Name: Ocena funkcji mięśni mięśnia prostownika długiego mięśnia ex vivo i mięśnia piszczelowego przedniego in situ u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 36 s
Description: Poznaj metodę oceny właściwości mechanicznych mięśni kończyn myszy, w tym mięśnia prostownika długiego ex vivo i mięśnia piszczelowego przedniego in situ. Technika ta umożliwia kompleksową analizę funkcji mięśniowej w badaniach chorób mięśniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z National Institutes of Health (AR-49419, DD), Muscular Dystrophy Association (DD) i NIH training grant T90DK70105 (CH).

1. Ocena kurczliwości i pasywnych właściwości mięśnia EDL ex vivo
Kurczliwe i pasywne właściwości mięśnia EDL są mierzone ex vivo za pomocą systemu testów in vitro in vitro Aurora Scientific. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z materiałami i wyposażeniem.
1.1 Przygotowanie sprzętu
<ol>
	<li>Zmontuj kąpiel tkankowo-narządową, mocując rurkę tlenową do kąpieli tkankowej z płaszczem wodnym. Przymocuj zmontowaną wannę do aparatu do montażu mięśni. Podłącz przewód gazowy do rurki tlenowej. Przymocuj przewody cyrkulacyjne wody do kąpieli tkankowej z płaszczem wodnym i umieść zawór iglicowy w odpływie wanny.</li>
	<li>Włączyć łaźnię wodną obiegową i ustawić temperaturę na 30 °C 7. Pozwól, aby 5 PSI (funtów na cal kwadratowy) 95% O2-5% CO2 przepłynęło przez rurkę tlenową. Napełnij wannę buforem Ringera. Równoważyć bufor przez co najmniej 10 minut ze stałym przepływem gazu, regulując zawór tlenowowy.</li>
	<li>Włącz instrumenty (stymulator, system dźwigni dwutrybowych i interfejs sygnału). Załaduj oprogramowanie do dynamicznej kontroli mięśni (DMC) zgodnie z instrukcją producenta.</li>
</ol>
1.2 Rozwarstwienie mięśni EDL
Wszystkie badania na zwierzętach muszą być zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.
<ol>
	<li>Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym 2,5 μl/g masy ciała koktajlu znieczulającego (patrz rozdział dotyczący materiałów). Przez cały czas trwania zabiegu chirurgicznego sprawdzano głębokość sedacji poprzez wykonanie uszczypnięcia palca u nogi. Suplement w wysokości 10% początkowej dawki znieczulenia jest podawany, gdy jest to konieczne, aby utrzymać zwierzę w znieczuleniu. Ogol tylną kończynę. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 °C przed zabiegiem sekcji, umieszczając mysz na poduszce grzewczej. Temperatura ciała jest monitorowana poprzez ciągły pomiar temperatury w odbycie za pomocą sondy termicznej. </li>
	<li>Umieść mysz na wznak na desce preparacyjnej (Rysunek 1). Zdejmij skórę nóg, aby odsłonić mięśnie kończyn tylnych. Zabezpiecz nogę na bloku sylgardowym za pomocą dwóch kołków krawieckich, jednego w stopie, a drugiego w mięśniu gracilis. Umieść lampę grzewczą nad korpusem myszy, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C. Stale łącz wszystkie odsłonięte mięśnie za pomocą bufora Ringera. Spuść nadmiar buforu przez przewód próżniowy.</li>
	<li>Odsłoń dystalne ścięgno TA i więzadło prostownika pod mikroskopem stereoskopowym, preparując skórę w kierunku stopy. Delikatnie zdejmij powięź pokrywającą mięsień TA. Przetnij więzadło prostownika, aby zwolnić dystalne ścięgno TA.</li>
	<li>Przetnij dystalne ścięgno TA i użyj go do odklejenia mięśnia TA. Ostrożnie usuń mięsień TA w jego bliższym przyczepie. Umieść cienki kawałek bawełny nasączonej buforem Ringera obok mięśnia EDL, aby wchłonąć krwawienie spowodowane pęknięciem układu naczyniowego mięśnia TA. Użyj przewodu próżniowego, aby usunąć nadmiar buforu i krwi.</li>
	<li>Zawiąż podwójne kwadratowe węzły, a następnie węzeł pętelkowy za pomocą nici chlebowej na połączeniu ścięgien mięśniowych (MTJ) dystalnego mięśnia EDL (ryc. 2). Wykonaj nacięcie w dystalnej części mięśnia dwugłowego uda, aby odsłonić proksymalny mięsień EDL. Powtórz ten sam zestaw węzłów (ryc. 2) w MTJ bliższego ścięgna EDL. Przymocuj hak ramienia dźwigni do bliższego lub dystalnego węzła za pomocą podwójnego węzła kwadratowego, używając tej samej linii szwów. Odetnij pozostałą linię szwów.</li>
	<li>Przeciąć proksymalne ścięgno EDL powyżej bliższego węzła szwu. Podnieś mięsień EDL za pomocą haczyka i przetnij naczynia krwionośne pod mięśniem. Przeciąć dystalne ścięgno EDL poniżej dystalnego węzła szwu, aby usunąć mięsień EDL z kończyny tylnej. Przykryj odsłoniętą tylną kończynę kawałkiem bawełny nasączonej buforem Ringera.</li>
	<li>Przymocuj hak do ramienia dźwigni. Ustaw mięsień pionowo między dwiema elektrodami. Przymocuj dystalną linię szwu do stałego słupka. Podnieś kąpiel tkankową, aby zanurzyć mięsień w buforze Ringera. Dostosuj napięcie spoczynkowe do 1,0 g za pomocą podwójnego stopnia zgrubnego/drobnego translacji i pozwól mięśniom zrównoważyć się przez co najmniej 10 minut.</li>
</ol>
1.3 Pomiar kurczliwości i pasywnych właściwości mięśnia EDL
Użyj Tabeli 2, aby ustawić parametry w oprogramowaniu DMC dla każdego z poniższych pomiarów. Analizuj dane za pomocą oprogramowania do dynamicznej analizy mięśni (DMA).
1.3.1 Pomiar kurczliwości mięśnia EDL
<ol>
	<li>Stymuluj mięsień EDL trzy razy przy 150 Hz w odstępie 60 sekund, aby ustabilizować mięsień 8.</li>
	<li>Stymuluj mięsień EDL przy różnych napięciach spoczynkowych, aby określić optymalną długość (Lo). Optymalna długość to długość, przy której mięsień rozwija maksymalne napięcie skurczowe. Pozwól mięśniom się rozluźnić przez 2 minuty.</li>
