Ocena nanocząstek dostarczających geny polimerowe za pomocą analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie i ocena eksperymentów z dostarczaniem genów z wykorzystaniem niewirusowych nanopartykuł polimerowych. Cel ten realizuje się poprzez przeprowadzenie transfekcji komórek cząsteczkami dostarczającymi geny. Następnie wydajność transfekcji jest oceniana za pomocą mikroskopii oraz wysokoprzepustowej analizy cytometrii przepływowej.

Następnie, przy użyciu analizatora śledzenia nanocząsteczek (NTA), wyznacza się rozkład wielkości nanocząsteczek, ich stężenie oraz liczbę plazmidów na jedną cząsteczkę. Ostatecznie metoda ta pozwala na charakterystykę wielkości nanocząsteczek oraz ocenę skuteczności transfekcji z ich wykorzystaniem. Główną zaletą stosowania biodegradowalnych nanocząsteczek polimerowych w dostarczaniu genów jest fakt, że mogą być one bezpieczniejsze i bardziej efektywne niż inne metody transferu genów.

Główną zaletą analizy śledzenia nanocząstek w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak dynamiczne rozpraszanie światła, jest fakt, że analiza śledzenia nanocząstek bezpośrednio dostarcza rozkładu średniej liczbowej oraz stężenia cząstek. Metoda ta pomogłaby odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nieviralowej dostawy genów, takie jak liczba plazmidów na cząstkę, co jest istotne w badaniach nad koekspresją. Poniższy protokół został zademonstrowany z wykorzystaniem ludzkich komórek śródbłonka siatkówki (hre) jako komórek modelowych oraz polibeta-aminoestrów (PBA AEs) jako polimerów modelowych.

Należy pamiętać, że warunki hodowli i rozpuszczalniki mogą wymagać dostosowania w zależności od użytych komórek i polimerów na 24 godziny przed transfekcją. Do wysiewu komórek do przezroczystych, traktowanych do hodowli tkankowej płytek 96-dołkowych o płaskim dnie, w stężeniu od 25 do 50 komórek na µL, należy użyć pipety wielokanałowej.

Zapewni to od 70 do 80% wydajności w dniu transfekcji; należy przygotować i opisać przezroczyste płytki 96-dołkowe, które nie były poddane obróbce do hodowli tkankowych, aby służyły jako płytki matrycowe do przygotowania i rozcieńczenia PBA oraz DNA. Należy przygotować dwie identyczne płytki.

Jedna do oceny toksyczności i jedna do oceny wydajności transfekcji. Przygotuj roztwory stokowe polimeru poly beta amino ester (PVAE) oraz P-E-G-F-P-N 1D NA w temperaturze pokojowej. Po wymieszaniu, użyj pipety 12-kanałowej, aby w każdej studni dla każdego warunku przygotować 50 µL DNA w stężeniu 0,06 mg/mL w 25 mM buforze octanu sodu.

Następnie na tej samej płytce rozcieńcz polimery PBAE do stężenia 10 mg/mL w buforze octanu sodu. Następnie wykonaj dalsze rozcieńczenie polimerów PBAE w stosunkach masy polimeru do masy DNA wynoszących 30 i 60, stosując 50 µL buforu octanu sodu. W celu utworzenia nanocząsteczek użyj pipety 12-kanałowej, aby połączyć 50 µL rozcieńczonego PBA z 50 µL rozcieńczonego plazmidowego DNA, mieszając zawartość energicznie poprzez pipetowanie w górę i w dół.

Następnie inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić samoorganizację. Po zakończeniu samoorganizacji, używając pipety 12-kanałowej, dodać kroplami 20 µL roztworu nanocząsteczek do każdej studni z wysianymi komórkami zawierającymi medium; przeprowadzić transfekcję w czterech studniach dla każdego wariantu, zgodnie z przedstawionym schematem. Na każdej płytce zarezerwować co najmniej cztery studnie dla każdej z kontroli negatywnej i pozytywnej.

Kontrola negatywna składa się z niepoddanych działaniu komórek, a kontrole pozytywne z komórek transfekowanych za pomocą dostępnego komercyjnie odczynnika, takiego jak lipo 2000 lub Fuge hd. Inkubować płytki z transfekowanymi komórkami w temperaturze 37 °C przez cztery godziny. Po inkubacji użyć pipety 12-kanałowej, aby usunąć medium z komórek i zastąpić je 100 µL świeżego medium hre na dołek. Inkubować przez kolejne 24 do 48 godzin.

Następnego dnia wyjmij jedną płytkę z inkubatora. Oceń efektywność transfekcji i toksyczność komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz określ poziom toksyczności komórkowej, stosując test Cell Titer 96 Aqueous One zgodnie z opisem w tekście towarzyszącym. Po 48 godzinach wyjmij drugą płytkę z inkubatora.

