Name: Ocena nanocząstek dostarczających geny polimerowe za pomocą analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj metodę oceny nanocząstek polimerowych do dostarczania genów przy użyciu analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia precyzyjną charakterystykę wielkości cząstek oraz efektywność transfekcji komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) i NIH R21CA152473 za wsparcie.

1. Sadzenie komórek
<ol>
 <li>Nie pozwól, aby komórki rosły do nadmiernej konfluencji. Używaj komórek wczesnego pasażu podczas transfekcji komórek pierwotnych.</li>
 <li>Dwadzieścia cztery godziny przed transfekcją trypsynizuj komórki, policz komórki za pomocą hemocytometru i rozcieńcz zawiesinę komórek pożywką, aby osiągnąć pożądaną gęstość komórek (komórki/objętość). Komórki nasienne umieścić na przezroczystych, 96-dołkowych płytkach z płaskim dnem poddanych działaniu kultur tkankowych za pomocą zbiornika i pipet wielokanałowych. Wybrana gęstość powinna dawać 70-80% konfluencji w dniu transfekcji. Na przykład, jak pokazano w tabeli 1, komórki rozcieńczono do 25 do 50 komórek/μl dla danych transfekcji pokazanych tutaj.</li>
</ol>
2. Transfekcja komórek
<ol>
 <li>Rozcieńczanie zapasów polimerów i DNA. Rozmrażać roztwory podstawowe polimerów i DNA w temperaturze pokojowej (RT). Rozcieńczyć podstawowy roztwór polimeru i podstawowy roztwór DNA, oddzielnie na przezroczystych 96-dołkowych płytkach, używając pipety dwunastokanałowej, odpowiednim rozpuszczalnikiem do stężeń wymaganych do uzyskania pożądanego stosunku masy polimeru do masy DNA (wag/wag.). W tym przypadku wybranym rozpuszczalnikiem jest 25 mM bufor octanu sodu (pH = 5,2).
	 <ol>
		 <li>Rozcieńczenie DNA. Zazwyczaj DNA przechowywane w stężeniu 1 mg/ml rozcieńcza się w buforze octanu sodu do stężenia od 0,03 do 0,06 mg/ml na przezroczystej 96-dołkowej płytce bez hodowli tkankowej (jedna studzienka dla pojedynczego preparatu). Tabela 2 przedstawia typowy protokół rozcieńczania DNA dla pojedynczego preparatu stosowanego do transfekcji czterech dołków replikowanych w 96-dołkowej płytce wysianej komórkami z Kroku 1.</li>
		 <li>Rozcieńczenie polimeru. Roztwór polimeru/DMSO o stężeniu 100 mg/ml rozcieńcza się w buforze octanu sodu zgodnie ze stężeniem wymaganym do uzyskania pożądanego stosunku wag. polimeru do DNA. Zakres stosunków wagowych / wagowych zwykle stosowanych do dostarczania genów z poli(beta-estrami) (PBAE) wynosi od 20 do 100. Polimery PBAE najpierw rozcieńcza się do 10 mg/ml, a następnie stosuje się protokół rozcieńczania, jak pokazano w tabeli 3. Rozcieńczenia polimeru można przeprowadzić na przezroczystej, 96-dołkowej płytce bez hodowli tkankowej, która odpowiada orientacji próbki płytki rozcieńczającej DNA.</li>
	 </ol>
	</li>
	<li>Powstawanie nanocząstek. Dodać roztwór PBAE do równej objętości roztworu plazmidowego DNA za pomocą dwunastokanałowej pipety i energicznie wymieszać. Pozostaw mieszaninę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić samodzielny montaż.</li>
 <li>Transfekcja nanocząstek. Po samoorganizacji 20 μl nanocząstek jest dodawanych kroplami do pożywki hodowlanej za pomocą dwunastokanałowej pipety. Studzienki replikowane pozostawia się bez obróbki lub transfekuje się je dostępnymi w handlu odczynnikami jako kontrolą. Transfekowane komórki inkubuje się w temperaturze 37 °C przez dwie do czterech godzin, a następnie studzienki zastępuje się świeżymi pożywkami (100 μl/dołek). Wybór czasu inkubacji będzie zależał od linii komórkowej, warunków hodowli i systemu transfekcji. Różnica w skuteczności transfekcji i toksyczności komórkowej wynikająca z różnych okresów inkubacji zostanie określona ilościowo za pomocą protokołu analizy opisanego w kroku 3.</li>
</ol>
3. Analiza skuteczności transfekcji i toksyczności komórek
Efektywność transfekcji jest analizowana wizualnie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i określana ilościowo za pomocą cytometru przepływowego czterdzieści osiem godzin po transfekcji. Toksyczność komórek jest analizowana wizualnie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i oznaczana ilościowo za pomocą testu CellTiter 96 AQueous One dwadzieścia cztery godziny po transfekcji.
<ol>
 <li>Mikroskopia fluorescencyjna. Przeanalizuj wizualnie studzienki pod kątem ekspresji transfekowanego genu reporterowego (na przykład EGFP lub DsRed) przy użyciu odpowiedniego kanału fluorescencyjnego. Zdobądź obrazy dla każdego dołka, wybierając pola widzenia, które odpowiednio reprezentują skuteczność transfekcji dla poszczególnych preparatów (rysunek 1). Zanotuj wszelkie zaobserwowane wizualnie objawy toksyczności komórek.</li>
