Wytwarzanie miejscowo transgenicznych szczurów za pomocą elektroporacji in utero i badań przesiewowych bioluminescencji in vivo
24 września 2013
Geny mogą być manipulowane podczas rozwoju kory mózgowej lub hipokampa szczura za pomocą elektroporacji in utero (IUE) w E16, aby umożliwić szybkie i ukierunkowane modyfikacje połączeń neuronalnych do późniejszych badań zachowania lub neuropatologii u dorosłych zwierząt. Poporodowe obrazowanie in vivo w celu kontroli powodzenia IUE wykonuje się za pomocą bioluminescencji aktywacji kotransfekowanej lucyferazy.
Ogólnym celem tej procedury jest pomyślne wyselekcjonowanie elektroporowanych owijek in utero do dalszej analizy. Osiąga się to poprzez wstrzyknięcie docelowego DNA, a następnie wykonanie elektroporacji in utero dla wybranego obszaru w mózgu. Zarodki poddane elektroporacji rozwijają się w macicy matki i rodzą się normalnie żywe.
Obrazowanie 2D służy do identyfikacji zwierząt, które zostały poddane elektroporacji w określonych punktach czasowych po urodzeniu. Wreszcie, obszar docelowy jest charakteryzowany bardziej szczegółowo przez obrazowanie 3D. Ostatecznie, te miejscowo transgeniczne szczury mogą być wykorzystane w testach behawioralnych, aby pokazać konsekwencje zaburzonego rozwoju neurologicznego na zachowanie dorosłych.
Chociaż elektroporacja jest uznaną techniką, nie jest szeroko stosowana do wytwarzania miejscowo transgenicznych dorosłych zwierząt. Jest to częściowo spowodowane wymaganymi umiejętnościami technicznymi, ale także naszą obecną niezdolnością do selekcji tylko dla udanych elektryczności nowonarodzonych szczeniąt. Przedstawiamy rozwiązanie tego problemu za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo na żywo, aby umożliwić udane obrazowanie esencji bios in vivo neutralnych szczurów elektrycznych.
Promienie Lucyfera zgłaszane przez gen jest jednocześnie elektroporowany. Wykrywanie luminescencji można aktywować przez wstrzyknięcie lucyfera w celu monitorowania przybliżonej pozycji ocenianych komórek. To z kolei pozwala wybrać pomyślnie elektroporowane czerwone trzaski.
Na początek zbierz razem sterylne materiały potrzebne do elektroporacji in utero. Następnie przygotuj roztwór DNA, który zawiera docelowy wektor D-N-A-G-F-P, wektor lucyferazy i szybki zielony barwnik. W znieczuleniu fluorowym ISO należy odsłonić macicę, aby uwidocznić zarodek, który ma zostać wstrzyknięty.
Za pomocą cienkiej szklanej igły wstrzyknij roztwór DNA do jednej z bocznych komór zarodka. Aby uderzyć w populację komórek górnych warstw kory mózgowej, umieść siedmiomilimetrową elektrodę wokół głowy zarodka i umieść elektrodę dodatnią nad komorą z lekką tendencją grzbietowo-boczną. Wykonaj elektroporację za pomocą elektroporacji impulsów fali prostokątnej, naciskając pedał nożny, aby celować w komórki hipokampa.
Umieść elektrodę dodatnią po przeciwnej stronie wstrzykiwanej komory. Przed elektroporacją najpierw rozcieńczyć sól sodową Lucyfera w PBS do stężenia 10 miligramów na mililitr i wysterylizować przez sterylną filtrację. Po zważeniu przytrzymaj szczeniaka z brzuchem uniesionym do góry i lekko rozciągniętym przed wstrzyknięciem Lucyfera, aby rozpocząć procedurę obrazowania.
Szczenięta, którym wstrzyknięto Lucyfer, są znieczulane i umieszczane w pozycji leżącej w urządzeniu ze spektrum Ivis. Pierwsze obrazy bioluminescencyjne 2D są wymagane do określenia, które szczenięta zostały pomyślnie elektroporowane podczas pracy w panelu sterowania akwizycją Ivis, wybierz tryb obrazowania bioluminescencyjnego, aby wykonać zdjęcia z góry na początku pomiaru. Sprawdź ustawienie zdjęcia i ustaw binning na średnie, a przysłonę na osiem, wybierz Użyj wysokości obiektu w ustawieniach ostrości.
