Name: In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie zależnych od doświadczenia zmian molekularnych w neuronach korowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Poznaj metodę dwufotonowego obrazowania in vivo do śledzenia zmian molekularnych zależnych od doświadczenia w neuronach korowych myszy. Technika ta umożliwia badanie ekspresji genu ARC w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować L. Belluscio za sprzęt do filmowania operacji, D. Kwon za pomoc przy filmowaniu, K. Liu za pomoc w edycji wideo, oraz K. MacLeod za całą muzykę w tle. K.W. dziękuje za hojne wsparcie Wydziału Wewnętrznych Programów Badawczych NIMH oraz Programu Geny, Poznanie i Psychoza. Praca ta była wspierana przez NIMH Intramural Research Program (V.C., Y.Y., S.M. K.W.) oraz NIAAA Division of Intramural Clinical and Biological Research Program (V.C., R.M.C., D.M.L.).

Procedury eksperymentalne opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Narodowym Instytucie Zdrowia Psychicznego i były zgodne z Przewodnikiem Narodowych Instytutów Zdrowia dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych.
1. Przygotowanie przedoperacyjne
<ol>
 <li>Wyczyść wszystkie narzędzia w gorącym sterylizatorze kulkowym przed zabiegiem aseptycznym, oczyść miejsce operacji 70% etanolem i połóż czyste ściereczki. Nosić sterylne rękawice. Znieczulić zwierzę świeżo przygotowanym 1,2% roztworem awertyny, podawanym dootrzewnowo w dawce 0,02 ml/g. Alternatywnie, znieczulenie gazem izofluranowym przez stożek nosowy, 5% do indukcji, 1,5% do konserwacji, z pasywnym obwodem zmiataczy. Sprawdź poziom znieczulenia za pomocą szczypania ogona lub palców u stóp, aby zapewnić pełną sedację. </li>
 <li>Zakryj oczy zwierzęcia sterylną maścią okulistyczną i wstrzyknij podskórnie świeżo przygotowany deksametazon (0,2 mg/kg) i karprofen (5 mg/kg), aby zapobiec obrzękowi mózgu i zapaleniu11. Ogol włosy nad czaszką między uszami i wysterylizuj skórę peelingiem betadynowym i trzema naprzemiennymi wacikami z 70% etanolu. </li>
 <li>Zamontuj zwierzę w stadium operacji stereotaktycznej z nausznikami, z podkładką grzewczą z cyrkulacją wody pod zwierzęciem ustawioną na 37 °C. Regularnie sprawdzaj poziom znieczulenia zwierzęcia i w razie potrzeby uzupełniaj oryginalną dawkę środka znieczulającego. </li>
 <li>Wstrzyknij 200 μl 0,5% Marcaine pod skórę głowy, aby znieczulić ten obszar. Naciąć skórę i usunąć płat skóry nad czaszką. Usuń okostną i osusz obszar czystymi wacikami. </li>
</ol>
2. Przewlekła operacja okna czaszkowego
<ol>
 <li>Użyj szybkoobrotowej wiertarki dentystycznej z zadziorem 0,5 mm, aby delikatnie obrysować okrąg o średnicy 3-5 mm nad interesującym obszarem mózgu. Okresowo zwilżaj miejsce wiercenia sterylnym 0,9% soli fizjologicznej i usuwaj pył kostny czystymi bawełnianymi wacikami. Jeśli kość krwawi, użyj pianki żelowej nasączonej sterylną solą fizjologiczną, aby osuszyć krwawienie i poczekaj, aż się zatrzyma. </li>
 <li>Po osiągnięciu ostatniej warstwy kości podnieś i usuń wyspę kostną za pomocą kleszczy z cienką końcówką. Przyczepy opony twardej do dolnej półki kości można napotkać, jeśli okno przecina szew kostny. Powinny one być delikatnie usuwane w miarę podnoszenia płata kostnego.</li>
 <li>Delikatnie rozwałkuj zwilżoną piankę żelową na odsłoniętej oponie twardej, aby oczyścić jej powierzchnię i poczekaj, aż krwawienie z opony twardej ustanie. Krytyczny krok: nie kontynuuj, dopóki całe krwawienie z opony twardej nie ustanie. Krew, która zostaje uwięziona w oknie czaszki, zwykle prowadzi do nieprzezroczystego okna. </li>
 <li>Jeśli obszar zainteresowania znajduje się pod miejscem, w którym opona twarda jest szczególnie gruba, może być konieczne usunięcie opony twardej powyżej niej. W takim przypadku delikatnie oddziel oponę twardą od opony twardej poniżej za pomocą bardzo cienkich kleszczy, wykonaj małe nacięcie w uniesionej oponie twardej za pomocą kolejnej pary cienkich kleszczy, a następnie chwyć przycięte krawędzie i delikatnie rozłup oponę twardą. Opona twarda jest cienka, ale mocna, więc uważaj, aby nie przeciąć mózgu nienaruszonymi krawędziami opony twardej. </li>
 <li>Spłucz obszar sterylnym ACSF lub sterylnym roztworem soli fizjologicznej. </li>
 <li>Połóż sterylne szklane szkiełko nakrywkowe (3-5 mm) na oponie twardej lub pia. Krok krytyczny: Jeśli otaczająca czaszka znacznie się zakrzywia, użyj kleju Kwiksil12, aby wypełnić przestrzenie, w których opona twarda lub pia nie miałyby bliskiego kontaktu ze szkiełkiem nakrywkowym w obszarach, które nie zostaną zobrazowane. </li>
 <li>Użyj żelu cyjanoakrylowego, aby pokryć klej elastomerowy i krawędzie szkiełka nakrywkowego. Przykryj całą odsłoniętą czaszkę żelem cyjanoakrylowym lub mieszanką krazyglue i cementu dentystycznego. Krok krytyczny: Nie pozwól, aby żel cyjanoakrylowy dotykał powierzchni mózgu. </li>