 <li>Cytometria przepływowa.
	 <ol>
		 <li>Użyj pipet wielokanałowych, aby przygotować 96-dołkową płytkę do cytometrii przepływowej. Przemyć PBS, trypsynizować 30 μl/basenik trypsyny/EDTA, zneutralizować 170 μl buforu FACS (PBS + 2% FBS), pipetować w górę i w dół w każdym dołku, w tym wokół krawędzi, i przenieść całą objętość 200 μl z każdej studzienki do odpowiednich dołków w 96-dołkowej płytce okrągłodennej lub V-dolnej.</li>
		 <li>Odwirować płytkę o sile 130 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	 <li>Usuń 170 μl pożywki z każdej studzienki i odpipetuj w celu ponownego zawieszenia komórek, unikając pęcherzyków. Aby użyć barwnika żywotności, takiego jak jodek propidyny (PI), dodaj 10 μl buforu FACS + PI (rozcieńczenie buforu FACS 50:1 PI; Stężenie PI 1 mg/ml) do każdej studzienki. Natychmiast umieść na lodzie i przykryj przed światłem.</li>
	 <li>Uruchom cytometr przepływowy C6 Accuri, nasadkę HyperCyt 96-dołkową i oprogramowanie HyperView. Użyj kart HyperView Design (Projekt) i Protocol (Protokół), aby wybrać odpowiedni typ płytki, układ płytki i inne ustawienia, takie jak czas potrząsania/popijania/płukania/wstrząsania. Dla powyższego protokołu zastosowano następujące parametry: wstępne zalewanie płytki przez jedną minutę i wstrząsanie przed płytką przez 30 sekund przy 2,400 obr./min. Czas łykania ustalono na 15 sekund przy 15 obr./min, sondę płukano co 2 sekundy przez 2 sekundy, a co 12 dołków wytrząsano przez 12 sekund przy 2,400 obr./min. Wytrząsanie między dołkami jest ważne, aby utrzymać komórki rozproszone w pożywce, a także dla poprawy zdolności do przetwarzania danych poprzez uwzględnienie przerw czasowych między grupami studzienek (w tym przypadku 12 sekund).</li>
	 <li>Użyj karty Identyfikacja studni HyperView, aby przetworzyć dane i rozdzielić je do odpowiedniego dołka (Rysunek 2). W celu zidentyfikowania poszczególnych studni pomocne może być użycie filtra szumów oprogramowania, a także dołączenie podstawowego filtra równomiernego w ustawieniach zaawansowanych.</li>
	 <li>Określ ilościowo procent dodatnio transfekowanych żywych komórek poprzez odpowiednie bramkowanie w celu oddzielenia różnych populacji (ryc. 3). Najpierw wyświetl dane dotyczące przepływu w FSC vs. Wykres punktowy SSC w celu oddzielenia komórek od zanieczyszczeń (rysunek 3A). Jeśli użyto jodku propidyny (PI), należy przebramować pojedynczą populację komórek i wyświetlić te dane na wykresie FSC w porównaniu z FL3 w celu oddzielenia żywych komórek od martwych komórek i bramki żywych komórek. Aby określić ilościowo liczbę transfekowanych komórek, należy wyświetlić populację żywych komórek na odpowiednich kanałach, na przykład GFP można zobaczyć w FL1. Korzystając z populacji nieleczonej, bramkują nieleczone komórki w celu zidentyfikowania sygnału tła (ryc. 3B). Dodatnio transfekowane komórki można następnie wyizolować za pomocą tej bramki i przeglądając transfekowane populacje za pomocą wykresów rozproszonych i konturowych (ryc. 3C i 3D). Może istnieć kontinuum dodatnio transfekowanych komórek, ponieważ różne komórki będą transfekowane do różnych stopni fluorescencji.</li>
	 </ol>
	 </li>
	 <li>Miano komórkowe 96 AQueous One test
	 <ol>
		 <li>Transfekować inną płytkę dokładnie w ten sam sposób do pomiarów toksyczności komórek.</li>
		 <li>Zmieszać 1 ml roztworu testowego CellTiter 96 AQueous One z 10 ml świeżej pożywki. Usuń pożywkę z komórek i za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 110 μl wstępnie zmieszanego roztworu + pożywki na dołek.</li>
	 <li>Mierzyć absorbancję przy długości fali 490 nm co godzinę w odstępach od 1 do 4 godzin, aż do momentu, gdy absorbancja z dołka bez poddawania działaniu środka znajdzie się w liniowym zakresie testu. Dołącz cztery studzienki kontrolne tylko z roztworem + pożywką do odczytu absorbancji tła.</li>
	 <li>Uśrednić wartości absorbancji z czterech dołamków replik dla każdego warunku i odjąć średnią absorbancję tła od każdej średniej. Znormalizuj skorygowaną średnią dla każdego leczonego schorzenia do skorygowanej średniej dla nieleczonego stanu, aby określić procent żywotności komórek.</li>
	 </ol>
	 </li>
</ol>
4. Wymiarowanie nanocząstek za pomocą obliczeń NTA i plazmidu na cząstkę
<ol>
