Name: Izolowanie i barwienie immunologiczne limfocytów i komórek dendrytycznych z mysich plastrów Peyera (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj izolację i barwienie immunologiczne limfocytów oraz komórek dendrytycznych z plastrów Peyera myszy. Metoda obejmuje cytometrię przepływową i immunobarwienie przekrojów kriogenicznych do analizy odpornościowej jelit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Renjie Song (Wadsworth Center Flow Cytometry Core) za pomoc w analizie komórek oraz Helen Johnson (Wadsworth Center Animal Histopathology Core) za przygotowanie sekcji parafinowych. Dziękujemy dr Richardowi A. Cole'owi (Wadsworth Center Light Microscopy Core) za pomoc w mikroskopii konfokalnej i zbieraniu obrazów. Chcielibyśmy podziękować Andy'emu Bentleyowi (Wadsworth Center Photo and Illustration) za pomoc przy animacjach.
	MDJ jest wspierany przez Fundację Badań nad Naukami Przyrodniczymi, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA jest wspierany przez stacjonarne stypendium podoktorskie Wadsworth Center-Health Research Inc. Prace te były częściowo wspierane przez granty NIH HD061916 i GM082978.

Zwierzęta były trzymane w konwencjonalnych, specyficznych warunkach wolnych od patogenów i były traktowane w pełnej zgodności z wytycznymi Międzynarodowego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Centrum Wadsworth.
 1. Zgłębnik oralny
 <ol>
 <li>(Opcjonalnie) Wybrany szczep myszy zgłębnika z antygenem lub drobnoustrojami będącymi przedmiotem zainteresowania przy użyciu igły do karmienia o końcu 22 G x 1,5 cala (Popper Scientific, New Hyde Park, NY). Ilość podawana nie powinna przekraczać 400 μl na mysz.</li>
 </ol>
 2. Izolacja komórek PP do cytometrii przepływowej
 <ol>
 <li>Eutanazja myszy przez uduszenie CO2 , zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania (IACUC).</li>
 <li>Przed zabiegiem oczyść brzuch 70% etanolem lub betadyną. Wykonaj standardową laparotomię, która obejmuje pojedyncze (1 cm) nacięcie za pomocą nożyczek chirurgicznych wzdłuż linii środkowej, zaczynając około 1,5 cm od podstawy klatki piersiowej. Odsłoń jamę otrzewnową i zidentyfikuj jelito ślepe. Przeciąć końcowe jelito cienkie na połączeniu jelita krętego i kątowego i delikatnie usunąć jelito w całości. Należy uważać, aby nie przeciągnąć tkanki jelitowej podczas jej usuwania z jamy otrzewnej.</li>
 <li>Połóż jelito cienkie na łóżku z wilgotnych ręczników papierowych lub chusteczek Kimwipe. Delikatnie zwilż jelito cienkie solą fizjologiczną, aby zapobiec odwodnieniu tkanek. Wizualnie zidentyfikuj poszczególne PP znajdujące się po stronie przeciwkrezkowej jelita (ryc. 1). Zazwyczaj pojedyncza mysz ma od 5 do 10 widocznych PP, które są równomiernie rozmieszczone od dwunastnicy (proksymalnie) do jelita krętego (dystalnie). Średnio cztery myszy dają 23 PP.</li>
 <li>Za pomocą zakrzywionych nożyczek chirurgicznych delikatnie wytnij poszczególne PP i umieść je w zimnym roztworze soli Hanka (HBSS). Uwaga, nożyczki należy ułożyć zakrzywioną stroną do góry tuż nad PP, a następnie delikatnie przyłożyć do tkanki. Wyciąć tylko PP (nie otaczającą tkankę) i przenieść do zimnego HBSS. 
 Uwaga: Wszystkie etapy inkubacji i wirowania, począwszy od tego punktu, w sekcji 2, powinny być przeprowadzane w temperaturze 4 °C w celu zachowania żywotności komórek.</li>
 <li>Przenieść PP do 5 ml pożywki dysocjacyjnej śledziony i inkubować przez 15-20 minut w temperaturze 37 °C, energicznie wstrząsając przy 250 obr./min. Dłuższy czas inkubacji negatywnie wpłynie na żywotność komórek.</li>
 <li>Aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową, umieść PP na sterylnym (autoklawowanym) sitku do komórek z nylonowej siatki o wielkości 70 μm i na siłę zmiel tkankę w siatce za pomocą podstawy tłoka ze strzykawki o pojemności 1 cm3. Alternatywnie, umieść PP między dwoma szkiełkami mikroskopowymi z matowego sterylnego szkła (autoklawowane w kopertach) i delikatnie zmielić tkanki ruchem do przodu iz powrotem. Za pomocą sterylnej pipety transferowej przenieść zawiesinę komórek do probówki Falcon o pojemności 5 ml.</li>
 <li>Dodać EDTA do końcowego stężenia 1 mM do zawiesiny komórek. Inkubować na bujaku przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Zdekantować zawiesinę komórek przez drugie sitko o wielkości 70 μm w celu usunięcia wszelkich pozostałych agregatów komórkowych lub resztek tkankowych. Zebrać komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 lub 50 ml.</li>
 <li>Poddać komórki delikatnemu wirowaniu (5 min przy 500 x g). Zdekantuj supernatant i ponownie zawieś komórki w buforze przepływowym, który jest solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 1% płodowej surowicy cielęcej (FCS).</li>
 <li>Aby określić liczbę komórek i żywotność, rozcieńczyć komórki w stosunku 1:10 do błękitu trypanowego i wizualnie sprawdzić komórki za pomocą mikroskopu świetlnego i hemocytometru. Alternatywnie, licznik komórek Countess (Invitrogen) lub podobny przyrząd może być użyty do automatycznego zliczania liczby komórek i żywotności. 
 Zaczynając od 20-25 PP, protokół ten powinien dać łącznie >2,5 x 106 komórek. Odpowiada to ~ 0,8-1,2 x 106 komórek na mysz. </li>
 </ol>
 Oznaczanie komórek przeciwciałami do cytometrii przepływowej
 <ol start="11">
 <li>Dozować komórki (10-5 na dołek) do studzienek 96-dołkowej okrągłej płytki dennej.</li>
 <li>Poddać płytkę delikatnemu odwirowaniu (5 minut przy 1 000 x g) i zdekantować supernatant poprzez delikatne odwrócenie płytki.</li>
 <li>Zawiesić komórki w buforze blokowym Fc i inkubować na lodzie przez 15 minut. Chociaż istnieje wiele komercyjnie dostępnych blokowych Fc (np. szczurzy anty-mysz CD16 / CD32, BD Biosciences), po prostu używamy zużytej pożywki z hybrydoma komórek B szczura (ATCC 2.4.G2), która wydziela monoklonalną IgG1 przeciwko mysim receptorom Fcγ na tym etapie.</li>
 <li>Poddać płytkę delikatnemu odwirowaniu (5 minut przy 1 000 x g) jak powyżej, a następnie zdekantować supernatant poprzez delikatne odwrócenie płytki.</li>
