Ocena funkcji mięśni mięśnia prostownika długiego mięśnia ex vivo i mięśnia piszczelowego przedniego in situ u myszy

Ogólnym celem tej procedury jest dokładne określenie właściwości mechanicznych mięśni kończyn myszy. Osiąga się to poprzez pomiar kurczliwości i właściwości biernych mięśnia prostownika długiego długiego ex evo lub poprzez pomiar właściwości kurczliwych mięśnia piszczelowego przedniego in situ, ostatecznie można uzyskać wyniki, które pozwalają lepiej zrozumieć zmiany fizjologiczne w różnych chorobach mięśni i czy interwencje eksperymentalne poprawiają funkcję mięśni. Metoda ta zapewnia pełną ocenę kurczliwości i bierności mięśni szkieletowych, które są dwoma nierozłącznymi aspektami mechanicznej funkcji mięśni szkieletowych niezbędnych do ruchu ciała.

Dlatego wizualna demonstracja procedury rozwarstwiania mięśni ma kluczowe znaczenie, ponieważ wymaga wielu umiejętności i manipulacji. Główną zaletą oceny właściwości skurczowych dużych mięśni metodą NC two w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak SA in vitro, jest to, że podejście instytutowe nie zakłóca normalnego przepływu krwi i natlenienia. Głównym problemem w badaniach fizjologii mięśni jest dotlenienie mięśnia docelowego.

W in vitro SA dla dużych mięśni, takich jak mięsień TA, dyfuzja tlenu może nie dotrzeć do środka mięśnia. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób mięśni, ponieważ dokładny pomiar funkcji mechanicznej mięśni szkieletowych może być również wykorzystany do oceny postępu chorób mięśni i określenia skuteczności terapeutycznej nowych interwencji genowych, komórkowych i farmakologicznych. Wszystkie przedstawione tutaj procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami.

Jest to operacja niemająca na celu przeżycia, mająca na celu ustawienie systemu testowania mięśni do eksperymentów ex vivo. Rozpocznij od zmontowania kąpieli tkankowej, mocując rurkę tlenową do kąpieli tkankowej z płaszczem wodnym. Przymocuj zmontowaną wannę do aparatu do montażu mięśni i umieść zawór iglicowy w odpływie wanny.

Podłącz przewód gazowy i przewody cyrkulacji wody do wanny. Pozwól, aby woda o temperaturze 30 stopni Celsjusza krążyła w komorze płaszcza, a pięć PSI gazu przepływało przez rurkę tlenową. Napełnij wannę buforem Ringera i zrównoważ ją stałym przepływem gazu.

Włącz instrumenty i załaduj oprogramowanie DMC, aby przeprowadzić sekcję znieczulenia tętnicy mięśniowej EDL i umieścić mysz na poduszce grzewczej. Ogol tylną kończynę i sprawdź, czy nie ma sedacji, wykonując szczypanie palca u nogi. Umieść mysz na desce sekcyjnej i zdejmij skórę nogi.

Użyj dwóch szpilek krawieckich, aby zabezpieczyć tylną kończynę w stopie i w mięśniu gracilis. Umieść lampę grzewczą nad myszą, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 stopni Celsjusza i w sposób ciągły łącz wszystkie odsłonięte mięśnie z ciepłym buforem dzwonków pod mikroskopem stereoskopowym, wypreparuj skórę, aby odsłonić dystalne ścięgno TA i więzadło prostownika, a następnie delikatnie usuń powięź pokrywającą mięsień TA. Przetnij więzadło prostownika, aby zwolnić dystalne ścięgno TA.

Przetnij dystalne ścięgno TA i użyj go do usunięcia mięśnia TA za pomocą cienkiego kawałka bawełny nasączonej buforem dzwonka. Zatrzymać krwawienie spowodowane pęknięciem układu naczyniowego mięśnia TA. Następnie, za pomocą szwu z jedwabiu chlebowego, zawiąż podwójny kwadratowy węzeł, a następnie węzeł pętlowy na połączeniu ścięgien mięśnia dystalnego mięśnia EDL.

Następnie wykonaj nacięcie w mięśniu dwugłowym kobiecym, aby odsłonić ścięgno proksymalne i zawiąż ten sam zestaw węzłów na połączeniu ścięgna mięśnia bliższego. Użyj tej samej linii szwów, aby wykonać podwójny kwadratowy węzeł. Aby przymocować hak ramienia dźwigni do węzła bliższego lub dalszego.

