Name: Izolacja i zapisy kanału Kv w kardiomiocytach przedsionkowych i komorowych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Poznaj metodę izolacji kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych z myszy do badań elektrofizjologicznych. Technika patch clamp pozwala analizować prądy kanałów Kv i mechanizmy arytmii serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantów Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Fritz-Thyssen-Stiftung i Charité/MDC.

1. Znieczulenie zwierząt i grabież organów
<ol>
 <li>Znieczulić mysz przez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie ketaminy (200 mg/kg m.c.) i ksylazyny (20 mg/kg m.c.).</li>
 <li>Aby przeciwzakrzepowo wstrzyknąć 250 j.m. heparyny i.p., aby uniknąć krzepnięcia krwi i tworzenia się skrzepliny.</li>
 <li>Poczekaj, aż zostanie osiągnięta głęboka narkoza, która charakteryzuje się arefleksją. Aby sprawdzić, czy nie ma arefleksji, przetestuj odruch rogówkowy, delikatnie dotykając rogówki lub przetestuj odruch lotu, szczypiąc ogon.</li>
 <li>Przenieś mysz na stół operacyjny i zamocuj ją w pozycji leżącej.</li>
 <li>Naciąć skórę i ścianę brzucha poniżej mieczykowatej i wykonać torakotomię z klapką: Rozciągnij cięcie na obie strony wzdłuż łuku żebrowego, a następnie przeciąć żebra w przyśrodkowej linii pachowej, odchyl klatkę piersiową do góry.</li>
 <li>Otwórz osierdzie, zlokalizuj wielkie naczynia. Delikatnie naciśnij ogon serca, aby lepiej wyświetlić aortę. Zacisnąć aortę za pomocą kleszczy.</li>
 <li>Umieść serce we wklęsłości nożyczek i wypreparuj wszystkie łączące się naczynia jednym cięciem. Upewnij się, że zachowałeś wystarczająco dużą część aorty wstępującej do kaniulacji Langendorffa.</li>
 <li>Natychmiast przenieść wycięte serce na szalkę Petriego wypełnioną lodowatym i wstępnie natlenionym roztworem 1 (dla roztworów, patrz Tabela 1).</li>
</ol>
2. Przygotowanie serca i perfuzji Langendorffa
<ol>
 <li>Kanniuluj aortę za pomocą kaniuli stalowej 1,8F. Upewnij się, że unikasz zatoru powietrznego.</li>
 <li>Unieruchomić aortę na kaniuli za pomocą szwu chirurgicznego i przepłukać naczynia wieńcowe 1 ml roztworu 1.</li>
 <li>Połącz kaniulę z aparatem Langendorffa.</li>
 <li>Upewnij się, że czas od torakotomii do kaniulacji Langendorffa nie przekracza 120 sekund, aby uniknąć przedłużonego niedokrwienia/uszkodzenia reperfuzyjnego mięśnia sercowego.</li>
 <li>Wypełnić serce za pomocą 10 ml roztworu wolnego odCa2+ 2 (4 ml/min).</li>
 <li>Perfekować serce roztworem kolagenazy 3 przez 8 min (4 ml/min).</li>
</ol>
3. Mikrochirurgiczne dysocjacje komór serca
<ol>
 <li>Przenieść serce do wstępnie podgrzanej 100-milimetrowej szalki Petriego zawierającej roztwór o niskiej zawartościCa2+ 4.</li>
 <li>Ostrożnie usuń nożyczkami tkankę aorty i inną tkankę niesercową i wyrzuć ją.</li>
 <li>Oddziel przedsionki i komory i kontynuuj z każdą komorą osobno. Utrzymuj komórki zanurzone w roztworze 4. Używaj małych objętości (mniej niż 5 ml).</li>
</ol>
4. Dalsza dysocjacja kardiomiocytów
<ol>
 <li>Kardiomiocyty przedsionkowe:
 <ol>
 <li>Aby zindywidualizować kardiomiocyty przedsionkowe, przenieś przedsionki do oddzielnego, wstępnie ogrzanego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm i rozdziel tkankę poprzez delikatne rozsunięcie jej cienkimi kleszkami. Zapewnić prawie całkowitą dysocjację tkanki.</li>
 <li>Użyj pipety o pojemności 1 ml z powiększoną, polerowaną ogniowo plastikową końcówką do pipety, aby zawiesić komórki w 1 ml roztworu 5 na 5 minut.</li>
 <li>Oddziel komórki od zanieczyszczeń za pomocą filtra komórkowego (rozmiar oczek 200 μm).</li>
 <li>Dodać 5 ml roztworu 5 do zawiesiny komórek i wirować przez 2 minuty przy 16 x g w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Poniższe kroki są wykonywane pod kapturem do hodowli komórkowej. Odrzucić sklarowany osad i ponownie zawiesić osad w 5 ml roztworu 6.</li>
 <li>Po sedymentacji grawitacyjnej przez 10 minut w probówce o pojemności 15 ml, wirować przez 1 minutę przy 16 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w zależności od ich ilości w 1-5 ml roztworu 6.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Kardiomiocyty komorowe:
 <ol>
 <li>Wyciąć interesujący obszar lewej komory za pomocą drobnych kleszczy w 5 ml roztworu 4.</li>