	<li>Dostosuj napięcie spoczynkowe do Lo. Zmierz siłę mięśni przy stymulacji pojedynczego skurczu. Określ bezwzględną siłę drgania (Pt), czas do osiągnięcia szczytowego napięcia (TPT) i czas połowy relaksacji (1/2 RT) Pt. Pozwól mięśniowi rozluźnić się przez 2 minuty.</li>
	<li>Dostosuj napięcie spoczynkowe do Lo. Zmierz siłę mięśni tężcowych generowaną przy różnych częstotliwościach stymulacji (50, 80, 100, 120, 150 i 200 Hz). Określ bezwzględną maksymalną siłę mięśnia tężcowego (Po), w której siła mięśni osiąga maksymalną. Zmierz TPT i 1/2 RT Po 9.</li>
	<li>Pozwól mięśniowi rozluźnić się przez 5 minut. Dostosuj napięcie spoczynkowe do Lo. Zastosuj 10 cykli skurczów ekscentrycznych z 2-minutowym odpoczynkiem między cyklami. Oblicz względną utratę siły Po po każdym cyklu skurczu mimośrodowego.</li>
	<li>Odłącz mięsień EDL od aparatu i przetnij ścięgna w miejscu szwu. Określić mokrą masę mięśni i obliczyć pole przekroju poprzecznego mięśni (CSA) 6,10.</li>
</ol>
1.3.2 Pomiar pasywnych właściwości mięśnia EDL
<ol>
	<li>Wypreparować mięsień EDL po lewej stronie i przymocować go do aparatu, jak opisano w sekcji 1.2, kroki od 2 do 7.</li>
	<li>Poddaj mięsień EDL sześciostopniowemu protokołowi rozciągania, w którym mięsień jest napięty do 160% Lo z przyrostem 10% Lo. Przeanalizuj profil naprężenie-odkształcenie 6.</li>
	<li>Oceń lepkość mięśnia EDL, mierząc szybkość relaksacji stresu (SRR) w następujących przedziałach czasowych po rozciągnięciu i utrzymaniu mięśnia na poziomie 10% Lo: od szczytu do 0,1 s po szczycie (pp), od 0,1 do 0,2 s pp, od 0,2 do 0,5 s pp, od 0,5 do 1 s pp i od 1 do 1,5 s pp.</li>
	<li>Pod koniec badania należy poddać mysz eutanazji poprzez zwichnięcie szyjki macicy i/lub ścięcie, gdy mysz jest jeszcze pod narkozą. Odłącz mięsień EDL od aparatu i przetnij ścięgna w miejscu szwu. Określić mokrą masę mięśni i obliczyć pole przekroju poprzecznego mięśni (CSA) 6,10.</li>
</ol>
2. Ocena właściwości kurczliwych mięśnia TA in situ
Właściwości kurczliwe mięśnia TA są mierzone za pomocą systemu testów mięśniowych in situ Aurora Scientific. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z materiałami i wyposażeniem.
2.1 Przygotowanie sprzętu
<ol>
	<li>Podgrzać temperaturę zwierzęcia do temperatury 37 °C za pomocą obiegowej łaźni wodnej.</li>
	<li>Włącz instrumenty (stymulator, system dźwigni dwutrybowych i interfejs sygnału). Załaduj oprogramowanie DMC zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
2.2 Przygotowanie mięśnia TA do pomiaru siły in situ
<ol>
	<li>Znieczulić mysz, ogolić tylną kończynę i odsłonić mięsień TA, jak opisano w krokach od 1 do 3 w punkcie 1.2.</li>
	<li>Zawiąż podwójny kwadratowy węzeł wokół więzadła rzepki za pomocą jedwabnego szwu chlebowego. Zawiąż podwójny węzeł kwadratowy, a następnie węzeł pętlowy w MTJ dystalnego mięśnia TA (ryc. 2), zawiąż kolejny podwójny węzeł kwadratowy, pozostawiając pętlę ~10 mm od dystalnego węzła ścięgna TA, używając tej samej linii szwu. Umieść drugi podwójny kwadratowy węzeł z boku pętli.</li>
	<li>Usuń szpilki z tylnej kończyny i ustaw zwierzę na brzuchu. Odsłoń mięsień dwugłowy uda. Wykonaj nacięcie w linii środkowej, aby odsłonić nerw kulszowy. Zawiąż podwójny kwadratowy węzeł wokół bliższego końca nerwu kulszowego. Przytnij jedną stronę linii szwów i przetnij nerw powyżej węzła. Delikatnie pociągnij nerw kulszowy w kierunku kolana za pomocą linii szwów i oczyść otaczającą tkankę łączną, aby uwolnić ~ 5 mm jej długości. Nie rozciągaj nerwu podczas tej procedury i stale przeraź nerw za pomocą bufora dzwonka.</li>
	<li>Przygotuj przeciwległy mięsień TA zgodnie z opisem w krokach od 1 do 3. Przykryj jedną z odsłoniętych tylnych kończyn kawałkiem bawełny nasączonej buforem Ringera. Stale zlewaj obie tylne kończyny za pomocą wstępnie rozgrzanego (37 °C) bufora Ringera. Usuń nadmiar buforu przez przewód próżniowy.</li>
	<li>Ustaw zwierzę leżące na brzuchu na platformie dla zwierząt. Przymocuj uchwyt zacisku kolanowego do platformy dla zwierząt i przymocuj oba kolana do metalowego kołka za pomocą podwójnych kwadratowych węzłów za pomocą linii szwów więzadła rzepki. Przypnij obie stopy do bloku sylgardowego za pomocą szpilek krawieckich. Przymocuj platformę dla zwierząt do stolika sterowanego termicznie. Ustawić lampę grzewczą tak, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 °C.</li>
	<li>Przymocuj uchwyt elektrody do platformy dla zwierząt i połóż nerw kulszowy na elektrodzie za pomocą linii do szycia. Trzymaj elektrodę z dala od mięśni kończyn tylnych. Przeciąć dystalne ścięgno TA odsłoniętej kończyny tylnej w miejscu szwu MTJ. Przymocuj pętlę szwów dystalnego ścięgna TA do haka ramienia dźwigni. Przykryj odsłonięty mięsień kończyny tylnej ciepłą bawełną nasączoną buforem Ringera.</li>
</ol>
2.3 Pomiar właściwości kurczliwych mięśnia TA
<ol>
	<li>Tabela 2 służy do ustawiania parametrów w oprogramowaniu DMC. Postępuj zgodnie z tym samym protokołem, co opisano w sekcji 1.3.1, aby określić właściwości skurczowe mięśnia TA. Analizuj dane za pomocą oprogramowania DMA.</li>
	<li>Po pomiarze właściwości skurczowych odczep pętlę szwów dystalnego ścięgna TA od haka ramienia niwelatora. Usuń mięsień TA. Określ mokrą masę mięśni i oblicz CSA 10.</li>
	<li>Zmierz właściwości skurczowe mięśnia TA po lewej stronie zgodnie z krokami od 1 do 3 opisanymi powyżej. Poddaj mysz eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi na koniec badania.</li>
</ol>