 <li>Dodać przeciwciała sprzężone z fluoroforem bezpośrednio do zawiesin komórkowych w pożądanym rozcieńczeniu i inkubować na lodzie przez 30 minut z ciągłym kołysaniem.</li>
 <li>Poddać płytkę delikatnemu odwirowaniu (5 minut przy 1 000 x g) i zdekantować supernatant poprzez delikatne odwrócenie płytki.</li>
 <li>Przemyć komórki 100 μl buforu przepływowego.</li>
 <li>Odwirować płytkę o masie 1 000 x g przez 5 minut i zdekantować supernatant poprzez delikatne odwrócenie płytki.</li>
 <li>Ponownie zawiesić komórki 400 μl buforu utrwalającego, który składa się z 300 μl buforu przepływowego i 100 μl 1% paraformaldehydu w buforze PHEM (60 mM PIPES, 25 mM HEPES, 10 mM EGTA, 4 mM MgCl2 przy pH 6).</li>
 <li>Poddaj komórki cytometrii przepływowej za pomocą FACSCalibur lub jego odpowiednika. Analizuj wyniki za pomocą oprogramowania Cell Quest Pro w wersji 5.2.</li>
 </ol>
 3. Przygotowanie kriosekcji PP
 <ol>
 <li>Przed pobraniem tkanki dodaj związek o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) do plastikowych form bazowych 7x7x5 mm. Przygotuj również kałużę ciekłego azotu (>750 ml) w wiadrze Dewara lub wiaderku na lód.</li>
 <li>Poddaj mysz eutanazji i wykonaj laparotamię, jak opisano powyżej. Usuń jelito i połóż na mokrych ręcznikach papierowych.</li>
 <li>Aby wyizolować PP do cyrosekcji, należy przeciąć 0,5 cm poprzeczne segmenty jelita cienkiego zawierające pojedynczy PP i przenieść tkankę na szalkę Petriego zawierającą PBS. Delikatnie spłucz światło tych segmentów PBS, aby usunąć niechciane resztki kału.</li>
 <li>Umieść segmenty tkanki jelitowej pionowo wewnątrz form bazowych zawierających OCT. Zanurz pleśnie w ciekłym azocie i pozwól tkance całkowicie zamarznąć (1-2 min). Kolor OCT zmieni się z przezroczystego na biały, gdy tkanka zostanie całkowicie zamrożona. W celu bardziej stopniowego chłodzenia (np. w celu zmniejszenia pękania KTZ), należy zanurzyć formę w kąpieli izopentanu chłodzonej oparami ciekłego azotu. nuta: Podczas pracy z ciekłym azotem należy nosić odpowiednie okulary ochronne. </li>
 <li>Usuń zamrożone formy bazowe z ciekłego azotu za pomocą kleszczy i pozwól pleśni ogrzać się w temperaturze pokojowej wystarczająco długo (~ 10-15 sekund), aby krawędzie bloku OCT zmiękły. Aby następnie wyjąć zamrożony blok OCT z formy, odwróć formę i delikatnie naciśnij z tyłu, aby wysunąć blok na czysty kawałek folii aluminiowej o wymiarach 4 x 4 cm. Natychmiast zawiń chusteczkę w folię i umieść w oznakowanej torbie na próbki przechowywanej w ciekłym azocie lub na suchym lodzie. Alternatywnie można przenieść tkankę do zamrażarki (<-20 °C). Użyj chusteczki w ciągu tygodnia, w przeciwnym razie bloki staną się kruche z wiekiem.</li>
</ol>
Kriosekcja
 <ol start="6"> 
 <li>Kriosekcja tkanki za pomocą kriomikrotomu Leica CM3050S lub jego odpowiednika. Temperatura komory na kriostacie powinna być ustawiona na -21 °C.</li>
 <li>Staraj się o sekcje o grubości 12-14 μm.</li>
 <li>Zbierz skrawki na szklanych szkiełkach mikroskopowych Fisher SuperFrost Plus (lub jego odpowiedniku) i sprawdź wizualnie za pomocą standardowego mikroskopu o małej mocy. Jeśli na szkiełku pobieranych jest wiele sekcji, upewnij się, że są one zgrupowane razem w celu dalszego barwienia.</li>
 <li>Przechowuj szkiełka w temperaturze pokojowej w pudełku na szkiełka i najlepiej zużyć je w ciągu kilku dni.</li>
</ol>
Oznaczanie przeciwciał w kriosekcjach i analiza mikroskopii konfokalnej
<ol start="10">
 <li>Zanurz szkiełka w acetonie (lub metanolu) w słoiku lub stojaku do barwienia tkanek na 2 minuty. Długotrwała inkubacja może spowodować oderwanie tkanek od szkiełka.</li>
 <li>Przenieś szkiełka do nowego słoika do barwienia i umyj je 3 razy PBS-T (1X PBS z 0,05% Tween-20) przez 3 minuty każde.</li>
 <li>Otocz sekcje hydrofobowym pisakiem ImmEdge. Zapewni to, że odczynniki i przeciwciała pozostaną ograniczone do tego obszaru podczas inkubacji.</li>
 <li>Szkiełka inkubować w buforze blokowym (2% surowicy koziej w PBS) przez 30 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze, chroniąc przed światłem. </li>
 <li>Inkubować szkiełka z buforem blokowym Fc (patrz wyżej) przez 10 minut w temperaturze 37 °C. </li>
 <li>Zanurz szkiełka w PBS-T i wysusz obszar wokół sekcji za pomocą chusteczek Kimwipes lub innej chłonnej chusteczki. Uważaj, aby nie dotykać rzeczywistych skrawków tkanki.</li>
 <li>Na skrawki tkanek nałożyć roztwór przeciwciała pierwotnego i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze. Przeciwciało pierwszorzędowe jest zwykle rozcieńczane w buforze blokowym do końcowego stężenia 20 μg/ml. Pożądane jest stosowanie bezpośrednio znakowanych przeciwciał pierwotnych, ponieważ na tym etapie można połączyć aż trzy przeciwciała. Przeciwciała znakowane bezpośrednio eliminują również potrzebę dodatkowych etapów inkubacji przeciwciał. </li>
 <li>Umyj szkiełka 3 razy (po 5 minut każde) przez zanurzenie w PBS.</li>
 <li>W razie potrzeby inkubować szkiełka z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez 30 minut w temperaturze 37 °C w komorze wilgotnościowej.</li>
 <li>Umyj szkiełka 3 razy (po 5 minut każde) przez zanurzenie w PBS.</li>
 <li>Inkubować szkiełka przez 4 minuty w 1% paraformaldehydzie w buforze PHEM, jak opisano powyżej.</li>
 <li>Płukać szkiełka PBS przez 1 min.</li>
 <li>Osusz obszar wokół sekcji za pomocą chusteczek Kimwipes lub innej chłonnej chusteczki. Uważaj, aby nie dotykać rzeczywistych skrawków tkanki. Za pomocą pipety lub zakraplacza delikatnie umieść kroplę podłoża montażowego Prolong Gold bezpośrednio na sekcji. Nałóż szklane szkiełko nakrywkowe na podłoże montażowe, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Użyj bibuły, aby wchłonąć nadmiar materiału montażowego.</li>
 <li>Uszczelnij szkiełka nakrywkowe do szkiełek mikroskopowych dostępnym w handlu lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. </li>
 <li>Przeglądaj slajdy za pomocą mikroskopu konfokalnego Leica TCS SP5 lub równoważnego. </li>
 </ol>