 <li>Zalać układ fluidyczny Nanosight NS500, uruchamiając pompę rozcieńczalnika do przodu z około 1/5 maksymalnej prędkości, a pompę próbki do tyłu z około 1/10 maksymalnej prędkości. Kontynuuj, aż układ fluidyki zostanie przepłukany rozcieńczalnikiem.</li>
 <li>Przygotuj nanocząstki do analizy. W przypadku PBAE oddzielnie rozcieńczyć podstawowy plazmidowy DNA (1 mg/ml) i podstawowy PBAE (100 mg/ml) w buforze octanu sodu (25 mM, pH 5) w probówkach Eppendorfa.</li>
 <li>Rozcieńczyć stężenie plazmidowego DNA do 0,06 mg/ml. Stężenie polimeru może się różnić w zależności od wymaganego stosunku masy do masy polimeru do DNA (na przykład dla cząstek o masie 60 wag./wt polimer rozcieńcza się do 3.6 mg/ml).</li>
 <li>Dodaj roztwór polimeru do równej objętości roztworu plazmidowego DNA i energicznie wymieszaj. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić samodzielny montaż.</li>
 <li>Rozcieńczyć roztwór nanocząstek 100-krotnie do PBS, aby stężenie nanocząstek mieściło się w odpowiednim zakresie dla NTA i aby uzyskać końcową objętość co najmniej 500 μl.</li>
 <li>Załaduj próbkę do Nanosight, umieszczając rurkę ładującą w sample probówce Eppendorfa (Rysunek 4A). Uważaj, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>W trybie przechwytywania zwiększaj poziom kamery, aż będzie można zobaczyć cząsteczki. Dostosuj ostrość tak, aby cząstki wyglądały na gładkie (Rysunek 4A i 4B).</li>
 <li>W trybie standardowym dostosuj poziom kamery do punktu, w którym wszystkie cząsteczki są widoczne na ekranie. Następnie zmniejsz poziom kamery do najniższego poziomu, tak aby wszystkie cząstki mogły być nadal obserwowane. Jeśli potrzebny jest pośredni poziom kamery, przejdź do trybu zaawansowanego i zmodyfikuj migawkę aparatu oraz wzmocnienie do odpowiednich poziomów.</li>
 <li>Sprawdź wzrokowo, czy na ekranie znajduje się od 20 do 100 cząstek. Idealna liczba do śledzenia nanocząstek to około 50 cząstek. Jeśli jest za dużo lub za mało, przepłukać NS500, dostosować rozcieńczenie do PBS i ponownie załadować próbkę.</li>
 <li>Dostosuj czas przechwytywania zgodnie z tabelą trybów standardowych. Zazwyczaj 30–60 sekund to odpowiednia długość przechwytywania (Rysunek 4B).</li>
 <li>Aby załadować następną próbkę, przepłucz system, a następnie ponownie załaduj nową próbkę.</li>
 <li>Po przechwyceniu filmów przejdź do etapu przetwarzania, otwierając plik wideo.</li>
 <li>Istnieje szereg parametrów, które można dostroić, aby jak najlepiej przetworzyć obraz wideo (Rysunek 4C). Celem jest wybranie parametrów, które najlepiej wychwytują każdą cząstkę na ekranie, zgodnie z czerwonym krzyżykiem na ekranie nad każdą cząstką (rysunek 5).</li>
 <li>Zwiększ zysk ekranu, aby lepiej widzieć cząsteczki. W trybie standardowym lub zaawansowanym wybierz automatyczną regulację parametrów, klikając odpowiednie pola. W przypadku, gdy ustawienia automatyczne nie wybierają odpowiednio cząstek, odznacz pole i ręcznie ustaw parametry (Rysunek 4C).</li>
 <li>Gdy wszystkie cząstki zostaną wybrane na ekranie, kliknij przycisk procesu w oprogramowaniu, aby przetworzyć plik wideo (Rysunek 4C). Zapewnia to rozkład wielkości cząstek, średnie wielkości oraz stężenie cząstek.</li>
 <li>Aby upewnić się, że stężenie cząstek jest dokładne, zmień rozcieńczenie PBS, na przykład zwiększając rozcieńczenie 2x, i powtórz powyższą procedurę. Zaleca się pomiar wielokrotnych rozcieńczeń tej samej próbki w celu zapewnienia dokładności pomiaru stężenia próbki. Dobry zakres do pomiaru to 107-10 9 cząstek/ml.</li>
 <li>Sprawdź, czy wszystkie plazmidy są włączone do nanocząstek, przeprowadzając elektroforezę żelową nanocząstek i oceniając, czy obecne jest wolne DNA. Jeśli nie wszystkie plazmidy są otorbione, należy użyć standardowych technik do pomiaru absorbancji DNA w celu ilościowego określenia całkowitej liczby plazmidów otoczonych kapsułkami.</li>
 <li>Aby obliczyć średnią liczbę plazmidów na cząstkę, podziel całkowite stężenie plazmidu w kapsułkach przez stężenie cząstek zmierzone przez NTA. Aby oszacować rozkład plazmidu na próbkę cząstki, najpierw użyj histogramu wielkości cząstek NTA, aby obliczyć udział objętościowy każdego pojemnika cząstki o długości 1 nm. Pomnóż ten rozkład ułamka objętościowego przez całkowitą ilość plazmidu, aby uzyskać liczbę plazmidów w każdym pojemniku. Podziel te liczby przez liczbę cząstek w każdym pojemniku, aby uzyskać liczbę plazmidów na cząstkę dla każdej wielkości cząstek (rysunek 6).</li>
</ol>

