In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie zależnych od doświadczenia zmian molekularnych w neuronach korowych

Doświadczane zależne zmiany molekularne w neuronach są niezbędne dla zdolności mózgu do adaptacji w odpowiedzi na wyzwania behawioralne. Opisano tutaj metodę obrazowania dwufotonowego in vivo, która umożliwia śledzenie takich zmian molekularnych w poszczególnych neuronach korowych za pomocą genetycznie kodowanych reporterów. Jednym z dobrze ugruntowanych, doświadczonych genów zależnych jest regulowane przez aktywność białko związane z cytoszkieletem lub łuk.

Transkrypcja ARC jest szybko i silnie indukowana przez zintensyfikowaną aktywność neuronalną Aby umożliwić badanie ekspresji łuku w żywych neuronach za pomocą dwóch mikroskopów fotograficznych, wykorzystujemy linię myszy knockin, w której reporter GFP jest umieszczony pod kontrolą endogennego promotora łuku. Protokół ten opisuje przygotowania chirurgiczne i procedury obrazowania do śledzenia doświadczonych wzorców ekspresji GFP zależnego łuku w zespołach neuronalnych u żywego zwierzęcia. Najpierw opiszemy przygotowanie zwierząt potrzebne do tej techniki.

Zwierzę z łukiem GFP przejdzie operację okna czaszki i dojdzie do siebie po operacji przez około dwa tygodnie. Jakość okna czaszkowego jest następnie sprawdzana i jeśli neurony mogą być przez nie zobrazowane, zwierzę umieszcza się w qua środowisku do czasu rozpoczęcia eksperymentów z obrazowaniem behawioralnym i dwoma fotonami. Zwierzęta te są następnie wielokrotnie obrazowane za pomocą dwóch mikroskopów fotograficznych.

Po ukończeniu pożądanych paradygmatów behawioralnych w ciągu kilku dni, wyczyść wszystkie narzędzia w sterylizatorze z gorącymi kulkami. Przed zabiegiem aseptycznym oczyść miejsce operacji 70% etanolem i odłóż czyste ściereczki. Znieczulić zwierzę 1,2% roztworem Everton podawanym w dawce 0,02 mililitra na gram dootrzewnowo.

Sprawdź poziom znieczulenia za pomocą szczypania ogona lub palców u stóp, aby zapewnić pełną sedację. Zakryj oczy zwierzęcia sterylną maścią okulistyczną i wstrzyknij podskórnie deksametazon 0,2 miligrama na kilogram i karprofen pięć miligramów na kilogram. Ogolić włosy nad czaszką między uszami i wysterylizować skórę za pomocą peelingu Betadine i trzech naprzemiennych wacików z 70% etanolem, zamontuj zwierzę w stereotaktycznym etapie chirurgii z paskami do uszu z podkładką grzewczą z cyrkulacją wody pod zwierzęciem ustawioną na 37 stopni.

Regularnie sprawdzaj poziom znieczulenia zwierzęcia i w razie potrzeby uzupełniaj oryginalną dawkę środka znieczulającego. Wstrzyknij 200 mikrolitrów 0,5% Marcaine pod skórę głowy, aby znieczulić obszar, naciąć skórę i usunąć płat skóry nad czaszką. Usuń okostną i osusz obszar czystymi wacikami.

Użyj szybkoobrotowej wiertarki dentystycznej z zadziorem o średnicy 0,5 milimetra, aby delikatnie obrysować okrąg o średnicy od trzech do pięciu milimetrów nad obszarem mózgu, który Cię interesuje, w zależności od potrzeb. Okresowo zwilżaj miejsce wiercenia sterylnym 0,9% soli fizjologicznej i usuwaj pył kostny czystymi wacikami. Jeśli kość krwawi, użyj pianki żelowej nasączonej sterylną solą fizjologiczną, aby osuszyć krwawienie i poczekaj, aż się zatrzyma.

