne z systemu węchowego ćmy

Bodźce węchowe pośredniczą w wielu różnych zachowaniach owadów i często stanowią złożone mieszaniny składające się z dziesiątek lub setek lotnych związków. Wykorzystując chromatografię gazową z wielokanałowym zapisem w płacie antenalnym owada, opisujemy metodę identyfikacji związków biologicznie czynnych.

Identyfikacja lotnych substancji zapachowych przy użyciu chromatografii gazowej z wielokanałowym zapisem (GCMR) w płacie antenalnym owada

Ten artykuł opisuje sekcję brzusznego rdzenia nerwowego karalucha oraz pozakomórkowe nagrania z nerwu szyjnego i łączników. Reakcje wywołane są generowane przez elektryczną stymulację nerwu szyjnego lub bezpośrednią mechaniczną stymulację szyjki macicy.

Zapis obwodu neuronalnego z nienaruszonego układu nerwowego karalucha

Wszczepianie zorganizowanych układów mikroprzewodów do użycia w jednojednostkowych zapisach elektrofizjologicznych stanowi szereg wyzwań technicznych. Opisano również metody wykonywania tej techniki i niezbędny sprzęt. Omówiono również korzystne wykorzystanie zorganizowanych układów mikroprzewodów do nagrywania z różnych podregionów neuronowych o wysokiej selektywności przestrzennej.

Procedura wszczepiania zorganizowanych układów mikroprzewodów do nagrań pojedynczych jednostek u obudzonych, zachowujących się zwierząt

U pszczół miodnych ustalono jednoczesne zewnątrzkomórkowe długoterminowe zapisy z dwóch różnych neuropile mózgowych lub dwóch różnych dróg anatomicznych. Nagrania te pozwalają na badanie czasowych aspektów przetwarzania neuronalnego w różnych obszarach mózgu zarówno na poziomie pojedynczego neuronu, jak i na poziomie zespołu u zachowującego się zwierzęcia.

Jednoczesne długoterminowe zapisy na dwóch etapach przetwarzania neuronalnego u zachowujących się pszczół miodnych

Analiza fizjologicznych właściwości węchowych neuronów czuciowych nadal napotyka na techniczne ograniczenia. Tutaj rejestrujemy je przez perforowany patch-clamp w nienaruszonym preparowaniu nabłonka węchowego u myszy ukierunkowanych na geny. Technika ta pozwala na scharakteryzowanie właściwości błony i odpowiedzi na określone ligandy neuronów wyrażających określone receptory węchowe.

Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

Prezentujemy trzy nowe metody do nauki kodowania smakowego. Posługując się prostym zwierzęciem, Manduca sexta (Manduca), opisujemy protokół preparacji, użycie zewnątrzkomórkowych tetrod do rejestrowania aktywności wielu neuronów receptorów smakowych oraz system dostarczania i monitorowania precyzyjnie wymierzonych impulsów degustacji.

Nowe metody badania kodowania smaku

Ten artykuł opisuje szczegółowy i wysoce skuteczny protokół dla pojedynczych nagrań sensillum z sensilla basiconica na palpach aparatów gębowych owadów.

Single Sensillum Recordings dla Locust Palp Sensilla Basiconica

Zewnątrzkomórkowy zapis wielopunktowy z nerwu węchowego jest czułą, solidną i powtarzalną metodą oceny wrażliwości węchowej u ryb morskich. Rejestruje pierwotne bodźce sensoryczne i jest niezależny od zewnętrznego zasolenia.

Zewnątrzkomórkowy zapis wielojednostkowy z nerwu węchowego teleostów

Prezentujemy metodę elastycznej chemicznej i multimodalnej stymulacji oraz rejestrowania jednoczesnej aktywności neuronalnej wielu robaków Caenorhabditis elegans. Metoda ta wykorzystuje mikrofluidykę, sprzęt i oprogramowanie typu open source oraz nadzorowaną automatyczną analizę danych, aby umożliwić pomiar zjawisk neuronalnych, takich jak adaptacja, hamowanie czasowe i przesłuchy bodźców.

Zautomatyzowana stymulacja multimodalna i jednoczesna rejestracja neuronów z wielu małych organizmów

Poznaj metody wielojednostkowej rejestracji aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy Schistocerca americana. Technika ta pozwala badać odpowiedzi na bodźce zapachowe w układzie nerwowym owadów.

Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana) (Wideo) | JoVE Journal

Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana)

Przeglądaj więcej filmów