<ol><li>Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymers+for+gene+delivery+across+length+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Polymers for gene delivery across length scales.</a> Nature Materials. 5, 439-451 (2006).</li>
<li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+cells+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).</li>
<li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo%3A+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).</li>
<li>Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rita+Schaffer+Lecture%3A+Nanoparticles+for+Intracellular+Nucleic+Acid+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).</li>
<li>Lynn, D. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradable+poly%28beta-amino+esters%29%3A+Synthesis%2C+characterization%2C+and+self-assembly+with+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).</li>
<li>Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+transfection+with+polymeric+nanoparticles+are+dependent+on+polymer+end-group+structure%2C+but+largely+independent+of+nanoparticle+physical+and+chemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties.</a> Mol. Pharm. , (2012).</li>
<li>Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+nanoparticles+specific+for+human+microvasculature+and+macrovasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).</li>
<li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+terminal+functionalization+and+molecular+weight+of+a+gene+delivery+polymer+and+transfection+efficacy+in+mammary+epithelial+2-D+cultures+and+3-D+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures.</a> Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).</li>
<li>Tzeng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+gene+delivery+nanoparticles+based+on+poly%28beta-amino+esters%29+for+treatment+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma.</a> Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).</li>
<li>Sunshine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Molecule+End-Groups+of+Linear+Polymer+Determine+Cell-Type+Gene-Delivery+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy.</a> Adv. Mater. 21, 4947(2009).</li>
<li>Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+quantifying+the+number+of+plasmids+encapsulated+by+polymer+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles.</a> Small. 8, 367-373 (2012).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%3A+Official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).</li>
<li>Kreiss, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+DNA+size+does+not+affect+the+physicochemical+properties+of+lipoplexes+but+modulates+gene+transfer+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency.</a> Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).</li>
<li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-sized+self-assembling+lamellar+complexes+between+plasmid+DNA+and+cationic+micelles+promote+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).</li>
<li>Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+solution+of+%28Lys%29%2816%29-containing+bifunctional+synthetic+peptide%2FDNA+nanoparticles+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).</li>
<li>Green, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+polymeric+vectors+for+gene+delivery+to+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells.</a> Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Powyższe protokoły opisują metody oceny skuteczności transfekcji preparatów nanocząstek, a także sposób charakteryzowania wielkości cząstek i obciążenia DNA nanocząstek. Liczba plazmidów na cząstkę jest ważnym parametrem, który może pomóc w przewidywaniu skuteczności cząstki i może być również wykorzystany do określenia dawki. Analizę śledzenia nanocząstek można przeprowadzić w wielu różnych roztworach wodnych, takich jak roztwory różniące się stężeniem soli. Często ta charakterystyka jest wykonywana w PBS, aby naśladowa...