Po osiągnięciu ostatniej warstwy kości podnieś i usuń wyspę kostną za pomocą kleszczy z cienką końcówką. Możesz napotkać przyczepy opony twardej do dolnej półki kości. Jeśli twoje okno krzyżuje się ze szwem kostnym, należy je delikatnie usunąć.

Gdy płat kostny zostanie podniesiony, delikatnie rozwałkuj wilgotną i żelową piankę na odsłoniętej oponie twardej, aby oczyścić jej powierzchnię i poczekaj, aż krwawienie z opony twardej ustanie. Jeśli obszar zainteresowania znajduje się w miejscu, w którym opona twarda jest szczególnie gruba, może być konieczne usunięcie opony twardej powyżej niej. W takim przypadku delikatnie oddziel oponę twardą od PIA poniżej za pomocą bardzo cienkich kleszczyków.

Wykonaj małe nacięcie w uniesionej oponie twardej za pomocą kolejnej pary cienkich kleszczy. Następnie chwyć przycięte krawędzie i delikatnie rozłup oponę twardą. Opona twarda jest cienka, ale mocna, więc uważaj, aby nie przeciąć mózgu nienaruszonymi krawędziami opony twardej.

Podczas pracy z powrotem i z dala od obszaru zainteresowania, spłucz ten obszar obficie sterylnym płynem mózgowo-rdzeniowym A lub sterylną solą fizjologiczną. Jeśli otaczająca czaszka zakrzywia się znacznie wokół odsłoniętej opony twardej lub pia, użyj kleju do szybkich komórek, aby wypełnić przestrzenie, które nie miałyby bliskiego kontaktu z szkiełkiem osłony okna w obszarach, które nie zostaną zobrazowane. Następnie delikatnie połóż sterylną szklaną pokrywę na oponie twardej lub pia.

Użyj żelu akrylowego Sano, aby pokryć klej elastomerowy i krawędzie szkła. Szkiełko nakrywkowe. Przykryj całą odsłoniętą czaszkę żelem cyjanoakrylowym Sano lub szaloną mieszanką kleju i cementu dentystycznego.

Osadź wykonany na zamówienie metalowy pręt mocujący głowę na przeciwległym końcu czaszki. Umieść zwierzę w ciepłej komorze rekonwalescencji po dootrzewnowym wstrzyknięciu ketoprofenu w ilości pięciu miligramów na kilogram w celu leczenia bólu. Kontynuuj leczenie przeciwbólowe przez dwa dni po operacji.

Po dwóch tygodniach rekonwalescencji pooperacyjnej znieczulij zwierzę fluorem ISO. 5% do indukcji, 1,5% do konserwacji. Zamontuj go w specjalnie wykonanym stoliku mikroskopowym z ramą mocującą głowę i sprawdź okienko czaszki pod kątem przejrzystości optycznej.

Przy oświetleniu niebieskim światłem przejrzystość naczyń krwionośnych powierzchni mózgu jest wysoce wskaźnikiem jakości okna czaszkowego. Jeśli ich krawędzie są ostro zarysowane, okno prawdopodobnie będzie użyteczne. Przed rozpoczęciem protokołu behawioralnego zwierzę powinno być trzymane w spójnym środowisku klatki domowej, aby zminimalizować codzienną zmienność.

W łuku wyjściowym poziomy ekspresji GFP rozpoczynają paradygmaty treningu behawioralnego lub stymulacji środowiskowej w zależności od obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania. Na przykład zwierzęta mogą być wystawione na działanie różnych środowisk wizualnych w ciągu kolejnych dni, aby zobrazować charakterystyczne populacje neuronów w łuku kory wzrokowej, fluorescencja GFP w neuronach zwykle osiąga szczytowy poziom dwie godziny po stymulacji. Eksperymentalna oś czasu może zostać zoptymalizowana w celu ułatwienia wykrywania ekspresji ARC GFP w neuronach przy ich szczytowych poziomach fluorescencji.