 <li>Zawiesić komórki, delikatnie pipetując, aż większość komórek zostanie oddzielona. Przenieść roztwór komórkowy po przefiltrowaniu (rozmiar oczek 200 μm) do probówki o pojemności 50 ml, dodać objętość 25 ml.</li>
 <li>Wirować przez 2 minuty przy 16 x g w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Poniższe kroki są wykonywane pod kapturem do hodowli komórkowej. Usunąć supernatant, zawiesić osad w 25 ml roztworu 6 i pozostawić do sedymentacji komórek przez 10 minut.</li>
 <li>Policz komórki i usuń supernatant, dodaj 25 - 50 ml roztworu 6 na komórki.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
5. Przygotowanie kardiomiocytów do badań elektrofizjologii komórkowej, biochemicznej lub IF
<ol>
 <li>W przypadku badań elektrofizjologicznych należy przechowywać miocyty w roztworze 6 w probówce o pojemności 50 ml i hamować sedymentację.</li>
 <li>Do badań biochemicznych, np. obrazowania wapnia, miocyty płytkowe na szalce do hodowli komórkowej pokrytej lamininą (końcowe stężenie 20 μg/ml lamininy w PBS).</li>
 <li>Do barwienia immunofluorescencyjnego przygotować płytkę do hodowli komórkowych ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi i pokryć roztworem lamininy (końcowe stężenie 50 μg/ml lamininy w PBS).
 <ol>
 <li>Usuń roztwór przed posiewem miocytów. Płytki komórek i kontroluj gęstość komórek za pomocą mikroskopu.</li>
 <li>Pozostawić miocyty do szkiełka nakrywkowego przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w 2 % CO2 , usunąć roztwór i natychmiast rozpocząć standardowy protokół procedury barwienia.</li>
 <li>Inkubować z utrwalaczem, np. 4% PFA w PBS (pH 7,5) przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wykonać trzy etapy płukania PBS przez 5 minut każdy.</li>
 <li>Aby przeniknąć do komórek i zahamować niespecyficzne wiązanie przeciwciał, należy inkubować miocyty z 10% surowicą, 0,3% Tritonem, 0,2% BSA w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i przemyć w sposób opisany powyżej.</li>
 <li>Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Aby przeciwdziałać barwieniu jąder i α-aktyninie, należy użyć DAPI i falloidyny sprzężonej z fluorochromem (Alexa Fluor 488, Invitrogen).</li>
 <li>Po umyciu ostrożnie przenieś szkiełka nakrywkowe na szkiełka mikroskopowe nasączone silanem i zanurz komórki w fluorescencyjnym podłożu montażowym.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
6. Elektrofizjologia komórkowa
<ol>
 <li>Wykonaj zapisy całokomórkowe na świeżo izolowanych kardiomiocytach przedsionkowych i komorowych w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przenieś zdrowo wyglądające kardiomiocyty do komory perfuzyjnej wypełnionej określoną objętością roztworu do kąpieli zewnątrzkomórkowej. 117 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 4 mM NaHCO3, 1,7 mM MgCl2, 3 mM CoCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glukozy i 0,02 mM tetrodotoksyny (TTX) (pH 7,4). Użyj NaOH do regulacji wartości pH.</li>
 <li>Używaj odpowiedniego sprzętu do zacisków krosowych (tj. mikroskopu odwróconego IX71, wzmacniacza Multiclamp 700B, systemu akwizycji Digidata 1440A i komputera PC z oprogramowaniem pClamp10.3 (urządzenia molekularne)).</li>
 <li>Stosować pipety krosowe o rezystancji 3-5 MΩ po napełnieniu roztworem wewnątrzkomórkowym zawierającym 130 mM KCl, 2 mM MgCl2, 11 mM HEPES, 11 mM EGTA, 5 mM Na2ATP, 0,4 mM Na2GTP, 5 mM Na2CP i 4,9 mM CaCl2 (pH 7,2). Użyj KOH do regulacji wartości pH.</li>
 <li>Wywoływanie zewnętrznych prądów K+ w krokach napięcia 4,5 sekundy w celu przetestowania potencjałów w zakresie od -60 do +50 mV w krokach co 10 mV od potencjału podtrzymania -70 mV po 20-sekundowym impulsie wstępnym do -40 mV.</li>
 <li>Upewnij się, że prądy upływowe zawsze wynoszą <100 pA.</li>
 <li>Do analizy różnych prądów K+ należy stosować specyficzne inhibitory, takie jak 4-aminopirydyna (4-AP; ICN Biomedicals, Irvine, Kalifornia, Stany Zjednoczone), Heteropodatoxin 2 (HpTx2; Alomon) lub tetraetyloamonu (TEA; Sigma). Roztwory podstawowe należy przygotować w roztworze kąpieli zewnątrzkomórkowej i nanieść bezpośrednio w najbliższe możliwe sąsiedztwo komórki za pomocą mikrokońcówki po zapisach "linii bazowej". Równowaga powinna być pozostawiona na 2-3 minuty przed nagraniami "narkotykowymi".</li>