Następnie ustaw filtr wzbudzenia tak, aby blokował otwieranie filtra emisji i binningowanie na średnie. Przysłona powinna być ustawiona na jeden, a poziom stage lub pole view jest ustawione na uzyskanie obrazu 2D. Przy czasie ekspozycji na luminescencję wynoszącym 180 sekund, elektroporowane obszary dodatnich szczeniąt są następnie dalej badane, wykonując zdjęcia 3D zgodnie z ustawieniami lucyferazy świetlika.
Najpierw upewnij się, że opcja zdjęcia jest wybrana, aby uzyskać zdjęcie z góry na początku obrazowania. Aby zeskanować powierzchnię zwierzęcia przed pomiarem bioluminescencji, wybierz opcję struktury dla szczeniąt do drugiego tygodnia życia. Następujące filtry emisyjne i czasy ekspozycji są wybierane ze względu na spadek siły sygnału u starszych zwierząt, czas ekspozycji jest wydłużony dla trzech najlepszych filtrów emisyjnych u szczurów starszych niż P 20.
Następnie ustaw poziom stołu montażowego tak, aby był wygięty na średni, a F zatrzymał się na jeden i uzyskaj obraz 3D. Po obrazowaniu oznacz szczury wyraźnymi otworami usznymi, aby odróżnić je od siebie i dopasować je do obrazów obrazowania na żywo Ivis. Na koniec przenieś zwierzę na rozgrzaną powierzchnię, aż w pełni wyzdrowieje.
Obrazy 3D są generowane za pomocą oprogramowania do obsługi obrazu na żywo, które jest fabrycznie zainstalowane w systemie widma Ivis. Pierwszym krokiem jest zrekonstruowanie topografii powierzchni. Aby to zrobić, przytnij obszar zainteresowania i ustaw próg między 20 a 30%Rozpocznij rekonstrukcję DLIT 3D dla tkanki mózgowej z progiem obrazu 10% dla każdego ustawienia długości fali.
Aby utworzyć filmy 3D, wybierz przycisk animacji Na pasku narzędzi 3D manipuluj orientacją i powiększeniem obrazu 3D zgodnie z potrzebami. Następnie naciśnij przycisk nagrywania, aby śledzić przełączenie z jednej pozycji lub orientacji na inną. W tych przykładach siedem szczurów P zobrazowanych po wstrzyknięciu lucyfera nie wykazało ani żadnego sygnału luminescencji, albo słaby sygnał, albo silny sygnał luminescencji, w zależności od powodzenia elektroporacji.
Obrazy te pokazują oś czasu kolejnych pomiarów bioluminescencji u tego samego szczura, co pokazuje długie okno detekcji. Tutaj obrazy 2D pokazują udaną elektroporację do kory lub hipokampa. Docelowe obszary są dalej wizualizowane za pomocą obrazowania 3D zarówno u zwierząt elektroporowanych korowo, jak i hipokampowo.
Ten film pokazuje pomyślnie elektroporowany obszar z wielu perspektyw. W tym przykładzie docelowe lokalizacje zidentyfikowane na podstawie obrazowania 2D i 3D u żywego zwierzęcia są dalej weryfikowane poprzez bioluminescencję i wykrywanie fluorescencji GFP epi w wypreparowanym mózgu. Ten obraz wykonany z tego samego, z powodzeniem elektropostowanego mózgu szczura pokazuje szczegółowy widok komórek wyrażających GFP w P 14, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.
Metoda ta pozwala na badanie behawioralnych i neuropatologicznych konsekwencji wad neurorozwojowych. Wybór tylko szczurów, które pomyślnie poddają się elektryczności, znacznie zmniejsza koszty i wysiłek. Sukces w tej technice wymaga praktyki i ma zmienną ruchliwość i skuteczność.
Immunohistologia rdzenia elektro GFP jest ważna dla udokumentowania dokładnego obszaru transfekcji w rozdzielczościach anatomicznych w celu korekty wyników behawioralnych post-hoc.
Przegląd
To badanie przedstawia metodę manipulacji genami w korze i hipokampie szczurów poprzez elektroporację in utero (IUE) na E16. Technika ta umożliwia ukierunkowane modyfikacje w łączności neuronowej, ułatwiając późniejsze badania behawioralne i neuropatologiczne na dorosłych szczurach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Inżynieria genetyczna
- Techniki obrazowania
Tło
- Elektroporacja in utero to technika stosowana do wprowadzania DNA do rozwijających się zarodków.