<ol><li>Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+IgA%27s+complex+roles+in+immunity+and+mucosal+homeostasis+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut.</a> Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).</li>
<li>Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue.</a> Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).</li>
<li>Rescigno, M., Sabatino, A. D. i <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+in+intestinal+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease.</a> J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).</li>
<li>Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GALT%3A+organization+and+dynamics+leading+to+IgA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis.</a> Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).</li>
<li>Iwasaki, A., Kelsall, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+distinct+Peyer%27s+patch+dendritic+cell+subsets+and+their+recruitment+by+chemokines+macrophage+inflammatory+protein+%28MIP%29-3alpha%2C+MIP-3beta%2C+and+secondary+lymphoid+organ+chemokine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine.</a> Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).</li>
<li>Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mucosal dendritic cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).</li>
<li>Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peyer%27s+Patch+Dendritic+Cells+Sample+Antigens+by+Extending+Dendrites+Through+M+Cell-Specific+Transcellular+Pores%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores.</a> Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).</li>
<li>Lelouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+bacteria+and+dead+cells+are+internalized+by+a+unique+subset+of+Peyer%27s+patch+dendritic+cells+that+express+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme.</a> Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).</li>
<li>Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholera+toxin+induces+migration+of+dendritic+cells+from+the+subepithelial+dome+region+to+T-+and+B-cell+areas+of+Peyer%27s+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).</li>
<li>Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+IgA+possesses+intrinsic+modulatory+properties+stimulating+mucosal+and+systemic+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses.</a> J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).</li>
<li>Kelsall, B. L., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+dendritic+cells+are+present+in+the+subepithelial+dome+and+T+cell+regions+of+the+murine+Peyer%27s+patch%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch.</a> J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).</li>
<li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer%27s+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> J. Vis. Exp. (58), e3225(2011).</li>
<li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J. Vis. Exp. (63), e4040(2012).</li>
<li>Lopez-Guerrero, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+infection+activates+dendritic+cells+from+Peyer%27s+patches+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice.</a> J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