 <li>Do analizy znormalizuj amplitudy prądu w poszczególnych komórkach do wielkości komórki (pojemność błony całej komórki). Analizuj dane w trybie offline za pomocą oprogramowania pClamp10.3 (Molecular Devices) lub porównywalnego oprogramowania.</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, G. W., Goldstein, S. A., Sesti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+all+voltage-gated+potassium+channels+use+MiRPs%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Do all voltage-gated potassium channels use MiRPs?</a> Circ. Res. 88, 981-983 (2001).</li>
<li>Abbott, G. W., Sesti, F., Splawski, I., Buck, M. E., Lehmann, M. H., Timothy, K. W., Keating, M. T., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRP1+forms+IKr+potassium+channels+with+HERG+and+is+associated+with+cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MiRP1 forms IKr potassium channels with HERG and is associated with cardiac arrhythmia.</a> Cell. 97, 175-187 (1999).</li>
<li>Barry, D. M., Trimmer, J. S., Merlie, J. P., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+voltage-gated+K%2B+channel+subunits+in+adult+rat+heart.+Relation+to+functional+K%2B+channels%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential expression of voltage-gated K+ channel subunits in adult rat heart. Relation to functional K+ channels?</a> Circ. Res. 77, 361-369 (1995).</li>
<li>Benjamin, E. J., Wolf, P. A., D'Agostino, R. B., Silbershatz, H., Kannel, W. B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+atrial+fibrillation+on+the+risk+of+death%3A+the+Framingham+Heart+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Impact of atrial fibrillation on the risk of death: the Framingham Heart Study.</a> Circulation. 98, 946-952 (1998).</li>
<li>Bou-Abboud, E., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+correlates+of+the+calcium-independent%2C+depolarization-activated+K%2B+currents+in+rat+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular correlates of the calcium-independent, depolarization-activated K+ currents in rat atrial myocytes.</a> J. Physiol. 517 (Pt 2), 407-420 (1999).</li>
<li>Gaborit, N., Steenman, M., Lamirault, G., Le, M. N., Le, B. S., Lande, G., Leger, J., Charpentier, F., Christ, T., Dobrev, D., Escande, D., Nattel, S., Demolombe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atrial+ion+channel+and+transporter+subunit+gene-expression+remodeling+associated+with+valvular+heart+disease+and+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Human atrial ion channel and transporter subunit gene-expression remodeling associated with valvular heart disease and atrial fibrillation.</a> Circulation. 112, 471-481 (2005).</li>
<li>Guo, W., Xu, H., London, B., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+transient+outward+K%2B+current+diversity+in+mouse+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of transient outward K+ current diversity in mouse ventricular myocytes.</a> J. Physiol. 521 (Pt 3), 587-599 (1999).</li>
<li>Lundby, A., Ravn, L. S., Svendsen, J. H., Hauns, S., Olesen, S. P., Schmitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNE3+mutation+V17M+identified+in+a+patient+with+lone+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">KCNE3 mutation V17M identified in a patient with lone atrial fibrillation.</a> Cell Physiol. Biochem. 21, 47-54 (2008).</li>
<li>Ma, K. J., Li, N., Teng, S. Y., Zhang, Y. H., Sun, Q., Gu, D. F., Pu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+KCNQ1+current+by+atrial+fibrillation-associated+KCNE4+%28145E%2FD%29+gene+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Med.+J.+%28Engl.%29%22%5BJournal%5D)">Modulation of KCNQ1 current by atrial fibrillation-associated KCNE4 (145E/D) gene polymorphism.</a> Chin Med. J. (Engl.). 120, 150-154 (2007).</li>
<li>McCrossan, Z. A., Abbott, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MinK-related+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">The MinK-related peptides.</a> Neuropharmacology. 47, 787-821 (2004).</li>
<li>Pongs, O., Schwarz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancillary+subunits+associated+with+voltage-dependent+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Ancillary subunits associated with voltage-dependent K+ channels.</a> Physiol. Rev. 90, 755-796 (2010).</li>
<li>Ravn, L. S., Aizawa, Y., Pollevick, G. D., Hofman-Bang, J., Cordeiro, J. M., Dixen, U., Jensen, G., Wu, Y., Burashnikov, E., Haunso, S., Guerchicoff, A., Hu, D., Svendsen, J. H., Christiansen, M., Antzelevitch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain+of+function+in+IKs+secondary+to+a+mutation+in+KCNE5+associated+with+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Gain of function in IKs secondary to a mutation in KCNE5 associated with atrial fibrillation.</a> Heart Rhythm. 5, 427-435 (2008).</li>