<ol><li>Huijing, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+as+a+collagen+fiber+reinforced+composite%3A+a+review+of+force+transmission+in+muscle+and+whole+limb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Muscle as a collagen fiber reinforced composite: a review of force transmission in muscle and whole limb.</a> J. Biomech. 32, 329-345 (1999).</li>
<li>Moss, R. L., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+and+viscous+properties+of+resting+frog+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Elastic and viscous properties of resting frog skeletal muscle.</a> Biophys. J. 17, 213-228 (1977).</li>
<li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin%3A+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51, 919-928 (1987).</li>
<li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li>
<li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mdx+mice+show+progressive+weakness+and+muscle+deterioration+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">mdx mice show progressive weakness and muscle deterioration with age.</a> J. Neurol. Sci. 129, 97-105 (1995).</li>
<li>Hakim, C. H., Grange, R. W., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+passive+mechanical+properties+of+the+extensor+digitorum+longus+muscle+are+compromised+in+2-+to+20-mo-old+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The passive mechanical properties of the extensor digitorum longus muscle are compromised in 2- to 20-mo-old mdx mice.</a> J. Appl. Physiol. 110, 1656-1663 (2011).</li>
<li>Segal, S. S., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependent+physiological+stability+of+rat+skeletal+muscle+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro.</a> Am. J. Physiol. 248, 265-270 (1985).</li>
<li>Grange, R. W., Gainer, T. G., Marschner, K. M., Talmadge, R. J., Stull, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast-twitch+skeletal+muscles+of+dystrophic+mouse+pups+are+resistant+to+injury+from+acute+mechanical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fast-twitch skeletal muscles of dystrophic mouse pups are resistant to injury from acute mechanical stress.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, 1090-1101 (2002).</li>
<li>Hakim, C. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+differences+in+contractile+and+passive+properties+of+mdx+extensor+digitorum+longus+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Gender differences in contractile and passive properties of mdx extensor digitorum longus muscle.</a> Muscle Nerve. 45, 250-256 (2012).</li>
<li>Hakim, C. H., Li, D., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+murine+skeletal+muscle+function+for+muscle+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Monitoring murine skeletal muscle function for muscle gene therapy.</a> Methods Mol. Biol. 709, 75-89 (2011).</li>
</ol>

Opłaty za otwarty dostęp zostały opłacone przez Aurora Scientific.

W tym protokole zilustrowaliśmy testy fizjologiczne do pomiaru właściwości kurczliwych i biernych mięśnia EDL oraz właściwości kurczliwych mięśnia TA. Głównym problemem w badaniach nad fizjologią mięśni jest dotlenienie mięśnia docelowego. W przypadku dużych mięśni (takich jak mięsień TA) preferowane jest podejście in situ , ponieważ dyfuzja tlenu z buforu Ringera może nie dotrzeć do środka mięśnia w teście in vitro . Podejście in situ nie zaburza normalnego ukrwienia i unika się sztucznych efektów związanych z niedotlenieniem. Mięsień EDL jest jednym z najczęściej używanych mięśni w badaniach fizjologicznych. Odpowiednie dotlenienie całego mięśnia można osiągnąć w systemie in vitro ze względu na mały rozmiar mięśnia. Co więcej, system in vitro zapewnia zamknięte środowisko do manipulowania stężeniami jonów ( Ca2+, Na+ i K+) i substancji chemicznych (ATP i glukozy), które są niezbędne do optymalnego wytwarzania siły mięśniowej. Daje to doskonałą okazję do zbadania wpływu tych zmiennych na wytwarzanie siły.
Dokładny pomiar właściwości kurczliwych i biernych mięśni kończyn ma kluczowe znaczenie dla badania funkcji mięśni szkieletowych. Charakterystyczne zmiany tych właściwości są często uważane za cechy charakterystyczne różnych chorób mięśni. Zmiany tych parametrów są również ważnymi wskaźnikami określającymi, czy terapia eksperymentalna jest skuteczna, czy nie.

<table><tbody><tr><td>Kąpiel tkankowo-organowa </td><td>Radnoti LLC, CA, USA</td><td></td><td>Kąpiel tkankowa z płaszczem wodnym (nr kat. 158351-LL), rurka do dyspersji tlenu (nr kat. 160192), zawór Luer (nr kat. 120722)</td></tr><tr><td>Cyrkulacyjna łaźnia wodna </td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina gazowa </td><td>Airgas National, Charlotte, NC, USA</td><td></td><td>95% O2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; oraz 5% CO2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; </td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In vitro&lt;/em&gt; aparat do badania funkcji mięśni </td><td><a href="http://www.aurorascientific.com/product/mp-model-1200/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aurora Scientific, Aurora, ON, Kanada</a></td><td></td><td>System składa się ze stymulatora (model nr 701A), dwutrybowego systemu dźwigni (model nr 300C lub 305C), interfejsu sygnałowego (model nr 604B) oraz aparatury testowej (model nr 800A) do pionowego montażu kąpieli tkankowej.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In vitro&lt;/em&gt; oprogramowanie do analizy funkcji mięśni</td><td><a href="http://www.aurorascientific.com/product/dmc-dma/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aurora Scientific, Aurora, ON, Kanada</a></td><td></td><td>Oprogramowanie do dynamicznej kontroli mięśni (DMC) oraz oprogramowanie do analizy danych dynamicznej kontroli mięśni (DMA)</td></tr><tr><td>Koktajl anestetyczny dla myszy rozpuszczony w 0,9% NaCl</td><td>Należy odnieść się do wytycznych instytucjonalnych</td><td></td><td>Ketamina (25 mg/ml), ksylazyna (2,5 mg/ml) i acepromazyna (0,5 mg/ml). W trakcie procedury chirurgicznej może być konieczne podanie dawki uzupełniającej w wysokości 10% dawki początkowej, aby utrzymać zwierzę w znieczuleniu. </td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>World Precision Instrument</td><td>Kat#SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>Specjalistyczna deska sekcyjna z pleksiglasu</td><td>Opracowany wewnętrznie</td><td></td><td>Należy odnieść się do &lt;strong&gt;Rysunek 1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Lampa grzewcza </td><td>Tensor Lighting Company, Boston, MA, USA</td><td></td><td>lampka 15 W w celu utrzymania ciepłoty myszy podczas sekcji</td></tr><tr><td>Bufor Ringera </td><td>Odczynniki chemiczne zakupiono w firmie Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td></td><td>Skład w mM: 1,2 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (Kat#S369), 1 MgSO4&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (Kat# M63), 4,83 KCl (Kat# P217), 137 NaCl (Kat# 217), 24 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (Kat# S233), 2 CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (nr kat. C79) oraz 10 glukozy (nr kat. D16). Rozpuścić odrębnie odczynniki chemiczne i wymieszać w kolejności wymienionej powyżej. Przechowywać w 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Stereomikroskop sekcyjny </td><td>Nikon, Melville, NY, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia do sekcji </td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td></td><td>pinceta chirurgiczna gruba, nożyczki grube, pinceta chirurgiczna precyzyjna (prosta i 45 &amp;deg; kąt)</td></tr><tr><td>Pleciona nici jedwabna 4-0 </td><td>szwy SofSilk USSC, Norwalk, CT, USA</td><td>Nr kat. SP116</td><td></td></tr><tr><td>Specjalnie wykonany hak ze stali nierdzewnej</td><td>Small Parts, Inc.</td><td></td><td>S/S 304V o długości 2'' (średnica 0,18'') dla przetwornika siły 305C lub S/S 304V o długości 2,5'' (średnica 0,012'') dla przetwornika 300C (Kat# ASTM A313) </td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In situ&lt;/em&gt; system do oceny funkcji mięśni </td><td><a href="http://www.aurorascientific.com/product/mp-model-1300/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aurora Scientific, Aurora, ON, Kanada</a></td><td></td><td>System (809B, &lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; (aparat dla myszy) składa się ze stymulatora (model 701B), dwutrybowego systemu dźwigni (model 305C), interfejsu sygnałowego (model 604A) oraz termostatycznego urządzenia z płytką pod stopami (model 809A)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In vitro&lt;/em&gt; oprogramowanie do analizy funkcji mięśni</td><td><a href="http://www.aurorascientific.com/product/dmc-dma/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aurora Scientific, Aurora, ON, Kanada</a></td><td></td><td>oprogramowanie do dynamicznej kontroli mięśni (DMC) oraz oprogramowanie do analizy danych dynamicznej kontroli mięśni (DMA)</td></tr><tr><td>Dedykowana platforma dla zwierząt do testu TA</td><td>Opracowany wewnętrznie</td><td></td><td>Należy odnieść się do &lt;strong&gt;Rycina 2&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Haczyk ze stali nierdzewnej wykonany na zamówienie</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>Nr kat. ASTM A313</td><td>S/S 304V o długości 0,5'' (średnica 0,18'') </td></tr><tr><td>Platynowe elektrody 25G wykonane na zamówienie</td><td>Chalgren Enterprises, Gilroy, CA</td><td></td><td>Przylutuj dwa platynowe druty o grubości 0,016 cala do dwóch przewodów elektrycznych 24G</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class="jove_content"&gt;&lt;strong&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Materiały i sprzęt.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