W tym artykule przedstawiliśmy równoległe protokoły przygotowania preparatów jednokomórkowych PP do cytometrii przepływowej i analizy funkcjonalnej oraz kriosekcji do barwienia immunologicznego. Obie metody są wysoce powtarzalne i łatwo dostępne, pod warunkiem, że dostępny jest cytometr przepływowy i kriostat. Dla początkujących badaczy należy zwrócić uwagę, że w porównaniu ze śledzioną, całkowita wydajność komórek z PP jest stosunkowo niewielka. Niemniej jednak opisany przez nas protokół zazwyczaj daje od 0,8 do 1,2 x 1...

Plamy Peyera (PPs) są makroskopowymi agregatami zorganizowanych pęcherzyków limfoidalnych obecnych w jelicie cienkim ludzi i myszy (Rysunek 1) i stanowią główne miejsca, w których inicjowane są odpowiedzi immunologiczne błony śluzowej przeciwko antygenom dietetycznym, bakteriom komensalnym, patogenom mikrobiologicznym i doustnym szczepionkom 1-4. W przeciwieństwie do innych obwodowych tkanek limfatycznych, takich jak krezkowe węzły chłonne, PP nie mają doprowadzających komórek limfatycznych. W związku z tym adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne w PP są napędzane w odpowiedzi na antygeny pochodzące ze światła jelita. Pobieranie próbek antygenów luminalnych odbywa się za pomocą nabłonka związanego z pęcherzykami (FAE), który składa się zarówno z enterocytów, jak i komórek pobierających próbki antygenu, znanych jako komórki M. Pod FAE, w regionie kopuły podnabłonkowej (SED), znajduje się sieć komórek dendrytycznych (DC) zmieszanych z makrofagami, komórkami B i limfocytami T CD4 + 5-9. W sercu każdego pęcherzyka limfatycznego PP znajdują się pęcherzykowe komórki dendrytyczne (FDC) i centralne centrum rozrodcze bogate w komórki B, otoczone strefami międzypęcherzykowymi bogatymi w limfocyty T. Pobieranie próbek antygenu za pomocą PP powoduje rozwój plazmablastów komórek B IgA+ oraz komórek efektorowych i pamięciowych CD4+, które zasiewają otaczającą blaszkę właściwą i zapewniają odporność w szerokim zakresie na najeźdźców błony śluzowej.
 Analizowanie skomplikowanych zdarzeń immunologicznych związanych z pobieraniem, przetwarzaniem i prezentacją antygenu w PPs jest trudnym zadaniem, biorąc pod uwagę, że komórki PP stanowią tylko niewielki ułamek wszystkich komórek limfatycznych w błonie śluzowej jelit. Aby pomóc w charakterystyce in vitro komórek w tym środowisku, udostępniamy protokół przygotowania całkowitych mysich komórek PP do cytometrii przepływowej i analizy funkcjonalnej, a także protokół przygotowania kriosekcji PP do mikroskopii immunofluorescencyjnej i immunohistologii. Nasz protokół izolacji, charakterystyki i barwienia immunologicznego mysich komórek PP sam w sobie nie jest nowy, o czym świadczy fakt, że istnieje wiele odniesień sprzed ponad 25 lat, które cytują te techniki 5,6,9-11. Nasz protokół zapewnia raczej uproszczoną (i wizualną) metodę dla badaczy zbierających PP po raz pierwszy. Techniki, które opisujemy, są łatwe do opanowania i z łatwością dają dużą liczbę komórek o żywotności >90%. Protokół kriosekcji pozwala uzyskać wysoce powtarzalne odcinki seryjne, które idealnie nadają się do barwienia immunofluorescencyjnego i obrazowania konfokalnego. Co więcej, nasz protokół uzupełnia dwa inne niedawne artykuły JoVE. Pierwsza, autorstwa Fukudy i współpracowników, opisuje zastosowanie testów podwiązanej pętli jelita krętego do oceny wychwytu bakterii chorobotwórczych przez komórki PP M 12. Drugi, autorstwa Geema i współpracowników, opisuje izolację i charakterystykę DC i makrofagów z błony śluzowej jelita myszy, ale wyraźnie wyklucza PP z ich analizy 13.