<li>Ravn, L. S., Hofman-Bang, J., Dixen, U., Larsen, S. O., Jensen, G., Haunso, S., Svendsen, J. H., Christiansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+of+97T+polymorphism+in+KCNE5+to+risk+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Relation of 97T polymorphism in KCNE5 to risk of atrial fibrillation.</a> Am. J. Cardiol. 96, 405-407 (2005).</li>
<li>Roepke, T. K., Abbott, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenetics+and+cardiac+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Vascul.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenetics and cardiac ion channels.</a> Vascul. Pharmacol. 44, 90-106 (2006).</li>
<li>Roepke, T. K., Kontogeorgis, A., Ovanez, C., Xu, X., Young, J. B., Purtell, K., Goldstein, P. A., Christini, D. J., Peters, N. S., Akar, F. G., Gutstein, D. E., Lerner, D. J., Abbott, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+deletion+of+kcne2+impairs+ventricular+repolarization+via+disruption+of+I%28K%2Cslow1%29+and+I%28to%2Cf%29%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Targeted deletion of kcne2 impairs ventricular repolarization via disruption of I(K,slow1) and I(to,f).</a> FASEB J. 22, 3648-3660 (2008).</li>
<li>Sesti, F., Abbott, G. W., Wei, J., Murray, K. T., Saksena, S., Schwartz, P. J., Priori, S. G., Roden, D. M., George, A. L., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+polymorphism+associated+with+antibiotic-induced+cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A common polymorphism associated with antibiotic-induced cardiac arrhythmia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10613-10618 (2000).</li>
<li>Temple, J., Frias, P., Rottman, J., Yang, T., Wu, Y., Verheijck, E. E., Zhang, W., Siprachanh, C., Kanki, H., Atkinson, J. B., King, P., Anderson, M. E., Kupershmidt, S., Roden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+fibrillation+in+KCNE1-null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Atrial fibrillation in KCNE1-null mice.</a> Circ. Res. 97, 62-69 (2005).</li>
<li>Yang, Y., Xia, M., Jin, Q., Bendahhou, S., Shi, J., Chen, Y., Liang, B., Lin, J., Liu, Y., Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+KCNE2+gain-of-function+mutation+in+patients+with+familial+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of a KCNE2 gain-of-function mutation in patients with familial atrial fibrillation.</a> Am. J. Hum. Genet. 75, 899-905 (2004).</li>
<li>Zeng, Z. Y., Pu, J. L., Tan, C., Teng, S. Y., Chen, J. H., Su, S. Y., Zhou, X. Y., Zhang, S., Li, Y. S., Wang, F. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BThe+association+of+single+nucleotide+polymorphism+of+slow+delayed+rectifier+K%2B+channel+genes+with+atrial+fibrillation+in+Han+nationality+Chinese%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Xin.+Xue.+Guan.+Bing.+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">[The association of single nucleotide polymorphism of slow delayed rectifier K+ channel genes with atrial fibrillation in Han nationality Chinese].</a> Zhonghua Xin. Xue. Guan. Bing. Za Zhi. 33, 987-991 (2005).</li>
<li>Zhang, M., Jiang, M., Tseng, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((minK-related+peptide+1+associates+with+Kv4.2+and+modulates+its+gating+function%3A+potential+role+as+beta+subunit+of+cardiac+transient+outward+channel%3F+Circ%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">minK-related peptide 1 associates with Kv4.2 and modulates its gating function: potential role as beta subunit of cardiac transient outward channel? Circ.</a> Circ. Res. 88, 1012-1019 (2001).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Wraz z rosnącym rozwojem genetycznie modyfikowanych szczepów myszy do badania funkcji serca i patologii serca związanych z delecją genów, rośnie również zainteresowanie specjalistycznymi metodami badania skutków specyficznej delecji genu in vitro. W naszym laboratorium badamy rolę rodziny podjednostek pomocniczych kanału Kv w repolaryzacji serca. Geny KCNE obejmują rodzinę 5 genów (KCNE1-5), które odgrywają ważną rolę w repolaryzacji komór i przedsionków człowieka 11, 15. KCNE</e...