ocena funkcji mięśni mięśnia prostownika długiego mięśnia ex vivo i mięśnia piszczelowego przedniego in situ u myszy

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Ruchy ciała są głównie zapewniane przez mechaniczną funkcję mięśni szkieletowych. Mięśnie szkieletowe składają się z licznych wiązek włókien mięśniowych, które są osłonięte śródmięśniowymi tkankami łącznymi. Każde włókno mięśniowe zawiera wiele miofibryli, które biegną podłużnie wzdłuż włókna mięśniowego. Miofibryle są aparatem kurczliwym mięśni i składają się z powtarzających się jednostek kurczliwych znanych jako sarkomery. Jednostka sarkomerowa zawiera włókna aktyny i miozyny, które są oddalone od siebie o krążki Z i białko tytyny. Mechaniczna funkcja mięśni szkieletowych jest definiowana przez kurczliwe i bierne właściwości mięśni. Właściwości kurczliwe służą do scharakteryzowania wielkości siły generowanej podczas skurczu mięśni, czasu wytwarzania siły i czasu rozluźnienia mięśni. Każdy czynnik wpływający na skurcz mięśni (taki jak interakcja między filamentami aktyny i miozyny, homeostaza wapnia, stosunek ATP / ADP itp.) wpływa na właściwości skurczowe. Właściwości pasywne odnoszą się do właściwości elastycznych i lepkich (sztywność i lepkość) mięśnia przy braku skurczu. O właściwościach tych decydują zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe składniki strukturalne (takie jak tytyna) oraz tkanki łączne (głównie kolagen) 1-2. Właściwości kurczliwe i pasywne to dwa nierozłączne aspekty funkcjonowania mięśni. Na przykład zgięcie łokcia odbywa się poprzez skurcz mięśni w przedniej części ramienia i bierne rozciąganie mięśni w tylnej części ramienia. Aby naprawdę zrozumieć funkcję mięśni, należy zbadać zarówno właściwości skurczowe, jak i pasywne.
Kurczliwe i/lub pasywne właściwości mechaniczne mięśni są często zagrożone w chorobach mięśni. Dobrym przykładem jest dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD), ciężka choroba zaniku mięśni spowodowana niedoborem dystrofiny 3. Dystrofina jest białkiem cytoszkieletu, które stabilizuje błonę komórek mięśniowych (sarcolemma) podczas skurczu mięśni 4. W przypadku braku dystrofiny sarcolemma jest uszkadzana przez siłę ścinającą wytwarzaną podczas przenoszenia siły. To rozerwanie błony inicjuje reakcję łańcuchową, która prowadzi do śmierci komórek mięśniowych i utraty maszynerii skurczowej. W konsekwencji siła mięśniowa zostaje zmniejszona, a martwe włókna mięśniowe są zastępowane tkankami zwłóknieniowymi 5. Ta późniejsza zmiana zwiększa sztywność mięśni 6. Dokładny pomiar tych zmian stanowi ważną wskazówkę do oceny postępu choroby i określenia skuteczności terapeutycznej nowych interwencji genowych/komórkowych/farmakologicznych. W tym miejscu przedstawiamy dwie metody oceny zarówno kurczliwych, jak i biernych właściwości mechanicznych mięśnia prostownika długiego palca (EDL) oraz właściwości kurczliwych mięśnia piszczelowego przedniego (TA).