<table><tbody><tr><td>OCT Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>7x7x5 mm Formy bazowe</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-552</td><td></td></tr><tr><td>Pióro ImmEdge</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice Superfrost Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>4951</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze Edge Rite</td><td>Thermo Scientific</td><td>4280L</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11c-PE</td><td>eBioscience</td><td>17-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45R/B220-APC</td><td>BD Pharmigen</td><td>553092</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD3-FITC</td><td>BD Pharmigen</td><td>561798</td> Anti-Mouse CD4-PE BD Pharmigen 553652 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Anti-Mouse</td></tr><tr><td>CD8-PE</td><td>BD Pharmigen</td><td>553032</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD19-PercP</td><td>BioLegend</td><td>115531</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) bez czerwieni fenolowej </td><td>Fisher Scientific</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Filtr siatkowy do komórek</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Dysocjacja śledziony Medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7915</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia </td><td>Invitrogen</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Fc Block</td><td>ATCC 2.4.G2</td><td>HB-197</td><td>Supes uzyskane z linii komórkowej 2.4.G2</td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyce</td><td>FST</td><td>14061-09</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat </td><td>Leica</td><td>3050S</td><td></td></tr><tr><td>FACS Calibur</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess Licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Richard Allan</td><td>7211</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Richard Allan</td><td>71304</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Starplex Scientific</td><td>3661</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Tabela 1. Odczynniki i sprzęt użyte w tym badaniu.</td></tr></tbody></table>

izolowanie i barwienie immunologiczne limfocytów i komórek dendrytycznych z mysich plastrów peyera

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Łaty Peyera (PPs) są integralnymi składnikami tkanek limfatycznych związanych z jelitami (GALT) i odgrywają kluczową rolę w inwigilacji immunologicznej jelit i homeostazie. Antygeny w postaci cząstek stałych i drobnoustroje w świetle jelita są w sposób ciągły próbkowane przez komórki PP M w nabłonku związanym z pęcherzykami (FAE) i transportowane do leżącej poniżej sieci komórek dendrytycznych (DC), makrofagów i limfocytów. W tym artykule opisujemy protokoły, w których mysie PP są (i) dysocjowane na zawiesiny pojedynczych komórek i poddawane cytometrii przepływowej oraz (ii) przygotowywane do kriosekcji i barwienia immunologicznego. W przypadku cytometrii przepływowej PP są mechanicznie dysocjowane, a następnie filtrowane przez błony o średnicy 70 μm w celu wytworzenia zawiesin pojedynczych komórek wolnych od komórek nabłonka i dużych zanieczyszczeń. Zaczynając od 20-25 PP (od czterech myszy), ta szybka i powtarzalna metoda daje populację >2,5 x 106 komórek o żywotności >90%. W przypadku kriosekcji, świeżo wyizolowane PP są zanurzane w pożywce o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), zamrażane zatrzaskowo w ciekłym azocie, a następnie cięte za pomocą kriomikrotomu. Wycinki tkanek (5-12 μm) są suszone na powietrzu, utrwalane acetonem lub metanolem, a następnie poddawane immunoznakowaniu.

Analiza cytometryczna przepływowa monodyspersyjnych zawiesin całkowitej populacji komórek PP wykazuje wyraźną różnicę między dobrymi a słabymi preparatami komórek. W dobrych preparatach komórek o żywotności przekraczającej 80%, ogromna większość komórek wykazuje wysokie rozproszenie światła w przód (FSC), co jest wskaźnikiem dużej objętości komórek, oraz niskie rozproszenie boczne (SSC), będące wskaźnikiem niskiej ziarnistości komórek (Rysunek 2A). W tym doświadczeniu celowo przygotowaliśmy również „słab...