Określenie liczby plazmidów skompleksowanych na nanocząstkę jest ważne dla projektowania skutecznych strategii dostarczania genów opartych na nanocząstkach, szczególnie dla jednoczesnego dostarczania wielu plazmidów do tego samego celu komórkowego, co często jest wymagane w badaniach nad przeprogramowaniem komórek macierzystych12. Opisano kilka podejść do obliczania liczby plazmidów związanych z pojedynczą nanocząstką, a każde podejście ma wady w technikach stosowanych do szacowania13-16. Znakowanie kropkami kwantowymi (QD) w połączeniu z TEM wykorzystano do oszacowania plazmidów na cząstkę w nanocząstkach na bazie chitozanu. Oszacowanie za pomocą tej techniki QD jest skomplikowane ze względu na konieczność znakowania DNA, co może zmienić jego właściwości samoorganizacji; możliwość, że kapsułkowane nieznakowane DNA nie jest bezpośrednio wykrywane; potencjalnie nakładające się plazmidy i QD na obrazach 2D TEM cząstek; i inne upraszczające założenia13. Alternatywne podejście, które ma zastosowanie, gdy w cząstkach występują uporządkowane mikrodomeny, zostało wykorzystane do badania kompleksów lipopoliamina-DNA za pomocą kriotransmisyjnej mikroskopii elektronowej (cryo-TEM), rozpraszania promieniowania rentgenowskiego i dynamicznego rozpraszania światła (DLS)14,15 . Niestety, materiały takie jak badane tutaj nanocząstki polimerowe nie mają zastosowania w tej metodzie. W innym badaniu Collins i in. wykorzystali technikę analizy obrazu cząstek przepływowych do zbadania kompleksów peptyd/DNA zawierających (Lys)16; Jednak ich metoda może oceniać tylko większe cząstki o rozmiarach mikronów16. W związku z tym niedawno opracowaliśmy nowatorski i elastyczny test do ilościowego określania liczby plazmidów na nanocząstkę11.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>odczynnik</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem, 1x (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10010</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2MV BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Invitrogen</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Bufor octanu sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td>Rozcieńczyć do 25mM w wodzie dejonizowanej</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek dimetylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP DNA</td><td>Elim Biopharmaceuticals</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DsRed DNA</td><td>Addgene</td><td>21718</td><td></td></tr><tr><td>PEI, rozgałęziony </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Clear flat bottom 96-well płytka, sterylna</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta okrągłodenna płytka 96-dołkowa, sterylna</td><td>Sarstedt</td><td>82.1582.001</td><td></td></tr><tr><td>12-kanałowa pipeta Finnpipette</td><td>Thermo Scientific</td><td>NA</td><td>5-50 i 50-300 &mu; l</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td>Numer modelu: AX10</td></tr><tr><td>C6 Cytometr przepływowy Accuri</td><td>BD Biosciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Przystawka</td><td>HyperCyt Intellicyt</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NS500</td><td>Nanosight</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena nanocząstek dostarczających geny polimerowe za pomocą analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Dostarczanie genów niewirusowych za pomocą nanocząsteczek polimerowych okazało się atrakcyjnym podejściem do terapii genowej w leczeniu chorób genetycznych1 oraz jako technologia dla medycyny regeneracyjnej2. W przeciwieństwie do wirusów, które mają poważne problemy z bezpieczeństwem, nanocząstki polimerowe mogą być zaprojektowane tak, aby były nietoksyczne, nieimmunogenne, niemutagenne, łatwiejsze do syntezy, wszechstronne chemicznie, zdolne do przenoszenia większych ładunków kwasów nukleinowych oraz biodegradowalne i/lub wrażliwe na środowisko. Polimery kationowe samoorganizują się z ujemnie naładowanym DNA poprzez oddziaływanie elektrostatyczne, tworząc kompleksy rzędu 100 nm, które są powszechnie nazywane nanocząstkami polimerowymi. Przykłady biomateriałów wykorzystywanych do tworzenia nanocząstek dostarczających geny polikationowe w skali nano obejmują polilizynę, polifosfoestry, poli(amidoaminy) i polietylenininę (PEI), która jest niedegradowalnym, gotowym do użycia polimerem kationowym powszechnie stosowanym do dostarczania kwasów nukleinowych1,3 . Poli(beta-aminoestry) (PBAE) są nowszą klasą polimerów kationowych4, które ulegają hydrolitycznie degradacji5,6 i wykazano, że są skuteczne w dostarczaniu genów do trudnych do transfekcji typów komórek, takich jak ludzkie komórki śródbłonka siatkówki (HREC)7, mysie komórki nabłonka sutka8, ludzkie komórki raka mózgu9 i komórki śródbłonka makronaczyniowe (ludzka żyła pępowinowa, HUVEC)10.
Opisano nowy protokół do charakteryzowania nanocząstek polimerowych za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). W tym podejściu uzyskuje się zarówno rozkład wielkości cząstek, jak i rozkład liczby plazmidów na cząstkę11. Ponadto przedstawiono wysokoprzepustowy test transfekcji 96-dołkowej na płytce do szybkiego badania przesiewowego skuteczności transfekcji nanocząstek polimerowych. W tym protokole poli(beta-aminoestry) (PBAE) są używane jako polimery modelowe, a ludzkie komórki śródbłonka siatkówki (HREC) są używane jako modelowe komórki ludzkie. Protokół ten można łatwo dostosować do oceny dowolnej nanocząstki polimerowej i dowolnego typu komórki będącej przedmiotem zainteresowania w formacie płytki wielodołkowej.