Poniższe wyniki stanowią reprezentację danych z naszych poprzednich raportów 6,9. Dane przedstawiono jako średnią±błąd standardowy średniej. Tabela 3 przedstawia właściwości morfometryczne mięśnia EDL u prawidłowych myszy BL10 oraz myszy z niedoborem dystrofiny (mdx) w wieku od 4 do 6 miesięcy. Rysunek 4 przedstawia reprezentatywne właściwości skurczowe i pasywne mięśnia EDL od myszy BL10 oraz mdx. Właściwości skurczowe mięśnia EDL są opisane za pomocą następujących parametrów, w tym swoistej siły drgań (bezwzględna siła podzielona przez CSA) (Rysunek 4A), swoistej maksymalnej siły tężcowej (Rysunek 4B), TPT oraz ½ RT bezwzględnej maksymalnej siły tężcowej (Rysunek 4C i D). TPT oraz ½ RT można obliczyć również z bezwzględnej siły drgań. Profil naprężenie-odkształcenie (Rysunek 4E) oraz SRR (Rysunek 4F) są wykorzystywane do opisu właściwości pasywnych mięśnia EDL.
Brak dystrofiny ma istotny wpływ na właściwości kurczliwe i pasywne mięśnia EDL 6,9. Specyficzne siły pojedynczego skurczu i tężca są znacząco zredukowane w mięśniu EDL myszy mdx. TPT jest znacząco szybszy, podczas gdy ½ RT jest znacząco wolniejszy w mięśniu EDL mdx. Profil naprężenie-odkształcenie sugeruje, że sztywność jest znacząco zwiększona w mięśniu EDL mdx. Mięsień EDL mdx wykazuje również znacząco wyższą siłę oporu (naprężenie pasywne) przed osiągnięciem maksymalnego naprężenia, podczas gdy naprężenia po osiągnięciu szczytu spadają znacznie szybciej. Ponadto SRR był znacząco wyższy w mięśniu EDL mdx w porównaniu do mięśnia EDL BL10.
Analiza statystyczna
Istotność statystyczną między dwiema grupami analizuje się za pomocą testu t Studenta t-test. W celu oceny istotności statystycznej dla wielu grup zastosowano jednoczynnikową lub dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z następującym testem Bonferroniego. post hoc Zaleca się przeprowadzenie analizy przy użyciu oprogramowania SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC). Różnicę uznaje się za istotną, gdy p &lt; 0.05.
Tabela 1. Materiały i sprzęt. 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td class="jove_content_small">Eksperyment</td>
 <td class="jove_content_small">Napięcie spoczynkowe (g)</td>
 <td class="jove_content_small">Częstotliwość impulsów (Hz) </td>
 <td class="jove_content_small">Szerokość impulsu (ms)</td>
 <td class="jove_content_small">Czas trwania stymulacji (ms)</td>
 <td class="jove_content_small">Długość rozciągnięcia </td>
 <td class="jove_content_small">Czas trwania rozciągania (ms) </td>
 <td class="jove_content_small">Szybkość rozciągania </td>
 <td class="jove_content_small">Komentarze</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="9">1. Ocena właściwości kurczliwych i biernych mięśnia EDL ex vivo</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="9">1.3.1 Pomiar właściwości kurczliwych mięśnia EDL </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1. Rozgrzewka</td>
 <td>1.0</td>
 <td>150</td>
 <td>0.2</td>
 <td>300</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Odpoczynek mięśnia powinien trwać 60 s pomiędzy poszczególnymi stymulacjami. Te wstępne skurcze tężcowe stabilizują mięsień przed kolejnymi pomiarami.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2. Optymalna długość mięśnia (Lo)</td>
 <td>0,5, 1,0, 1,5 i 2,0</td>
 <td>1</td>
 <td>0.2</td>
 <td>300</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Pozostaw mięsień do rozluźnienia na 30 s pomiędzy poszczególnymi stymulacjami. Pomiar optymalnej długości mięśnia przeprowadź za pomocą suwmiarki cyfrowej.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3. Siła pojedynczego skurczu (Pt)</td>
 <td>Ustaw napięcie spoczynkowe na poziom Lo</td>
 <td>1</td>
 <td>0.2</td>
 <td>300</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4. Siła tężcowa mięśnia </td>
 <td>Ustaw napięcie spoczynkowe na Lo</td>
 <td>50, 80, 100, 120, 150 i 200 </td>
 <td>0.2</td>
 <td>300</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Pozostaw mięsień w stanie rozluźnienia przez 1 min między poszczególnymi stymulacjami. Wyznacz częstotliwość generującą maksymalną bezwzględną siłę tężcową (Po).</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5. Skurcz ekscentryczny</td>
 <td>Ustaw napięcie spoczynkowe na wartość Lo</td>
 <td>Należy zastosować częstotliwość, która generuje maksymalną siłę tetaniczną (Po) </td>
 <td>0.2</td>
 <td>700</td>
 <td>10% Lo</td>
 <td>ostatnie 200 ms czasu trwania stymulacji</td>
 <td>0,5 Lo/s</td>
 <td>Powtórz skurcz ekscentryczny przez 10 cykli z 2-minutową przerwą między cyklami.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6. CSA mięśnia EDL </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>CSA = (masa mięśnia (g) / [1,06 g/cm³])3 x (Lo x 0,44)]. 1,06 g/cm³3 gęstość mięśnia, a 0,44 to stosunek długości włókien mięśnia EDL do Lo. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="9">1.3.2 Pomiar właściwości pasywnych mięśnia EDL </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1. Sześciostopniowy protokół rozciągania</td>
 <td>Ustaw napięcie spoczynkowe na wartość Lo</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>10% Lo</td>
 <td></td>
 <td>2 cm/s</td>
 <td>Powtórz protokół rozciągania, zwiększając wartość Lo o 10%, aż do osiągnięcia poziomu 160% Lo. Zachowaj 1,5 s przerwy między cyklami rozciągania.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2. SRR</td>
 <td>Ustaw napięcie spoczynkowe na Lo</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>10% Lo</td>
 <td></td>
 <td>2 cm/s</td>
 <td>Wartość SSR oblicza się poprzez podzielenie różnicy naprężeń przez czas, który upłynął między dwoma punktami czasowymi w określonym przedziale czasowym. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="9">2.3 Pomiar właściwości kurczliwych mięśnia TA </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1. Rozgrzewka</td>
 <td>4.0</td>
 <td>150</td>
 <td>0.2</td>
 <td>300</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Pozostaw mięsień w spoczynku przez 60 s pomiędzy poszczególnymi bodźcami. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2. Optymalna długość mięśnia (Lo)</td>
 <td>3,0, 4,0, 5,0, 6,0 i 7,0</td>
 <td>1</td>
 <td>0.2</td>
 <td>300</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Pozostaw mięsień w stanie rozluźnienia przez 30 s pomiędzy poszczególnymi stymulacjami. Zmierz optymalną długość mięśnia za pomocą suwmiarki cyfrowej.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3. CSA mięśnia TA </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>CSA = (masa mięśnia (g) / [1,06 g/cm³3 x (Lo x 0,6)]. 0,6 to stosunek długości włókna mięśnia TA do Lo. </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 2. Parametry służące do oceny właściwości mechanicznych mięśni EDL i TA.
<table border="1">
 <tbody >
 <tr>
 <td>Szczep</td>
 <td>Wiek (miesiąc)</td>
 <td>Masa ciała (g)</td>
 <td>Masa EDL (mg)</td>
 <td>Długość EDL (mm)</td>
 <td>CSA EDL (mm2)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL10</td>
 <td>6</td>
 <td>32.03 ± 0.57</td>
 <td>13.90 ± 0.77</td>
 <td>14.09 ± 0.04</td>
 <td>2.12 ± 0.12</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>mdx</td>
 <td>6</td>
 <td>35.44 ± 0.42*</td>
 <td>16.73 ± 0.42*</td>
 <td>13.93 ± 0.05*</td>
 <td>2.57 ± 0.07*</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 3. Właściwości morfometryczne mięśnia EDL. *, wartość u myszy mdx różni się znacząco od wartości u myszy BL10 w tym samym wieku.
<img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1.jpg" alt="Schemat zestawu bloku Sylgard w dwóch rzutach; zaznaczono wymiary dla układu projektu eksperymentalnego." fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1highres.jpg" fo:content-width="5.5in" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Schemat wykonanej na zamówienie deski do sekcji myszy. Deska do sekcji została wykonana z pleksiglasu o grubości ½ cala w warsztacie instytucjonalnym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
<img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2.jpg" alt="Proces wiązania węzła chirurgicznego; sekwencja krok po kroku; technika szycia; schemat procedury medycznej." fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2highres.jpg" fo:content-width="4in" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2">/&gt; 
 Rycina 2. Seria obrazów cyfrowych przedstawiająca etapy wiązania podwójnego węzła kwadratowego, a następnie węzła pętlowego w obrębie MTJ. Gwiazdka: mięsień EDL; Strzałka: ścięgno dystalne mięśnia EDL.
<img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3.jpg" alt="Schemat równowagi statycznej z wymiarami i konfiguracją zestawu, podkreślający analizę rozkładu sił." fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3highres.jpg" fo:content-width="6in" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3">/&gt; 
 Rycina 3. Schemat specjalnie wykonanej platformy do badania funkcji mięśnia TA in situ. Pleksiglasowa platforma dla zwierzęcia oraz stalowy uchwyt kolana zostały zaprojektowane do montażu w aparaturze do badań in situ myszy 809B. *, pręt ze stali nierdzewnej (Cat# MPR-2.0, Siskiyou, Grants Pass, OR); #, uniwersalny uchwyt elektrod (Cat# MXB, Siskiyou, Grants Pass, OR); §, pręt do mocowania elektrod (Cat# MPR-3.0, Siskiyou, Grants Pass, OR); **, blok Sylgard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę</a>.
<img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4.jpg" alt="Analiza skurczu mięśni; wykresy słupkowe i liniowe przedstawiają siłę, napięcie, naprężenie, odkształcenie oraz wskaźniki SRR." fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4highres.jpg" fo:content-width="4in" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4">/&gt; 
 Rycina 4. Reprezentatywne wyniki dla właściwości kurczliwych i pasywnych mięśnia EDL. Właściwości kurczliwe mięśnia EDL charakteryzują swoista siła pojedynczego skurczu (A), swoista siła tężcowa (B), czas do osiągnięcia szczytowego napięcia (C) oraz połowa czasu relaksacji (D). Właściwości pasywne mięśnia EDL oceniane są na podstawie profilu naprężenie-odkształcenie (E) oraz wskaźnika SSR. *, myszy mdx różnią się znacząco od myszy BL10 w tym samym wieku.

