Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana)

Ogólnym celem tej procedury jest zarejestrowanie odwołanej przez zapach wielojednostkowej aktywności neuronalnej z pierwszych trzech centrów przetwarzania sygnałów szlaku węchowego owadów. Osiąga się to poprzez najpierw unieruchomienie szarańczy w specjalnie zaprojektowanej komorze i ustabilizowanie jednej z jej anten do nagrań elektrofizjologicznych. Drugim krokiem jest wyprodukowanie szklanej mikroelektrody i umieszczenie jej u podstawy słońca w celu monitorowania reakcji wywołanych zapachem.

Obok rejestruj aktywność neuronalną z mózgu szarańczy. Przeprowadzana jest wieloetapowa procedura preparacji w celu odsłonięcia tkanki nerwowej, która przetwarza dane wejściowe z węchowych neuronów czuciowych. Ostatnim krokiem jest odpowiednie rozmieszczenie układów wieloelektrodowych w celu zarejestrowania zespołowej aktywności neuronalnej z płata szarańczy i anteny oraz korpusu grzyba.

Ostatecznie zademonstrowane tutaj metody rejestracji zewnątrzkomórkowej są wykorzystywane do scharakteryzowania reakcji wywołanych zapachem w pierwszych trzech centrach przetwarzania wzdłuż szlaku węchowego owadów. Chociaż metoda ta została wykorzystana do scharakteryzowania reakcji neurologicznej wywołanej zapachem w stosunkowo prostym układzie węchowym bezkręgowców, można ją również dostosować do badania aktywności zespołu w innych układach nerwowych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ niektóre kluczowe aspekty tej procedury, takie jak umieszczenie elektrod i niektóre etapy sekcji, są bardzo trudne do nauczenia.

Ponadto metody są w większości jakościowe, a różne laboratoria z biegiem czasu udoskonaliły je w różny sposób. Aby rozpocząć tę procedurę, wybierz młodą dorosłą szarańczę dowolnej płci z w pełni rozwiniętymi skrzydłami, ale przed etapem krycia z zatłoczonej kolonii. Następnie powstrzymaj szarańczę, amputując jej nogi.

Uszczelnij miejsca amputacji klejem tkankowym. Następnie przymocuj szarańczę do specjalnie zaprojektowanej komory za pomocą małego kawałka taśmy izolacyjnej owijającej się wokół jego klatki piersiowej. Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj płytki rowek w woskowej platformie do umieszczenia anteny.

Umieść antenę w rowku i ustabilizuj ją za pomocą wosku bati na dwóch końcach anteny. Następnie włóż elektrodę uziemiającą do klatki piersiowej. Użyj wosku Batik, aby uszczelnić miejsce nacięcia i przytrzymać przewód uziemiający na miejscu.

Następnie umieść ustabilizowaną antenę szarańczy pod mikroskopem stereoskopowym na stole do izolacji drgań. Podłącz przewody wylotowe butelek zapachowych do rurki doprowadzającej zapachy. Umieść rurkę doprowadzającą zapachy w odległości kilku centymetrów od dostarczonej anteny, opary zapachowe są usuwane przez lejek próżniowy, umieszczony około 10 centymetrów za anteną szarańczy.

Następnie wyprodukuj szklane elektrody za pomocą kapilary ze szkła krzemionkowego za pomocą mikropipety biegunowej, napełnij szklaną elektrodę solą fizjologiczną. Następnie umieść szklaną elektrodę w uchwycie na mikropipety, który jest przymocowany do zmotoryzowanego mikromanipulatora. Upewnij się, że podstawa nagrania jest wyraźnie widoczna pod mikroskopem.

Delikatnie włóż elektrodę do podstawy syna. Następnie wzmocnij sygnał 10 000 razy. Korzystanie z AC amplifier.

Przefiltruj sygnał w zakresie od 0,3 do 10,0 kiloherców i uzyskaj go z częstotliwością próbkowania 15 kiloherców. Za pomocą systemu akwizycji danych, gdy elektroda jest odpowiednio ustawiona, można wykryć spontaniczną aktywność neuronalną. Reakcje wywołane bodźcem można monitorować, dostarczając impuls zapachowy przez rurkę doprowadzającą zapach.

Umieszczony blisko anteny i śledzący zmianę aktywności zewnątrzkomórkowej, postępował zgodnie z procedurami ograniczającymi, jak opisano wcześniej. Umieść szarańczę w specjalnie zaprojektowanej komorze. Rozpocznij proces preparacji od zbudowania woskowego kubka wokół głowy szarańczy.

Zbuduj dwie woskowe wieże po obu stronach głowy szarańczy, sięgające do wysokości anten. Następnie przełóż każdą antenę przez mały kawałek rurki polietylenowej, która jest ciasno dopasowana do gumowej uszczelki. Następnie przymocuj uszczelki do wież woskowych tak, aby plastikowa rurka mogła swobodnie przesuwać się w kierunku lub od podstawy anteny, jednocześnie zapobiegając przesuwaniu się anteny.

Następnie pod mikroskopem zacznij budować woskowy kubek wokół głowy szarańczy, aby umożliwić perfuzję soli fizjologicznej podczas i po zabiegu sekcji. Miseczka na wosk powinna zaczynać się tuż nad częściami ustnymi, obejmować obie wieże woskowe i wychodzić poza oczy złożone. Gdy kubek na wosk jest w pełni skonstruowany, przymocuj podstawę anteny do dolnego końca plastikowej rurki za pomocą żywicy epoksydowej.