<table><tbody><tr><td>Tetrodotoksyna</td><td>Alomone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-aminopirydyna</td><td>ICN Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heteropodatoxin 2</td><td>Alomone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetraethyloammonium</td><td>Sigma Chemicals Kolagenaza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typ 2</td><td>Worthington</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i zapisy kanału kv w kardiomiocytach przedsionkowych i komorowych myszy

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Geny KCNE kodują małą rodzinę podjednostek pomocniczych kanału Kv, które tworzą heteromeryczne kompleksy z podjednostkami kanału alfa kanału Kv, aby modyfikować ich właściwości funkcjonalne. Mutacje w genach KCNE stwierdzono u pacjentów z zaburzeniami rytmu serca, takimi jak zespół wydłużonego odstępu QT i (lub) migotanie przedsionków. Jednak dokładna patofizjologia molekularna, która prowadzi do tych chorób, pozostaje nieuchwytna. W poprzednich badaniach właściwości elektrofizjologiczne choroby powodującej mutacje w tych genach były badane głównie w heterologicznych systemach ekspresji i nie możemy być pewni, czy zgłoszone efekty można bezpośrednio przełożyć na natywne kardiomiocyty. Dlatego w naszym laboratorium stosujemy inne podejście. Bezpośrednio badamy efekty delecji genu KCNE w izolowanych kardiomiocytach od myszy z nokautem za pomocą elektrofizjologii komórkowej - unikalnej techniki, którą opisujemy w tym wydaniu Journal of Visualized Experiments. Serca genetycznie modyfikowanych myszy KCNE są szybko wycinane i montowane w aparacie Langendorffa za pomocą kaniulacji aorty. Wolny Ca2 + w mięśniu sercowym jest wiązany przez EGTA, a dysocjacja miocytów serca jest następnie osiągana przez wsteczną perfuzję tętnic wieńcowych z wyspecjalizowanym buforem o niskiej zawartości Ca2 + zawierającym kolagenazę. Przedsionki, wolna ściana prawej komory i lewa komora mogą być następnie oddzielone za pomocą technik mikrochirurgicznych. Wapń jest następnie powoli dodawany z powrotem do izolowanych kardiomiocytów w wielu etapach obejmujących procedurę mycia. Kardiomiocyty przedsionkowe i komorowe o zdrowym wyglądzie bez spontanicznych skurczów są następnie natychmiast poddawane analizom elektrofizjologicznym techniką patch clamp lub innym analizom biochemicznym w ciągu pierwszych 6 godzin po izolacji.