 <li>Umieść wykonany na zamówienie metalowy pręt mocujący głowę na przeciwległym końcu czaszki. </li>
 <li>Zwierzę należy umieścić w ciepłej komorze rekonwalescencji, po dootrzewnowym wstrzyknięciu ketoprofenu w dawce 5 mg/kg mc. w celu leczenia bólu. Kontynuuj działanie przeciwbólowe jeszcze przez dwa dni po operacji. </li>
 <li>Po dwóch tygodniach rekonwalescencji pooperacyjnej znieczulij zwierzę izofluranem (5% do indukcji, 1,5% do konserwacji), zamontuj go w specjalnie wykonanym stoliku mikroskopowym z ramką do mocowania głowy i sprawdź okienko czaszki pod kątem przejrzystości optycznej przy oświetleniu niebieskim światłem. Przejrzystość naczyń krwionośnych na powierzchni mózgu jest wysoce wskaźnikiem jakości okna czaszkowego. Jeśli krawędzie naczyń krwionośnych są ostro zarysowane, okienko prawdopodobnie będzie nadawało się do użytku. Zalecany jest dwutygodniowy czas rekonwalescencji po operacji, aby zapewnić zwierzęciu wystarczającą ilość czasu na powrót do zdrowia po operacji. Okna czaszki zazwyczaj oczyszczają się i poprawiają w tym czasie i pozostają optycznie przezroczyste przez dodatkowe tygodnie do miesięcy, aż odrost czaszki lub pogrubienie opony twardej pogorszy jakość okna. </li>
</ol>
3. Protokół behawioralny i skaning laserowy Mikroskopia dwufotonowa
<ol>
 <li>Zwierzęta z przezroczystymi oknami czaszkowymi zostaną wystawione na bodziec środowiskowy lub poddane sesji treningu behawioralnego, a następnie zobrazowane w momencie maksymalnej ekspresji Arc-GFP. Przed rozpoczęciem protokołu behawioralnego zwierzę powinno być trzymane w spójnym środowisku klatki domowej, aby zminimalizować codzienne wahania w wyjściowych poziomach ekspresji Arc-GFP. </li>
 <li>Rozpocznij trening behawioralny lub paradygmaty stymulacji środowiskowej, w zależności od obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania. Na przykład, zwierzęta mogą być wystawione na działanie różnych środowisk wizualnych przez kolejne dni i obrazowane każdego dnia po stymulacji wzrokowej w celu zidentyfikowania reakcji specyficznych dla bodźca w korze wzrokowej10. </li>
 <li>Fluorescencja Arc-GFP w neuronach zwykle osiąga swój szczytowy poziom dwie godziny po stymulacji. Eksperymentalna oś czasu może zostać zoptymalizowana, aby ułatwić wykrywanie ekspresji Arc-GFP w neuronach przy ich szczytowych poziomach fluorescencji. </li>
 <li>Po zakończeniu treningu behawioralnego lub stymulacji środowiskowej znieczulij zwierzę izofluranem (5% do indukcji, 1,5% do konserwacji) i zamontuj zwierzę w specjalnie wykonanym stoliku mikroskopowym z ramką do mocowania głowy pod mikroskopem dwufotonowym. </li>
 <li>Pozycja głowy zwierzęcia jest przymocowana do ramy mocującej głowę, która łączy się bezpośrednio ze sceną, za pomocą wszczepionego metalowego pręta na czaszce. Izofluran i tlen są w sposób ciągły dostarczane do myszy przez stożek nosowy. Temperatura ciała jest utrzymywana za pomocą poduszki grzewczej.</li>
 <li>Upewnij się, że detektory mikroskopowe są chronione przed światłem otoczenia, przeprowadzając dwufotonowe skanowanie laserowe w ciemnym pomieszczeniu. Do obrazowania należy używać obiektywu zanurzeniowego 20x lub 25x (apertura numeryczna 1.05). Najpierw, w oświetleniu epi-fluorescencyjnym, uzyskaj obraz wzorów naczyń krwionośnych na powierzchni mózgu za pomocą kamery CCD w celu przyszłego wyrównania obrazu. </li>
 <li>Rozpocznij dwufotonowe skanowanie laserowe, aby uzyskać stos obrazów 3D. W naszej konfiguracji używany jest mikroskop wielofotonowy Olympus FV1000MPE. Długość fali wzbudzenia lasera dwufotonowego jest ustawiona na 920 nm, a moc lasera emitowanego z obiektywu jest ustawiona na około 50 mW. Emitowana fluorescencja jest jednocześnie wykrywana w kanałach zielonym i czerwonym (zwierciadło dichroiczne przy 570 nm, filtry barierowe przy 495-540 nm i 570-625 nm), za pomocą zewnętrznego dwukanałowego systemu detekcji fotomutelierowej umieszczonego w pobliżu próbki. Fluorescencja Arc-GFP pojawia się tylko w kanale zielonym, podczas gdy autofluorescencja tkankowa pojawia się w obu kanałach13, 14. </li>
 <li>Typowe stosy obrazów mają wymiary około 320x320x100 μm (szerokość x długość x głębokość), rozdzielczość poziomą 0,5 μm/piksel i rozdzielczość pionową 3 μm/piksel.</li>
 <li>Po zdobyciu stosu obrazów przywróć zwierzę do jego domowej klatki. Nie przeszkadzaj zwierzęciu do następnej sesji behawioralnej i obrazowej. Powtarzaj procedurę zachowania i obrazowania przez kilka dni zgodnie z potrzebami. Użyj wcześniej uzyskanego obrazu naczynia krwionośnego na powierzchni mózgu, aby zorientować się z powrotem w tym samym miejscu obrazowania. </li>
</ol>