Po zakończeniu sesji treningu behawioralnego lub stymulacji środowiskowej znieczulij zwierzę fluorem ISO 5% w celu indukcji, 1,5% w celu utrzymania. Zamontuj zwierzę w specjalnie wykonanym stoliku mikroskopowym z ramką do mocowania głowy. Pod mikroskopem dwufotonowym pozycja głowy zwierzęcia jest ustalana na ramie mocującej głowę, która łączy się bezpośrednio ze stolikiem za pomocą wszczepionego metalowego pręta na czaszce.

Fluor ISO i tlen są stale dostarczane do myszy przez stożek nosowy. Temperatura ciała jest utrzymywana za pomocą poduszki grzewczej. Upewnij się, że detektory mikroskopowe są chronione przed światłem otoczenia.

Przeprowadzając dwufotonowe skanowanie laserowe w ciemnym pomieszczeniu, do obrazowania użyj soczewki zanurzeniowej z aperturą numeryczną 20 x lub 25 x 1,05. Najpierw, w oświetleniu fluorescencyjnym epi, uzyskaj obraz wzorów naczyń krwionośnych na powierzchni obszaru mózgu za pomocą kamery CCD. Aby w przyszłości wyrównać obraz, rozpocznij skanowanie laserowe dwoma fotonami, aby uzyskać stos obrazów 3D.

Długość fali wzbudzenia lasera dwufotonowego jest ustawiona na 920 nanometrów, a moc jest ustawiona na około 50. Miliwaty emitowane fluorescencja jest jednocześnie wykrywana zarówno w łuku kanału zielonego, jak i czerwonego. Fluorescencja GFP pojawia się tylko w kanale zielonym, podczas gdy autofluorescencja tkankowa pojawia się w obu kanałach.

Typowe stosy obrazów mają wymiary około 320 na 300, 20 na 100 mikrometrów, rozdzielczość poziomą 0,5 mikrometra na piksel i rozdzielczość pionową trzy mikrometry na piksel. Po zdobyciu stosu obrazów przywróć zwierzę do jego domowej klatki. Nie przeszkadzaj zwierzęciu do następnej sesji behawioralnej i obrazowej.

Powtarzaj procedurę zachowania i obrazowania przez kilka dni zgodnie z potrzebami. Użyj wcześniej uzyskanego obrazu naczynia krwionośnego na powierzchni mózgu, aby zorientować się z powrotem w tym samym miejscu obrazowania. Mocną stroną tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie zmian ekspresji genu łuku w tym samym zestawie neuronów przez wiele dni.

W żywym zwierzęciu. Standardowe metody histochemiczne pozwalają osiągnąć rozdzielczość pojedynczej komórki, ale nie są w stanie śledzić zmian ekspresji genów w tych samych neuronach przez wiele dni. Inne techniki obrazowania, takie jak rezonans magnetyczny lub metody obrazowania jądrowego, nie mają rozdzielczości pozwalającej na obrazowanie pojedynczych neuronów.

W związku z tym żadne inne istniejące metody pomiaru zmian ekspresji genów nie mogą dorównać zarówno rozdzielczości przestrzennej, jak i czasowemu pokryciu opisanej tutaj metody obrazowania. Kluczowym krokiem w tej procedurze jest operacja okna czaszki. Należy go wykonywać ze szczególną ostrożnością, aby uniknąć urazu mózgu lub pozostawienia krwi pod szkiełkiem nakrywkowym.

W razie potrzeby oponę twardą można usunąć. Należy pamiętać, że maksymalna głębokość obrazowania w mózgu przy użyciu tej procedury będzie zależeć od przejrzystości okna czaszki, ustawienia mikroskopu i jasności fluorescencyjnych reporterów. Ten protokół obrazowania in vivo jest skuteczną i wszechstronną metodą uzyskiwania informacji na temat dynamiki molekularnej związanej z neuroplastycznością w poszczególnych neuronach w odpowiedzi na różne doświadczenia behawioralne i prawdopodobnie będzie ogólnie stosowany u myszy transgenicznych przenoszących fluorescencyjne reportery dla innych doświadczonych regulowanych genów.