Izolacja dorosłych kardiomiocytów myszy z myszy modyfikowanych genetycznie w celu badania funkcji specyficznych genów zainteresowania in vitro stała się potężnym narzędziem do lepszego zrozumienia patofizjologii serca. Metoda ta jest obecnie stosowana przez niewielką, ale stale rosnącą liczbę laboratoriów nauk podstawowych na całym świecie. Jednak izolacja dorosłych komórk mięśniowych serca z komór komór myszy może być trudna i musi być przeprowadzana starannie oraz wielokrotnie przez doświadczonych operatorów. ...

Dysfunkcja kanału Kv jest związana z zaburzeniami rytmu serca. W celu zbadania mechanizmów molekularnych, które prowadzą do takich arytmii, stosujemy systematyczny protokół izolacji kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych od myszy z nokautem podjednostki pomocniczej kanału Kv. Wyizolowane kardiomiocyty można następnie natychmiast wykorzystać do komórkowych badań elektrofizjologicznych, testów biochemicznych lub immunofluorescencyjnych (IF).

Izolacja i zapisy kanału Kv w kardiomiocytach przedsionkowych i komorowych myszy

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie żywych kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych z genetycznie zmodyfikowanych myszy w celu wykorzystania ich w rejestracji patch-clamp w konfiguracji whole-cell oraz w innych eksperymentach. Osiąga się to poprzez najpierw ostrożne, lecz szybkie wycięcie serca z znieczulonego zwierzęcia. Drugim krokiem jest podłączenie wyciętego i kaniulowanego serca do aparatu LOR.Następnie serce poddaje się intensywnej perfuzji wstecznej roztworem kolagenazy. Aby rozluźnić tkankę łączną, w ostatnim kroku tkankę dysocjuje się, delikatnie rozdzielając ją cienkimi pęsetami, a następnie zawiesza komórki za pomocą powiększonej, wypalonem płomieniem końcówki pipety plastikowej. Po tym etapie komórki są stopniowo resuspendsowane w roztworze bogatym w wapń. Ostatecznie wykorzystuje się technikę patch clamp na całych komórkach, aby wykazać różnice w prądach potencjałowo zależnych kanałów potasowych.Główną zaletą tej metody jest uzyskanie odpowiedniej ilości kardiomiocytów przedsionkowych (HL) oraz komorowych o dobrych parametrach do dalszych eksperymentów. Zazwyczaj naukowcy rozpoczynający pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ precyzyjne wykonanie tej procedury i osiągnięcie naprawdę dobrych wyników wymaga dużej wprawy. Po wstrzyknięciu środków znieczulających oraz 250 IU heparyny, upewniam się, że mysz jest głęboko znieczulona, uciskając ogon w celu sprawdzenia odruchu ucieczki.Następnie przenieś mysz na stół operacyjny w pozycji grzbietowej. Następnie wykonaj nacięcie skóry i ściany brzusznej poniżej wyrostka mieczowatego, aby przeprowadzić torakotomię typu clamshell.Przedłuż nacięcie na obie strony wzdłuż łuku żebrowego. Następnie przetnij żebra w linii pachowej przyśrodkowej i odchyl klatkę piersiową ku górze. Po tym otworzy osierdzie i zlokalizuj duże naczynia.Delikatnie uciśnij serce w naczyniu do gotowania, aby lepiej wyeksponować aortę. Następnie zaklemuj aortę za pomocą pęsety. Ostrożnie unieś serce, po czym umieść nożyczki pod sercem i przetnij wszystkie łączące je naczynia jednym cięciem.Należy zachować odpowiednio duży fragment aorty wstępującej w celu kanulacji lewej tętnicy wieńcowej (Lor). Następnie wycięte serce należy niezwłocznie przenieść do szalki Petriego wypełnionej lodowatym roztworem pre. One. W tej procedurze aortę kanuluje się za pomocą stalowej kaniuli 1,8 French, dbając o to, aby uniknąć zatorowości powietrznej.Następnie przymocuj aortę do kaniuli za pomocą szwu chirurgicznego. Po tym przepłucz tętnice wieńcowe jednym mililitrem roztworu. Podłącz kaniulę do aparatu Langendorka, aby uniknąć przedłużonego uszkodzenia mięśnia sercowego w wyniku niedokrwienia i reperfuzji.Należy upewnić się, że procedury od torakotomii do kanulacji lewego przedsionka zostaną wykonane w ciągu 120 sekund. Następnie, po uprzednim napełnieniu cewki grzewczej systemu Langendorffa roztworem bezwapniowym, należy przepłukać serce 10 mililitrami tego roztworu z prędkością 4 mililitrów na minutę.Następnie należy przeprowadzić perfuzję serca roztworem kolagenazy. Proces ten trwa od trzech do ośmiu minut przy przepływie 4 mL/min. Teraz należy przenieść serce do podgrzanej wcześniej 100 mm szalki Petriego zawierającej roztwór z niską zawartością wapnia.Ostrożnie usuń aortę i inne tkanki poza sercem za pomocą nożyczek. Następnie oddziel przedsionki od komór, utrzymując tkankę przedsionkową i komorową w niewielkiej ilości roztworu. Po czwarte, aby wyizolować kardiomiocyty przedsionkowe, przenieś przedsionki do oddzielnej, uprzednio ogrzanej szalki hodowlanej o średnicy 100 mm.Rozdziel tkankę, delikatnie rozciągając ją pęsetą precyzyjną, aż zostanie ona niemal całkowicie zdysocjowana. Następnie, używając pipety o objętości 1 ml z powiększoną, wypalaną plastikową końcówką, zawieś komórki w 1 ml roztworu. W przypadku komórek przedsionkowych