<ol><li>Leslie, J. H., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-regulated+genes+as+mediators+of+neural+circuit+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity.</a> Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).</li>
<li>Flavell, S. W., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+linking+neuronal+activity+to+gene+expression+and+plasticity+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system.</a> Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).</li>
<li>Guzowski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+behaviorally+relevant+neural+circuits+with+immediate-early+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate-early gene expression.</a> Current opinion in neurobiology. 15 (5), 599-606 (2005).</li>
<li>Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+circuits+and+systems+using+transgenic+reporters+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Visualizing circuits and systems using transgenic reporters of neural activity.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 17 (5), 567-5671 (2007).</li>
<li>Lyford, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+growth+factor+and+activity-regulated+gene%2C+encodes+a+novel+cytoskeleton-associated+protein+that+is+enriched+in+neuronal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites.</a> Neuron. 14 (2), 433-445 (1995).</li>
<li>Link, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatodendritic+expression+of+an+immediate+early+gene+is+regulated+by+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Somatodendritic expression of an immediate early gene is regulated by synaptic activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5734-5738 (1995).</li>
<li>Shepherd, J. D., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+views+of+Arc%2C+a+master+regulator+of+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticity.</a> Nature neuroscience. 14 (3), 279-284 (2011).</li>
<li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in Neurosciences. 34 (4), 177-187 (2011).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Wang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+a+role+of+arc+in+enhancing+orientation+specificity+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex.</a> Cell. 126 (2), 389-402 (2006).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), e680(2008).</li>
<li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Large-Scale+Neural+Activity+with+Cellular+Resolution+in+Awake%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+Mice.+Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake.</a> Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li>
<li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> PNAS. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li>
<li>Eichhoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+of+the+aging+and+diseased+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Nucl.+Med.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging of the aging and diseased brain.</a> Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 99-106 (2008).</li>
<li>Klohs, J., Rudin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+molecular+events+in+the+brain+by+noninvasive+imaging.+The+Neuroscientist%3A+a+review+journal+bringing+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22neurology+and+psychiatry%22%5BJournal%5D)">Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist: a review journal bringing neurobiology.</a> neurology and psychiatry. 17 (5), 539-559 (2011).</li>
<li>Chen, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chamber+and+artificial+dura+method+for+long-term+optical+imaging+in+the+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey.</a> Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).</li>
<li>Kleinfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).</li>
<li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).</li>
<li>Stosiek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Opisana tutaj metoda obrazowania in vivo umożliwia wielokrotne badanie zmian ekspresji genu Arc w tych samych zestawach neuronów przez wiele dni u żywego zwierzęcia. Jest to skuteczna i wszechstronna metoda uzyskiwania informacji o dynamice molekularnej związanej z plastycznością neuronalną w poszczególnych neuronach w odpowiedzi na różne doświadczenia behawioralne. Standardowe metody histochemiczne, takie jak hybrydyzacja in situ i barwienie immunologiczne, mogą osiągnąć rozdzielczośćpojedynczej...