Rysunek 1 przedstawia obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przykładu udanej transfekcji HRECs plazmidem EGFP. Obraz w świetle przechodzącym jest pomocny w upewnieniu się, że komórki zachowują swoją typową morfologię. Dodatkowo, do oceny toksyczności nanocząstek można wykorzystać testy żywotności komórek, takie jak MTS lub podobne testy7. Cytometria przepływowa, zgodnie z opisem, może służyć do ilościowego określenia wydajności transfekcji. Przy użyciu przystawki HyperCyt do płytek wielodołkowy...

Opisano protokół analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej do oceny nanocząstek dostarczających geny polimerowe. NTA wykorzystuje się do scharakteryzowania rozkładu wielkości cząstek nanocząstek i rozkładu plazmidu na cząstkę. Wysokoprzepustowa cytometria przepływowa umożliwia ilościową ocenę skuteczności transfekcji dla biblioteki biomateriałów dostarczających geny.

Ocena nanocząstek dostarczających geny polimerowe za pomocą analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie i ocena eksperymentów z dostarczaniem genów z wykorzystaniem niewirusowych nanopartykuł polimerowych. Cel ten realizuje się poprzez przeprowadzenie transfekcji komórek cząsteczkami dostarczającymi geny. Następnie wydajność transfekcji jest oceniana za pomocą mikroskopii oraz wysokoprzepustowej analizy cytometrii przepływowej.Następnie, przy użyciu analizatora śledzenia nanocząsteczek (NTA), wyznacza się rozkład wielkości nanocząsteczek, ich stężenie oraz liczbę plazmidów na jedną cząsteczkę. Ostatecznie metoda ta pozwala na charakterystykę wielkości nanocząsteczek oraz ocenę skuteczności transfekcji z ich wykorzystaniem. Główną zaletą stosowania biodegradowalnych nanocząsteczek polimerowych w dostarczaniu genów jest fakt, że mogą być one bezpieczniejsze i bardziej efektywne niż inne metody transferu genów.Główną zaletą analizy śledzenia nanocząstek w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak dynamiczne rozpraszanie światła, jest fakt, że analiza śledzenia nanocząstek bezpośrednio dostarcza rozkładu średniej liczbowej oraz stężenia cząstek. Metoda ta pomogłaby odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nieviralowej dostawy genów, takie jak liczba plazmidów na cząstkę, co jest istotne w badaniach nad koekspresją. Poniższy protokół został zademonstrowany z wykorzystaniem ludzkich komórek śródbłonka siatkówki (hre) jako komórek modelowych oraz polibeta-aminoestrów (PBA AEs) jako polimerów modelowych.Należy pamiętać, że warunki hodowli i rozpuszczalniki mogą wymagać dostosowania w zależności od użytych komórek i polimerów na 24 godziny przed transfekcją. Do wysiewu komórek do przezroczystych, traktowanych do hodowli tkankowej płytek 96-dołkowych o płaskim dnie, w stężeniu od 25 do 50 komórek na µL, należy użyć pipety wielokanałowej.Zapewni to od 70 do 80% wydajności w dniu transfekcji; należy przygotować i opisać przezroczyste płytki 96-dołkowe, które nie były poddane obróbce do hodowli tkankowych, aby służyły jako płytki matrycowe do przygotowania i rozcieńczenia PBA oraz DNA. Należy przygotować dwie identyczne płytki.Jedna do oceny toksyczności i jedna do oceny wydajności transfekcji. Przygotuj roztwory stokowe polimeru poly beta amino ester (PVAE) oraz P-E-G-F-P-N 1D NA w temperaturze pokojowej. Po wymieszaniu, użyj pipety 12-kanałowej, aby w każdej studni dla każdego warunku przygotować 50 µL DNA w stężeniu 0,06 mg/mL w 25 mM buforze octanu sodu.Następnie na tej samej płytce rozcieńcz polimery PBAE do stężenia 10 mg/mL w buforze octanu sodu. Następnie wykonaj dalsze rozcieńczenie polimerów PBAE w stosunkach masy polimeru do masy DNA wynoszących 30 i 60, stosując 50 µL buforu octanu sodu. W celu utworzenia nanocząsteczek użyj pipety 12-kanałowej, aby połączyć 50 µL rozcieńczonego PBA z 50 µL rozcieńczonego plazmidowego DNA, mieszając zawartość energicznie poprzez pipetowanie w górę i w dół.Następnie inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić samoorganizację. Po zakończeniu samoorganizacji, używając pipety 12-kanałowej, dodać kroplami 20 µL roztworu nanocząsteczek do każdej studni z wysianymi komórkami zawierającymi medium; przeprowadzić transfekcję w czterech studniach dla każdego wariantu, zgodnie z przedstawionym schematem. Na każdej płytce zarezerwować co najmniej cztery studnie dla każdej z kontroli negatywnej i pozytywnej.Kontrola negatywna składa się z niepoddanych działaniu komórek, a kontrole pozytywne z komórek transfekowanych za pomocą dostępnego komercyjnie odczynnika, takiego jak lipo 2000 lub Fuge hd. Inkubować płytki z transfekowanymi komórkami w temperaturze 37 °C przez cztery godziny. Po inkubacji użyć pipety 