Aby delikatnie wypreparować mięsień EDL z kończyny tylnej. Najpierw przetnij ścięgno bliższe powyżej węzłów szwów i przetnij naczynia krwionośne pod mięśniem. Następnie przeciąć dystalne ścięgno poniżej węzła szwu.

Przykryj odsłoniętą tylną kończynę kawałkiem bawełny nasączonej dzwonkami. Na koniec przymocuj haczyk do ramienia dźwigni i ustaw mięśnie pionowo między elektrodami. Przymocuj dystalną linię szwu do stałego słupka.

Zanurz mięsień w buforze dzwonka i dostosuj napięcie spoczynkowe do 1,0 grama. Pozwól mięśniom zrównoważyć się przez co najmniej 10 minut. Aby zmierzyć właściwości skurczowe mięśnia EDL, ustaw parametry dla każdego z poniższych protokołów w oprogramowaniu DMC, jak pokazano tutaj.

W pierwszym protokole ustabilizuj mięsień EDL, stymulując go trzykrotnie z częstotliwością 150 Hz z 62. odpoczynkiem między stymulacjami. W przypadku drugiego protokołu pozwól mięśniom rozluźnić się przez dwie minuty, a następnie określ optymalną długość lub LN, stymulując mięsień EDL przy różnych napięciach spoczynkowych. Użyj suwmiarki cyfrowej, aby zmierzyć optymalną długość mięśnia między węzłem dystalnym i proksymalnym.

Pozwól mięśniom rozluźnić się przez dwie minuty. W przypadku protokołu trzeciego dostosuj napięcie spoczynkowe do L zero i zmierz siłę mięśni przy stymulacji pojedynczego skurczu. Określ napięcie Twitcha lub pt czas do osiągnięcia szczytowego napięcia lub TPT oraz czas połowicznego relaksu pt.

Pozwól mięśniom rozluźnić się przez dwie minuty. Aby przeprowadzić czwarty protokół, dostosuj napięcie spoczynkowe do LN i zmierz siłę mięśni jąder generowaną przy różnych częstotliwościach stymulacji. Zmierz P NAUGH, w którym siła mięśniowa osiąga maksymalną tytaniczną siłę.

Zmierz czas do osiągnięcia szczytowego napięcia i czas połowy relaksu dla pnaugh. Rozpocznij protokół piąty, pozwalając mięśniowi rozluźnić się przez pięć minut, dostosuj napięcie spoczynkowe do L Naugh i zastosuj 10 cykli ekscentrycznych skurczów z dwiema minutami odpoczynku między cyklami. Oblicz względny ubytek siły PN po każdym cyklu skurczu mimośrodowego.

Na koniec należy odłączyć mięsień EDL od aparatu i przeciąć ścięgna w miejscu szwu. Określ mokrą masę mięśni i oblicz pole przekroju poprzecznego mięśni. Aby zmierzyć właściwości pasywne mięśnia EDL, należy rozciąć mięsień przeciwległy EDL i przymocować go do aparatu, jak pokazano wcześniej.

W tym filmie poddaj mięsień sześcioetapowemu protokołowi rozciągania, w którym mięsień jest napięty do 160% L naugh w krokach co 10%. Przeanalizuj profil naprężeniowo-odkształceniowy, aby ocenić lepkość rozciągnięcia mięśnia EDL i utrzymaj mięsień na poziomie 10% L i zmierz szybkość relaksacji stresu w następujących ramach czasowych. Rozpocznij od podgrzania kontrolowanego termicznie etapu zwierzęcego do 37 stopni Celsjusza za pomocą wody krążącej.

Włącz i załaduj oprogramowanie DMC. Po odsłonięciu mięśnia TA na tylnej kończynie znieczulonej myszy, użyj nici chlebowej, aby zawiązać podwójny kwadratowy węzeł wokół więzadła rzepki. Następnie zawiąż podwójny kwadratowy węzeł, a następnie węzeł pętlowy na połączeniu ścięgien mięśniowych lub MTJ dystalnego ścięgna ta.

Użyj tego samego szwu, aby wykonać około 10-milimetrową pętlę. Ułóż zwierzę na brzuchu i odsłoń mięsień dwugłowy. Odsłoń nerw kulszowy i zawiąż podwójny kwadratowy węzeł wokół jego bliższego końca.