<table><tbody><tr><td>Wielofotonowy laserowy mikroskop skaningowy FV1000 Mikroskop do</td><td>obrazowania</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE</td> Mikroskop</tr><tr><td>preparacyjny</td><td>Omano</td><td>555V107</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Etap operacji stereotaksji dla myszy</td><td>Aparat Harvarda</td><td>726335</td><td>Chirurgia</td>Obiektyw</tr><tr><td>zanurzeniowy 20X lub 25X</td><td></td><td></td> Stopień mikroskopu <td>obrazowania</td>Olympus XLPL25XWMP</tr><tr><td>z rama do mocowania głowy</td><td>Wykonane na zamówienie</td><td>obrazowanie</td><td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>Drobne kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11251-20</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Frez dentystyczny</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>QImaging</td><td>QICAM 12-bitowe</td><td>obrazowanie</td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) dwufotonowe obrazowanie zależnych od doświadczenia zmian molekularnych w neuronach korowych

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Zdolność mózgu do zmian w odpowiedzi na doświadczenie jest niezbędna dla zdrowego funkcjonowania mózgu, a nieprawidłowości w tym procesie przyczyniają się do różnych zaburzeń mózgu1,2. Lepsze zrozumienie mechanizmów, za pomocą których obwody mózgowe reagują na doświadczenia zwierzęcia, wymaga możliwości monitorowania zależnych od doświadczenia zmian molekularnych w danym zestawie neuronów, przez dłuższy czas, u żywego zwierzęcia. Podczas gdy doświadczenie i związana z nim aktywność neuronalna są znane z wywoływania zmian ekspresji genów w neuronach1,2, większość metod wykrywania takich zmian nie pozwala na wielokrotną obserwację tych samych neuronów przez wiele dni lub nie ma wystarczającej rozdzielczości, aby obserwować pojedyncze neurony3,4. W tym miejscu opisujemy metodę, która łączy mikroskopię dwufotonową in vivo z genetycznie kodowanym reporterem fluorescencyjnym w celu śledzenia zależnych od doświadczenia zmian ekspresji genów w poszczególnych neuronach korowych w trakcie codziennego doświadczenia. 
Jednym z dobrze znanych genów zależnych od doświadczenia jest białko związane z cytoszkieletem (Arc) o regulowanej aktywności5,6. Transkrypcja Arc jest szybko i silnie indukowana przez wzmożoną aktywność neuronalną3, a jego produkt białkowy reguluje endocytozę receptorów glutaminianu i długoterminową plastyczność synaptyczną7. Ekspresja łuku jest szeroko stosowana jako marker molekularny do mapowania obwodów neuronalnych zaangażowanych w określone zachowania3. W większości tych badań ekspresję łuku wykryto za pomocą hybrydyzacji in situ lub immunohistochemii w nieruchomych odcinkach mózgu. Chociaż metody te ujawniły, że ekspresja Arc była zlokalizowana w podzbiorze neuronów pobudzających po doświadczeniu behawioralnym, nie zbadano, w jaki sposób wzorce komórkowe ekspresji Arc mogą się zmieniać z wieloma epizodami powtarzających się lub charakterystycznych doświadczeń w ciągu kilku dni. 
Mikroskopia dwufotonowa in vivo oferuje potężny sposób badania zależnych od doświadczenia zmian komórkowych w żywym mózgu8,9. Aby umożliwić badanie ekspresji łuku w żywych neuronach za pomocą mikroskopii dwufotonowej, wcześniej wygenerowaliśmy linię myszy knock-in, w której reporter GFP jest umieszczony pod kontrolą endogennego promotora łuku10. Protokół ten opisuje przygotowania chirurgiczne i procedury obrazowania do śledzenia zależnych od doświadczenia wzorców ekspresji Arc-GFP w zespołach neuronalnych u żywego zwierzęcia. W tej metodzie przewlekłe okna czaszki zostały najpierw wszczepione myszom Arc-GFP w obszarach kory mózgowej. Zwierzęta te były następnie wielokrotnie obrazowane za pomocą mikroskopii dwufotonowej według pożądanych paradygmatów behawioralnych w ciągu kilku dni. Metoda ta może być ogólnie stosowana do zwierząt będących nosicielami innych fluorescencyjnych reporterów zmian molekularnych zależnych od doświadczenia4.