- Udana elektroporacja może prowadzić do wytwarzania zwierząt transgennych do badań.
- Wizowaniu postnatalne jest kluczowe dla identyfikacji udanej elektroporacji.
- Wizowaniu bioluminescencyjne może być stosowane do monitorowania ekspresji genów w żywych zwierzętach.
Cel badania
- Rozwój niezawodnej metody wybierania szczurów z powodzeniem elektroporowanych do dalszej analizy.
- Wykorzystanie wizualizacji bioluminescencyjnej do monitorowania sukcesu elektroporacji.
- Zbadanie konsekwencji behawioralnych modyfikacji neurorozwojowych.
Zastosowane metody
- Wstrzyknięcie docelowego DNA do bocznych komór mózgu zarodków.
- Zastosowanie elektroporacji impulsowej kwadratowej do ukierunkowania na określone obszary mózgu.
- Wizowaniu postnatalne za pomocą technik bioluminescencji 2D i 3D.
- Charakteryzacja elektroporowanych obszarów poprzez obrazowanie i analizę histologiczną.
Główne wyniki
- Identyfikacja szczeniąt z powodzeniem elektroporowanych za pomocą wizualizacji bioluminescencyjnej.
- Wizowaniu 3D zapewniło szczegółową wizualizację ukierunkowanych obszarów mózgu.
- Wykazano zdolność do śledzenia ekspresji genów w czasie u żywych zwierząt.
- Podkreślono znaczenie wybierania tylko szczurów z powodzeniem elektroporowanych do badań.
Wnioski
- Metoda ta pozwala na efektywne wybieranie szczurów genetycznie zmodyfikowanych do badań behawioralnych.
- Wizowaniu in vivo zwiększa efektywność wytwarzania zwierząt transgennych.
- Dalsze badania mogą zbadać implikacje zakłóceń neurorozwojowych na zachowanie.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method addresses a key bottleneck in behavioral neuroscience: the inability to non-invasively confirm successful in utero electroporation in postnatal animals. By enabling longitudinal bioluminescence tracking of transfected cells, it improves predictive confidence in target validation and reduces attrition in preclinical model generation. The approach supports mechanistic de-risking by linking early neurodevelopmental interventions to adult phenotypic outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of therapeutic hypotheses in developing neural circuits.
- Operational Value: Facilitates selection of animals with sufficient transfection for biological effect detection.
- Strategic Value: Supports target de-risking by correlating early gene manipulation with later behavioral phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative bioluminescence readouts to standardize transfection efficiency across litters.
- Operational Value: Enables non-invasive, longitudinal monitoring of gene expression up to 5 weeks postnatal.
- Strategic Value: Improves assay reproducibility for downstream behavioral and neuropathological screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by tracking gene expression from neurodevelopment to adulthood.
- Operational Value: Allows correlation of early transfection with long-term outcomes, such as amphetamine hypersensitivity at 3 months.
- Strategic Value: Enhances translational continuity by validating target engagement in vivo over time.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical behavioral assessment, enabling iterative refinement of mechanistic hypotheses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling spatially and temporally controlled gene delivery in embryonic brain.
- Screening: Delivers assay-ready models with quantifiable transfection success for compound or phenotype screening.
- Analytics: Generates 2D and 3D bioluminescence data to compare transfection efficiency and spatial distribution.
- Translational Research: Connects embryonic manipulation to adult behavioral readouts, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating topically transgenic rats across multiple targets and brain regions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false-negative models.
- Operational Value: Standardizes prenatal transfection success assessment, reducing variability in behavioral cohorts.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing resource investment in unsuccessfully electroporated animals.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on confirmed neurodevelopmental engagement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic surgery, electroporation parameters, and postnatal imaging protocols.
- Dependent on access to IVIS Spectrum or comparable bioluminescence imaging systems with 3D reconstruction capability.
- Necessitates standardization of luciferin dosing, anesthesia, and animal handling for reproducible signal detection.
- Adaptation across models may require optimization of electrode placement and DNA construct design.
- Practical limitations include variable transfection efficacy and the need for postnatal screening to confirm success.