Rośnie zainteresowanie zrozumieniem funkcji immunologicznych określonych subpopulacji komórek w łatach Peyera (PP), głównych miejscach indukcyjnych tkanek limfatycznych związanych z jelitami. W tym miejscu przedstawiamy równoległe protokoły przygotowania preparatów pojedynczych komórek PP do analizy cytometrii przepływowej i kriosekcji PP do barwienia immunologicznego.

Izolowanie i barwienie immunologiczne limfocytów i komórek dendrytycznych z mysich plastrów Peyera

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie i immunobarwienie limfocytów i komórek dendrytycznych z plastrów płatników neuronów, przy użyciu dwóch równoległych podejść eksperymentalnych. Po pierwsze, wycisnąć świeże plastry płatników z myszy, jelita cienkiego. Następnie należy fizycznie oddzielić plastry płatnika, pobrać tkankę i przepuścić ją przez filtr siatkowy, aby wygenerować zawiesinę pojedynczej komórki do analizy cytometrii przepływowej.Zebrać komórki przez odwirowanie i rozprowadzić porcje w 96-dołkowej okrągłej płycie dennej. Następnie oznacz komórki przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym specyficznym dla typu komórki. Natychmiast przystąp do analizy cytometrii przepływowej w celu wyliczenia określonych typów komórek: Równolegle wyizoluj plastry płatnika i zatrzaskowo zamroź próbki tkanek.W blokach OCT, sekcja kriogeniczna, próbki znakowane są przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym specyficznym dla typu komórki, a następnie wizualizowane za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej razem wziętych. Metody te pozwolą określić ilościowo limfocyty B, limfocyty T i komórki dendrytyczne w określonych przedziałach w tkankach łatowych płatnika. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ tkanki łaty PI są niezwykle delikatne i można je łatwo uszkodzić.Podczas przenoszenia. Połóż świeżo wyizolowane jelito cienkie na łóżku z wilgotnych ręczników papierowych lub chusteczek Kim. Następnie delikatnie zwilż jelito cienkie solą fizjologiczną, aby zapobiec odwodnieniu tkanek.Teraz wizualnie zidentyfikuj poszczególne plastry płatników znajdujące się po stronie przeciw krezce jelita. Zazwyczaj pojedyncza mysz ma od pięciu do 10 widocznych płatników, które są równomiernie rozmieszczone od dwunastnicy do jelita krętego. Używanie zakrzywionych nożyczek chirurgicznych zazwyczaj wycina plastry indywidualnego płatnika.Umieść je w zimnym roztworze do sortowania wagowego Matcha, utrzymując tkankę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zachować żywotność komórek. Następnie przenieś plastry płatnika do pięciu mililitrów pożywki dysocjacyjnej śledziony i wstrząsaj z prędkością 250 obr./min przez 15 do 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki, umieść próbkę na sterylnym sitku do komórek z nylonowej siatki o grubości 70 mikronów i na siłę zmiel tkankę w siatce za pomocą podstawy tłoka ze strzykawki o pojemności jednej cm3 w celu usunięcia pozostałych agregatów komórkowych.Przelej zawiesinę komórek przez drugą komórkę o grubości 70 mikronów, sitko i zbierz komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 lub 50 mililitrów. Dozować 10 do pięciu komórek na studzienkę do 96-dołkowych komórek z okrągłą płytką przez wirowanie przez pięć minut po 1000 razy. G. Następnie zdekantować supernatant, delikatnie odwracając płytkę.Teraz ponownie zawiesić komórki w buforze blokowym FC i inkubować na lodzie przez 15 minut. Następnie dodać przeciwciała sprzężone z fluorem bezpośrednio do zawiesin komórkowych w pożądanym rozcieńczeniu i inkubować na komórkach przemywania lodem ze 100 mikrolitrami buforu przepływowego. Następnie ponownie zawieś komórki w 400 mikrolitrach buforu utrwalającego, aby przeanalizować komórki za pomocą cytometrii przepływowej w celu wyizolowania plastrów płatników do kriosekcji.Wytnij 0,5 centymetra poprzeczne segmenty jelita cienkiego zawierające pojedynczy plaster płatnika. Przenieść tkankę na szalkę Petriego zawierającą PBS. Następnie umieść segmenty tkanki jelitowej pionowo w foremkach bazowych zawierających OCT.Zanurz formy w ciekłym azocie i pozwól tkance całkowicie zamarznąć. Usuń zamrożone formy bazowe z ciekłego azotu za pomocą kleszczy. Pozwól pleśni nagrzać się do temperatury pokojowej na tyle długo, aby krawędzie bloku OCT zmiękły.Następnie wyjmij zamrożony blok OCT z formy. Odwróć formę i delikatnie naciśnij z tyłu, aby wysunąć blok na czysty kawałek folii aluminiowej o wymiarach cztery na cztery centymetry. Natychmiast zawinąć chusteczkę w folię i umieścić w oznakowanej torbie na próbkę, przechowywanej w ciekłym azocie lub na