Izolowanie i barwienie immunologiczne limfocytów i komórek dendrytycznych z mysich plastrów Peyera

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie i immunobarwienie limfocytów i komórek dendrytycznych z plastrów płatników neuronów, przy użyciu dwóch równoległych podejść eksperymentalnych. Po pierwsze, wycisnąć świeże plastry płatników z myszy, jelita cienkiego. Następnie należy fizycznie oddzielić plastry płatnika, pobrać tkankę i przepuścić ją przez filtr siatkowy, aby wygenerować zawiesinę pojedynczej komórki do analizy cytometrii przepływowej.

Zebrać komórki przez odwirowanie i rozprowadzić porcje w 96-dołkowej okrągłej płycie dennej. Następnie oznacz komórki przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym specyficznym dla typu komórki. Natychmiast przystąp do analizy cytometrii przepływowej w celu wyliczenia określonych typów komórek: Równolegle wyizoluj plastry płatnika i zatrzaskowo zamroź próbki tkanek.

W blokach OCT, sekcja kriogeniczna, próbki znakowane są przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym specyficznym dla typu komórki, a następnie wizualizowane za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej razem wziętych. Metody te pozwolą określić ilościowo limfocyty B, limfocyty T i komórki dendrytyczne w określonych przedziałach w tkankach łatowych płatnika. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ tkanki łaty PI są niezwykle delikatne i można je łatwo uszkodzić.

Podczas przenoszenia. Połóż świeżo wyizolowane jelito cienkie na łóżku z wilgotnych ręczników papierowych lub chusteczek Kim. Następnie delikatnie zwilż jelito cienkie solą fizjologiczną, aby zapobiec odwodnieniu tkanek.

Teraz wizualnie zidentyfikuj poszczególne plastry płatników znajdujące się po stronie przeciw krezce jelita. Zazwyczaj pojedyncza mysz ma od pięciu do 10 widocznych płatników, które są równomiernie rozmieszczone od dwunastnicy do jelita krętego. Używanie zakrzywionych nożyczek chirurgicznych zazwyczaj wycina plastry indywidualnego płatnika.

Umieść je w zimnym roztworze do sortowania wagowego Matcha, utrzymując tkankę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zachować żywotność komórek. Następnie przenieś plastry płatnika do pięciu mililitrów pożywki dysocjacyjnej śledziony i wstrząsaj z prędkością 250 obr./min przez 15 do 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki, umieść próbkę na sterylnym sitku do komórek z nylonowej siatki o grubości 70 mikronów i na siłę zmiel tkankę w siatce za pomocą podstawy tłoka ze strzykawki o pojemności jednej cm3 w celu usunięcia pozostałych agregatów komórkowych.

Przelej zawiesinę komórek przez drugą komórkę o grubości 70 mikronów, sitko i zbierz komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 lub 50 mililitrów. Dozować 10 do pięciu komórek na studzienkę do 96-dołkowych komórek z okrągłą płytką przez wirowanie przez pięć minut po 1000 razy. G. Następnie zdekantować supernatant, delikatnie odwracając płytkę.

Teraz ponownie zawiesić komórki w buforze blokowym FC i inkubować na lodzie przez 15 minut. Następnie dodać przeciwciała sprzężone z fluorem bezpośrednio do zawiesin komórkowych w pożądanym rozcieńczeniu i inkubować na komórkach przemywania lodem ze 100 mikrolitrami buforu przepływowego. Następnie ponownie zawieś komórki w 400 mikrolitrach buforu utrwalającego, aby przeanalizować komórki za pomocą cytometrii przepływowej w celu wyizolowania plastrów płatników do kriosekcji.

Wytnij 0,5 centymetra poprzeczne segmenty jelita cienkiego zawierające pojedynczy plaster płatnika. Przenieść tkankę na szalkę Petriego zawierającą PBS. Następnie umieść segmenty tkanki jelitowej pionowo w foremkach bazowych zawierających OCT.

Zanurz formy w ciekłym azocie i pozwól tkance całkowicie zamarznąć. Usuń zamrożone formy bazowe z ciekłego azotu za pomocą kleszczy. Pozwól pleśni nagrzać się do temperatury pokojowej na tyle długo, aby krawędzie bloku OCT zmiękły.

Następnie wyjmij zamrożony blok OCT z formy. Odwróć formę i delikatnie naciśnij z tyłu, aby wysunąć blok na czysty kawałek folii aluminiowej o wymiarach cztery na cztery centymetry. Natychmiast zawinąć chusteczkę w folię i umieścić w oznakowanej torbie na próbkę, przechowywanej w ciekłym azocie lub na suchym lodzie, kriogenicznym przekroju tkanki za pomocą mikrotomu kriogenicznego LI, a, CM, 3, 0, 0 s lub równoważnego.