zastosuj 4 lub 5 ml roztworu.Inkubować komórki komorowe przez pięć minut. Następnie oddzielić komórki od zanieczyszczeń, używając filtra komórkowego o rozmiarze oczek 200 micron. Wirować komórki w roztworze czwartym przez jedną minutę w przypadku komórek przedsionkowych oraz przez dwie minuty w przypadku komórek komorowych w temperaturze pokojowej przy 16 ×g w dygestorium do hodowli komórkowych, odlać nadsącz i zawiesić osad w pięciu mililitrach roztworu.Pięć dla komórek przedsionkowych i około 20 do 25 mililitrów. W przypadku komórek komorowych należy delikatnie potrząsnąć probówką, aby rozbić pellet komórkowy, a następnie ponownie odwirować przez jedną minutę w temperaturze pokojowej przy 16 ×g. Po drugim wirowaniu ponownie odlać nadsącz i resuspender pellet w pięciu mililitrach roztworu. Sześć dla komórek przedsionkowych i około 20 do 25 mililitrów dla komórek komorowych.Następnie pozostaw komórki do sedymentacji na 10 minut. W komorze z laminarnym przepływem powietrza usuń nadsącz, a następnie dokonaj zliczenia komórek. Do badań elektrofizjologicznych dodaj do komórek od 25 do 50 mililitrów roztworu sześć.Przechowywać miocyty w roztworze sześć w probówce o pojemności 50 ml, zapobiegając sedymentacji. Do barwienia immunofluorescencyjnego przygotować szalkę do hodowli komórek z szkiełkami podstawowymi pokrytymi roztworem lamininy w stężeniu końcowym 50 µg/ml.Inkubować szalkę z hodowlą komórkową w lamininie w PBS przez dwie godziny w temperaturze 37 °C. Następnie usunąć roztwór lamininy. Przed wysianiem miocytów pod mikroskopem, wysiać komórki i kontrolować gęstość komórkową.Pozostawić miocyty do przywiernięcia do szkiełka nakrywki na jedną godzinę w temperaturze 37 °C w 2% CO2. Po godzinie usunąć roztwór i niezwłocznie rozpocząć standardowy protokół procedury barwienia. Następnie inkubować miocyty z utrwalaczem.Na przykład, 4% PFA w PBS o pH 7,5 przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy przeprowadzić trzy etapy płukania w PBS po pięć minut każdy, aby przepuścić odczynniki do wnętrza komórek i zahamować nieswoiste wiązanie przeciwciał. Miocyty należy inkubować z 10% serum, 0,3% Triton i 0,2% BSA w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie inkubować je z przeciwciałem pierwszorzędowym przez jedną godzinę w temperaturze 37°C i przemyć zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie inkubować z przeciwciałem wtórnym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w celu przeciwbarwienia jąder komórkowych oraz alfa-aktyniny. Inkubować przeciwciało wtórne z DPI oraz fluorochromem sprzężonym z phin przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Po transferze po przemywaniu, szkiełko zakrywkowe ostrożnie przesuwa się na szkiełka mikroskopowe potraktowane solą fizjologiczną. Następnie komórki zatapia się w medium montażowym do fluorescencji w celu przeprowadzenia rejestracji metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell. Zdrowo wyglądające kardiomiocyty przenosi się do komory perfuzyjnej wypełnionej określoną objętością zewnątrzkomórkowego roztworu kąpielowego.Należy użyć odpowiedniego sprzętu do techniki patch clamp oraz pipet do patch clamp o oporności od trzech do pięciu mega omów po wypełnieniu ich roztworem wewnątrzkomórkowym. W przypadku standardowych pomiarów patch clamp, po wykonaniu patchu i uzyskaniu giga seal, należy zastosować standardowy protokół pomiaru prądów potasowych poprzez wywołanie wychodzących prądów potasowych za pomocą 4,5 sekundowych skoków napięcia od minus 60 milliwoltów do 50 milliwoltów w przyrostach 10 milliwoltów. Należy upewnić się, że prądy upływu są zawsze mniejsze niż 100 piko amperów.Aby odróżnić poszczególne prądy potasowe, należy zastosować specyficzne inhibitory, takie jak four amino paridine, hetero potto, toin lub tetraethyl ammonium. Roztwory zapasowe powinny zostać przygotowane w zewnętrznym roztworze kąpieli i podane bezpośrednio w jak najbliższym sąsiedztwie komórki za pomocą mikrokapilary. Po przeprowadzeniu pomiarów bazowych.Przed rozpoczęciem rejestracji po aplikacji leku należy odczekać od dwóch do trzech minut w celu osiągnięcia stanu równowagi. Na koniec należy przeanalizować dane offline przy użyciu oprogramowania P clamp 10.3 lub porównywalnego oprogramowania. Ta rycina przedstawia przykładowy kardiomiocyt komorowy zabarwiony DPI oraz LOR 4 88 Phin. A tutaj znajdują się przykładowe ślady z rejestracji whole cell patch clamp.Rysunek ten przedstawia przykładowy kardiomiocyt przedsionkowy zabarwiony DPI oraz fluorochromem sprzężonym z phin. Tutaj natomiast znajdują się przykładowe zapisy z rejestracji metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell. Po opanowaniu tej techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, procedura zajmuje mniej więcej półtorej godziny. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat izolacji kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych z genetycznie zmodyfikowanych myszy.