Niniejszy protokół opisuje metodę śledzenia zależnych od doświadczenia zmian molekularnych w pojedynczych neuronach kory mózgowej u żywych zwierząt. W pierwszej kolejności tworzone jest chroniczne okno czaszkowe nad obszarem kory stanowiącym przedmiot zainteresowania u myszy posiadającej fluorescencyjny reporter ekspresji genów. Następnie mikroskopia dwufotonowa może zostać połączona z różnymi paradygmatami behawioralnymi w celu obserwacji indukowanych behawioralnie zmian molekularnych w pojedynczych neuronach oraz śledz...

Zależne od doświadczenia zmiany molekularne w neuronach są niezbędne dla zdolności mózgu do adaptacji w odpowiedzi na wyzwania behawioralne. Opisano tutaj metodę obrazowania dwufotonowego in vivo, która umożliwia śledzenie takich zmian molekularnych w poszczególnych neuronach korowych za pomocą genetycznie kodowanych reporterów.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie zależnych od doświadczenia zmian molekularnych w neuronach korowych

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Doświadczane zależne zmiany molekularne w neuronach są niezbędne dla zdolności mózgu do adaptacji w odpowiedzi na wyzwania behawioralne. Opisano tutaj metodę obrazowania dwufotonowego in vivo, która umożliwia śledzenie takich zmian molekularnych w poszczególnych neuronach korowych za pomocą genetycznie kodowanych reporterów. Jednym z dobrze ugruntowanych, doświadczonych genów zależnych jest regulowane przez aktywność białko związane z cytoszkieletem lub łuk.Transkrypcja ARC jest szybko i silnie indukowana przez zintensyfikowaną aktywność neuronalną Aby umożliwić badanie ekspresji łuku w żywych neuronach za pomocą dwóch mikroskopów fotograficznych, wykorzystujemy linię myszy knockin, w której reporter GFP jest umieszczony pod kontrolą endogennego promotora łuku. Protokół ten opisuje przygotowania chirurgiczne i procedury obrazowania do śledzenia doświadczonych wzorców ekspresji GFP zależnego łuku w zespołach neuronalnych u żywego zwierzęcia. Najpierw opiszemy przygotowanie zwierząt potrzebne do tej techniki.Zwierzę z łukiem GFP przejdzie operację okna czaszki i dojdzie do siebie po operacji przez około dwa tygodnie. Jakość okna czaszkowego jest następnie sprawdzana i jeśli neurony mogą być przez nie zobrazowane, zwierzę umieszcza się w qua środowisku do czasu rozpoczęcia eksperymentów z obrazowaniem behawioralnym i dwoma fotonami. Zwierzęta te są następnie wielokrotnie obrazowane za pomocą dwóch mikroskopów fotograficznych.Po ukończeniu pożądanych paradygmatów behawioralnych w ciągu kilku dni, wyczyść wszystkie narzędzia w sterylizatorze z gorącymi kulkami. Przed zabiegiem aseptycznym oczyść miejsce operacji 70% etanolem i odłóż czyste ściereczki. Znieczulić zwierzę 1,2% roztworem Everton podawanym w dawce 0,02 mililitra na gram dootrzewnowo.Sprawdź poziom znieczulenia za pomocą szczypania ogona lub palców u stóp, aby zapewnić pełną sedację. Zakryj oczy zwierzęcia sterylną maścią okulistyczną i wstrzyknij podskórnie deksametazon 0,2 miligrama na kilogram i karprofen pięć miligramów na kilogram. Ogolić włosy nad czaszką między uszami i wysterylizować skórę za pomocą peelingu Betadine i trzech naprzemiennych wacików z 70% etanolem, zamontuj zwierzę w stereotaktycznym etapie chirurgii z paskami do uszu z podkładką grzewczą z cyrkulacją wody pod zwierzęciem ustawioną na 37 stopni.Regularnie sprawdzaj poziom znieczulenia zwierzęcia i w razie potrzeby uzupełniaj oryginalną dawkę środka znieczulającego. Wstrzyknij 200 mikrolitrów 0,5% Marcaine pod skórę głowy, aby znieczulić obszar, naciąć skórę i usunąć płat skóry