suchym lodzie, kriogenicznym przekroju tkanki za pomocą mikrotomu kriogenicznego LI, a, CM, 3, 0, 0 s lub równoważnego.Ustaw temperaturę komory na kriostacie na minus 21 stopni Celsjusza. Idealnie tnij odcinki o grubości od 12 do 14 mikronów. Zbierz skrawki na szkiełkach mikroskopowych Supercross plus.Sprawdź próbki wizualnie za pomocą standardowego mikroskopu świetlnego o małej mocy. Zanurz szkiełka w acetonie na dwie minuty. Należy pamiętać, że długotrwała inkubacja może spowodować oderwanie tkanek od szkiełka.Przemyć próbki trzykrotnie za pomocą PBST. Następnie otocz sekcje hydrofobowym pisakiem obrazu. Teraz inkubuj próbki w buforze blokowym, nałóż skrawki tkanki na roztwór przeciwciała pierwotnego.Osusz obszar wokół sekcji za pomocą chusteczek Kim lub innej chłonnej chusteczki bez dotykania rzeczywistych odcinków tkanki. Za pomocą pipety lub zakraplacza delikatnie umieść kroplę przedłużonego złotego podłoża mocującego bezpośrednio na sekcji. Nałóż szklane szkiełko nakrywkowe, unikając pęcherzyków powietrza i usuwając nadmiar mocowania.Analiza średniofaksowa mono rozproszonych zawiesin komórek krosowych wszystkich płatników ujawnia wyraźne rozróżnienie między dobrymi i złymi preparatami komórkowymi w dobrych preparatach komórkowych. Przy ponad 80% żywotności zdecydowana większość komórek wykazuje wysokie rozproszenie do przodu, co wskazuje na dużą objętość komórek i niskie rozproszenie boczne zgodne z niską ziarnistością komórek. W tym eksperymencie celowo przygotowano złe przygotowanie komórek, aby wykazać, że w złej populacji większość komórek wykazuje niski FSC, wysoki SSC i znajduje się poza wskazanym chodem R.Komórki te prawdopodobnie przechodzą apoptozę i/lub martwicę. Oto koktajl składający się z aż czterech różnych Fluorów. Cztery sprzężone przeciwciała monoklonalne do rozróżniania różnych typów komórek.U płatników stosowano zawiesiny pojedynczych komórek, znakowane klastrem markerów różnicowania. CD 19 i B two 20 ujawniają, że komórki B stanowią około 60% płatników bramkowanych. Podzbiory limfocytów T specyficzne dla populacji komórek krosowych można łatwo wyliczyć przez podwójne znakowanie przeciwciałami przeciwko CD trzy i CD czterem lub CD trzy i CD osiem, CD cztery dodatnie i CD osiem dodatnie limfocyty T stanowią odpowiednio około 23% i 9% wszystkich komórek płatniczych.Podzbiory DC, które byłyby CD 11 C dodatnie i CD 1 0 3 dodatnie, można również wyliczyć tą metodą. CD 11 C dodatnie DC przyczyniają się do około 8% całkowitej populacji bramkowanej, co w przybliżeniu odpowiada 10 000 dcs na płatnik plastrów. W populacji komórek CD 11 C dodatnich około 4,7% było podwójnie dodatnich dla B 20 dodatnich.Podobne wyniki uzyskuje się, gdy płatnicy pobierają łatane komórki od czarnych sześciu myszy C 57. Złe przygotowanie komórek może prowadzić do bardzo mylących wyników, głównie dlatego, że martwe lub umierające komórki mają tendencję do niespecyficznego wiązania przeciwciał. Zazwyczaj prowadzą one do nadreprezentacji B 2 2 0 dodatnich i CD trzech dodatnich podwójnie dodatnich komórek, a także B dwóch 20 dodatnich komórek B i CD czterech dodatnich komórek T podwójnie dodatnich.Plastry kriogeniczne myszy płatników są podatne na analizę histopatologiczną, a także znakowanie immunologiczne. Podczas gdy moc sekcji in zapewnia większą rozdzielczość na poziomie komórkowym po zabarwieniu przez h i e, jasne i ciemne strefy płatników łatają centra rozrodcze łatwiej rozgraniczyć w sekcjach kriosekcji. W tej typowej sekcji kriogenicznej plastra płatnika, przeciwciała anty CD 3, znakują limfocyty T przeciwciała anty CD 11 C.Podświetl komórki dendrytyczne i przeciwciała anty B dwa 20. Podświetl komórki B Po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom w tej dziedzinie do zrozumienia, w jaki sposób określone typy komórek, takie jak komórki dendrytyczne w tkankach limfatycznych związanych z jelitami, reagują na antygeny jelitowe i patogeny mikrobiologiczne.Informacje te wpłynęły na projektowanie i opracowywanie szczepionek błony śluzowej.

isolating-immunostaining-lymphocytes-dendritic-cells-from-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolowanie i immunobarwienie limfocytów i komórek dendrytycznych z łatek Peyer'a u myszy

Komórki M w wyspecjalizowanym nabłonku związanym z mieszykami, pokrywającym kępki Peyera, odgrywają istotną rolę w nadzorze immunologicznym błony śluzowej w tkance limfatycznej związanej z jelitami. W niniejszej pracy opisaliśmy metodę oceny transcytozy bakteryjnej przez komórki M in vivo. Metoda ta pozwala na zrozumienie funkcji komórek M w układzie odpornościowym.