Przetnij nerw powyżej węzła i ostrożnie wypreparuj około pięciu milimetrów jego długości w kierunku kolana. Nie rozciągaj ani nie uszkadzaj nerwu. Przygotuj mięsień przeciwległy, jak pokazano wcześniej w tym filmie, i przykryj jedną z tylnych kończyn kawałkiem bawełny nasączonej buforem dzwonka.

Następnie ułóż zwierzę leżące na platformie dla zwierząt i użyj linii szwów więzadła rzepki wokół sworznia kolanowego, aby zawiązać podwójny kwadratowy węzeł, aby zabezpieczyć kolano. Następnie, po przypięciu stóp do bloku ochronnego SIL, przymocuj platformę dla zwierząt do stolika sterowanego termicznie i ustaw lampę grzewczą tak, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 stopni Celsjusza. Po przymocowaniu elektrody do platformy należy przymocować nerw kulszowy do elektrody, a następnie przeciąć ścięgno TA odsłoniętej kończyny tylnej dystalnie do węzła dystalnego i przymocować pętlę do szwu do haka ramienia dźwigni.

Przykryj odsłonięty mięsień kończyny tylnej ciepłymi pierścieniami, buforem nasączonym bawełną, aby zarejestrować pomiary kurczliwości mięśnia TA. Użyj parametrów i protokołu w oprogramowaniu DMC pokazanym wcześniej w tym filmie dla mięśnia EDL i użyj oprogramowania do analizy danych. Po wykonaniu pomiarów mięśnia TA odczep dystalną pętlę szwu ścięgna TA od haka ramienia dźwigni i zmierz właściwości skurczowe przeciwległego mięśnia TA, jak pokazano Po eutanazji zwierzęcia usuń mięśnie TA i określ ich mokrą masę.

Aby obliczyć pole przekroju poprzecznego, poniższa tabela przedstawia właściwości morfometryczne mięśnia EDL u normalnych myszy z niedoborem czarnej 10 i dystrofiny lub MDX w wieku od czterech do sześciu miesięcy. Pokazano tutaj reprezentatywne właściwości skurczowe i pasywne mięśnia EDL od myszy czarnych 10 i MDX, w tym specyficzny dla siły Twitcha maksymalny czas siły tytanowej do szczytowego napięcia i czas połowy relaksacji bezwzględnej maksymalnej siły tytanowej. Czas do osiągnięcia szczytu napięcia i czas połowicznego rozluźnienia można również obliczyć na podstawie bezwzględnej siły drgania.

Profil naprężenia, odkształcenia i współczynnik relaksacji stresu są używane do opisania pasywnych właściwości mięśnia EDL. Brak dystrofiny ma znaczący wpływ na kurczliwe i bierne właściwości mięśnia EDL. Specyficzne siły drgań i tytaniczne są znacznie zmniejszone w mięśniu M-D-X-E-D-L.

Na przykład czas do osiągnięcia szczytowego napięcia jest znacznie szybszy, podczas gdy czas połowy relaksu jest znacznie wolniejszy w mięśniu M-D-X-E-D-L. Ponadto profil naprężenia i odkształcenia sugeruje, że sztywność mięśnia M-D-X-E-D-L. Mięsień M-D-X-E-D-L wytwarza również znacznie większą siłę oporu przed osiągnięciem naprężenia szczytowego, podczas gdy naprężenia po szczycie spadają znacznie szybciej.

Co więcej, tempo relaksacji stresu było znacznie wyższe w mięśniu M-D-X-E-D-L w porównaniu z czarnym mięśniem 10 EDL. Po opanowaniu procedury preparacji, analizę ex vivo kurczliwości i właściwości biernych mięśnia EDL można przeprowadzić w ciągu 40 minut. A ocenę in situ właściwości skurczowych obu mięśni TA można przeprowadzić w ciągu 60 minut po jego rozwinięciu.

Technika ta utorowała drogę naukowcom do oceny kurczliwości i pasywnych właściwości mięśni szkieletowych w dziedzinie chorób mięśni, aby pomóc w określeniu skuteczności leczenia po tej procedurze. Inne metody, takie jak analiza histopatologiczna mięśni szkieletowych, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytanie. Na przykład wpływ eksperymentalnego leczenia na histopatologię mięśni szkieletowych.