nad czaszką. Usuń okostną i osusz obszar czystymi wacikami.Użyj szybkoobrotowej wiertarki dentystycznej z zadziorem o średnicy 0,5 milimetra, aby delikatnie obrysować okrąg o średnicy od trzech do pięciu milimetrów nad obszarem mózgu, który Cię interesuje, w zależności od potrzeb. Okresowo zwilżaj miejsce wiercenia sterylnym 0,9% soli fizjologicznej i usuwaj pył kostny czystymi wacikami. Jeśli kość krwawi, użyj pianki żelowej nasączonej sterylną solą fizjologiczną, aby osuszyć krwawienie i poczekaj, aż się zatrzyma.Po osiągnięciu ostatniej warstwy kości podnieś i usuń wyspę kostną za pomocą kleszczy z cienką końcówką. Możesz napotkać przyczepy opony twardej do dolnej półki kości. Jeśli twoje okno krzyżuje się ze szwem kostnym, należy je delikatnie usunąć.Gdy płat kostny zostanie podniesiony, delikatnie rozwałkuj wilgotną i żelową piankę na odsłoniętej oponie twardej, aby oczyścić jej powierzchnię i poczekaj, aż krwawienie z opony twardej ustanie. Jeśli obszar zainteresowania znajduje się w miejscu, w którym opona twarda jest szczególnie gruba, może być konieczne usunięcie opony twardej powyżej niej. W takim przypadku delikatnie oddziel oponę twardą od PIA poniżej za pomocą bardzo cienkich kleszczyków.Wykonaj małe nacięcie w uniesionej oponie twardej za pomocą kolejnej pary cienkich kleszczy. Następnie chwyć przycięte krawędzie i delikatnie rozłup oponę twardą. Opona twarda jest cienka, ale mocna, więc uważaj, aby nie przeciąć mózgu nienaruszonymi krawędziami opony twardej.Podczas pracy z powrotem i z dala od obszaru zainteresowania, spłucz ten obszar obficie sterylnym płynem mózgowo-rdzeniowym A lub sterylną solą fizjologiczną. Jeśli otaczająca czaszka zakrzywia się znacznie wokół odsłoniętej opony twardej lub pia, użyj kleju do szybkich komórek, aby wypełnić przestrzenie, które nie miałyby bliskiego kontaktu z szkiełkiem osłony okna w obszarach, które nie zostaną zobrazowane. Następnie delikatnie połóż sterylną szklaną pokrywę na oponie twardej lub pia.Użyj żelu akrylowego Sano, aby pokryć klej elastomerowy i krawędzie szkła. Szkiełko nakrywkowe. Przykryj całą odsłoniętą czaszkę żelem cyjanoakrylowym Sano lub szaloną mieszanką kleju i cementu dentystycznego.Osadź wykonany na zamówienie metalowy pręt mocujący głowę na przeciwległym końcu czaszki. Umieść zwierzę w ciepłej komorze rekonwalescencji po dootrzewnowym wstrzyknięciu ketoprofenu w ilości pięciu miligramów na kilogram w celu leczenia bólu. Kontynuuj leczenie przeciwbólowe przez dwa dni po operacji.Po dwóch tygodniach rekonwalescencji pooperacyjnej znieczulij zwierzę fluorem ISO. 5% do indukcji, 1,5% do konserwacji. Zamontuj go w specjalnie wykonanym stoliku mikroskopowym z ramą mocującą głowę i sprawdź okienko czaszki pod kątem przejrzystości optycznej.Przy oświetleniu niebieskim światłem przejrzystość naczyń krwionośnych powierzchni mózgu jest wysoce wskaźnikiem jakości okna czaszkowego. Jeśli ich krawędzie są ostro zarysowane, okno prawdopodobnie będzie użyteczne. Przed rozpoczęciem protokołu behawioralnego zwierzę powinno być trzymane w spójnym środowisku klatki domowej, aby zminimalizować codzienną zmienność.W łuku wyjściowym poziomy ekspresji GFP rozpoczynają paradygmaty treningu behawioralnego lub stymulacji środowiskowej w zależności od obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania. Na przykład zwierzęta mogą być wystawione na działanie różnych środowisk wizualnych w ciągu kolejnych dni, aby zobrazować charakterystyczne populacje neuronów w łuku kory wzrokowej, fluorescencja GFP w neuronach zwykle osiąga szczytowy poziom dwie godziny po