12-kanałowej, aby usunąć medium z komórek i zastąpić je 100 µL świeżego medium hre na dołek. Inkubować przez kolejne 24 do 48 godzin.Następnego dnia wyjmij jedną płytkę z inkubatora. Oceń efektywność transfekcji i toksyczność komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz określ poziom toksyczności komórkowej, stosując test Cell Titer 96 Aqueous One zgodnie z opisem w tekście towarzyszącym. Po 48 godzinach wyjmij drugą płytkę z inkubatora.Oceń wydajność transfekcji za pomocą fluorescencji, mikroskopii i cytometrii przepływowej, zgodnie z opisem w towarzyszącym tekście. Wykorzystaj uzyskane tutaj dane dotyczące toksyczności i transfekcji, aby określić optymalne stężenia PBA do zastosowania w przyszłych eksperymentach. Nano Sight NS 500 to instrument do analizy śledzenia nanocząstek, który umożliwia uzyskanie informacji o rozkładzie wielkości próbki nanocząstek poprzez śledzenie dyfuzji poszczególnych nanocząstek; przed użyciem przygotuj systemy płynowe urządzenia Nano Sight w probówce do mikrowirówki o pojemności 0.5 ml.Przygotować PBA i plazmowe DNA do analizy w ten sam sposób i w tych samych stężeniach, co w poprzedniej części tego filmu. Po samomontażu rozcieńczyć 100-krotnie roztwór nanocząstek w PBS w nowej probówce o pojemności 1,5 mililitra, aby uzyskać objętość końcową co najmniej 500 microliters. Pozwoli to uzyskać stężenie nanocząstek w zakresie odpowiednim dla analizy śledzenia nanocząstek.Następnie wprowadź próbkę do nano-portu. Należy upewnić się, że nie wprowadzono pęcherzyków powietrza, a następnie sprawdzić wizualnie, czy na ekranie znajduje się od 20 do 100 cząstek. Idealna liczba cząstek dla śledzenia nanocząstek wynosi około 50.Jeśli cząstek jest zbyt wiele lub zbyt mało, należy przepłukać NS 500, skorygować rozcieńczenie w PBS i ponownie załadować próbkę. Jeśli liczba cząstek na ekranie mieści się w przedziale od 20 do 100, należy zarejestrować filmy. Po zarejestrowaniu filmów należy przejść do etapu przetwarzania, otwierając plik wideo w tym samym oprogramowaniu.Po otwarciu pliku zwiększ wzmocnienie ekranu. Wybierz automatyczną regulację parametrów obrazu, zaznaczając odpowiednie pola. Jeśli oprogramowanie rozpozna cząsteczkę na ekranie, zostanie ona oznaczona czerwonym krzyżykiem.Po zaznaczeniu wszystkich cząstek kliknij przycisk przetwarzania (process) w oprogramowaniu, aby przetworzyć plik wideo. Następnie wyświetlone zostaną rozmiary cząstek, średnie wartości rozkładu rozmiarów oraz stężenie cząstek, co pozwoli zweryfikować poprawność zliczenia cząstek. Powtórz tę procedurę, używając tej samej próbki rozcieńczonej dwukrotnie i czterokrotnie.Komórki Forex w PBS zostały przetransfekowane nanocząsteczkami E-G-F-P-P-B-A-E, jak pokazano w tym filmie. Aby wizualnie ocenić wydajność transfekcji, wykonano obrazowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Obrazy te przedstawiają fluorescencję, pole jasne oraz obrazy scalone przetransfekowanych komórek; jak widać na obrazie scalonym, większość komórek wykazuje ekspresję EGFP i zachowuje prawidłową morfologię.Aby określić wydajność transfekcji, przeprowadzono cytometrię przepływową, co przedstawiono na tej rycinie po wyznaczeniu bramki dla populacji żywych komórek. Populacja niepoddana resekcji nie zawierała komórek wykazujących ekspresję EGFP. Jednakże 71,6% komórek traktowanych było pozytywnych pod kątem EGFP. Następnie wykorzystano analizę śledzenia nanocząsteczek (NTA), aby określić rozkład wielkości i stężenie nanocząsteczek.W tej analizie kluczowe jest, aby rozkład wielkości cząstek był monodyspersyjny. Wykorzystując te informacje, średnią liczbę plazmidów na cząstkę można obliczyć, dzieląc stężenie plazmidów w roztworze przez stężenie cząstek wyznaczone za pomocą NS 500. Liczba plazmidów na cząstkę jest rozkładem, który odzwierciedla rozkład wielkości cząstek.W próbce znajdą się zarówno większe cząstki z liczbą plazmidów na cząstkę wyższą od średniej, jak i mniejsze cząstki z liczbą plazmidów na cząstkę niższą od średniej. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie pozostawiać polimerów degradowalnych w rozpuszczalniku wodnym zbyt długo przed dodaniem nanocząstek do komórek; w przypadku użycia ncy należy dostosować rozcieńczenie odpowiednio do rozmiaru. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak transfekować przylegające typy komórek za pomocą niewirusowych polimerów dostarczających geny, a także jak mierzyć skuteczność transfekcji oraz rozkład wielkości cząstek.Pamiętaj, że praca z ludzkimi komórkami wiąże się z zagrożeniem biologicznym. Podczas wykonywania tej procedury zawsze używaj środków ochrony osobistej i pracuj w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