Zmiany w kurczliwości mięśni kończyn i pasywnych właściwościach mechanicznych są ważnymi biomarkerami chorób mięśni. W tym manuskrypcie opisano testy fizjologiczne do pomiaru tych właściwości w mysich mięśniach prostownika długiego palca długiego i piszczelowych przednich.

Ocena funkcji mięśni mięśnia prostownika długiego mięśnia ex vivo i mięśnia piszczelowego przedniego in situ u myszy

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Ogólnym celem tej procedury jest dokładne określenie właściwości mechanicznych mięśni kończyn myszy. Osiąga się to poprzez pomiar kurczliwości i właściwości biernych mięśnia prostownika długiego długiego ex evo lub poprzez pomiar właściwości kurczliwych mięśnia piszczelowego przedniego in situ, ostatecznie można uzyskać wyniki, które pozwalają lepiej zrozumieć zmiany fizjologiczne w różnych chorobach mięśni i czy interwencje eksperymentalne poprawiają funkcję mięśni. Metoda ta zapewnia pełną ocenę kurczliwości i bierności mięśni szkieletowych, które są dwoma nierozłącznymi aspektami mechanicznej funkcji mięśni szkieletowych niezbędnych do ruchu ciała.Dlatego wizualna demonstracja procedury rozwarstwiania mięśni ma kluczowe znaczenie, ponieważ wymaga wielu umiejętności i manipulacji. Główną zaletą oceny właściwości skurczowych dużych mięśni metodą NC two w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak SA in vitro, jest to, że podejście instytutowe nie zakłóca normalnego przepływu krwi i natlenienia. Głównym problemem w badaniach fizjologii mięśni jest dotlenienie mięśnia docelowego.W in vitro SA dla dużych mięśni, takich jak mięsień TA, dyfuzja tlenu może nie dotrzeć do środka mięśnia. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób mięśni, ponieważ dokładny pomiar funkcji mechanicznej mięśni szkieletowych może być również wykorzystany do oceny postępu chorób mięśni i określenia skuteczności terapeutycznej nowych interwencji genowych, komórkowych i farmakologicznych. Wszystkie przedstawione tutaj procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami.Jest to operacja niemająca na celu przeżycia, mająca na celu ustawienie systemu testowania mięśni do eksperymentów ex vivo. Rozpocznij od zmontowania kąpieli tkankowej, mocując rurkę tlenową do kąpieli tkankowej z płaszczem wodnym. Przymocuj zmontowaną wannę do aparatu do montażu mięśni i umieść zawór iglicowy w odpływie wanny.Podłącz przewód gazowy i przewody cyrkulacji wody do wanny. Pozwól, aby woda o temperaturze 30 stopni Celsjusza krążyła w komorze płaszcza, a pięć PSI gazu przepływało przez rurkę tlenową. Napełnij wannę buforem Ringera i zrównoważ ją stałym przepływem gazu.Włącz instrumenty i załaduj oprogramowanie DMC, aby przeprowadzić sekcję znieczulenia tętnicy mięśniowej EDL i umieścić mysz na poduszce grzewczej. Ogol tylną kończynę i sprawdź, czy nie ma sedacji, wykonując szczypanie palca u nogi. Umieść mysz na desce sekcyjnej i zdejmij skórę nogi.Użyj dwóch szpilek krawieckich, aby zabezpieczyć tylną kończynę w stopie i w mięśniu gracilis. Umieść lampę grzewczą nad myszą, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 stopni Celsjusza i w sposób ciągły łącz wszystkie odsłonięte mięśnie z ciepłym buforem dzwonków pod mikroskopem stereoskopowym, wypreparuj skórę, aby odsłonić dystalne ścięgno TA i więzadło prostownika, a następnie delikatnie usuń powięź pokrywającą mięsień TA. Przetnij więzadło prostownika, aby zwolnić dystalne ścięgno TA.Przetnij dystalne ścięgno TA i użyj go do usunięcia mięśnia TA za pomocą cienkiego kawałka bawełny nasączonej buforem dzwonka. Zatrzymać krwawienie spowodowane pęknięciem układu naczyniowego mięśnia TA. Następnie, za pomocą szwu z jedwabiu chlebowego, zawiąż podwójny kwadratowy węzeł, a następnie węzeł pętlowy na połączeniu ścięgien mięśnia dystalnego mięśnia EDL.Następnie wykonaj nacięcie w mięśniu dwugłowym kobiecym, aby odsłonić ścięgno proksymalne i zawiąż ten sam zestaw węzłów na połączeniu ścięgna mięśnia bliższego. Użyj tej samej linii szwów, aby wykonać podwójny kwadratowy węzeł. Aby przymocować hak ramienia dźwigni do węzła bliższego lub dalszego.Aby delikatnie wypreparować mięsień EDL z kończyny tylnej. Najpierw przetnij ścięgno bliższe powyżej węzłów szwów i przetnij naczynia krwionośne pod mięśniem. Następnie przeciąć dystalne ścięgno poniżej węzła szwu.Przykryj odsłoniętą tylną kończynę kawałkiem bawełny nasączonej dzwonkami. Na koniec przymocuj haczyk do ramienia dźwigni i ustaw mięśnie pionowo między elektrodami. Przymocuj dystalną linię szwu do stałego słupka.Zanurz mięsień w buforze dzwonka i dostosuj napięcie spoczynkowe do 1,0 grama. Pozwól mięśniom zrównoważyć się przez co najmniej 10 minut. Aby zmierzyć właściwości skurczowe mięśnia EDL, ustaw parametry dla każdego z poniższych protokołów w oprogramowaniu DMC, jak pokazano tutaj.W pierwszym protokole ustabilizuj mięsień EDL, stymulując go trzykrotnie z częstotliwością 150 Hz z 62. odpoczynkiem między stymulacjami. W przypadku drugiego protokołu pozwól mięśniom rozluźnić się przez dwie minuty, a następnie określ optymalną długość lub LN, stymulując mięsień EDL przy różnych napięciach spoczynkowych. Użyj suwmiarki cyfrowej, aby zmierzyć optymalną długość mięśnia między węzłem dystalnym i proksymalnym.Pozwól mięśniom rozluźnić się przez dwie minuty. W przypadku protokołu trzeciego dostosuj napięcie spoczynkowe do L zero i zmierz siłę mięśni przy stymulacji pojedynczego skurczu. Określ napięcie Twitcha lub pt czas do osiągnięcia szczytowego napięcia