Zapewni to, że czułki będą utrzymywane na miejscu nawet po usunięciu otaczającego naskórka. Od tego momentu utrzymuj kubek na wosk wypełniony roztworem soli fizjologicznej. Teraz usuń środkowy prostokątny obszar między nimi.

Anteny. Następnie usuń naskórek w sąsiednich regionach, nie naruszając złożonych oczu ani naskórka u podstawy czułków. Za pomocą cienkich kleszczy delikatnie usuń worki powietrzne i ciała tłuszczowe otaczające mózg.

Mózg szarańczy powinien być teraz wyraźnie widoczny. Obszary mózgu, które przetwarzają informacje węchowe, znajdują się pomiędzy nimi. Czułki delikatnie pociągają za jelito i przecinają je cienkimi nożyczkami.

Następnie usuń skrzydła i wykonaj małe nacięcie w jamie brzusznej tuż nad odbytnicą. Usuń jelito, ciągnąc tylne jelito grubymi kleszczami. Ten krok zapewnia, że ruch jelit nie destabilizuje preparatu.

Aby zapobiec wyciekom soli fizjologicznej. Przywiąż brzuch tuż przed miejscem nacięcia za pomocą nici do szwów. Następnie użyj małej platformy wykonanej z cienkiej drucianej pętli pokrytej cienką warstwą wosku, aby podnieść mózg i ustabilizować go do elektrofizjologiczności.

Nagrywanie mózgu jest chronione przez półprzezroczystą osłonę, którą należy zdjąć przed nagraniami. Aby osłabić osłonkę, częściowo opróżnij miseczkę woskową i ostrożnie rozprowadź niewielką ilość proteazy na powierzchni mózgu. Po około pięciu do 10 sekundach od aplikacji enzymu dokładnie spłucz mózg solą fizjologiczną.

Następnie bardzo delikatnie ściśnij i pociągnij osłonę za pomocą bardzo cienkich kleszczy, aby ją rozerwać i odsłonić miejsca nagrywania. W tej procedurze należy umieścić preparat z szarańczy pod mikroskopem stereoskopowym na stole do izolacji drgań. Utrzymuj stałą szybkość perfuzji soli fizjologicznej wynoszącą około 40 mililitrów na godzinę.

Podczas eksperymentu użyj drutu chlorkowo-srebrnego zanurzonego w woskowym kubku wypełnionym solą fizjologiczną jako elektrody uziemiającej. Przygotuj konfigurację dostarczania zapachu podobną do eksperymentu z nagrywaniem z jednym czujnikiem. Przed eksperymentem należy galwanizować elektrody złotem, aby osiągnąć impedancje w zakresie od 200 do 300 kilo.

Użyj 16-kanałowej sondy krzemowej do nagrań głównych neuronów. Pod mikroskopem. Umieść elektrodę blisko powierzchni płata anteny i delikatnie włóż do tkanki za pomocą ręcznego manipulatora mikrom w idealnym miejscu nagrywania, sygnały zewnątrzkomórkowe zostaną odebrane przez wiele kanałów rejestrujących i będą miały wysoki stosunek sygnału do szumu.

W przypadku nagrań komórek Kenyon stosuje się specjalnie wykonane tero ze skręconego drutu, galwanizowane tero zgodnie z procedurami galwanizacji. Następnie sonda krzemowa umieszcza tero na powierzchni korpusu grzyba. Ponieważ Samara komórek kenijskich jest ograniczona do powierzchownej warstwy tego regionu, zarówno główne zapisy neuronów, jak i komórek kenijskich mogą być wykonane jednocześnie z tego samego preparatu szarańczy.

Po zidentyfikowaniu miejsca nagrywania odczekaj co najmniej 15 minut, aby umożliwić stabilizację elektrod. Następnie uzyskaj sygnał zewnątrzkomórkowy o częstotliwości 15 kiloherców. Przefiltruj go w zakresie od 0,3 do sześciu kiloherców i wzmocnij za pomocą 16-kanałowego wzmacniacza prądu przemiennego, zarówno spontanicznego, jak i wywołanego bodźcem.

Można zaobserwować wielojednostkową aktywność neuronalną neuronów projekcyjnych w płacie anteny. Surowe ślady napięcia zewnątrzkomórkowego pokazujące reakcje neuronu receptora węchowego na dwa różne zapachy. Pokazano tutaj dwa etanol ósemkowy i jeden H.

Reprezentatywny ślad zewnątrzkomórkowy z wieloczęściowego nagrania płata anteny jest pokazany tutaj. W tym śladzie napięcia można zaobserwować potencjały czynnościowe lub skoki o różnych amplitudach pochodzące z różnych neuronów zasadniczych. Zwróć uwagę, że czterosekundowy impuls zapachowy został zastosowany w okresie wskazanym przez szare pole.

Przykładowy zapis zewnątrzkomórkowy ciała grzyba jest pokazany tutaj. W przeciwieństwie do neuronów receptorów węchowych i neuronów zasadniczych, komórki Kenyona w ciele grzyba owada mają niższą aktywność wyjściową i reagują na zapachy w rzadki i selektywny sposób. Aby wyizolować odpowiedzi pojedynczej jednostki z tych nagrań wielojednostkowych, przeprowadzamy procedurę sortowania wartości szczytowych przy użyciu opublikowanego oprogramowania w trybie offline.

Przykłady zasadniczego sortowania neuronów i kenijskich kolców komórkowych są pokazane tutaj Po obejrzeniu tego filmu. Powinien dobrze rozumieć, jak wykonywać zewnątrzkomórkowe nagrania wielojednostkowe w celu scharakteryzowania zespołowej aktywności neuronalnej w pierwszych trzech ośrodkach węchowych wzdłuż ścieżki węchowej wstawki.