isolation-kv-channel-recordings-murine-atrial-ventricular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja i rejestrowanie kanałów Kv w komórkach mięśnia sercowego przedsionków i komór mysich

Opisujemy izolację ludzkich miocytów przedsionkowych, które mogą być używane do wewnątrzkomórkowych pomiarów Ca2+ w połączeniu z elektrofizjologicznymi badaniami patch-clamp.

Izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądów błonowych

Tutaj opisujemy izolację dorosłych kardiomioktyesów myszy za pomocą systemu perfuzyjnego Langendorffa.  Powstałe komórki tolerują Ca2+, są elektrycznie uśpione i mogą być hodowane i transfekowane adeno- lub lentiwirusami w celu manipulowania ekspresją genów.  Ich funkcjonalność może być również analizowana za pomocą systemu MMSYS i technik zacisków krosowych.

Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

Pojedyncze kardiomiocyty od myszy typu dzikiego i zmutowanych mogą być izolowane z serca w celu zbadania ich kurczliwości i przejściowych stanów wapnia. Pozwala to na scharakteryzowanie udziału dysfunkcji komórkowej w dysfunkcji serca z dowolnej przyczyny.

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Obecna wiedza na temat komórkowych podstaw chorób serca opiera się głównie na badaniach na modelach zwierzęcych. W tym miejscu opisujemy i walidujemy nowatorską metodę uzyskiwania pojedynczych żywotnych kardiomiocytów z małych próbek chirurgicznych ludzkiego mięśnia sercowego komorowego. Ludzkie miocyty komorowe mogą być wykorzystywane do badań elektrofizjologicznych i testów leków.

Izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną, opartą na Langendorffie procedurę izolacji jednokomórkowych kardiomiocytów przedsionkowych z szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową. Ręczna regulacja ciśnienia śródświetlnego w jamach serca jest wdrażana w celu uzyskania funkcjonalnie nienaruszonych miocytów odpowiednich do badań pobudzenia, skurczu i sprzężenia.

Izolacja kardiomiocytów przedsionkowych od szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową

Ten protokół jest używany do izolowania pojedynczych kardiomiocytów przedsionkowych z serca dorosłej myszy za pomocą metody trawienia fragmentów. Podejście to stosuje się do izolacji miocytów prawego lub lewego przedsionka, które można wykorzystać do scharakteryzowania elektrofizjologii miocytów przedsionków w badaniach typu patch-clamp.

Izolacja miocytów przedsionkowych od dorosłych myszy

Prezentowany jest protokół izolacji ludzkich i zwierzęcych kardiomiocytów komorowych z wyciętych wibratomem plastrów mięśnia sercowego. Wysoką wydajność komórek tolerujących wapń (do 200 komórek/mg) można uzyskać z niewielkich ilości tkanek (&lt;50 mg). Protokół ma zastosowanie do mięśnia sercowego narażonego na zimne niedokrwienie przez okres do 36 godzin.

Izolacja ludzkich kardiomiocytów komorowych z plastrów mięśnia sercowego wycinanych wibratomem

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Ten protokół opisuje modyfikacje metody Langendorffa, w tym głębokość kaniulacji aorty do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy.

Modyfikacje metody Langendorffa do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy

Poznaj metodę izolacji kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych z myszy do badań elektrofizjologicznych. Technika patch clamp pozwala analizować prądy kanałów Kv i mechanizmy arytmii serca.

Izolacja i zapisy kanału Kv w kardiomiocytach przedsionkowych i komorowych myszy

Przeglądaj więcej filmów