lub TPT oraz czas połowicznego relaksu pt.Pozwól mięśniom rozluźnić się przez dwie minuty. Aby przeprowadzić czwarty protokół, dostosuj napięcie spoczynkowe do LN i zmierz siłę mięśni jąder generowaną przy różnych częstotliwościach stymulacji. Zmierz P NAUGH, w którym siła mięśniowa osiąga maksymalną tytaniczną siłę.Zmierz czas do osiągnięcia szczytowego napięcia i czas połowy relaksu dla pnaugh. Rozpocznij protokół piąty, pozwalając mięśniowi rozluźnić się przez pięć minut, dostosuj napięcie spoczynkowe do L Naugh i zastosuj 10 cykli ekscentrycznych skurczów z dwiema minutami odpoczynku między cyklami. Oblicz względny ubytek siły PN po każdym cyklu skurczu mimośrodowego.Na koniec należy odłączyć mięsień EDL od aparatu i przeciąć ścięgna w miejscu szwu. Określ mokrą masę mięśni i oblicz pole przekroju poprzecznego mięśni. Aby zmierzyć właściwości pasywne mięśnia EDL, należy rozciąć mięsień przeciwległy EDL i przymocować go do aparatu, jak pokazano wcześniej.W tym filmie poddaj mięsień sześcioetapowemu protokołowi rozciągania, w którym mięsień jest napięty do 160% L naugh w krokach co 10%. Przeanalizuj profil naprężeniowo-odkształceniowy, aby ocenić lepkość rozciągnięcia mięśnia EDL i utrzymaj mięsień na poziomie 10% L i zmierz szybkość relaksacji stresu w następujących ramach czasowych. Rozpocznij od podgrzania kontrolowanego termicznie etapu zwierzęcego do 37 stopni Celsjusza za pomocą wody krążącej.Włącz i załaduj oprogramowanie DMC. Po odsłonięciu mięśnia TA na tylnej kończynie znieczulonej myszy, użyj nici chlebowej, aby zawiązać podwójny kwadratowy węzeł wokół więzadła rzepki. Następnie zawiąż podwójny kwadratowy węzeł, a następnie węzeł pętlowy na połączeniu ścięgien mięśniowych lub MTJ dystalnego ścięgna ta.Użyj tego samego szwu, aby wykonać około 10-milimetrową pętlę. Ułóż zwierzę na brzuchu i odsłoń mięsień dwugłowy. Odsłoń nerw kulszowy i zawiąż podwójny kwadratowy węzeł wokół jego bliższego końca.Przetnij nerw powyżej węzła i ostrożnie wypreparuj około pięciu milimetrów jego długości w kierunku kolana. Nie rozciągaj ani nie uszkadzaj nerwu. Przygotuj mięsień przeciwległy, jak pokazano wcześniej w tym filmie, i przykryj jedną z tylnych kończyn kawałkiem bawełny nasączonej buforem dzwonka.Następnie ułóż zwierzę leżące na platformie dla zwierząt i użyj linii szwów więzadła rzepki wokół sworznia kolanowego, aby zawiązać podwójny kwadratowy węzeł, aby zabezpieczyć kolano. Następnie, po przypięciu stóp do bloku ochronnego SIL, przymocuj platformę dla zwierząt do stolika sterowanego termicznie i ustaw lampę grzewczą tak, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 stopni Celsjusza. Po przymocowaniu elektrody do platformy należy przymocować nerw kulszowy do elektrody, a następnie przeciąć ścięgno TA odsłoniętej kończyny tylnej dystalnie do węzła dystalnego i przymocować pętlę do szwu do haka ramienia dźwigni.Przykryj odsłonięty mięsień kończyny tylnej ciepłymi pierścieniami, buforem nasączonym bawełną, aby zarejestrować pomiary kurczliwości mięśnia TA. Użyj parametrów i protokołu w oprogramowaniu DMC pokazanym wcześniej w tym filmie dla mięśnia EDL i użyj oprogramowania do analizy danych. Po wykonaniu pomiarów mięśnia TA odczep dystalną pętlę szwu ścięgna TA od haka ramienia dźwigni i zmierz właściwości skurczowe przeciwległego mięśnia TA, jak pokazano Po eutanazji zwierzęcia usuń mięśnie TA i określ ich mokrą masę.Aby obliczyć pole przekroju poprzecznego, poniższa tabela przedstawia właściwości morfometryczne mięśnia EDL u normalnych myszy z niedoborem czarnej 10 i dystrofiny lub MDX w wieku od czterech do sześciu miesięcy. Pokazano tutaj reprezentatywne właściwości skurczowe i pasywne mięśnia EDL od myszy czarnych 10 i MDX, w tym specyficzny dla siły Twitcha maksymalny czas siły tytanowej do szczytowego napięcia i czas połowy relaksacji bezwzględnej maksymalnej siły tytanowej. Czas do osiągnięcia szczytu napięcia i czas połowicznego rozluźnienia można również obliczyć na podstawie bezwzględnej siły drgania.Profil naprężenia, odkształcenia i współczynnik relaksacji stresu są używane do opisania pasywnych właściwości mięśnia EDL. Brak dystrofiny ma znaczący wpływ na kurczliwe i bierne właściwości mięśnia EDL. Specyficzne siły drgań i tytaniczne są znacznie zmniejszone w mięśniu M-D-X-E-D-L.Na przykład czas do osiągnięcia szczytowego napięcia jest znacznie szybszy, podczas gdy czas połowy relaksu jest znacznie wolniejszy w mięśniu M-D-X-E-D-L. Ponadto profil naprężenia i odkształcenia sugeruje, że sztywność mięśnia M-D-X-E-D-L. Mięsień M-D-X-E-D-L wytwarza również znacznie większą siłę oporu przed osiągnięciem naprężenia szczytowego, podczas gdy naprężenia po szczycie spadają znacznie szybciej.Co więcej, tempo relaksacji stresu było znacznie wyższe w mięśniu M-D-X-E-D-L w porównaniu z czarnym mięśniem 10 EDL. Po opanowaniu procedury preparacji, analizę ex vivo kurczliwości i właściwości biernych mięśnia EDL można przeprowadzić w ciągu 40 minut. A ocenę in situ właściwości skurczowych obu mięśni TA można przeprowadzić w ciągu 60 minut po jego rozwinięciu.Technika ta utorowała drogę naukowcom do oceny kurczliwości i pasywnych właściwości mięśni szkieletowych w dziedzinie chorób mięśni, aby pomóc w określeniu skuteczności leczenia po tej procedurze. Inne metody, takie jak analiza histopatologiczna mięśni szkieletowych, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytanie. Na przykład wpływ eksperymentalnego leczenia na histopatologię mięśni szkieletowych.