Oceń wydajność transfekcji za pomocą fluorescencji, mikroskopii i cytometrii przepływowej, zgodnie z opisem w towarzyszącym tekście. Wykorzystaj uzyskane tutaj dane dotyczące toksyczności i transfekcji, aby określić optymalne stężenia PBA do zastosowania w przyszłych eksperymentach. Nano Sight NS 500 to instrument do analizy śledzenia nanocząstek, który umożliwia uzyskanie informacji o rozkładzie wielkości próbki nanocząstek poprzez śledzenie dyfuzji poszczególnych nanocząstek; przed użyciem przygotuj systemy płynowe urządzenia Nano Sight w probówce do mikrowirówki o pojemności 0.5 ml.

Przygotować PBA i plazmowe DNA do analizy w ten sam sposób i w tych samych stężeniach, co w poprzedniej części tego filmu. Po samomontażu rozcieńczyć 100-krotnie roztwór nanocząstek w PBS w nowej probówce o pojemności 1,5 mililitra, aby uzyskać objętość końcową co najmniej 500 microliters. Pozwoli to uzyskać stężenie nanocząstek w zakresie odpowiednim dla analizy śledzenia nanocząstek.

Następnie wprowadź próbkę do nano-portu. Należy upewnić się, że nie wprowadzono pęcherzyków powietrza, a następnie sprawdzić wizualnie, czy na ekranie znajduje się od 20 do 100 cząstek. Idealna liczba cząstek dla śledzenia nanocząstek wynosi około 50.

Jeśli cząstek jest zbyt wiele lub zbyt mało, należy przepłukać NS 500, skorygować rozcieńczenie w PBS i ponownie załadować próbkę. Jeśli liczba cząstek na ekranie mieści się w przedziale od 20 do 100, należy zarejestrować filmy. Po zarejestrowaniu filmów należy przejść do etapu przetwarzania, otwierając plik wideo w tym samym oprogramowaniu.

Po otwarciu pliku zwiększ wzmocnienie ekranu. Wybierz automatyczną regulację parametrów obrazu, zaznaczając odpowiednie pola. Jeśli oprogramowanie rozpozna cząsteczkę na ekranie, zostanie ona oznaczona czerwonym krzyżykiem.

Po zaznaczeniu wszystkich cząstek kliknij przycisk przetwarzania (process) w oprogramowaniu, aby przetworzyć plik wideo. Następnie wyświetlone zostaną rozmiary cząstek, średnie wartości rozkładu rozmiarów oraz stężenie cząstek, co pozwoli zweryfikować poprawność zliczenia cząstek. Powtórz tę procedurę, używając tej samej próbki rozcieńczonej dwukrotnie i czterokrotnie.

Komórki Forex w PBS zostały przetransfekowane nanocząsteczkami E-G-F-P-P-B-A-E, jak pokazano w tym filmie. Aby wizualnie ocenić wydajność transfekcji, wykonano obrazowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Obrazy te przedstawiają fluorescencję, pole jasne oraz obrazy scalone przetransfekowanych komórek; jak widać na obrazie scalonym, większość komórek wykazuje ekspresję EGFP i zachowuje prawidłową morfologię.

Aby określić wydajność transfekcji, przeprowadzono cytometrię przepływową, co przedstawiono na tej rycinie po wyznaczeniu bramki dla populacji żywych komórek. Populacja niepoddana resekcji nie zawierała komórek wykazujących ekspresję EGFP. Jednakże 71,6% komórek traktowanych było pozytywnych pod kątem EGFP. Następnie wykorzystano analizę śledzenia nanocząsteczek (NTA), aby określić rozkład wielkości i stężenie nanocząsteczek.

W tej analizie kluczowe jest, aby rozkład wielkości cząstek był monodyspersyjny. Wykorzystując te informacje, średnią liczbę plazmidów na cząstkę można obliczyć, dzieląc stężenie plazmidów w roztworze przez stężenie cząstek wyznaczone za pomocą NS 500. Liczba plazmidów na cząstkę jest rozkładem, który odzwierciedla rozkład wielkości cząstek.

W próbce znajdą się zarówno większe cząstki z liczbą plazmidów na cząstkę wyższą od średniej, jak i mniejsze cząstki z liczbą plazmidów na cząstkę niższą od średniej. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie pozostawiać polimerów degradowalnych w rozpuszczalniku wodnym zbyt długo przed dodaniem nanocząstek do komórek; w przypadku użycia ncy należy dostosować rozcieńczenie odpowiednio do rozmiaru. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak transfekować przylegające typy komórek za pomocą niewirusowych polimerów dostarczających geny, a także jak mierzyć skuteczność transfekcji oraz rozkład wielkości cząstek.

Pamiętaj, że praca z ludzkimi komórkami wiąże się z zagrożeniem biologicznym. Podczas wykonywania tej procedury zawsze używaj środków ochrony osobistej i pracuj w komorze z laminarnym przepływem powietrza.