Zastosowanie testu pętli jelitowej z podwiązaną plamką Peyer’a u myszy do oceny wychwytu bakterii przez komórki M

W tym filmie pokazujemy izolację limfocytów z pobranej myszy łaty Peyera. Wyizolowane limfocyty można wykorzystać do dalszej analizy.

Izolacja limfocytów z mysiego plastra Peyera

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania komórek prezentujących antygen z ludzkiej grasicy poprzez różne etapy enzymatycznego trawienia tkanki, następnie gęstości odwirowania zawiesiny pojedynczej komórki i na końcu magnetycznego i/lub FACS sortowania interesujących populacji komórek.

Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

Ten protokół opisuje eksperymentalne procedury oceny różnicowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w plastrze Peyera od typowych komórek progenitorowych komórek dendrytycznych, przy użyciu technik obejmujących izolację komórek za pośrednictwem FACS, hydrodynamiczny transfer genów i analizę przepływu podzbiorów immunologicznych w plastrze Peyera.

Ocena rozwoju mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w łatach Peyera z wykorzystaniem adoptywnego transferu przodków hematopoetycznych

Opisujemy protokół skutecznego izolowania limfocytów T rezydujących w skórze z biopsji ludzkiej skóry. Protokół ten zapewnia wystarczającą liczbę żywotnych limfocytów rezydentnych w ludzkiej skórze do analizy cytometrii przepływowej i hodowli ex vivo.

Izolacja limfocytów z ludzkiej skóry w celu analizy fenotypowej i hodowli komórkowej ex vivo

Opisujemy tutaj transgeniczny model myszy reporterowej do wizualizacji komórek wytwarzających IL-22 wewnątrz różnych tkanek myszy. Ta metoda może być wykorzystana do śledzenia lokalizacji innych cytokin lub białek wydzielniczych u myszy.

Wizualizacja limfocytów z ekspresją IL-22 przy użyciu myszy reporterowych

Opisujemy metodę generowania precyzyjnie wycinanych plastrów płuc (PCLS) i ich barwienia immunologicznego, aby zobrazować lokalizację różnych typów komórek odpornościowych w płucach. Nasz protokół można rozszerzyć w celu wizualizacji lokalizacji i funkcji wielu różnych typów komórek w różnych warunkach.

Precyzyjnie wycięte plastry płuc myszy do wizualizacji żywych komórek dendrytycznych płuc

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych, w tym tkanki limfatycznej związanej z jelitami, plam Peyera i drenujących węzłów chłonnych krezkowych, oraz miejsc efektorowych, w tym blaszki właściwej i nabłonka jelitowego układu odpornościowego jelita cienkiego.

Izolowanie limfocytów od układu odpornościowego myszy w jelicie cienkim

W tym badaniu prezentujemy nowatorski i skuteczny protokół izolacji limfocytów z plastrów Peyera (PPs), który może być następnie wykorzystany do testów funkcjonalnych in vivo i in vitro, a także do badań cytometrycznych komórek T pomocniczych pęcherzyków i komórek B centrum rozrodczego.

Odkrywanie kluczowych graczy odporności humoralnej: zaawansowany i zoptymalizowany protokół izolacji limfocytów z plastrów mysich Peyera

Prezentowany tutaj jest test do ilościowego określenia hipermutacji somatycznej w locus genu ciężkiego łańcucha immunoglobuliny przy użyciu komórek B centrum zarodkowego z mysich plastrów Peyera.

Analiza hipermutacji somatycznej w intronie JH4 komórek B centrum rozrodczego z mysich plastrów Peyera

Tutaj opisujemy dokładną metodę pobierania limfocytów przewodu piersiowego i obserwacji migracji limfocytów tropikalnych jelitowych w plamach Peyera szczura przez 3 godziny za pomocą fotografii poklatkowej. Ta technika może wyjaśnić, w jaki sposób dynamika limfocytów wpływa na stan zapalny.

Obserwacja mikroskopowa dynamiki limfocytów w szczurzych łatach Peyera

Poznaj izolację i barwienie immunologiczne limfocytów oraz komórek dendrytycznych z plastrów Peyera myszy. Metoda obejmuje cytometrię przepływową i immunobarwienie przekrojów kriogenicznych do analizy odpornościowej jelit.

Izolowanie i barwienie immunologiczne limfocytów i komórek dendrytycznych z mysich plastrów Peyera

Przeglądaj więcej filmów