Ustaw temperaturę komory na kriostacie na minus 21 stopni Celsjusza. Idealnie tnij odcinki o grubości od 12 do 14 mikronów. Zbierz skrawki na szkiełkach mikroskopowych Supercross plus.

Sprawdź próbki wizualnie za pomocą standardowego mikroskopu świetlnego o małej mocy. Zanurz szkiełka w acetonie na dwie minuty. Należy pamiętać, że długotrwała inkubacja może spowodować oderwanie tkanek od szkiełka.

Przemyć próbki trzykrotnie za pomocą PBST. Następnie otocz sekcje hydrofobowym pisakiem obrazu. Teraz inkubuj próbki w buforze blokowym, nałóż skrawki tkanki na roztwór przeciwciała pierwotnego.

Osusz obszar wokół sekcji za pomocą chusteczek Kim lub innej chłonnej chusteczki bez dotykania rzeczywistych odcinków tkanki. Za pomocą pipety lub zakraplacza delikatnie umieść kroplę przedłużonego złotego podłoża mocującego bezpośrednio na sekcji. Nałóż szklane szkiełko nakrywkowe, unikając pęcherzyków powietrza i usuwając nadmiar mocowania.

Analiza średniofaksowa mono rozproszonych zawiesin komórek krosowych wszystkich płatników ujawnia wyraźne rozróżnienie między dobrymi i złymi preparatami komórkowymi w dobrych preparatach komórkowych. Przy ponad 80% żywotności zdecydowana większość komórek wykazuje wysokie rozproszenie do przodu, co wskazuje na dużą objętość komórek i niskie rozproszenie boczne zgodne z niską ziarnistością komórek. W tym eksperymencie celowo przygotowano złe przygotowanie komórek, aby wykazać, że w złej populacji większość komórek wykazuje niski FSC, wysoki SSC i znajduje się poza wskazanym chodem R.

Komórki te prawdopodobnie przechodzą apoptozę i/lub martwicę. Oto koktajl składający się z aż czterech różnych Fluorów. Cztery sprzężone przeciwciała monoklonalne do rozróżniania różnych typów komórek.

U płatników stosowano zawiesiny pojedynczych komórek, znakowane klastrem markerów różnicowania. CD 19 i B two 20 ujawniają, że komórki B stanowią około 60% płatników bramkowanych. Podzbiory limfocytów T specyficzne dla populacji komórek krosowych można łatwo wyliczyć przez podwójne znakowanie przeciwciałami przeciwko CD trzy i CD czterem lub CD trzy i CD osiem, CD cztery dodatnie i CD osiem dodatnie limfocyty T stanowią odpowiednio około 23% i 9% wszystkich komórek płatniczych.

Podzbiory DC, które byłyby CD 11 C dodatnie i CD 1 0 3 dodatnie, można również wyliczyć tą metodą. CD 11 C dodatnie DC przyczyniają się do około 8% całkowitej populacji bramkowanej, co w przybliżeniu odpowiada 10 000 dcs na płatnik plastrów. W populacji komórek CD 11 C dodatnich około 4,7% było podwójnie dodatnich dla B 20 dodatnich.

Podobne wyniki uzyskuje się, gdy płatnicy pobierają łatane komórki od czarnych sześciu myszy C 57. Złe przygotowanie komórek może prowadzić do bardzo mylących wyników, głównie dlatego, że martwe lub umierające komórki mają tendencję do niespecyficznego wiązania przeciwciał. Zazwyczaj prowadzą one do nadreprezentacji B 2 2 0 dodatnich i CD trzech dodatnich podwójnie dodatnich komórek, a także B dwóch 20 dodatnich komórek B i CD czterech dodatnich komórek T podwójnie dodatnich.

Plastry kriogeniczne myszy płatników są podatne na analizę histopatologiczną, a także znakowanie immunologiczne. Podczas gdy moc sekcji in zapewnia większą rozdzielczość na poziomie komórkowym po zabarwieniu przez h i e, jasne i ciemne strefy płatników łatają centra rozrodcze łatwiej rozgraniczyć w sekcjach kriosekcji. W tej typowej sekcji kriogenicznej plastra płatnika, przeciwciała anty CD 3, znakują limfocyty T przeciwciała anty CD 11 C.

Podświetl komórki dendrytyczne i przeciwciała anty B dwa 20. Podświetl komórki B Po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom w tej dziedzinie do zrozumienia, w jaki sposób określone typy komórek, takie jak komórki dendrytyczne w tkankach limfatycznych związanych z jelitami, reagują na antygeny jelitowe i patogeny mikrobiologiczne.

Informacje te wpłynęły na projektowanie i opracowywanie szczepionek błony śluzowej.