stymulacji. Eksperymentalna oś czasu może zostać zoptymalizowana w celu ułatwienia wykrywania ekspresji ARC GFP w neuronach przy ich szczytowych poziomach fluorescencji.Po zakończeniu sesji treningu behawioralnego lub stymulacji środowiskowej znieczulij zwierzę fluorem ISO 5% w celu indukcji, 1,5% w celu utrzymania. Zamontuj zwierzę w specjalnie wykonanym stoliku mikroskopowym z ramką do mocowania głowy. Pod mikroskopem dwufotonowym pozycja głowy zwierzęcia jest ustalana na ramie mocującej głowę, która łączy się bezpośrednio ze stolikiem za pomocą wszczepionego metalowego pręta na czaszce.Fluor ISO i tlen są stale dostarczane do myszy przez stożek nosowy. Temperatura ciała jest utrzymywana za pomocą poduszki grzewczej. Upewnij się, że detektory mikroskopowe są chronione przed światłem otoczenia.Przeprowadzając dwufotonowe skanowanie laserowe w ciemnym pomieszczeniu, do obrazowania użyj soczewki zanurzeniowej z aperturą numeryczną 20 x lub 25 x 1,05. Najpierw, w oświetleniu fluorescencyjnym epi, uzyskaj obraz wzorów naczyń krwionośnych na powierzchni obszaru mózgu za pomocą kamery CCD. Aby w przyszłości wyrównać obraz, rozpocznij skanowanie laserowe dwoma fotonami, aby uzyskać stos obrazów 3D.Długość fali wzbudzenia lasera dwufotonowego jest ustawiona na 920 nanometrów, a moc jest ustawiona na około 50. Miliwaty emitowane fluorescencja jest jednocześnie wykrywana zarówno w łuku kanału zielonego, jak i czerwonego. Fluorescencja GFP pojawia się tylko w kanale zielonym, podczas gdy autofluorescencja tkankowa pojawia się w obu kanałach.Typowe stosy obrazów mają wymiary około 320 na 300, 20 na 100 mikrometrów, rozdzielczość poziomą 0,5 mikrometra na piksel i rozdzielczość pionową trzy mikrometry na piksel. Po zdobyciu stosu obrazów przywróć zwierzę do jego domowej klatki. Nie przeszkadzaj zwierzęciu do następnej sesji behawioralnej i obrazowej.Powtarzaj procedurę zachowania i obrazowania przez kilka dni zgodnie z potrzebami. Użyj wcześniej uzyskanego obrazu naczynia krwionośnego na powierzchni mózgu, aby zorientować się z powrotem w tym samym miejscu obrazowania. Mocną stroną tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie zmian ekspresji genu łuku w tym samym zestawie neuronów przez wiele dni.W żywym zwierzęciu. Standardowe metody histochemiczne pozwalają osiągnąć rozdzielczość pojedynczej komórki, ale nie są w stanie śledzić zmian ekspresji genów w tych samych neuronach przez wiele dni. Inne techniki obrazowania, takie jak rezonans magnetyczny lub metody obrazowania jądrowego, nie mają rozdzielczości pozwalającej na obrazowanie pojedynczych neuronów.W związku z tym żadne inne istniejące metody pomiaru zmian ekspresji genów nie mogą dorównać zarówno rozdzielczości przestrzennej, jak i czasowemu pokryciu opisanej tutaj metody obrazowania. Kluczowym krokiem w tej procedurze jest operacja okna czaszki. Należy go wykonywać ze szczególną ostrożnością, aby uniknąć urazu mózgu lub pozostawienia krwi pod szkiełkiem nakrywkowym.W razie potrzeby oponę twardą można usunąć. Należy pamiętać, że maksymalna głębokość obrazowania w mózgu przy użyciu tej procedury będzie zależeć od przejrzystości okna czaszki, ustawienia mikroskopu i jasności fluorescencyjnych reporterów. Ten protokół obrazowania in vivo jest skuteczną i wszechstronną metodą uzyskiwania informacji na temat dynamiki molekularnej związanej z neuroplastycznością w poszczególnych neuronach w odpowiedzi na różne doświadczenia behawioralne i prawdopodobnie będzie ogólnie stosowany u myszy transgenicznych przenoszących fluorescencyjne reportery dla innych doświadczonych regulowanych genów.