evaluation-polymeric-gene-delivery-nanoparticles-nanoparticle

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ocena nanocząstek dostarczających geny polimeryczne poprzez analizę śledzenia nanocząstek i przepływową cytometrię wysokoprzekątniową

Niniejszy artykuł opisuje metodę nanoprecypitacji do syntezy nanocząsteczek polimerowych z wykorzystaniem kopolimerów diblokowych. Omówimy syntezę kopolimerów diblokowych, technikę nanoprecypitacji oraz potencjalne zastosowania.

Formułowanie diblokowych nanocząstek polimerowych za pomocą techniki nanoprecypitacji

Opracowano system inżynieryjnych nanonośników na bazie żelatyny typu B (GENS) do systemowego dostarczania genów i transfekcji w leczeniu raka trzustki. Dzięki modyfikacji powierzchni nanocząstek specyficznym peptydem do receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), nanonośniki te mogą celować w receptor EGFR i uwalniać plazmid w środowisku redukującym, takim jak wysokie wewnątrzkomórkowe stężenia glutationu.

Terapeutyczna dostawa genów i transfekcja w ludzkich komórkach raka trzustki z wykorzystaniem nanocząstek żelatynowych celowanych w receptor epidermalnego czynnika wzrostu

W niniejszym artykule opisujemy metodę wykorzystującą multispektralną przepływową cytometrię obrazową do ilościowego oznaczenia internalizacji nanocząstek polianhydrydowych lub bakterii przez komórki RAW 264.7.

Analiza internalizacji komórkowej nanocząsteczek i bakterii przy użyciu wielospektralnej obrazującej cytometrii przepływowej

Nanocząstki wirusowe pochodzenia roślinnego (VNPs) stanowią obiecujące platformy do zastosowań w biomedycynie. W niniejszym materiale opisujemy procedury propagacji, oczyszczania, charakteryzacji oraz biokoniugacji roślinnych VNP. Na koniec przedstawiamy zastosowanie VNP w celowanym dostarczaniu do guzów oraz obrazowaniu z wykorzystaniem modelu ksenoprzeszczepu u myszy i obrazowania fluorescencyjnego.

Nanocząsteczki wirusowe do obrazowania guzów in vivo

Analiza interakcji nanocząsteczek z określonymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej.

Wykrywanie oddziaływań nanocząstek fluorescencyjnych z pierwotnymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej

Opisujemy obrazowanie całego zwierzęcia i techniki oparte na cytometrii przepływowej do monitorowania ekspansji limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu w odpowiedzi na immunizację nanocząstkami w mysim modelu szczepienia.

Obrazowanie całych zwierząt i techniki cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu po szczepieniu nanocząstkami

Ten manuskrypt opisuje nowatorską technikę, która pozwala na wykrywanie wewnątrzkomórkowej ekspresji genów po endocytozie nanocząstek znakowanych fluorescencyjnie bezpośrednio w żywych komórkach. Metoda nie wymaga manipulacji komórkami i nie jest ograniczona w odniesieniu do docelowego genu lub gatunku.

Wykrywanie wewnątrzkomórkowej ekspresji genów w żywych komórkach pochodzenia mysiego, ludzkiego i świńskiego za pomocą nanocząstek znakowanych fluorescencyjnie

Słabe zrozumienie skuteczności nanoleków in vivo utrudnia ich kliniczne tłumaczenie. Opisano tutaj procedury oceny zachowania in vivo nanoleków przeciwnowotworowych na poziomie ogólnoustrojowym, tkankowym, jednokomórkowym i subkomórkowym u myszy immunokompetentnych z nowotworem. Podejście to może pomóc naukowcom w zidentyfikowaniu obiecujących nanoleków przeciwnowotworowych do zastosowania klinicznego.

Kompleksowa procedura oceny skuteczności in vivo nanoleków przeciwnowotworowych

Nanomateriały zapewniają wszechstronne mechanizmy kontrolowanego dostarczania terapeutycznego zarówno dla nauk podstawowych, jak i zastosowań translacyjnych, ale ich wytwarzanie często wymaga specjalistycznej wiedzy, która jest niedostępna w większości laboratoriów biomedycznych. W tym miejscu przedstawiamy protokoły skalowalnego wytwarzania i ładowania terapeutycznego różnorodnych, samoorganizujących się nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej.

Szybkie, skalowalne składanie i ładowanie bioaktywnych białek i immunostymulantów do różnych syntetycznych nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej

Tutaj przedstawiono prosty protokół produkcji nanocząsteczek mRNA opartych na polimerach poli(beta aminoestrowych), który można łatwo dostosować poprzez zmianę kapsułkowanego mRNA. Opisano również przebieg syntezy polimerów, nanocząstek oraz ich niezbędną charakterystykę in vitro. Dodano również dowód słuszności koncepcji dotyczący szczepień.

Synteza i charakterystyka nanocząstek poli(beta-aminoestrów) obciążonych mRNA do celów szczepień

Protokół ten przedstawia rozbicie Rayleigha jako łagodny proces aerozolizowania niewirusowych wektorów mRNA. Regionalna depozycja dla aerozolowanych wektorów mRNA jest oceniana za pomocą modelu Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI). Ekspresja zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) w ludzkich komórkach płuc reprezentuje utrzymanie funkcji fizykochemicznych i biologicznych wektorów mRNA po aerozoli.

Intranosowe podawanie polyplexów mRNA za pomocą aerozoli Rayleigh Breakup: metoda in vitro do osadzania nosa i testów funkcjonalnych

Poznaj metodę oceny nanocząstek polimerowych do dostarczania genów przy użyciu analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia precyzyjną charakterystykę wielkości cząstek oraz efektywność transfekcji komórek.

Ocena nanocząstek dostarczających geny polimerowe za pomocą analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal

Ocena nanocząstek dostarczających geny polimerowe za pomocą analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów