Ocena nanocząstek dostarczających geny polimerowe za pomocą analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie i ocena eksperymentów z dostarczaniem genów przy użyciu niewirusowych nanocząstek polimerowych. Osiąga się to poprzez pierwszą transekcję komórek z cząstkami dostarczającymi geny. Wydajność transfekcji jest następnie oceniana za pomocą mikroskopii i analizy wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej.

Następnie określa się rozkład wielkości nanocząstek, koncentrację i plazmidy na cząstkę za pomocą przyrządu do analizy śledzenia nanocząstek. Ostatecznie metoda ta pozwala na charakterystykę wielkości nanocząstek i skuteczność transfekcji przy użyciu nanocząstek. Główną zaletą stosowania biodegradowalnych nanocząstek polimerowych do dostarczania genów jest to, że mogą one być bezpieczniejsze i skuteczniejsze niż inne metody transferu genów.

Główną zaletą analizy śledzenia nanocząstek w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak dynamiczne rozpraszanie światła, jest to, że analiza śledzenia nanocząstek bezpośrednio podaje średni rozkład liczbowy i stężenie cząstek. Metoda ta pomogłaby odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie dostarczania genów niewirusowych, takie jak liczba plazmidów w cząsteczce, co jest ważne dla badań nad koekspresją. Poniższy protokół przedstawiono przy użyciu ludzkich komórek śródbłonka siatkówki lub hre jako komórek modelowych i poli-beta-aminowych estrów lub PBA AE jako polimerów modelowych.

Należy pamiętać, że warunki hodowli i rozpuszczalniki mogą wymagać dostosowania w zależności od komórek i polimerów użytych 24 godziny wcześniej. Transfekcja. Użyj pipety wielokanałowej, aby wprowadzić je do klarownej kultury tkankowej poddanej płaskiej obróbce. Dolne płytki 96-dołkowe o stężeniu od 25 do 50 komórek na mikrolitr.

Zapewni to od 70 do 80% płynności CO w dniu transfekcji, przygotuj i oznacz klarowną kulturę nietkankową poddaną obróbce. 96-dołkowe płytki, które posłużą jako płytki wzorcowe do przygotowania i rozcieńczenia PBA i DNA. Przygotowane zostaną dwie identyczne płyty.

Jeden do oceny toksyczności, a drugi do oceny skuteczności transfekcji. Postępuj zgodnie z roztworami podstawowymi poli beta estru aminowego lub polimeru PVAE i P-E-G-F-P-N 1D NA w temperaturze pokojowej. Po zduszeniu użyj 12-kanałowej pipety, aby przygotować studzienkę zawierającą 50 mikrolitrów 0,06 miligrama na mililitr DNA w 25-milimolowym buforze octanu sodu dla każdego stanu.

Następnie na tej samej płytce rozcieńczyć polimery PBAE do 10 miligramów na mililitr w buforze octanu sodu. Następnie należy dalej rozcieńczyć polimery PBAE do proporcji masy polimeru do masy DNA wynoszących 30 i 60 oraz 50 mikrolitrów buforu octanu sodu. Do tworzenia nanocząstek użyj 12-kanałowej pipety, aby połączyć 50 mikrolitrów rozcieńczonego PBA z 50 mikrolitrami rozcieńczonego DNA osocza energicznie zmieszanego przez pipetowanie w górę iw dół.

Następnie pozwól mieszaninie inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić samodzielny montaż. Po samoorganizacji użyj 12-kanałowej pipety, aby dodać kroplami 20 mikrolitrów roztworu nanocząstek do każdej studzienki z wysiewanych komórek zawierających pożywkę transfekcję po cztery dołki na warunek, jak pokazano na tym schemacie. Dla każdej płytki należy zarezerwować co najmniej cztery studzienki dla każdej z kontroli ujemnych i dodatnich.

Kontrola ujemna składa się z komórek niepoddanych działaniu substancji, a kontrola pozytywna składa się z komórek transfekowanych dostępnym w handlu odczynnikiem, takim jak lipo 2000 lub Fuge hd. Inkubować płytki z transfekowanymi komórkami w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny Po inkubacji użyj pipety 12-kanałowej, aby usunąć pożywkę z komórek i zastąpić ją 100 mikrolitrami na studzienkę świeżego zającu. Pożywkę inkubować przez dodatkowe 24 do 48 godzin.

Następnego dnia wyjąć jedną płytkę z inkubatora. Ocenić transfekcję komórkową i toksyczność za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i określić ilościowo toksyczność komórek za pomocą testu wodnego miana komórek 96, jak opisano w załączonym tekście. Po 48 godzinach wyjąć drugą płytkę z inkubatora.

Oceń skuteczność transfekcji za pomocą fluorescencji, mikroskopii i cytometrii przepływowej, jak opisano w załączonym tekście. Wykorzystane tutaj dane dotyczące toksyczności i transfekcji można wykorzystać do określenia optymalnych stężeń PBA do wykorzystania w przyszłych eksperymentach. Nano site NS 500 to przyrząd do analizy śledzenia nanocząstek, który może dostarczyć informacji na temat rozkładu wielkości próbki nanocząstek poprzez śledzenie dyfuzji poszczególnych nanocząstek przed użyciem zalania układu płynowego nano miejsca w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 0,5 mililitra.

Przygotuj PBA i DNA osocza do analizy, jak poprzednio, w tych samych stężeniach, które użyto w poprzedniej sekcji tego filmu. Po samoorganizacji rozcieńczyć roztwór nanocząstek 100-krotnie w PBS w nowej probówce o pojemności 1,5 mililitra, aby uzyskać końcową objętość co najmniej 500 mikrolitrów. W ten sposób uzyska się stężenie nanocząstek w odpowiednim zakresie do analizy śledzenia nanocząstek.

Następnie załaduj próbkę do miejsca nano. Pamiętaj, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza, które zostały wizualnie sprawdzone, aby upewnić się, że na ekranie znajduje się od 20 do 100 cząstek. Idealna liczba do śledzenia nanocząstek to około 50 cząstek.

Jeśli jest ich za dużo lub za mało, przepłukać NS 500, dostosować rozcieńczenie do PBS i ponownie załadować próbkę. Jeśli liczba cząsteczek na ekranie wynosi od 20 do 100, nagrywaj filmy. Po przechwyceniu filmów przejdź do etapu przetwarzania, otwierając plik wideo w tym samym oprogramowaniu.

Następnie, gdy plik jest otwarty, zwiększ wzmocnienie ekranu. Wybierz opcję automatycznego dopasowania parametrów obrazu, klikając odpowiednie pola. Jeśli cząstka na ekranie zostanie rozpoznana przez oprogramowanie, zostanie oznaczona czerwonym krzyżykiem.

Po zaznaczeniu wszystkich cząstek kliknij przycisk procesu w oprogramowaniu, aby przetworzyć plik wideo. Następnie zostanie wyświetlona wielkość cząstek, średnia wielkość rozkładu i stężenie cząstek, aby sprawdzić, czy liczba cząstek jest dokładna. Powtórzyć tę procedurę, używając tej samej próbki rozcieńczonej przez dwa x i cztery.

Forex w PBS apre zostały transfekowane nanocząstkami E-G-F-P-P-B-A-E, jak pokazano na tym filmie. W celu wizualnej oceny skuteczności transfekcji przeprowadzono obrazowanie mikroskopią fluorescencyjną. Obrazy te pokazują jasne pole fluorescencji i połączone obrazy transfekowanych komórek, jak widać na połączonym obrazie, większość komórek wyraża EGFP i utrzymuje normalną morfologię.

Aby określić ilościowo skuteczność transfekcji, przeprowadzono cytometrię przepływową, co widać na tym rysunku po bramkowaniu na żywej populacji. Niewycięta populacja nie zawierała komórek EGFP dodatnich. Jednak 71,6% leczonych komórek było dodatnich dla nano miejsca EGFP Analiza śledzenia nanocząstek została następnie wykorzystana do określenia rozkładu wielkości i stężenia nanocząstek.

Dla tej analizy ważne jest, aby rozkład wielkości cząstek był monodyspersyjny. Korzystając z tych informacji, średnią liczbę plazmidów na cząstkę można obliczyć, dzieląc stężenie plazmidów w roztworze przez stężenie cząstek określone przez NS 500. Liczba plazmidów na cząstkę to rozkład, który odzwierciedla rozkład wielkości cząstek.

W próbce będą większe cząstki o wartości plazmidów na cząstkę większej niż średnia, a także mniejsze cząstki o niższej wartości plazmidów na cząstkę niż średnia. Próbując tej procedury, należy pamiętać, aby nie dopuścić do tego, aby polimery ulegające degradacji pozostawały zbyt długo w wodnym rozpuszczalniku przed dodaniem nanocząstek do komórek w celu użycia ncy, dostosuj rozcieńczenie odpowiednie do wielkości. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak transfekować typy komórek adhezyjnych za pomocą niewirusowych polimerów dostarczających geny, a także mierzyć skuteczność transfekcji, a także rozkład wielkości cząstek.

Nie zapominaj, że praca z ludzkimi komórkami jest biologiczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić środki ochrony osobistej i pracować w komorze bezpieczeństwa biologicznego.