in-vivo-two-photon-imaging-experience-dependent-molecular-changes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

In Vivo dwufotonowe obrazowanie zmian molekularnych u neuronów kory mózgu zależnych od doświadczeń

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

Opisano małoinwazyjny protokół stabilizacji kręgosłupa myszy oraz wykonywania powtarzalnego obrazowania rdzenia kręgowego in vivo z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej. Metoda ta łączy urządzenie do stabilizacji kręgosłupa z reżimem anestezjologicznym w celu zminimalizowania ruchów wywołanych oddychaniem i uzyskania surowych danych obrazowych, które nie wymagają wyrównania ani innego przetwarzania końcowego.

Obrazowanie in vivo rdzenia kręgowego myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Source: Mizuno, H., et al. In Vivo Dwufotonowe obrazowanie neuronów korowych u noworodków myszy. J. Vis. Exp. (2018)Ten film prezentuje mikroskopię dwufotonową używaną do obrazowania neuronów w mózgu znieczulonego transgenicznego szczeniaka myszy. Laser dwufotonowy pozwala na głębsze obrazowanie z wysoką rozdzielczością przestrzenną i minimalnym rozpraszaniem światła, umożliwiając szczegółowe uchwycenie morfologii neuronów, w tym projekcji dendrytycznych.

Mikroskopia dwufotonowa do obrazowania morfologii neuronów u szczeniaka myszy

Źródło: Kamei, R., et al., In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2022)Film przedstawia proces konfiguracji i obrazowania do mikroskopii dwufotonowej in vivo dynamiki mikrogleju w hipokampie CA1 (Cornu ammonis 1) i zakręcie zębatym, zapewniając optymalne wyrównanie optyczne i ocenę integralności strukturalnej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo dynamiki mikrogleju w hipokampie myszy

Opisano metodę znakowania neuronów barwnikami fluorescencyjnymi w określonych funkcjonalnych mikrodomenach kory nowej. Po pierwsze, obrazowanie optyczne sygnału wewnętrznego służy do uzyskania mapy funkcjonalnej. Następnie mikroskopia dwufotonowa jest używana do oznaczania i obrazowania neuronów w mikrodomenie mapy.

Celowane znakowanie neuronów w specyficznej funkcjonalnej mikrodomenie kory nowej poprzez połączenie sygnału wewnętrznego i obrazowania dwufotonowego

Obrazowanie poklatkowe u żywego zwierzęcia dostarcza cennych informacji na temat reorganizacji strukturalnej w nienaruszonym mózgu. Tutaj wprowadzamy preparat z rozcieńczoną czaszką, który umożliwia przezczaszkowe obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie struktur synaptycznych w żywej korze myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Prezentujemy protokół obrazowania in vivo dwufotonowego do obrazowania kory mózgowej noworodków myszy. Metoda ta jest odpowiednia do analizy dynamiki rozwojowej neuronów korowych, mechanizmów molekularnych kontrolujących dynamikę neuronów oraz zmian w dynamice neuronów w modelach chorób.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie neuronów korowych u nowonarodzonych myszy

Ta metoda opisuje chroniczne przygotowanie, które umożliwia optyczny dostęp do hipokampa żywych myszy. Preparat ten może być stosowany do wykonywania podłużnego obrazowania optycznego plastyczności strukturalnej neuronów i plastyczności komórkowej wywołanej aktywnością przez okres kilku tygodni.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy

Ten artykuł opisuje metodę przewlekłej obserwacji in vivo spoczynkowego mikrogleju w mysim hipokampie CA1 przy użyciu precyzyjnie kontrolowanej chirurgii i mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Przewlekłe dwufotonowe obrazowanie mikrogleju w hipokampie myszy

Poznaj metodę dwufotonowego obrazowania in vivo do śledzenia zmian molekularnych zależnych od doświadczenia w neuronach korowych myszy. Technika ta umożliwia badanie ekspresji genu ARC w czasie rzeczywistym.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie zależnych od doświadczenia zmian molekularnych w neuronach korowych

Przeglądaj więcej filmów