evaluation-muscle-function-extensor-digitorum-longus-muscle-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena funkcji mięśnia rozciągacza długiego palców Ex vivo oraz mięśnia brzucha przedniego piszczeli In situ u myszy

Aby ocenić efekty in vivo interwencji terapeutycznych w chorobach mięśni, konieczne są metody ilościowego pomiaru generowanej siły oraz podatności na zmęczenie w leczonych mięśniach. Szczegółowo opisujemy podejście do oceny właściwości miomechanicznych w wyizolowanym mięśniu kończyny tylnej myszy. Analiza ta stanowi solidną metodę ilościowego określania wpływu modyfikacji genetycznej na funkcję mięśni, a także porównywania terapii w modelach mysich chorób mięśni.

Analiza miomechaniczna wyizolowanego mięśnia szkieletowego

Opisujemy metodę bezpośredniego pomiaru siły mięśniowej, mocy mięśniowej, kinetyki skurczu oraz podatności na zmęczenie izolowanych mięśni szkieletowych w układzie in vitro z wykorzystaniem stymulacji polowej. Dzięki zastosowaniu różnych protokołów stymulacji można uzyskać cenne informacje na temat właściwości gospodarki Ca2+ oraz mechanizmu skurczowego mięśnia.

Ex Vivo ocena kurczliwości, męczliwości i alternansu w izolowanych mięśniach szkieletowych

Pomiary funkcji mięśni przyczyniają się do oceny potencjalnych metod leczenia patologii mięśni, jak również do określenia mechanizmów leżących u podstaw fizjologii tej tkanki.   Zademonstrujemy przygotowanie mięśni prostownika długiego palca i przepony do testów funkcjonalnych. Pokazane zostaną protokoły skurczów izometrycznych i ekscentrycznych, a także różnice w wynikach między mięśniami dystroficznymi, reprezentującymi stan patologiczny, a mięśniami typu dzikiego.

Izometryczna i ekscentryczna ocena generowania sił mięśni szkieletowych wyizolowanych z mysich modeli dystrofii mięśniowych

Neurony czuciowe mięśni są zaangażowane w sygnalizację proprioceptorową, a także informują o stanie metabolicznym i zdarzeniach związanych z urazami. Opisujemy preparat mięśniowo-nerwowy dorosłej myszy in vitro do badań nad mięśniami aferentnymi aktywowanymi rozciąganiem.

Preparat mięśniowo-nerwowy dorosłej myszy in vitro do badania właściwości wypalania aferentów mięśniowych

Opisujemy protokół in vivo do pomiaru zgięcia grzbietowego stopy po stymulacji nerwu strzałkowego i skurczu przedniego przedziału podudniowego kończyny tylnej szczura. Takie pomiary są niezastąpionym narzędziem translacyjnym do oceny patologii mięśni szkieletowych i podejść inżynierii tkankowej do naprawy i regeneracji mięśni.

Zastosowania testów funkcjonalnych in vivo kości piszczelowej szczura przedniego do oceny naprawy mięśni szkieletowych za pomocą inżynierii tkankowej

Pomiar funkcji kurczliwości mięśni szkieletowych gryzoni jest użytecznym narzędziem, które może być używane do śledzenia postępu choroby, jak również skuteczności interwencji terapeutycznej. Opisujemy tutaj nieinwazyjną ocenę in vivo mięśni zginaczy grzbietowych, która może być powtarzana w czasie u tej samej myszy.

Nieinwazyjna ocena funkcji mięśni zginacza grzbietowego u myszy

Przedstawiamy szczegółowe protokoły przeprowadzania eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej pod małym kątem przy użyciu nienaruszonych mięśni szkieletowych myszy. Dzięki szerokiej dostępności transgenicznych modeli myszy w chorobach ludzkich, ta eksperymentalna platforma może stanowić użyteczne stanowisko testowe do wyjaśnienia strukturalnych podstaw genetycznych chorób...

Dyfrakcja rentgenowska nienaruszonych mięśni szkieletowych myszy jako narzędzie do badania strukturalnych podstaw choroby mięśni

Nienaruszona regulacja wychwytu glukozy w mięśniach jest ważna dla utrzymania homeostazy glukozy w całym organizmie. Protokół ten przedstawia ocenę wychwytu glukozy stymulowanego insuliną i skurczem w izolowanych i inkubowanych dojrzałych mięśniach szkieletowych przy jednoczesnym określeniu wpływu różnych interwencji fizjologicznych na metabolizm glukozy w całym organizmie.

Pomiar wychwytu glukozy stymulowanego insuliną i skurczem w izolowanych i inkubowanych dojrzałych mięśniach szkieletowych myszy

Kwantyfikacja maksymalnej siły prostownika kolana jest niezbędna do zrozumienia funkcjonalnych adaptacji do starzenia się, chorób, urazów i rehabilitacji. Przedstawiamy nowatorską metodę wielokrotnego pomiaru in vivo izometrycznego szczytowego momentu obrotowego tężcowego wyprostu kolana.

Pomiar in vivo funkcji mięśni prostowników stawu kolanowego u myszy

Ten protokół opisuje metodę analizy morfometrycznej połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i STED, która jest używana do ilościowego określania zmian patologicznych w mysich modelach SMA i CMS związanych z ColQ.

Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej

Opisujemy protokół uzyskiwania enzymatycznie zdysocjowanych włókien o różnych długościach i typach z sześciu mięśni dorosłych myszy: trzy z nich już opisane (zginacz palca krótkiego, prostownik palca długiego, płaszczkowaty) i trzy z nich pomyślnie zdysocjowane po raz pierwszy (prostownik palucha długiego, mięsień długi długi, peroneus digiti quarti).

Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

Poznaj metodę oceny właściwości mechanicznych mięśni kończyn myszy, w tym mięśnia prostownika długiego ex vivo i mięśnia piszczelowego przedniego in situ. Technika ta umożliwia kompleksową analizę funkcji mięśniowej w badaniach chorób mięśniowych.

Ocena funkcji mięśni mięśnia prostownika długiego mięśnia ex vivo i mięśnia piszczelowego przedniego in situ u myszy

Przeglądaj więcej filmów